Artykuł metodologiczny

Monitorowanie aktywności elastazy neutrofilowej i katepsyny G w próbkach ludzkiej plwociny

21.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62193

⸱

21 maja 2021

 ,  ,  , 
1Translational Lung Research Center Heidelberg (TLRC), German Center for Lung Research (DZL), 2Dept. of Translational Pulmonology, University of Heidelberg, 3Molecular Medicine Partnership Unit (MMPU), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), University of Heidelberg, 4Faculty of Biosciences, Collaboration for Joint Ph.D. Degree between EMBL and Heidelberg University, University of Heidelberg, 5Dept. of Pediatric Pulmonology, Immunology and Critical Care Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 6Berlin Institute of Health (BIH), 7German Center for Lung Research (DZL), Associated Partner Site, Berlin, 8Dept. of Chemical Physiology and Biochemistry, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane tutaj protokoły dostarczają przewodnika do wizualizacji i ilościowego określenia aktywności proteaz neutrofilowych w ludzkiej plwocinie. Zastosowania takiej analizy obejmują zarówno ocenę leczenia przeciwzapalnego, jak i walidację biomarkerów, badania przesiewowe leków i badania kliniczne na dużych kohortach.

Streszczenie

Proteazy są regulatorami niezliczonych procesów fizjologicznych, a dokładne badanie ich działania pozostaje intrygującym wyzwaniem biomedycznym. Wśród ~ 600 proteaz kodowanych przez ludzki genom, proteazy neutrofilowe seryny (NSP) są dokładnie badane pod kątem ich udziału w wystąpieniu i progresji stanów zapalnych, w tym chorób układu oddechowego. Wyjątkowo, wydzielane NSP nie tylko dyfundują w płynach zewnątrzkomórkowych, ale także lokalizują się w błonach plazmatycznych. Podczas tworzenia pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) NSP stają się integralną częścią wydzielanej chromatyny. Tak złożone zachowanie sprawia, że zrozumienie patofizjologii NSP jest trudnym zadaniem. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe protokoły wizualizacji, ilościowego określania i rozróżniania aktywności elastozy neutrofilowej (NE) i katepsyny G (CG) w próbkach plwociny oraz wolnych i związanych z błoną neutrofilów. NE i CG są NSP, których aktywność pełni plejotropową rolę w patogenezie mukowiscydozy (CF) i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP): promują przebudowę tkanek, regulują dalszą odpowiedź immunologiczną i korelują z ciężkością choroby płuc. Protokoły pokazują, jak oddzielić frakcję płynną i komórkową, a także izolować neutrofile z ludzkiej plwociny w celu ilościowego określenia aktywności enzymatycznej za pomocą małocząsteczkowych reporterów opartych na rezonansie Förstera (FRET). Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat względnej roli aktywności NE i CG, odczyt FRET można zmierzyć za pomocą różnych technologii: i) pomiary in vitro za pomocą czytnika płytek pozwalają na wysokoprzepustowe i masowe wykrywanie aktywności proteazy; ii) mikroskopia konfokalna czasoprzestrzennie rozwiązuje aktywność związaną z błoną na powierzchni komórki; iii) małocząsteczkowa cytometria przepływowa FRET umożliwia szybką ocenę leczenia przeciwzapalnego poprzez kwantyfikację aktywności proteazy jednokomórkowej i fenotypowanie. Wdrożenie takich metod otwiera drzwi do zbadania patobiologii NSP i ich potencjału jako biomarkerów ciężkości choroby w przypadku mukowiscydozy i POChP. Biorąc pod uwagę ich potencjał standaryzacyjny, solidny odczyt i prostotę transferu, opisane techniki można natychmiast udostępnić do wdrożenia w laboratoriach badawczych i diagnostycznych.

Wprowadzenie

Elastaza neutrofilowa (NE), katepsyna G (CG), proteinaza 3 (PR3) i proteaza seryny neutrofilowej 4 (NSP4) to cztery proteazy neutrofilowe seryny (NSPs)1. Są one przechowywane, wraz z mieloperoksydazą, w granulkach pierwotnych lub azurofilowych neutrofili. Ze względu na podwyższoną zawartość proteolityczną wydzielanie pierwotnych granulek jest ściśle regulowane, a neutrofile muszą być sekwencyjnie prowokowane za pomocą bodźców pobudzających i aktywujących2.

Wewnątrz fagolizosomu NSP funkcjonują jako wewnątrzkomórkowe środki bakteriobójcze3. Po wydzieleniu NSP stają się silnymi mediatorami stanu zapalnego: rozszczepiają cytokiny i receptory powierzchniowe, aktywując równoległe szlaki prozapalne3. Co ważne, stany zapalne charakteryzują się niekontrolowanym wydzielaniem NSP. Na przykład w obrębie stanów zapalnych dróg oddechowych nadmierna aktywność NE powoduje nadmierne wydzielanie śluzu, metaplazję komórek kubkowych, inaktywację CFTR i przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej4,5. Katepsyna G uczestniczy również w stanach zapalnych: w szczególności rozszczepia i aktywuje dwa składniki rodziny IL-1, IL-36α i IL-36β6. W połączeniu z NE, CG rozszczepia receptory aktywowane proteazą na nabłonku dróg oddechowych, a także aktywuje TNF-α i IL-1β.

