Celem tego badania było ustalenie, czy analiza śledzenia nanocząstek (NTA) może wykryć i określić ilościowo nanokryształy zawierające wapń w moczu od zdrowych dorosłych. Wyniki obecnego badania sugerują, że NTA może być potencjalnym narzędziem do oceny nanokryształów moczu podczas choroby kamicy nerkowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena nanokryształów moczu u ludzi za pomocą znakowania fluoroforem wapnia i analizy śledzenia nanocząstek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kamienie nerkowe stają się coraz bardziej powszechne na całym świecie u dorosłych i dzieci. Najczęstszym rodzajem kamienia nerkowego są kryształy szczawianu wapnia (CaOx). Krystaluria występuje, gdy mocz ulega przesyceniu minerałami (np. wapniem, szczawianami, fosforanami) i poprzedza tworzenie się kamieni nerkowych. Standardowe metody oceny krystalurii w kamieniach formujących kamień obejmują mikroskopię, filtrację i wirowanie. Jednak metody te wykrywają przede wszystkim mikrokryształy, a nie nanokryształy. Sugeruje się, że nanokryształy są bardziej szkodliwe dla komórek nabłonka nerek niż mikrokryształy in vitro. W tym miejscu opisujemy zdolność analizy śledzenia nanocząstek (NTA) do wykrywania ludzkich nanokryształów moczu. Zdrowi dorośli byli karmieni kontrolowaną dietą szczawianową przed wypiciem ładunku szczawianów w celu stymulacji nanokryształów w moczu. Mocz zbierano przez 24 godziny przed i po obciążeniu szczawianami. Próbki poddano obróbce i przemyto etanolem w celu oczyszczenia próbek. Nanokryształy moczu barwiono fluoroforem wiążącym wapń, Fluo-4 AM. Po barwieniu określono wielkość i liczbę nanokryształów za pomocą NTA. Wyniki tego badania pokazują, że NTA może skutecznie wykrywać nanokrystalurię u zdrowych osób dorosłych. Odkrycia te sugerują, że NTA może być cenną metodą wczesnego wykrywania nanokrystalurii u pacjentów z kamicą nerkową.
Wprowadzenie
Kryształy moczu powstają, gdy mocz staje się przesycony minerałami. Może to wystąpić u osób zdrowych, ale częściej występuje u osób z kamicą nerkową1. Obecność i nagromadzenie kryształów moczu może zwiększyć ryzyko rozwoju kamieni nerkowych. W szczególności dzieje się tak, gdy kryształy wiążą się z płytką Randalla, zarodkują, gromadzą się i rosną w czasie2,3,4. Krystaluria poprzedza powstawanie kamieni nerkowych, a ocena krystalurii może mieć wartość predykcyjną u osób tworzących kamienie nerkowe3,5<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty opisane w tej pracy zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Alabama w Birmingham (UAB). Zdrowi dorośli (33,6 ± 3,3 lat; n=10) zostali włączeni do badania, jeśli mieli prawidłowy kompleksowy panel metaboliczny krwi, nie używali tytoniu, nie byli w ciąży, BMI między 20-30 kg/m2 i nie mieli przewlekłych schorzeń lub ostrych chorób. Zdrowi uczestnicy podpisali pisemny formularz świadomej zgody przed rozpoczęciem badania.
1. Protokół kliniczny i zbieranie moczu
- Poproś uczestników, aby spożywali dietę o niskiej zawartości szczawianów przygotowaną przez Centrum Nauk Kliniczny....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki niniejszego badania wykazują, że NTA może skutecznie wykrywać średnią wielkość i stężenie zawierających wapń nanokryształów w ludzkim moczu. Osiągnięto to dzięki zastosowaniu fluoroforu Fluo-4 AM oraz analizy śledzenia nanocząstek. Fluo-4 AM był w stanie wiązać się zarówno z kryształami CaOx, jak i CaP. Jak pokazano na Rysunku 3A, ustalono, że kryształy CaOx mają wielkość od 50 do 270 nm i średnie stężenie 1,26 x 109 cząstek/mL. Kryształy CaP miały wielkość od 30 do 225 nm .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
NTA został wykorzystany w niniejszym badaniu do oceny nanokryształów w ludzkim moczu za pomocą sondy wiążącej wapń, Fluo-4 AM. Nie ma standardowej metody wykrywania nanokryształów w moczu. Niektóre grupy badawcze wykryły nanokryształy w moczu i polegały na zastosowaniu obszernych protokołów lub metod, które mają ograniczoną zdolność do ilościowego oznaczania próbek 27,28. Badanie to przedstawia specyficzną i czułą metodę wykrywania nanokryształów wapnia zawierają.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują wszystkim uczestnikom badania oraz UAB CCTS Bionutrition Core i UAB High Resolution Imaging Service Center za ich wkład. Praca ta była wspierana przez granty NIH DK106284 i DK123542 (TM) oraz UL1TR003096 (National Center for Advancing Translational Sciences).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wirówka stołowa | Wirówka Jouan | CR3-12 | |
| Monohydrat szczawianu wapnia | Syntetyzowany w laboratorium, jak opisano wcześniej29. | Przechowywać w RT; Zapas 10 mM | |
| kryształów fosforanu wapnia (nanoproszek hydroksyapatytu) | Sigma | 677418 | Przechowywać w RT; Zapas 10 mM |
| etanolu | Fischer Scientific AC615095000 | Przechowywać w RT; Stan magazynowy 100% | |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Przechowywać w zamrażarce (-20° C); Zapasy 5 mM |
| Nanocząstki złota | Sigma | 742031 | Przechowuj w temperaturze 2-8° C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, Wielka Brytania | NS300 | |
| Pompa strzykawkowa | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Niemcy | LSP | |
| * Barwniki fluorescencyjne są wrażliwe na światło; bulion i porcje należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20& stopni C. |
Bibliografia
- Fogazzi, G. B. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 11 (2), 379-387 (1996).
- Kuo, R. L. Urine calcium and volume predict coverage of renal papilla by Randall's plaque. <....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
