Artykuł metodologiczny

Ocena nanokryształów moczu u ludzi za pomocą znakowania fluoroforem wapnia i analizy śledzenia nanocząstek

DOI:

10.3791/62192

⸱

9 lutego 2021

 ,  , 
1Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było ustalenie, czy analiza śledzenia nanocząstek (NTA) może wykryć i określić ilościowo nanokryształy zawierające wapń w moczu od zdrowych dorosłych. Wyniki obecnego badania sugerują, że NTA może być potencjalnym narzędziem do oceny nanokryształów moczu podczas choroby kamicy nerkowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kamienie nerkowe stają się coraz bardziej powszechne na całym świecie u dorosłych i dzieci. Najczęstszym rodzajem kamienia nerkowego są kryształy szczawianu wapnia (CaOx). Krystaluria występuje, gdy mocz ulega przesyceniu minerałami (np. wapniem, szczawianami, fosforanami) i poprzedza tworzenie się kamieni nerkowych. Standardowe metody oceny krystalurii w kamieniach formujących kamień obejmują mikroskopię, filtrację i wirowanie. Jednak metody te wykrywają przede wszystkim mikrokryształy, a nie nanokryształy. Sugeruje się, że nanokryształy są bardziej szkodliwe dla komórek nabłonka nerek niż mikrokryształy in vitro. W tym miejscu opisujemy zdolność analizy śledzenia nanocząstek (NTA) do wykrywania ludzkich nanokryształów moczu. Zdrowi dorośli byli karmieni kontrolowaną dietą szczawianową przed wypiciem ładunku szczawianów w celu stymulacji nanokryształów w moczu. Mocz zbierano przez 24 godziny przed i po obciążeniu szczawianami. Próbki poddano obróbce i przemyto etanolem w celu oczyszczenia próbek. Nanokryształy moczu barwiono fluoroforem wiążącym wapń, Fluo-4 AM. Po barwieniu określono wielkość i liczbę nanokryształów za pomocą NTA. Wyniki tego badania pokazują, że NTA może skutecznie wykrywać nanokrystalurię u zdrowych osób dorosłych. Odkrycia te sugerują, że NTA może być cenną metodą wczesnego wykrywania nanokrystalurii u pacjentów z kamicą nerkową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kryształy moczu powstają, gdy mocz staje się przesycony minerałami. Może to wystąpić u osób zdrowych, ale częściej występuje u osób z kamicą nerkową1. Obecność i nagromadzenie kryształów moczu może zwiększyć ryzyko rozwoju kamieni nerkowych. W szczególności dzieje się tak, gdy kryształy wiążą się z płytką Randalla, zarodkują, gromadzą się i rosną w czasie2,3,4. Krystaluria poprzedza powstawanie kamieni nerkowych, a ocena krystalurii może mieć wartość predykcyjną u osób tworzących kamienie nerkowe3,5. W szczególności zasugerowano, że krystaluria jest przydatna do przewidywania ryzyka nawrotu kamieni u pacjentów z historią szczawianu wapnia zawierającego kamienie6,7.

Kryształy negatywnie wpływają na funkcjonowanie nabłonka nerek i krążących komórek odpornościowych8,9,10,11,12,13. Wcześniej donoszono, że krążące monocyty z postaci szczawianu wapnia (CaOx) tworzących kamienie nerkowe mają stłumioną bioenergetykę komórkową w porównaniu ze zdrowymi osobami14. Ponadto kryształy CaOx zmniejszają bioenergetykę komórkową i zaburzają homeostazę redoks w monocytach8. Spożywanie posiłków bogatych w szczawiany może powodować krystalurię, która może prowadzić do uszkodzenia kanalików nerkowych oraz zmiany produkcji i funkcji makrocząsteczek w moczu, które chronią przed tworzeniem się kamieni nerkowych15,16. Kilka badań wykazało, że kryształy moczu mogą różnić się kształtem i rozmiarem w zależności od pH i temperatury moczu17,18,19. Ponadto wykazano, że białka moczowe modulują zachowanie kryształów20. Daudon et al.19, zaproponowali, że analiza krystalurii może być pomocna w leczeniu pacjentów z kamicą nerkową i w ocenie ich odpowiedzi na terapie. Kilka obecnie dostępnych konwencjonalnych metod oceny obecności kryształów to mikroskopia spolaryzowana21,22, mikroskopia elektronowa23, liczniki cząstek3, filtracja moczu24, evaporation3,5 lub wirowanie21. Badania te dostarczyły cennych informacji na temat kamienia nerkowego w odniesieniu do krystalurii. Jednak ograniczeniem tych metod była niemożność wizualizacji i ilościowego określenia kryształów o wielkości mniejszej niż 1 μm. Kryształy tej wielkości mogą wpływać na wzrost kamieni CaOx poprzez przyczepianie się do płytki Randalla.