Endogenne antyproteazy, takie jak alfa-1-antytrypsyna, alfa-1-antychymotrypsyna i inhibitor proteazy wydzielniczej, regulują aktywność elastazy neutrofilowej i katepsyny G5. Jednak w trakcie postępu choroby płuc ciągłe wydzielanie proteaz przekracza stechiometrycznie tarczę antyproteazową, prowadząc do nieustępującej neutrofilii w drogach oddechowych, pogorszenia stanu zapalnego i uszkodzenia tkanek5,7. Chociaż wykazano, że stężenie i aktywność NE w rozpuszczalnych frakcjach dróg oddechowych pacjenta jest obiecującym biomarkerem ciężkości choroby8, NE i CG wiążą się również z błoną plazmatyczną neutrofili i zewnątrzkomórkowym DNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne9,10, gdzie stają się mniej dostępne dla antyproteaz. Co ważne, w badaniach przedklinicznych zdefiniowano scenariusz, w którym aktywność proteazy związana z powierzchnią komórki pojawia się wcześniej i/lub niezależnie od jej rozpuszczalnego odpowiednika4,11. W rzeczywistości, aby stać się wykrywalną, wolna aktywność proteazy musi najpierw przytłoczyć tarczę antyproteazową. Zamiast tego, na powierzchni komórki, aktywność proteazy związanej z błoną pozostaje przynajmniej częściowo nienaruszona z powodu niedostępności dużych inhibitorów dla błony komórkowej plazmatycznej12. Tak złożone zachowanie proteazy ma ważne konsekwencje dla początku i rozprzestrzeniania się zapalenia za pośrednictwem neutrofili, dlatego musi być badane za pomocą precyzyjnych i pouczających narzędzi.

Z biegiem lat, sondy oparte na transferze energii rezonansu (FRET) Förster znalazły liczne zastosowania biomedyczne jako narzędzia, które skutecznie i szybko oceniają specyficzną aktywność proteazy w próbkach ludzkich13. Aby funkcjonować, reportery proteazy składają się z motywu rozpoznawania (tj. peptydu), który jest rozpoznawany przez enzym docelowy i opiera się na FRET, procesie fizycznym, w którym po wzbudzeniu fluorofor donorowy przekazuje energię cząsteczce akceptorowej. Przetwarzanie zachodzące w enzymie na reporterze, a mianowicie rozszczepienie części rozpoznającej, powoduje, że akceptor dyfunduje z dala od dawcy: aktywność enzymu jest zatem mierzona jako zależna od czasu zmiana dawcy w stosunku do fluorescencji akceptora. Taki odczyt jest samonormalizujący się i ratiometryczny, a zatem warunki środowiskowe, takie jak pH i lokalne stężenie sondy, mają na niego tylko marginalny wpływ. NEmo-114 i sSAM15 to sondy FRET, które raportują konkretnie aktywność NE i CG, odpowiednio. Jednak takie reportery nie lokalizują się specyficznie w żadnym przedziale komórkowym, dlatego są wykorzystywane do monitorowania aktywności proteazy obecnej w ludzkich płynach. Aby monitorować aktywność proteazy w sposób przestrzennie zlokalizowany, wraz z innymi opracowaliśmy sondy FRET, które łączą się ze składnikami subkomórkowymi za pomocą znaczników molekularnych14,15,16,17,18,19. Taka syntetyczna strategia pozwoliła na opracowanie NEmo-2 i mSAM, dwóch sond FRET wyposażonych w kotwice lipidowe, które lokalizują się w błonie plazmatycznej. Autorzy ci przyczynili się do głębszego zrozumienia proteaz NE i CG w mukowiscydozie i przewlekłych obturacyjnych chorobach płuc14,15.

Tutaj dostępne są szczegółowe protokoły wizualizacji i kwantyfikacji rozpuszczalnych i związanych z błoną aktywności NE i CG w ludzkiej plwocinie za pomocą sond FRET serii NEmo i SAM. Aby zająć się różnymi aspektami patofizjologii NSP i zapewnić szereg metod, które można zastosować w zależności od potrzeb użytkownika, przedstawiono analizę za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej, mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Protokół

Poniższe protokoły opisują analizę przeprowadzoną na ludzkiej plwocinie. Postępowanie z próbkami ludzkimi zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną Uniwersytetu w Heidelbergu i uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów lub ich rodziców/opiekunów prawnych (S-370/2011) i zdrowych osób z grupy kontrolnej (S-046/2009).

UWAGA: Poniższe protokoły opisują przygotowanie próbki i kwantyfikację aktywności proteaz neutrofilowych seryny (NSP). Przedstawione tutaj procedury eksperymentalne koncentrują się na pomiarze aktywności ludzkiej plwociny i elastazy neutrofilowej 14,20,21 (NE) lub katepsyna G15 (CG). Jednak niewielkie adaptacje w protokole przygotowania próbki umożliwiają analizę komórek pochodzących z krwi i homogenatów guza. Ponadto aktywność metaloproteinazy macierzy 12 i katepsyny S można badać w podobny sposób za pomocą dedykowanych sond FRET22,23,24,25,26.

1. Przygotowanie próbki: izolacja komórek i separacja supernatantu

UWAGA: Jeśli to możliwe, leczenie plwociny powinno być przeprowadzone w ciągu 120 minut po odkrztuszaniu, a plwocina powinna być przechowywana na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.

