Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ptasi embrion był używany jako system modelowy przez ponad sto lat i doprowadził do fundamentalnego zrozumienia rozwoju kręgowców. Jedną z mocnych stron tego systemu modelowego jest to, że wpływ i interakcja między tkankami mogą być bezpośrednio oceniane w zarodkach chimerycznych. Wcześniej wykazaliśmy, że sygnały z przodomózgowia przyczyniają się do morfogenezy twarzy poprzez regulację kształtu domeny ekspresji jeża sonicznego (SHH) w strefie czołowo-nosowej ektodermalnej (FEZ). W artykule opisano metodę generowania chimer przodomózgowia oraz przedstawiono ilustracje wyników tych eksperymentów.
Wprowadzenie
Wiele współczesnych badań w dziedzinie biologii rozwojowej skupia się na roli genów w kształtowaniu embrionów. Istnieją dobre narzędzia do badania mechanizmów rozwojowych z perspektywy genetycznej. Jednak zarodki są składane i ulegają morfogenezie w odpowiedzi na interakcje tkankowe. System ptasi jest klasycznym narzędziem wykorzystywanym do oceny różnorodności interakcji tkankowych, które regulują rozwój, z następujących powodów: embriologia jest dobrze poznana, zarodki są łatwo dostępne, narzędzia do analizy systemów ptasich są dobrze rozwinięte, a zarodki są niedrogie.
System transplantacji ptaków jest szeroko stosowany do śledzenia linii i oceny interakcji tkanek podczas rozwoju od prawie stu lat1,2,3,4. System ten został wykorzystany do zbadania centrum sygnalizacyjnego, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), które reguluje morfogenezę górnej szczęki5, a wcześniej opublikowano film opisujący tę technikę6. Oprócz piskląt przepiórczych inne gatunki zostały również wykorzystane do produkcji chimer do analizy interakcji tkankowych. Na przykład mysi FEZ został przeniesiony z dzikiego typu7 i zmutowanych myszy8, a inni wykorzystali systemy kaczki, przepiórki i piskląt do oceny roli grzebienia nerwowego w tworzeniu wzoru szkieletu twarzy9,10,11,12.
W tej pracy oceniono rolę przodomózgowia w regulowaniu wzorca ekspresji genów w FEZ poprzez wzajemne przeszczepianie brzusznej części przodomózgowia między zarodkami przepiórek, kaczek i piskląt, ponieważ sygnał z przodomózgowia jest wymagany do wywołania ekspresji Sonic hedgehog w WSE. Przeszczepy przodomózgowia nie są wyjątkowe w tej dziedzinie. Przeszczepy te wykorzystano do oceny rozwoju ruchliwości zarodków przepiórek i kaczek13, chociaż w tych eksperymentach przeszczepiono również tkanki, które przyczyniły się do powstania pochodnych nieneuronalnych. W innych pracach obwody słuchowe u ptaków zostały ocenione za pomocą przeszczepu przodomózgowia14, ale te przeszczepy zawierały przypuszczalne komórki grzebienia nerwowego, które przyczyniają się do kształtu twarzy9,10 i uczestniczą w regulacji ekspresji SHH w klasie FEZ15. W związku z tym opracowano system do przeszczepiania tylko brzusznego przodomózgowia od jednego gatunku ptaka do drugiego przed zamknięciem cewy nerwowej, aby ocenić rolę mózgu w kształcie twarzy16 (Rysunek 1A,B). Metoda ta była pozbawiona zanieczyszczenia grzebienia nerwowego przeszczepu. W artykule przedstawiono metodę i opisano oczekiwane wyniki, a także omówiono stojące przed nią wyzwania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Biała kaczka pekińska (Anas platyrhynchos), biały kurczak Leghorn (Gallus gallus) i przepiórka japońska (Cortunix coturnix japonica) są inkubowane w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze aż do momentu dopasowania etapu w HH7/817.
1. Przygotowanie tkanki dawcy
UWAGA: Opisano przygotowanie odczynników i narzędzi oraz sposób otwierania jaj do eksperymentalnej manipulacji6.