Wykazano, że nanokryształy powodują rozległe uszkodzenia komórek nerkowych w porównaniu z większymi mikrokryształami25. Obecność nanokryształów w moczu została zgłoszona za pomocą analizatora nanocząstek26,27. W ostatnich badaniach wykorzystano znakowane fluorescencyjnie sondy bisfosforanowe (alendronian-fluoresceina/alendronian-Cy5) do zbadania nanokryształów za pomocą cytometrii przepływowej w nanoskali28. Ograniczeniem tego barwnika jest to, że nie jest on specyficzny i wiąże się z prawie wszystkimi rodzajami kamieni z wyjątkiem cysteiny. W związku z tym dokładna ocena obecności nanokryształów u osób może być skutecznym narzędziem do diagnozowania krystalurii i/lub przewidywania ryzyka wystąpienia kamieni. Celem tego badania było wykrycie i ilościowe określenie nanokryształów zawierających wapń (o wielkości <1 μm) za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Aby to osiągnąć, zastosowano technologię NTA w połączeniu z fluoroforem wiążącym wapń, Fluo-4 AM, w celu wykrycia i ilościowego określenia nanokryształów wapnia zawierających wapń w moczu zdrowych osób dorosłych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty opisane w tej pracy zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Alabama w Birmingham (UAB). Zdrowi dorośli (33,6 ± 3,3 lat; n=10) zostali włączeni do badania, jeśli mieli prawidłowy kompleksowy panel metaboliczny krwi, nie używali tytoniu, nie byli w ciąży, BMI między 20-30 kg/m2 i nie mieli przewlekłych schorzeń lub ostrych chorób. Zdrowi uczestnicy podpisali pisemny formularz świadomej zgody przed rozpoczęciem badania.

1. Protokół kliniczny i zbieranie moczu

  1. Poproś uczestników, aby spożywali dietę o niskiej zawartości szczawianów przygotowaną przez Centrum Nauk Klinicznych i Translacyjnych UAB Bionutrition Core przez 3 dni i pościli przez noc przed pobraniem moczu (próbka 24-godzinna).
  2. Następnego dnia poproś uczestników, aby zwrócili 24-godzinną próbkę moczu (pre-szczawiany) przed spożyciem ładunku szczawianów (koktajl zawierający owoce i warzywa, ~ 8 mM szczawianów). Następnie poproś uczestników, aby zbierali mocz przez 24 godziny (próbka po szczawianach) i zwracali mocz następnego dnia.
  3. Utrzymuj wszystkie próbki moczu w temperaturze pokojowej (RT) przed przetwarzaniem, jak opisano poniżej i pokazano na Rysunek 1.

2. Przetwarzanie moczu

UWAGA: Wszystkie użyte materiały i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
UWAGA: Podczas pracy z próbkami klinicznymi i odczynnikami należy nosić środki ochrony osobistej. W szczególności rękawice, osłony twarzy i oczu, ochrona dróg oddechowych i odzież ochronna.