  1. Jeśli spontaniczne odkrztuszanie plwociny nie jest możliwe, wyindukuj plwocinę zgodnie z wcześniejszym opisem19. Krótko wdychać 200 μg antagonisty receptora β-2 salbutamolu przed rozpoczęciem procedury indukcji plwociny. Następnie wdychaj hipertoniczny (6%) roztwór soli fizjologicznej przez 15 minut za pomocą nebulizatora. Zbierz odkrztuszoną plwocinę na szalce Petriego.
  2. Oddziel grudki śluzu ze śliny na szalkę Petriego za pomocą końcówki pipety.
  3. Zważ śluz.
    UWAGA: Średnia masa próbki śluzu wynosi 0,8 g (waha się od 0,1 g do 5 g); Do wykonania wymienionych zabiegów zwykle wystarcza 0,1 g.
  4. Dodaj 4 części (v/w) 10% sputolizyny (w PBS) do plwociny (na przykład: 4 ml 10% sputolizyny na każdy gram plwociny).
    UWAGA: Sputolizyna składa się ze skoncentrowanego ditiotreitolu w buforze fosforanowym, dlatego należy obchodzić się z nią ostrożnie.
  5. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) na kołyszącym się wytrząsarce przez 15 minut, aby rozpuścić śluz. Ze względów bezpieczeństwa należy umieścić wytrząsarkę w dygestorium.
  6. Ugasić reakcję, dodając tę samą objętość zimnego PBS (na przykład: 1 ml zimnego PBS na każdy ml 10% sputolizyny).
  7. Mieszać pipetując do uzyskania jednorodnego roztworu.
  8. Przefiltrować mieszaninę przez sitko z nylonu o średnicy 100 μm do probówki o pojemności 50 ml.
  9. Powtórz etap filtracji przez sitko nylonowe o średnicy 40 μm.
  10. Odwirowywać roztwór przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
  11. Ostrożnie przenieść frakcję sklarowaną nad osadem do świeżej probówki i przechowywać ją na lodzie.
    UWAGA: Frakcje supernatantu mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu dalszej analizy.
  12. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 500 μl zimnego PBS i umieścić go na lodzie.
    UWAGA: Frakcja komórkowa musi zostać natychmiast przetworzona.

2. Pomiar aktywności proteazy neutrofilowej seryny

UWAGA: Tutaj wprowadzane są różne metody ilościowego określania aktywności NSP za pomocą reporterów FRET. Wybór technologii jest podyktowany konkretnym pytaniem biomedycznym i celem eksperymentu. Zaprezentowane sondy zostały gruntownie przetestowane pod kątem ich specyficzności w odniesieniu do zestawu enzymów istotnych dla płuc14,15. Chociaż sondy są specyficzne dla docelowego enzymu, zawsze sprawdzaj swoistość sondy na interesującej nas próbce klinicznej. Można to osiągnąć poprzez inkubację próbki ze specyficznym inhibitorem proteazy przed dodaniem sondy, co powinno znieść jakikolwiek wzrost stosunku D/A.