- Przygotuj podłoże DMEM z neutralną czerwienią, szklaną pipetą transferową i zaostrzonymi igłami wolframowymi.
- Eksponuj zarodki (jak pokazano w6).
- Pobieraj przeszczepy tkanek z lewej strony podstawy przodomózgowia zarodków w stadium 7/8. Użyj zakrzywionych, zaostrzonych igieł wolframowych6, aby delikatnie naciąć kawałek przodomózgowia o wymiarach ~0,3 mm długości i 0,2 mm szerokości, upewniając się, że nie obejmuje leżącej pod spodem endodermy, wsuwając igłę pod przodomózgowie tak, aby igła była równoległa do osi cewy nerwowej.
- Za pomocą szklanej pipety do transferu pobrać przeszczep z zarodka dawcy.
- Przenieś przeszczep do DMEM zawierającego neutralną czerwień (0,01% w PBS, 23 °C) na 2 minuty, aby go zabarwić, a następnie umieść wybarwiony przeszczep w DMEM, który nie zawiera neutralnej czerwieni, aż będzie gotowy do wszczepienia.
2. Przygotowanie hosta
- Inkubować zapłodnione jaja od białego kurczaka Leghorn (Gallus gallus) w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze do HH7/8 17.
- Eksponuj zarodki (jak pokazano w6).
- Za pomocą zaostrzonych igieł wolframowych przygotuj miejsce przeszczepu, delikatnie przecinając, a następnie usuwając kawałek podstawy przodomózgowia o wymiarach 0,3 mm na 0,2 mm z lewej strony, aby pomieścić przeszczep, tak jak to miało miejsce w celu wyizolowania tkanki dawcy.
- Uważaj, aby uniknąć nadmiernego przerwania leżącej pod spodem endodermy, co będzie widoczne, gdy granulki żółtka zaczną przeciekać przez każde rozdarcie, które powstanie. Wymaga to wprawy i nie wszystkie próby zakończą się sukcesem.
- Po przeniesieniu do hosta6, ustaw przeszczep tak, aby zastąpił wytępioną podstawną przodomózgowie gospodarza.
- Umieścić taśmę na otworze i umieścić zarodek z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na odpowiedni czas do analizy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ocena chimeryzmu i kontaminacji przeszczepu
W celu oceny chimer należy przeanalizować stopień chimeryzmu oraz stopień kontaminacji przeszczepu innymi typami komórek. Tworzenie chimer poprzez transplantację tkanek przepiórnika do zarodków kury umożliwia przeprowadzenie tego rodzaju analizy. Przy użyciu przeciwciała QCPN można zwizualizować komórki przepiórnika i odróżnić je od tkanek gospodarza (Rycina 1 C,D). W tym przypadku przeciwciałem barwiono jedyni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana metoda pozwala na zbadanie interakcji tkankowych między podstawną częścią przodomózgowia a przylegającą ektodermą. Podejście to różni się od poprzednich metod przeszczepu przodomózgowia, ponieważ tkanka dawcy była ograniczona do brzusznego przodomózgowia. Eliminuje to przeszczepianie komórek grzebienia nerwowego, które, jak wykazano, uczestniczą w kształtowaniu morfologii twarzy 9,10. W związku z tym ograniczenie przeszczepu do podstawy przodomózgowia był...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health pod numerami nagród R01DE019648, R01DE018234 i R01DE019638.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm szalka Petriego | Falcon | 1008 | |
| DMEM Thermofisher | 11965084 | ||
| Uchwyt na igłę | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutralna czerwona | Sigma | 553-24-2 | |
| nr 5 Kleszcze Dumont | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pipety Pasteura | Thermofisher | 13-678-6B | |
| rozwojowe przeciwciał QCPN | Bank hybrydoma, Uniwersytet Iowa, Iowa, USA | ||
| Nożyczki | Narzędzia naukowe | 14058-11 | |
| Igła wolframowa | Precyzyjne narzędzia naukowe | 26000 |
Bibliografia
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477(2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