  1. Zmierz i zapisz pH i objętość moczu. Dokładnie wymieszaj przed dodaniem 50 ml moczu do oznaczonej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Odwirować próbkę o masie 1200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej.
    UWAGA: Utrzymuj próbkę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się kryształów, ponieważ niższe temperatury mogą sprzyjać krystalizacji.
  3. Wyrzucić sklarowany osad i ponownie przemyć i ponownie zawiesić osad 5 ml 100% etanolu. Odwirować próbkę o masie 1200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 100% etanolu. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C do późniejszego przetwarzania LUB wybarwić próbkę w sposób opisany poniżej.
    UWAGA: Nie ma znaczącej różnicy w punktach danych (tj. wielkości/stężeniu cząstek) między przechowywanymi lub świeżo barwionymi próbkami.

3. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)

  1. Przygotowanie próbki
    1. Nanocząstki złota: Użyj nanocząstek złota, aby zoptymalizować ustawienia w instrumencie. Rozcieńczyć nanocząstki złota o wielkości 100 nm w stosunku 1:1000 w ultraczystej wodzie.
    2. Ludzki mocz: Rozcieńczyć próbki moczu 20 razy w wodzie przed barwieniem 5 mM Fluo-4 AM (barwnik fluorescencyjny wapnia) przez 30 minut w ciemności. Analizować próbki za pomocą NTA.
    3. Przygotuj kryształy szczawianu wapnia (CaOx) zgodnie z wcześniejszym opisem29. Rozcieńczyć 10 mM roztwór podstawowy (14,6 mg w 10 ml wody) do 50 μM w wodzie i zabarwić rozcieńczone próbki za pomocą 5 mM Fluo-4 AM przez 30 minut w ciemności przed analizą.
    4. Kryształy fosforanu wapnia (CaP): Rozcieńczyć 10 mM roztworu podstawowego (50,4 mg w 10 ml wody) do 50 μM w wodzie i zabarwić rozcieńczone próbki za pomocą 5 mM Fluo-4 AM przez 30 minut w ciemności przed analizą NTA.
  2. Konfiguracja przyrządu, ustawienia kamery i gromadzenie danych
    UWAGA: Ustawienia komputera i instrumentu używane w tej metodzie są pokazane na Rysunek 2.
    1. Włącz komputer, a następnie instrument. Otwórz oprogramowanie i włącz aparat.
    2. Po otwarciu okna oprogramowania kliknij ikonę przechwytywania w lewym górnym rogu okna, aby uruchomić tryb przechwytywania. Inicjalizacja kamery trwa kilka sekund.
    3. Wyczyść platformę, najpierw wpompowując do niej powietrze za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aż platforma będzie wyglądać na czystą. Delikatnie dodaj wodę do aparatu 2-3 razy za pomocą kolejnej strzykawki o pojemności 1 ml, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Poszukaj pęcherzyków powietrza na platformie, a także w rurce. Ważne jest, aby w całym aparacie nie było pęcherzyków powietrza przed i w trakcie badania próbek. Jeśli obecne są bąbelki, ponownie wyczyść platformę powietrzem i wodą.
    4. Gdy platforma jest czysta, dolej wody, aby sprawdzić, czy na powierzchni nie ma zanieczyszczeń, patrząc na kamerę. Następnie dodaj nanocząstki złota jako kontrolę do wtryskiwacza pompy ładującej próbkę, aby skonfigurować instrument.
    5. Dostosuj poziom kamery na ekranie lub na pokrętle po prawej stronie instrumentu, aż obraz zacznie wyświetlać kolorowe piksele, a następnie zmniejsz poziom kamery.
    6. Następnie dostosuj ekran, aby zoptymalizować obraz. Kliknij lewym przyciskiem myszy na obrazie wideo. Przytrzymaj lewy przycisk myszy i przeciągnij obraz w górę iw dół, aby wyświetlić cały widok.
      UWAGA: Normalny obiektyw i filtr aparatu służą do oceny nanocząstek złota i niebarwionych próbek.
    7. Ustaw prędkość infuzji i ustaw ostrość aparatu tak, aby nanocząsteczki złota były widoczne na ekranie aparatu. Ustaw prędkość infuzji na wysoką (tj. 500 μl/min) w celu wstępnej konfiguracji, aby zapewnić wykrycie nanocząstek złota. Po wykryciu zmniejsz prędkość do 50 μl/min.