  1. Kwantyfikacja aktywności rozpuszczalnych NSP za pomocą testu fluorymetru lub czytnika płytek
    UWAGA: Aktywność proteazy w rozpuszczalnych frakcjach próbki można wykryć za pomocą dowolnego przyrządu zdolnego do wykrywania fluorescencji.
    1. Rozmrozić enzymy na lodzie.
    2. Do czasu użycia należy przechowywać NE i CG w kwaśnym buforze do przechowywania (50 mM octan sodu, 200 mM NaCl, pH 5,5), aby zapobiec samorozszczepieniu.
    3. Aby ustawić krzywą wzorcową enzymu, należy przygotować seryjne rozcieńczenie enzymu w stosunku 1:2 (33,9 - 0,271 nM dla NE; 42,6 - 0,333 nM dla CG) w buforze aktywacyjnym (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl przy pH 7,5). Bufor aktywacyjny ma neutralne pH, dzięki czemu kataliza enzymatyczna może przebiegać efektywnie.
      1. Aby przygotować najwyższe stężenie wzorcowe (stężenie NE: 33,9 nM), należy rozcieńczyć 1 μL NE (33,9 μM) w 999 μL buforu aktywacyjnego.
      2. Aby przygotować drugi wzorzec (stężenie NE: 16,95 nM), należy zmieszać 200 μl pierwszego rozcieńczenia z 200 μl buforu aktywacyjnego.
      3. Postępuj odpowiednio, aby przygotować pozostałe rozcieńczenia 1:2.
      4. Ostatni wzorzec, którym jest ślepa próba, składa się z czystego bufora aktywacyjnego. Zaleca się pomiar duplikatów technicznych lub potrójnych egzemplarzy. Podczas przygotowywania wzorca i próbki należy starać się, aby fiolki były na lodzie.
    4. Równolegle z preparatem wzorcowym rozcieńczyć próbki plwociny w buforze aktywacyjnym. Rozcieńczyć próbki ludzkie przed oceną ich aktywności proteazy, aby pozostać w liniowym zakresie wzrostu sygnału reporterowego (stosunek dawcy do akceptora). Gdyby próbki pacjenta pozostały nierozcieńczone, rozszczepienie nastąpiłoby zbyt szybko, aby można było je wiarygodnie dopasować. Ponieważ zdrowa plwocina dawcy zawiera mniej aktywnych proteaz w porównaniu z próbkami pobranymi od pacjentów z mukowiscydozą i POChP, na ogół wykonuje się różne rozcieńczenia (1:10 dla zdrowego supernatantu plwociny, 1:20-500 dla supernatantu plwociny u pacjentów z POChP lub mukowiscydozą).
      UWAGA: W celu ilościowego pomiaru aktywności proteazy w próbkach, w których jej stężenie jest nieznane, należy zmierzyć równolegle krzywą wzorcową ze znanymi stężeniami enzymów, najlepiej na tej samej płytce. Stężenie aktywnego enzymu w ludzkiej plwocinie oblicza się poprzez interpolację nachyleń zmierzonych w próbkach ludzkiej plwociny z tymi zmierzonymi za pomocą krzywych standardowych.
    5. Przed przygotowaniem próbek do pomiaru należy skonfigurować przyrząd. Ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy NE FRET (NEmo-114) na 354 nm i ustaw długość fali detekcji na 400 nm dla donora i 490 nm dla akceptora. Ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy CG FRET (sSAM15) na 405 nm i ustaw emisję na 485 (donor) i 580 nm (akceptor).
    6. Dodać 40 μl próbek, wzorcowych lub ślepych, do studzienek czarnej 96-dołkowej płytki o połowie powierzchni.
    7. Aby przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą reportery (stężenie reportera w mieszance wzorcowej: 10 μM), należy rozcieńczyć materiał sondy (1 mM w DMSO) w stosunku 1:100 w buforze aktywacyjnym. Przygotować potrzebną objętość mieszanki wzorcowej, mnożąc 10 μl x liczbę wymaganych dołków na płytki. Aby osiągnąć optymalne stężenie końcowe (2 μM) do pomiaru fluorescencji reporterów NEmo-1 i sSAM, należy dodać 10 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki (zawierającej 40 μl próbki, wzorca lub próby ślepej) i rozpocząć odczyt. Reportery NEmo-1 i sSAM będą zatem monitorować odpowiednio aktywność rozpuszczalnej elastazy neutrofilowej i katepsyny G.
      UWAGA: Jeśli wstrzykiwacz odczynnika nie jest dostępny, należy rozpocząć odczyt tak szybko, jak to możliwe po dodaniu reportera do próbek.
    8. Rozpocznij pomiar czytnikiem płytek i zapisuj wzrost stosunku dawca do akceptora co 60-90 sekund przez co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy wzrost sygnału osiągnie plateau.
    9. Po wyeksportowaniu danych oblicz stosunek dawcy/akceptora (stosunek D/A), dzieląc względne jednostki fluorescencji dawcy (RFU) przez RFU akceptora dla każdego punktu czasowego i próbki.
    10. Obliczyć średni stosunek cyfr do przejęć i odchylenie standardowe każdej próbki.
    11. Określ nachylenie w obrębie liniowego wzrostu zmiany współczynnika C/A. Nachylenie jest wskaźnikiem szybkości rozszczepienia enzymu dla sondy FRET. Obliczyć stężenie aktywnego enzymu w plwocinie, dopasowując nachylenia regresji liniowej uzyskane z próbek ludzkich z nachyleniami obliczonymi na podstawie wzorca enzymu.
  2. Kwantyfikacja aktywności NSP związanych z błoną za pomocą fluorymetru lub czytnika płytek
    1. Wyizoluj komórki plwociny, jak opisano powyżej. Zawiesić 3 x 104 komórki w objętości 40 μl PBS. Dodaj komórki do czytnika płytek.
    2. Skonfiguruj instrument. Ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy NE FRET związanej z membraną (NEmo-214) na 405 nm i ustaw długość fali wykrywania na 485 nm dla donora i 580 nm dla akceptora. Ustaw długość fali wzbudzenia dla sondy CG FRET z membraną (mSAM15) na 405 nm i ustaw emisję na 485 (donor) i 580 nm (akceptor).
    3. Aby przygotować mieszankę wzorcową zawierającą reportery, należy rozcieńczyć masę sondy w buforze aktywacyjnym do stężenia 10 μM. Przygotować potrzebną objętość mieszanki wzorcowej, mnożąc 10 μl X liczbę wymaganych studzienek na płytki. Aby osiągnąć optymalne stężenie końcowe (2 μM) do pomiaru fluorescencji reporterów NEmo-2 i mSAM, należy dodać 10 μl mieszanki głównej do każdej studzienki (zawierającej 40 μl próbki, wzorca lub próby ślepej) i rozpocząć odczyt. Reportery NEmo-2 i mSAM będą zatem monitorować odpowiednio aktywność elastazy neutrofilowej związanej z błoną i katepsyny G.
      UWAGA: Komórkowa kontrola ujemna może być stosowana, na przykład komórki, które nie wydzielają aktywnie NSP. Na przykład inkubacja reporterów z 3 x 104 progenitorami leukocytów HL-60 promielocytów stanowi ważną kontrolę negatywną rozszczepienia.
