Artykuł metodologiczny

Badania białek w błonach naturalnych w wysokiej rozdzielczości za pomocą NMR w stanie stałym

DOI:

10.3791/62197

⸱

3 marca 2021

 ,  ,  ,  , 
1NMR Spectroscopy, Bijvoet Centre for Biomolecular Research, Department of Chemistry, Faculty of Science, Utrecht University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca szczegółowo opisuje podstawowe procedury przygotowania próbek białek błonowych znakowanych izotopowo i analizowania ich w wysokiej rozdzielczości za pomocą nowoczesnych metod spektroskopii NMR w stanie stałym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe są niezbędne do funkcjonowania komórek, a zatem stanowią ważne cele leków. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym (ssNMR) oferuje unikalny dostęp do badania struktury i dynamiki takich białek w błonach biologicznych o rosnącej złożoności. W niniejszej pracy przedstawiono nowoczesną spektroskopię NMR w stanie stałym jako narzędzie do badania struktury i dynamiki białek w naturalnych błonach lipidowych oraz w skali atomowej. Takie badania spektroskopowe korzystają z zastosowania metod ssNMR o wysokiej czułości, tj. ssNMR z detekcją protonów (1H) i ssNMR wspieranych przez DNP (dynamiczna polaryzacja jądrowa). Wykorzystując białko beta-beczkowe błony zewnętrznej bakterii BamA i kanał jonowy KcsA, przedstawiamy metody wytwarzania białek błonowych znakowanych izotopowo oraz uzyskiwania informacji strukturalnych i ruchowych za pomocą ssNMR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania strukturalne i ruchotwórcze białek błonowych w fizjologicznie istotnych środowiskach stanowią wyzwanie dla tradycyjnych technik biologii strukturalnej1. Nowoczesne metody spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym (ssNMR) oferują unikalne podejście do charakterystyki białek błonowych2,3,4,5,6,7 i od dawna jest używany do badania białek błonowych, w tym pomp białkowych osadzonych w błonie8, channels9,10,11, lub receptors12,13,14,15. Postęp techniczny, taki jak ultra-wysokie pola magnetyczne >1,000 MHz, częstotliwości wirowania pod szybkim magicznym kątem >100 kHz oraz techniki hiperpolaryzacji16 ugruntowały pozycję ssNMR jako potężnej metody badania białek błonowych w środowiskach o stale rosnącej złożoności, od liposomów po błony komórkowe, a nawet całe komórki. Na przykład, DNP stał się potężnym narzędziem do takich eksperymentów (zobacz reference17,18,19,20,21,22,23,24,25). Od niedawna ssNMR wykryty przez 1H oferuje coraz większe możliwości badania białek błonowych w wysokiej rozdzielczości spektralnej i czułości25,26,27,28,29. W pracy zwrócono uwagę na dwa bakteryjne białka błonowe, które są zaangażowane w podstawowe funkcje, tj. insercję białek i transport jonów. Odpowiednie białka, BamA25,30,31,32,33 i KcsA23,27,28,34,35,36,37,38,39 (lub jego chimeryczne warianty10,40) są badane metodami ssNMR od ponad dekady.

Reprezentatywny protokół przygotowania i charakterystyki ssNMR białek błonowych pochodzenia bakteryjnego jest prezentowany tutaj. Poszczególne kroki protokołu są pokazane w Rysunek 1. Po pierwsze, wyjaśniono wyrażanie, znakowanie izotopowe, oczyszczanie i odtwarzanie błonowe BamA. Następnie przedstawiono ogólny przebieg pracy w celu scharakteryzowania białka błonowego za pomocą ssNMR; w szczególności przypisanie szkieletów białek błonowych za pomocą ssNMR wykrytego przez 1H przy szybkim wirowaniu pod magicznym kątem. Na koniec szczegółowo omówiono podstawową konfigurację i akwizycję eksperymentów wspieranych dynamiczną polaryzacją jądrową (DNP), które znacznie zwiększają czułość sygnału ssNMR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja jednolicie oznakowanych 2H, 13C, 15N znakowanych BamA-P4P5

UWAGA: Chociaż ten protokół wymaga pracy z niepatogennymi bakteriami Gram-ujemnymi, przestrzeganie podstawowych procedur bezpieczeństwa biologicznego jest koniecznością, a mianowicie noszenie okularów ochronnych, fartuchów laboratoryjnych, rękawic i przestrzeganie instytucjonalnych standardowych procedur operacyjnych dotyczących pracy z mikroorganizmami.

