Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej

Summary

Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.

Abstract

Embriony kurczaka są klasycznym modelem w badaniach rozwojowych. Podczas rozwoju zarodków kurzych okno czasowe rozwoju serca jest dobrze określone i stosunkowo łatwo jest osiągnąć precyzyjną i terminową ekspozycję za pomocą wielu metod. Co więcej, proces rozwoju serca w zarodkach kurcząt jest podobny do procesu ssaków, co również prowadzi do powstania czterokomorowego serca, co czyni go cennym modelem alternatywnym w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej. W naszym laboratorium model zarodka kurzego jest rutynowo stosowany do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po narażeniu na różne zanieczyszczenia środowiska, w tym substancje per- i polifluoroalkilowe (PFAS), cząstki stałe (PM), spaliny z silników wysokoprężnych (DE) i nanomateriały. Czas ekspozycji można dowolnie dobierać w zależności od potrzeb, od początku rozwoju (dzień embrionalny 0, ED0) aż do dnia poprzedzającego wyklucie. Główne metody ekspozycji obejmują wstrzyknięcie komórek powietrznych, bezpośrednie mikroiniekcje i inhalacje komórek powietrznych (pierwotnie opracowane w naszym laboratorium), a obecnie dostępne punkty końcowe obejmują czynność serca (elektrokardiografia), morfologię (oceny histologiczne) i oceny biologii molekularnej (immunohistochemia, qRT-PCR, western blotting itp.). Oczywiście model zarodka kurzego ma swoje ograniczenia, takie jak ograniczona dostępność przeciwciał. Niemniej jednak, wraz z coraz większą liczbą laboratoriów zaczynających korzystać z tego modelu, może on zostać wykorzystany do wniesienia znaczącego wkładu w badania nad kardiotoksycznością rozwojową.

Introduction

Embrion kurczaka to klasyczny model rozwojowy, który jest używany od ponad dwustu lat¹. Model zarodka kurczaka ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi modelami. Po pierwsze, już ponad 70 lat temu prawidłowy rozwój zarodka kurzego został bardzo wyraźnie zilustrowany w przewodniku Hamburger-Hamilton², w którym zdefiniowano łącznie 46 etapów rozwoju zarodka kurzego z dokładnym czasem i charakterystyką morfologiczną, co ułatwiło wykrycie nieprawidłowego rozwoju. Ponadto model zarodka kurzego ma inne cechy, takie jak stosunkowo niski koszt i nadmiarowość pod względem ilości, stosunkowo dokładna kontrola ekspozycji i dawki,....

Protocol

Wszystkie opisane procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Qingdao. W naszym laboratorium jaja inkubowano w dwóch inkubatorach. Jaja trzymano pionowo w inkubatorze i losowo umieszczano na półkach. Warunki inkubacji jaj były następujące: temperatura inkubacji rozpoczęła się od 37,9 °C i stopniowo spadała do 37,1 °C w miarę postępu inkubacji; Wilgotność zaczynała się od 50% i stopniowo wzrastała do 70%.

1. Metody ekspozycji

UWAGA: Narażenie na zanieczyszczenia środowiskowe zarodków kurczaków można osiągnąć na kilka sposobów. W tej sekcj....

Results

Wyniki ekspozycji
Wtrysk komórek powietrznych
Iniekcja komórek powietrznych może skutecznie narazić rozwijające się zarodki kurczaków na działanie różnych czynników, które mogą być następnie wykryte w pobranych próbkach (surowica, tkanka itp.) zarodków/piskląt kurcząt. Oto przykład, w którym kwas perfluorooktanowy (PFOA) wstrzyknięto do komórek powietrznych, a następnie oznaczono stężenia PFOA w surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Stężenia w surowicy odpowiadały dawkom.......

Discussion

Zarodek kurczaka jest klasycznym modelem w badaniach rozwojowych od 200 lat¹. Nasze metody przedstawione w tym manuskrypcie zostały wykorzystane do oceny kilku zanieczyszczeń środowiska, w tym kwasu perfluorooktanowego, cząstek stałych i spalin z silników wysokoprężnych z powodzeniem^{5, 7,8,9,10,11,12}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% buforowany fosforanem formaldehydefiksative	Biosharp, Hefei, Chiny	REF: BL539A
75% etanol	Guoyao, Szanghaj, Chiny	CAS: 64-17-5
Monitor biosygnalizacji BL-420E +	Taimeng, Chengdu, Chiny	BL-420E+
Lampa świecowa	Zhenwei, Dezhou, Chiny	WZ-001
Jednorazowa strzykawka	Zhiyu, Jiangsu, Chiny
Inkubator jaj	Keyu, Dezhou, Chiny	KFX
Bilans elektryczny	OHAUS, Szanghaj, Chiny	224CN
Inkubator elektrotermiczny	Shenxian, Szanghaj, Chiny	DHP-9022
Absolut etanolu	Guoyao, Szanghaj, Chiny	CAS: 64-17-5
Płodne jajo	kurzeJianuo, Jining, Chiny
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny	Beyotime, Pekin, Chiny	C0105
Histologia parafina	Aladyn, Szanghaj, Chiny	P100928-500g	Temperatura topnienia 52 ~ 54° C
Parafina histologiczna	Aladdin, Szanghaj, Chiny	P100936-500g	Temperatura topnienia 62 ~ 64°
Cewnik C IV	KDL, Zhejiang, Chiny		Cewniki muszą być miękkie, plastikowe.
Lentivirus	Genechem, Szanghaj, Chiny		lentiwirusy zostały indywidualnie zaprojektowane/zsyntetyzowane przez Genechem.
Zestaw do barwienia trichromów Massona	Solarbio, Pekin, Chiny	Metalowa sonda G1340
	Jinuotai, Pekin, Chiny
Mikrowtryskiwacz (5 uL)	Anting, Szanghaj, Chiny
	Mikroskop CAIKON, Szanghaj, Chiny	XSP-500
Microtome	Leica, Niemcy	HistoCore BIOCUT
Microtome blade	Leica,Niemcy	Leica 819
Pentobarbitual sodu	Yitai Technology Co. Ltd.,  Wuhan, Chiny	CAS: 57-33-0
Piper (10ul)	Sartorius, Niemcy
Jodek powidonu	Longyuquan, Taian, Chiny
Nożyczki	Anqisheng, Suzhou, Chiny
Sterylna sól fizjologiczna	Kelun, Chengdu, Chiny
Olej słonecznikowy	Mighty Jiage, Jiangsu, Chiny		Każdy komercyjny olej słonecznikowy do spożycia przez ludzi powinien działać
Taśma	M& G, Szanghaj, Chiny
Torba PVF Tedlar (5L)	Delin, Dalian, Chiny
Mikser Vortex	SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US	MX-F
Xylene	Guoyao, Szanghaj, Chiny	CAS: 1330-20-7