    4. Rejestruj zmianę stosunku dawcy do akceptora przez co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy wzrost sygnału osiągnie plateau. Przeanalizuj dane zgodnie z powyższym opisem.
  3. Pomiar aktywności NSP związanych z błoną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
    1. Określ liczbę warunków, które należy przeanalizować.
      UWAGA: Dla każdego pomiaru próbki plwociny zaleca się przygotowanie i analizę dodatkowej kontroli dodatniej (PC) i ujemnej (NC).
    2. Dla każdego pomiaru należy ponownie zawiesić 3 x 104 komórki plwociny w objętości 50 μl PBS w probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Jako kontrolę ujemną inkubować komórki plwociny ze specyficznym inhibitorem (Sivelestat, swoisty inhibitor NE lub inhibitor katepsyny G I, swoisty inhibitor CG, w końcowym stężeniu 100 μM). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Jako kontrolę pozytywną inkubować komórki plwociny z odpowiednim enzymem (NE lub CG odpowiednio przy 340 nM lub 200 nM) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 50 μl PBS zawierającego reporter FRET i barwienie jądrowe (w końcowym rozcieńczeniu 1:1000) do każdej probówki (komórki poddane kontroli dodatniej, komórki poddane kontroli ujemnej i komórki niepoddane działaniu kontroli dodatniej) w celu osiągnięcia końcowego stężenia sondy 2 μM. Inkubować przez 10-20 minut w temperaturze RT.
      WAŻNE: Dodanie barwnika jądrowego ułatwia obrazowanie mikroskopią fluorescencyjną, ponieważ pozwala na wyszukiwanie interesujących komórek plwociny bez użycia kanałów sondy FRET, a tym samym unika wybielania reporterowego. Ponadto barwienie DNA pozwala na segmentację komórek plwociny zgodnie z kształtem ich jądra. Na przykład neutrofile można łatwo zidentyfikować po ich jądrach wielopłatkowych. Można również uzyskać dodatkowe informacje na temat żywotności komórek (neutrofile z bardziej segmentowanym jądrem mają większe szanse na przeżycie).
      UWAGA: Oprócz funkcji związanej z błoną, aktywność NE lub CG związanego z DNA w ludzkiej plwocinie może być mierzona w ten sam sposób za pomocą H-NE i H-CG, zewnątrzkomórkowych sond FRET kojarzących DNA27. Podczas przygotowywania mieszanki wzorcowej, H-NE i H-CG można dodać w stężeniu 10 μM i inkubować z plwociną przed przygotowaniem cytospiny i szkiełka. Kwantyfikacja stosunku D/A na zewnątrzkomórkowym DNA przebiega identycznie jak w przypadku NEmo-2 i mSAM, z tą różnicą, że zewnątrzkomórkowe agregaty DNA są segmentowane, a nie pojedyncze komórki27.
    6. Ugasić reakcję, dodając 100 μl lodowatego PBS i przenieść próbki na lód.
    7. Cytowirować mieszaninę na szkiełkach mikroskopowych, wysuszyć na powietrzu, utrwalić lodowatym metanolem 10% przez 10 minut, wysuszyć na powietrzu i zamocować odpowiednim medium montażowym.
      UWAGA: Szkiełka mikroskopowe można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do jednego miesiąca do czasu dalszej analizy.
    8. Uzyskuj obrazy mikroskopowe za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem olejowym PL APO 40x lub 63x. Aby zwiększyć jakość obrazu i skrócić czas akwizycji, zalecany jest tryb sekwencyjnej akwizycji obrazu.
      1. Najpierw zobrazuj plamę jądrową poprzez wzbudzenie 633 nm za pomocą linii hel-neon-laser i zarejestruj jej emisję między 650 a 715 nm.
      2. Zapisać dawcę (kumarynę 343) reportera FRET między 470 a 510 nm po wzbudzeniu przy 458 nm za pomocą lasera argonowego. Uzyskać uczuloną emisję akceptora (5,6-TAMRA) między 570 a 610 nm po wzbudzeniu jedynego donora.
      3. Zarejestrować bezpośrednią emisję akceptora w oddzielnym kanale między 470 a 510 nm po optymalnym wzbudzeniu akceptora przy 561 nm za pomocą lasera na ciele stałym pompowanym diodą (DPSS).
      4. Ustaw otwór na początku eksperymentu i utrzymuj go w trakcie sesji obrazowania.
        UWAGA: Ze względu na ich niewielkie rozmiary, w celu prawidłowej wizualizacji neutrofili zaleca się użycie obiektywu mikroskopowego 40x lub 63x. Zazwyczaj obrazy są pozyskiwane w kilku następujących po sobie kanałach, zaczynając od dłuższej długości fali wzbudzenia, aby zapobiec fotowybielaniu reportera podczas akwizycji.
    9. Wyobraź sobie co najmniej 100 komórek na warunek, aby uzyskać rozstrzygające statystyki. Do analizy obrazów mikroskopowych należy użyć odpowiedniego oprogramowania: podzielić komórki na segmenty i obliczyć współczynnik cyfrowo-analogowy piksel po pikselu, a następnie obliczyć średnią lub medianę danego obszaru zainteresowania, który jest wybierany ręcznie przez użytkownika. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, zobacz Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy i kwantyfikacja aktywności NE związanej z błoną na neutrofilach wyizolowanych z plwociny pacjenta z mukowiscydozą. a) Reprezentatywne obrazy mikroskopii konfokalnej neutrofili wstępnie inkubowanych (górny panel) przez 10 minut z 100 μM Sivelestat (w/) lub pozostawionych nieleczonych (w/o) (dolny panel) przed dodaniem reportera NEmo-2 (2 μM). Pierwsza kolumna od lewej pokazuje barwienie jądrowe, druga kanał donorowy, trzecia kanał akceptorowy, a ostatnia obliczony stosunek D/A uzyskany przez podzielenie kanałów donorowych i akceptorowych na zasadzie piksel po pikselu. Granice obszaru zainteresowania (pojedynczy neutrofil) są przedstawione jako linia przerywana. Wskazana jest skala (10 μm) i paski kalibracyjne (stosunek D/A). b) Wykresy pudełkowe i kropkowe przedstawiające stosunek D/A neutrofili plwociny od reprezentatywnego pacjenta z mukowiscydozą. Komórki inkubowane z inhibitorem i nieleczone są pokazane odpowiednio w kolorze szarym i niebieskim. Każda kropka reprezentuje jedną komórkę (N: w/ inhibitor = 113 i w/o inhibitor = 96). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pomiar aktywności NSP związanych z błoną za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Zawiesić 1 x 106 komórek w 100 μl PBS w probówce okrągłodennej z polistyrenu FACS o pojemności 5 ml i umieścić probówkę na lodzie.