    8. Dostosuj poziom kamery, aby zobrazować cząsteczki. W przypadku próbek niebarwionych wyreguluj wzmocnienie ekranu na poziomie 5, aby uzyskać ostrość kamery, i ustaw poziom kamery na 8. Po ustawieniu ostrości zapisz próbkę (tj. 1 pomiar tylko przez 60 sekund).
      UWAGA: Ostrość i ciągła prędkość przepływu są ważne dla uzyskania wyraźnych i ostrych obrazów cząstek do zliczania.
    9. Po optymalizacji należy ponownie oczyścić aparaturę wodą przed oceną próbek. View z kamery, aby upewnić się, że rurka jest czysta i nie ma w niej cząstek.
      UWAGA: Umyj komorę między każdą próbką, aż kamera nie wykryje żadnych cząstek.
    10. Aby przeanalizować poplamione próbki, ustaw aparat w pozycji filtra zawierającego odpowiedni filtr fluorescencyjny. Załadować rozcieńczone i zabarwione próbki do wtryskiwacza pompy ładującej próbkę i zmniejszyć prędkość do 20 μl/min w celu analizy próbki.
    11. Następnie dostosuj wzmocnienie ekranu i poziom kamery, ponieważ są to ważne parametry. W przypadku próbek barwionych (fluorescencyjnych) ustaw wzmocnienie ekranu na 5, a poziom kamery na poziomie 13.
      UWAGA: Parametry te będą się różnić w zależności od typu próbki i każda próbka będzie musiała zostać zoptymalizowana, aby uzyskać ostrość.
    12. Użyj standardowego pomiaru, aby zmierzyć próbki dla 5 przechwyceń na próbkę, gdzie jeden czas trwania przechwytywania wynosi 60 sekund.
    13. Zapisuj i przechowuj dane po każdym pomiarze. Oprogramowanie zapisze pliki graficzne i wideo dla każdego pomiaru. Oprogramowanie dostarcza dane wyjściowe (np. wielkość kryształu: 10 nM - 1000 nM i koncentracja) zarówno w formacie Excel, jak i PDF.
    14. Oblicz średnią liczbę nanocząstek dla wszystkich 5 odczytów dla każdej pojedynczej próbki. Przeanalizuj dane przy użyciu odchylenia standardowego lub błędu standardowego średniej i użyj testów t do analizy sparowanej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki tego badania pokazują, że NTA może skutecznie wykrywać średnią wielkość i stężenie nanokryształów wapnia zawierających wapń w moczu człowieka. Udało się to osiągnąć dzięki zastosowaniu analizy fluoroforu, Fluo-4 AM i śledzenia nanocząstek. Fluo-4 AM był w stanie wiązać się zarówno z kryształami CaOx, jak i CaP. Jak pokazano w Rysunek 3A, kryształy CaOx zostały określone jako o wielkości od 50 do 270 nm i średnim stężeniu 1,26 x 109 cząstek/ml. Kryształy CaP miały wielkość od 30 do 22...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NTA został wykorzystany w niniejszym badaniu do oceny nanokryształów w ludzkim moczu za pomocą sondy wiążącej wapń, Fluo-4 AM. Nie ma standardowej metody wykrywania nanokryształów w moczu. Niektóre grupy badawcze wykryły nanokryształy w moczu i polegały na zastosowaniu obszernych protokołów lub metod, które mają ograniczoną zdolność do ilościowego oznaczania próbek 27,28. Badanie to przedstawia specyficzną i czułą metodę wykrywania nanokryształów wapnia zawierają...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują wszystkim uczestnikom badania oraz UAB CCTS Bionutrition Core i UAB High Resolution Imaging Service Center za ich wkład. Praca ta była wspierana przez granty NIH DK106284 i DK123542 (TM) oraz UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wirówka stołowaWirówka JouanCR3-12
Monohydrat szczawianu wapniaSyntetyzowany w laboratorium, jak opisano wcześniej29. Przechowywać w RT; Zapas 10 mM
kryształów fosforanu wapnia (nanoproszek hydroksyapatytu)Sigma677418Przechowywać w RT; Zapas 10 mM
