Method Article

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

DOI:

10.3791/62196

⸱

June 9th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedicine, Basel University Hospital, 2Department of Life Sciences, University of Ferrara, 3Department of Anesthesia, Basel University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zidentyfikowano ponad 700 wariantów genu RYR1 u pacjentów z różnymi zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, w tym podatnością na hipertermię złośliwą, miopatiami rdzeniowymi i miopatią centronuklearną. Ze względu na różnorodne fenotypy związane z mutacjami RYR1 zasadnicze znaczenie ma scharakteryzowanie ich efektów funkcjonalnych, sklasyfikowanie wariantów przenoszonych przez pacjentów do przyszłych interwencji terapeutycznych i identyfikacja wariantów niepatogennych. Wiele laboratoriów było zainteresowanych opracowaniem metod funkcjonalnego charakteryzowania mutacji RYR1 ulegających ekspresji w komórkach pacjentów. Takie podejście ma wiele zalet, w tym: mutacje są wyrażane endogennie, RyR1 nie ulega nadmiernej ekspresji, unika się stosowania heterologicznych komórek eksprymujących RyR1. Ponieważ jednak pacjenci mogą wykazywać mutacje w różnych genach oprócz RYR1, ważne jest, aby porównać wyniki z materiału biologicznego od osób będących nosicielami tej samej mutacji, o różnym pochodzeniu genetycznym. Niniejszy manuskrypt opisuje metody opracowane do badania funkcjonalnych skutków endogennie eksprymowanych wariantów RYR1 w: (a) wirusie Epsteina-Barra unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz (b) komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni i zróżnicowanych w miotuby. Następnie monitorowane są zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia wywołane dodaniem farmakologicznych aktywatorów RyR1. Wybrany typ komórki jest ładowany ratiometrycznym fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, a zmiany wewnątrzkomórkowe [Ca2+] są monitorowane na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub w populacjach komórek za pomocą spektrofluorometru. Spoczynkowe [Ca2+], agonistyczne krzywe odpowiedzi na dawkę są następnie porównywane między komórkami zdrowych osób z grupy kontrolnej a pacjentami z wariantami RYR1, co prowadzi do wglądu w efekt funkcjonalny danego wariantu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory w populacji ludzkiej zidentyfikowano ponad 700 wariantów RYR1, które są powiązane z różnymi zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, w tym złośliwą podatnością na hipertermię (MHS), rabdomiolizą wywołaną wysiłkiem fizycznym, chorobą centralnego rdzenia (CCD), chorobą wielordzeniową (MmD), miopatią centronuklearną (CNM)1,2,3; Niemniej jednak badania mające na celu scharakteryzowanie ich efektów funkcjonalnych są opóźnione i tylko około 10% mutacji zostało przetestowanych funkcjonalnie. Do oceny wpływu danego wariantu RyR1 można zastosować różne podejścia eksperymentalne, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane poniżej protokoły są zgodne z wytycznymi etycznymi Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Przygotowanie unieśmiertelnionych linii komórkowych limfocytów B Epsteina Barra11

  1. Po wyrażeniu świadomej zgody należy pobrać 30 ml krwi pełnej w sterylnych probówkach traktowanych EDTA od probanta z mutacją RYR1 oraz od zdrowych członków rodziny bez mutacji.
    UWAGA: Utrzymuj wszystkie roztwory w sterylności i pracuj w kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Wyizolować komórki jednojądrzaste z krwi pełnej za pomocą pożywki wirowej w gradiacji gęstości (np. Ficoll-Hypaque, 0,077 g / l). ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[Ca2+]i pomiary w populacjach limfocytów B unieśmiertelnionych przez EBV
Pierwotne limfocyty B wyrażają izoformę RyR1, która działa jako kanał uwalniania Ca2 + podczas procesów sygnalizacyjnych stymulowanych przez receptor antygenu komórek B17. Unieśmiertelnienie limfocytów B za pomocą EBV, procedura rutynowo stosowana przez genetyków w celu uzyskania linii komórkowych zawieraj.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły opisane w tym artykule zostały z powodzeniem wykorzystane przez kilka laboratoriów do badania wpływu mutacji RYR1 na homeostazę wapnia. Kluczowe etapy podejść przedstawionych w tym artykule dotyczą bezpłodności, umiejętności i technik hodowli komórek oraz dostępności materiału biologicznego. Zasadniczo zastosowanie unieśmiertelnionych przez EBV limfocytów B jest prostsze i pozwala na generowanie linii komórkowych zawierających zmutowane kanały RyR1. Komórki można zamrażać i przechowywać w ciekłym azocie przez w.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca opisana w tym manuskrypcie była wspierana przez granty ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNF) i Szwajcarskiej Fundacji Mięśniowej.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-m-krezolFluka24940
Probówki do pobierania krwiSarstedt172202
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7906
kofeinaMerk102584
Cascade 125+ Kamera CCDFotometria
Kaskada 128+ CCDFotometria
KreatynaSigma-AldrichC-3630
DMEMThermoFisher Scientific11965092
DMSOSigma41639
EGTAFluka3778
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Sigma-AldrichE9644
Ficoll PaqueCytiva17144002
Surowica cielęca płoduThermoFisher Scientific26140079
Fura-2/AMInvitrogen Life SciencesF1201
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050061
HEPESThermoFisher Scientific15630049
Serum dla koniThermo Fisher Scientific16050122
InsulinaThermoFisher ScientificA11382II
IonomycynaSigmaI0634
KClSigma-AldrichP9333
LamininThermoFisher Scientific23017015
LanthanumFluka61490
System mikroperfuzjiALA-ScientificDAD VM 12
Oprogramowanie OriginOprogramowanieOriginLab Corp
Pennicylina/StreptomycynaGibco Life Sciences15140-122
Komora perfuzyjna POC-RPecon000000-1116-079
poli-L-lizynaSigma-AldrichP8920
RPMI21875091ThermoFisher Scientific
Perkin ElmerLS50
ThapsigarginCalbiochem586005
Naczynia do hodowli tkankowychFalcon353046
Kolba do kultur tkankowychFalcon353107
Wkładki do kultur tkankowychFalcon353090
Roztwór trypsyny/EDTAThermoFisher Scientific25300054
VisiviewVisitron Systems GmbHOprogramowanie
Mikroskop telewizyjny Zeiss Axiovert S100Carl Zeiss AG
Szkiełka nakrywkowe szklane ZeissCarl Zeiss AG0727-016
Wyspa zaworowa Spektrofluorymetr RPMI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
  2. Klein, A., et al. Clinical and genetic findings i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RYR1 VariantsCalcium HomeostasisIntracellular CalciumFluorescence MicroscopySpectrofluorometer AnalysisB LymphocytesHuman MyotubesFura 2 AMDose Response CurveMalignant Hyperthermia

Related Articles