    2. Do badania neutrofili plwociny należy użyć następujących przeciwciał: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) i CD66b (1:50). Przygotować wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla wszystkich próbek. Umieść mieszankę wzorcową na lodzie w ciemności.
    3. Ustaw strategię bramkowania zgodnie z opisem w Rysunek 2. Neutrofile są bramkowane jako zdarzenia 7AAD-CD45 + CD14-CD16 + CD66b +. Zdarzenia bramkowane zostaną następnie przeanalizowane pod kątem ich aktywności proteazy związanej z błoną dla ich dawcy (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) i akceptora (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) średnich intensywności fluorescencji (MIF).
    4. Dodać 2 μl FcBlock do każdej próbki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodaj wybrane przeciwciała do każdej probówki i inkubuj przez 30 minut na lodzie w ciemności.
    6. Przemyć komórki, dodając 2 ml zimnego PBS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g i 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl zimnego PBS.
    7. Podzielić 200 μl na dwie probówki po 100 μl każda i dodać 5 μl roztworu barwiącego żywotność komórek do każdej probówki. Umieść probówki na lodzie.
    8. Dodać odpowiedni specyficzny inhibitor NSP (dla NE należy użyć Sivelestat w stężeniu końcowym 225 μM, dla CG należy użyć inhibitora katepsyny G I w stężeniu 100 μM) do probówki kontroli ujemnej (NC). Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
    9. Dodać 100 μl zimnego PBS do próbki, przefiltrować ją przez filtr 40 μm w czystej probówce FACS, aby zapobiec zatkaniu instrumentu.
    10. Dodać reporter (dla NE, NEmo-2 o końcowym stężeniu 4 μM, dla CG, mSAM o stężeniu końcowym 2 μM) do próbki NC, delikatnie przemieszać rurkę.
    11. Rozpocznij pobieranie komórek inkubowanych ze specyficznym inhibitorem, aby nieznacznie dostosować, jeśli to konieczne, bramki, a także napięcia PMT reportera.
    12. Zapisz co najmniej 1000 neutrofili. Przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Chociaż można zarejestrować więcej zdarzeń, 1000 komórek zapewnia dobry kompromis między właściwymi statystykami a czasem nagrywania.
    13. Postępuj odpowiednio z poniższymi probówkami (niepoddanymi działaniu substancji próbkami plwociny).
    14. Aby zarejestrować zmiany w stosunku D/A spowodowane aktywnością proteazy związanej z błoną, rejestruj 1000 neutrofili z każdej probówki co 5 do 10 minut.
      UWAGA: Po udanym rozszczepieniu reportera FRET, intensywność MIF kanału darczyńcy będzie z czasem wzrastać. Intensywność MIF w kanale akceptorowym powinna z czasem zmniejszać się lub utrzymywać na stałym poziomie.
    15. Obliczyć współczynnik FRET, dzieląc donor przez wartości kanału akceptorowego dla próbek mierzonych na bramkowanych żywotnych pojedynczych neutrofilach.
    16. Normalizuj pomiary próbek, dzieląc je przez odpowiedni punkt czasowy 0 min (dla reprezentatywnych wyników i analizy, patrz Rysunek 2).
      UWAGA: Rejestracja co najmniej dwóch punktów czasowych (tj. 0 i 10 minut) jest niezbędna do dynamicznego pomiaru zmiany współczynnika cyfrowo-analogowego. Aby znormalizować pomiar aktywności dla każdej próbki, stosunek cyfrowo-analogowy zmierzony w późniejszych punktach czasowych (np. 10 min) dzieli się przez stosunek obliczony bezpośrednio po dodaniu sondy (0 min).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Strategia bramkowania i reprezentatywne wykresy aktywności NE związanej z błoną mierzoną na neutrofilach wyizolowanych z plwociny pacjenta z mukowiscydozą.a) Do wysiewania neutrofili plwociny stosuje się następujące przeciwciała: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) i CD66b (1:50). Neutrofile są bramkowane jako zdarzenia 7-AAD-CD45 + CD14-CD16 + CD66b +. Zdarzenia bramkowane są analizowane pod kątem ich dawcy (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) i akceptora (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) średnich intensywności fluorescencji (MIF). b) Reprezentatywne histogramy neutrofili plwociny CF analizowane pod kątem ich aktywności NE związanej z błoną. Lewa kolumna pokazuje sygnał dawcy, prawa kolumna pokazuje sygnał akceptora. Górny rząd pokazuje średnie intensywności fluorescencji komórek poddanych działaniu Sivelestat (w/) przez 10 minut przed dodaniem reportera. Dolny rząd pokazuje nietraktowane (w/o) komórki, których fluorescencja reporterowa jest mierzona natychmiast (0 min, szary) i 10 minut (niebieski) po dodaniu reportera. Neutrofile są bramkowane zgodnie ze strategią przedstawioną w panelu a. c) Tabela danych przedstawia reprezentatywny zestaw danych składający się z surowych MFI dla sygnału dawcy i akceptora na neutrofilach mierzonych w kilku punktach czasowych (0-3-5-10-15-20 min), a także obliczonego stosunku D/A. Współczynnik cyfrowo-analogowy można znormalizować, tj. do punktu czasowego 0 min (biała czcionka). 0 min oznacza zapis wykonany tak szybko, jak to możliwe po dodaniu reportera do rurki przepływowej z barwionymi komórkami plwociny. Dane MIF są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe dla 1000 neutrofili. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Wyniki pokazane w Rysunek 1a ilustruje reprezentatywny zestaw danych mikroskopowych. Sygnał jądrowy służy do identyfikacji neutrofili na podstawie ich charakterystycznych segmentowanych jąder. Obszar zainteresowania (ROI) jest wybierany ręcznie (linia przerywana w Rysunek 1a). Obraz współczynnika cyfrowo-analogowego oblicza się, dzieląc intensywność kanału donorowego przez intensywność kanału akceptorowego piksel po pikselu. W ostatnim kroku obliczany jest średni współczynnik C/A na komórkę (ROI). W Rysunek 1b każda kropka reprezentuje średnią jednego ROI (neutrofilów). Zaleca się obrazowanie i ocenę około 100 komórek na stan.