etanoluFischer Scientific AC615095000Przechowywać w RT; Stan magazynowy 100%
Fluo-4 AM*AAT Bioquest, Inc.20550Przechowywać w zamrażarce (-20° C); Zapasy 5 mM
Nanocząstki złotaSigma742031Przechowuj w temperaturze 2-8° C
NanoSight InstrumentMalvern Instruments, Wielka BrytaniaNS300
Pompa strzykawkowaHarvard Apparatus98-4730
Virkon DisinfectantLanXESS Energizing Company, NiemcyLSP
* Barwniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło; bulion i porcje należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20& stopni C.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
  2. Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. Kidney International. 64 (6), 2150-2154 (2003).
  3. Robertson, W. G., Peacock, M., Nordin, B. E. Calcium crystalluria in recurrent renal-stone formers. Lancet. 2 (7610), 21-24 (1969).
  4. Robertson, W. G., Peacock, M. Calcium oxalate crystalluria and inhibitors of crystallization in recurrent renal stone-formers. Clinical Science. 43 (4), 499-506 (1972).
  5. Hallson, P. C., Rose, G. A. A new urinary test for stone "activity". British Journal of Urology. 50 (7), 442-448 (1978).
  6. Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
  7. Baumann, J. M., Affolter, B. From crystalluria to kidney stones, some physicochemical aspects of calcium nephrolithiasis. World Journal of Nephrology. 3 (4), 256-267 (2014).
  8. Patel, M., et al. Oxalate induces mitochondrial dysfunction and disrupts redox homeostasis in a human monocyte derived cell line. Redox Biology. 15, 207-215 (2018).
  9. Khan, S. R. Role of renal epithelial cells in the initiation of calcium oxalate stones. Nephron Experimental Nephrology. 98 (2), 55-60 (2004).
  10. Mulay, S. R., et al. Calcium oxalate crystals induce renal inflammation by NLRP3-mediated IL-1beta secretion. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 236-246 (2013).
  11. Umekawa, T., Chegini, N., Khan, S. R. Oxalate ions and calcium oxalate crystals stimulate MCP-1 expression by renal epithelial cells. Kidney International. 61 (1), 105-112 (2002).
  12. Huang, M. Y., Chaturvedi, L. S., Koul, S., Koul, H. K. Oxalate stimulates IL-6 production in HK-2 cells, a line of human renal proximal tubular epithelial cells. Kidney International. 68 (2), 497-503 (2005).
  13. Lu, X. Renal tubular epithelial cell injury, apoptosis and inflammation are involved in melamine-related kidney stone formation. Urological Research. 40 (6), 717-723 (2012).
  14. Williams, J., Holmes, R. P., Assimos, D. G., Mitchell, T. Monocyte Mitochondrial Function in Calcium Oxalate Stone Formers. Urology. 93, 221-226 (2016).
  15. Balcke, P., et al. Transient hyperoxaluria after ingestion of chocolate as a high risk factor for calcium oxalate calculi. Nephron. 51 (1), 32-34 (1989).
  16. Khan, S. R., Kok, D. J. Modulators of urinary stone formation. Frontiers in Bioscience. 9, 1450-1482 (2004).
  17. Rodgers, A., Allie-Hamdulay, S., Jackson, G. Therapeutic action of citrate in urolithiasis explained by chemical speciation: increase in pH is the determinant factor. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 21 (2), 361-369 (2006).
  18. Verplaetse, H., Verbeeck, R. M., Minnaert, H., Oosterlinck, W. Solubility of inorganic kidney stone components in the presence of acid-base sensitive complexing agents. European Urology. 11 (1), 44-51 (1985).
  19. Frochot, V., Daudon, M. Clinical value of crystalluria and quantitative morphoconstitutional analysis of urinary calculi. International Journal of Surgery. 36, London, England. Pt D 624-632 (2016).