Reprezentatywna strategia bramkowania cytometrii przepływowej jest pokazana w Rysunek 2a. Takie bramkowanie pozwala na rozróżnianie i badanie neutrofili plwociny. Aby uniknąć rozlewania się fluorescencji lub artefaktów kompensacji, zaleca się poświęcenie linii laserowej (np. niebieskiego lasera) do wykrywania fluorescencji sondy FRET. Kompensacja fluorescencji cytometrii przepływowej powinna być wykonywana dla przeciwciał, a nie dla sondy FRET. Rysunek 2b przedstawia rozkład MFI po 0 i 10 minutach od dodania raportu. Każdy wiersz w Rysunek 2c wskazuje średnie wartości MIF dawcy i akceptora dla 1000 neutrofili plwociny. Wskaźnik dojrzałości i przejęć oblicza się, dzieląc MIF udzielającego i akceptującego. Przebieg czasowy w klasie Rysunek 2c po prawej stronie pokazuje postęp pomiaru: po szybkim początkowym wzroście stosunek D/A osiąga plateau, zgodnie z aktywnością enzymu związanego z błoną.

Dyskusja

Przedstawione protokoły wyjaśniają różne podejścia do ilościowego określania aktywności elastazy neutrofilowej i katepsyny G w próbkach ludzkiej plwociny. Punktami krytycznymi dla udanego pomiaru aktywności enzymatycznej są i) precyzyjny czas i standaryzacja procedury operacyjnej oraz ii) zastosowanie wiarygodnych kontroli negatywnych i pozytywnych. Jeśli te warunki są spełnione, opisane metody nie ograniczają się do plwociny, ale można je również łatwo dostosować do analizy aktywności proteazy we krwi, płynach z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych i skrawkach tkanek lub homogenatach.

Każda z trzech technik ma swoje mocne i słabe strony, które często wzajemnie się uzupełniają. Na przykład cytometria przepływowa pozwala na szybką analizę rzadkich populacji komórek, a także fenotypowanie komórek, ale brakuje informacji o rozdzielczości przestrzennej, które można uzyskać za pomocą mikroskopii. Zamiast tego pomiary czytnika płytek pozwalają na równoległą ocenę kilku próbek lub warunków w sposób wysokoprzepustowy. Ponieważ świeże komórki plwociny nie mogą być zamrażane i przechowywane, te trzy metody wymagają, aby próbki były przetwarzane szybko po odkrztuszaniu. Ogranicza to elastyczność lub przepustowość pomiarów aktywności związanej z membraną. Opracowanie protokołu cytometrii przepływowej, który pozwala na utrwalenie komórek po dodaniu sondy i rozszczepieniu enzymatycznym, otworzyłoby drogę do równoległego pomiaru większej liczby probówek. Ponadto należy zwrócić szczególną uwagę na obsługę i przechowywanie sond FRET. W rzeczywistości niektóre aminokwasy obecne w substracie peptydowym, takie jak metionina, ulegają utlenianiu, co prowadzi do zmniejszenia wrażliwości reportera. Aby wydłużyć okres trwałości reportera (szacowany na około trzy miesiące w temperaturze 20 °C), można je przechowywać w porcjach o małej objętości (1–2 μl) w atmosferze gazu obojętnego, takiego jak azot lub argon.