  20. Grover, P. K., Thurgood, L. A., Wang, T., Ryall, R. L. The effects of intracrystalline and surface-bound proteins on the attachment of calcium oxalate monohydrate crystals to renal cells in undiluted human urine. BJU International. 105, 708-715 (2010).
  21. Bader, C. A., Chevalier, A., Hennequin, C., Jungers, P., Daudon, M. Methodological aspects of spontaneous crystalluria studies in calcium stone formers. Scanning Microscopy. 8 (2), 215-231 (1994).
  22. Daudon, M., Cohen-Solal, F., Jungers, P. Eurolithiasis. 9th European Symposium on Urolithiasis. , Shaker Publishing. Maastricht. 261-263 (2001).
  23. Werness, P. G., Bergert, J. H., Smith, L. H. Crystalluria. Journal of Crystal Growth. 53 (1), 166-181 (1981).
  24. Fan, J., Chandhoke, P. S. Examination of crystalluria in freshly voided urines of recurrent calcium stone formers and normal individuals using a new filter technique. Journal of Urology. 161 (5), 1685-1688 (1999).
  25. Sun, X. Y., Ouyang, J. M., Yu, K. Shape-dependent cellular toxicity on renal epithelial cells and stone risk of calcium oxalate dihydrate crystals. Scientific Reports. 7 (1), 7250(2017).
  26. He, J. Y., Deng, S. P., Ouyang, J. M. Morphology, particle size distribution, aggregation, and crystal phase of nanocrystallites in the urine of healthy persons and lithogenic patients. IEEE Trans Nanobioscience. 9 (2), 156-163 (2010).
  27. Gao, J., et al. Comparison of Physicochemical Properties of Nano- and Microsized Crystals in the Urine of Calcium Oxalate Stone Patients and Control Subjects. Journal of Nanomaterials. 2014, 9(2014).
  28. Gavin, C. T., et al. Novel Methods of Determining Urinary Calculi Composition: Petrographic Thin Sectioning of Calculi and Nanoscale Flow Cytometry Urinalysis. Scientific Reports. 6, 19328(2016).
  29. Kumar, P., et al. Dietary Oxalate Induces Urinary Nanocrystals in Humans. Kidney International Reports. 5 (7), 1040-1051 (2020).
  30. Carr, B., Hole, P., Malloy, A., Nelson, P., Smith, J. Applications of nanoparticle tracking analysis in nanoparticle research--A mini-review. European Journal of Parenteral Sciences and Pharmaceutical Sciences. 14 (2), 45(2009).
  31. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  32. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
  33. Gercel-Taylor, C., Atay, S., Tullis, R. H., Kesimer, M., Taylor, D. D. Nanoparticle analysis of circulating cell-derived vesicles in ovarian cancer patients. Analytical Biochemistry. 428 (1), 44-53 (2012).
  34. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8171-8178 (1989).
  35. Harkins, A. B., Kurebayashi, N., Baylor, S. M. Resting myoplasmic free calcium in frog skeletal muscle fibers estimated with fluo-3. Biophysical Journal. 65 (2), 865-881 (1993).
  36. Hernandez-Santana, A., Yavorskyy, A., Loughran, S. T., McCarthy, G. M., McMahon, G. P. New approaches in the detection of calcium-containing microcrystals in synovial fluid. Bioanalysis. 3 (10), 1085-1091 (2011).
  37. Tong, M., Brown, O. S., Stone, P. R., Cree, L. M., Chamley, L. W. Flow speed alters the apparent size and concentration of particles measured using NanoSight nanoparticle tracking analysis. Placenta. 38, 29-32 (2016).
  38. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  39. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15, 2101(2013).
  40. Tomlinson, P. R., et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease. Annals of Clinical and Translational Neurology. 2 (4), 353-361 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Powstawanie kamieni nerkowychkryszta y szczawianu wapniawykrywanie krystalurii24 godzinna zbi rka moczunanocz steczki z otaprzemywanie etanolembarwienie Fluo 4 AM

Powiązane artykuły