W mukowiscydozie i innych przewlekłych chorobach zapalnych płuc ważne jest jak najwcześniejsze wykrycie stanu zapalnego, a wiarygodne biomarkery mogą osiągnąć ten cel. Możliwość wykrycia aktywności NSP związanych z powierzchnią, która okazała się szkodliwa dla otaczających tkanek, również w warunkach, gdy nie ma lub występuje niewielka aktywność wolnego NE, dodaje kolejny poziom cennych informacji, który jest trudny do osiągnięcia za pomocą innych istniejących metod 4,11.

Reportery mogą być wykorzystane do zbadania związku związanej z błoną aktywności NSP z ciężkością i postępem choroby płuc, zwłaszcza na wczesnym początku. Metody te mogą być wykorzystywane do monitorowania skuteczności leczenia (np. leczenia przeciwzapalnego lub wysoce skutecznych modulatorów i potencjatorów CFTR28) i badania wynikającego z tego tłumienia zapalenia wywołanego przez neutrofile. Ponadto protokoły opierają się na nieinwazyjnych procedurach pobierania próbek, które niosą ze sobą bardzo niskie ryzyko dla pacjenta, a zatem mogą być stosowane na bardzo szeroką skalę i otwierają drzwi do wielu ekscytujących zastosowań.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez granty z niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań (FKZ 82DZL004A1 dla M.A.M) oraz Niemieckiej Fundacji Badawczej (SFB-TR84TP B08 dla M.A.M). Prace opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez Niemieckie Centrum Badań Płuc (DZL) i EMBL Heidelberg poprzez stypendium doktoranckie dla M.G. Dziękujemy J. Schatterny'emu, S. Butzowi i H. Scheuermannowi za fachową pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 &mikro; m Nylonowe sitko komórkoweCorning Inc.
2300 EnSpire (Czytnik Multilabel)Talerz PerkinElmer
35x10mm, Nunclon DeltaThermo Fisher Scientific150318
40 µ m Nylonowe sitko komórkoweCorning Inc.431750
Probówki 50 mlSarstedt10535253
7-AAD, barwnik żywotnościBio Legend4204045 µ L/100 &mikro; L
BalanceOHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.PR124
BD Falcon Probówki okrągłodenne 5 mlBD Bioscience352054
BD LSRFortessa analizator komórekBD Bioscience
płaska płaska 96-dołkowa płytka półpowierzchniowaCorning Life Science3694
Katepsyna GProdukty elastynowe FirmaSG623
Inhibitor katepsyny G IMerck KGaA219372
Wirówka 5418REppendorf AGEP5401000137
Combitips advanced 1,0 mlEppendorf AG0030 089 430
cKompletny inhibitor proteinazyRoche11697498001
Ulepszone komory Countig NeubauerGlaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG40442
szkiełka nakrywkowe i Oslash; 25mmThermo Fisher ScientificMENZCB00250RA003
Cytospin 4Thermo Fisher Scientific
DRAQ5 (plama jądrowa)BioStatus LimitedDR500501:10000
Oprogramowanie FACSDiva, v8.0.1BD Bioscience
FcBlockBD Bioscience564219
Fidżi (Fidżi to tylko ImageJ)fiji.sc
Oprogramowanie Flow Jo, wtyczka v10TreeStar
FluoQ, v3-97
Heraeus Megafuge 16RThermo Fisher Scientific
Plwocina ludzka Leukocyty ElastazaProdukty FirmaSE563
Mikroskop konfokalny Leica SP8Leica Microsystems
Mini Rock-ShakerPEQLAB Biotechnologie GmbHMR-1
mysz anty-ludzka CD14, Pe-Cy7, klon M5E2BD Bioscience557742 Lot:82219831:50
mysz anty-ludzka CD16, AF700, klon 3G8BD Bioscience557820 Lot:82087911:50
mysz anty-ludzka CD45, APC-Cy7, klon 2D1BD Bioscience557833 Lot:80596881:33
mysz anty-ludzka CD66b, PE/Dazzel 594, klon G10F5BioLegend305122 Lot:B241921 1:50
mSAMw domu2 mM
Multipette plusEppendorf AG
NEmo-1SiChemSC-02001 mM
NEmo-2ESiChemSC-02012 mM
Pari Boy SX z odrzutowcem LC Sprint nebulizatorPari085G3001
sól fizjologiczna buforowana fosforanemGibco10010-015
ROTI Histokitt (medium montażowe)Carl Roth GmbH + Co.KG6638.1
SalbutamolTeva GmbH
SivelestatCayman Chemicals17779
SputolysinCalbiochem560000-1SET
sSAMw domu2 mM
Prowadnice adhezyjne SuperFrost PlusThermo Fisher Scientific10149870
Trypan Blue roztwórSigma-AldrichT8154
431752

Bibliografia

  1. Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
  2. Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448(2014).
  3. Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  4. Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
  5. McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
  6. Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
  7. Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
  8. Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
  9. Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
  10. Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  11. Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
  12. Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
  13. Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
  14. Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
  15. Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
  16. Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
  17. Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
  18. Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490(2018).
  19. Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
  20. Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355(2020).
  21. Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910(2018).
  22. Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
  23. Hu, H. -Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
  24. Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
  25. Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25(2016).
  26. Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
  27. Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
  28. Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno elastazy neutrofilowejserynowe proteazy neutrofilowetest z reporterem FRETcytometria przep ywowamikroskopia konfokalnapomiary czytnikiem p ytekbiomarkery mukowiscydozyproteazy w chorobach dr g oddechowych

Powiązane artykuły