  1. Użyj pojedynczej kolonii E. coli BL 21 Star (DE3) zawierającej plazmid pET11aΔssYaeT kodujący E. coli BamA-P4P5, aby zaszczepić 50 ml bulionu lizogenicznego uzupełnionego 50 μg/l ampicyliny.
  2. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C przy 200 obr./min, aż do osiągnięcia OD600 równej 0,6. Wirować z prędkością 2 000 x g przez 10 minut. Zawiesić osad w 50 ml M9 (patrz Tabela 1) do maksymalnej średnicy zewnętrznej600 wynoszącej 0,1.
    UWAGA: Wszystkie przyszłe etapy uprawy odbywają się w warunkach określonych powyżej, chyba że zaznaczono inaczej.
  3. Uprawiaj kulturę do OD600 0,5. Wirować w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 50 ml M9 zawierającym 90%D2O(patrz Tabela 1 dla receptury) do maksymalnej średnicyOD 600 0,1. Hodować kulturę przez noc w temperaturze 30 °C przy 200 obr./min.
  4. Odwiruj kulturę w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w podgrzanym 50 ml 90% D2O M9 do maksymalnej średnicy zewnętrznej600 0,1. Rosnąć, aż zostanie osiągnięty OD600 równy 1,0.
  5. Odwiruj kulturę w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować 100 ml pożywki 100% D2O M9 z wzbogaconymi izotopami ilościami niewzbogaconej glukozy i chlorku amonu. Zawiesić ponownie w podłożu 100% D2O M9 do maksymalnej średnicy zewnętrznej600 wynoszącej 0,1. Rosnąć, aż zostanie osiągnięty OD600 równy 0,7.
  6. Odwiruj kulturę w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 ml 100% pożywki D2O M9 z izotopami (patrz tabela 1) do maksymalnej wartości OD600 wynoszącej 0,1.
  7. Pozwól kulturze rosnąć, aż zostanie osiągnięty OD600 0,6-0,9. Indukować za pomocą 1 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Odciągać pokarm przez 4 godziny i zbierać komórki w temperaturze 4 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

2. Oczyszczanie, ponowne fałdowanie i tworzenie proteo-liposomów BamA-P4P5

UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji powinny być wykonywane pod wyciągiem. Należy zachować szczególną ostrożność podczas otwierania probówek po odwirowaniu, ponieważ ogranicza to szkodliwe aerozole.

  1. Rozmrozić granulki na lodzie. Zawiesić osad w 20 ml zimnego buforu 1. znajdują się w tabeli 2.
  2. Odwirowywać roztwór o sile 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 20 ml destylowanego na zimnoH2O. Pozostawić zawiesinę do inkubacji na lodzie przez 10 minut.
  3. Odwirowywać zawiesinę w temperaturze 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w 10 ml zimnego buforu 2 i pozostawić do inkubacji na lodzie przez 30 minut.
  4. Uzupełnij mieszaninę dodatkowymi 10 ml zimnego buforu 2 i inkubuj przez kolejne 30 minut na lodzie. Dodaj 0,5% n-dodecylo-B-D-maltozydu (DDM) i delikatnie zamieszaj.
  5. Sonikować próbkę na lodzie z częstotliwością 13 kHz, aż do impulsów włączania/wyłączania o długości 10 sekund. Wirować w temperaturze 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć trzykrotnie 20 ml buforu 3. Wirować przy 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zawiesić osad w 20 ml buforu 4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Sonikować próbkę na lodzie z częstotliwością 13 kHz, aż do uzyskania 10-sekundowych impulsów włączania/wyłączania.
  7. Odwirować próbkę o masie 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć czynności 2,4-2,6, pomijając dodawanie inhibitora proteazy i inkubację w temperaturze 37 °C.
  8. Przemyć granulki 20 ml wody i dwukrotnie buforem 3. Wirować w dół przy 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesinę rozdzielić na 1 ml probówek do mikrowirówek i obracać probówki do mikrowirówek z maksymalną prędkością w wirówce stołowej przez 20 minut. Czystość ciała inkluzji jest oceniana za pomocą 10% żelu SDS-Page, patrz Rysunek 2A. Oczekiwana wydajność dla oczyszczonego BamA-P4P5 trzykrotnie (2H, 13C, 15N) znakowanego wynosi 30 mg/L.
  9. Rozpuść ciała inkluzyjne w 200 μl buforu 5 i 300 μlH2O. Dodać 6M chlorek guanidu (GdnCl). Dostosować objętość probówki do mikrowirówki do 1 ml zH2O. Zmieszać mieszaninę i inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Okresowo wirować probówki do mikrowirówek (co 30 minut).
  10. Wirować w temperaturze 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Użyj prawa Beera-Lamberta, aby określić stężenie białka o długości fali 280 nm. Współczynnik ekstynkcji molowej wynosi 117 120 M-1 cm-1. Jeśli stężenie wynosi >100 μM, rozcieńczyć 1x buforem 5 z 6 M GdnCl. Szybko rozcieńczyć białko 10x w buforze 6. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Do ultrawirowania należy używać probówek o pojemności 1.5 ml do ultrawirowania.
  11. Określ wydajność ponownego składania za pomocą półnatywnego żelu SDS-Page. Pobrać dwie podwielokrotności po 10 μl z kroku 2.10 i dodać 10 μl buforu Lameili (buforu 8) do każdej podwielokrotności. Gotować jedną próbkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C; Pozostałą podwielokrotność pozostawić na lodzie. Następnie uruchom obie próbki w temperaturze 14 mA na 10% żelu SDS-Page. Części żeli do układania w stosy i do biegania nie zawierają środka redukującego i SDS. Barwienie białek uzyskuje się za pomocą barwnika Coomassie. Oczekiwane wyniki są pokazane w Rysunek 2B.
  12. Odwirowywać próbkę w temperaturze 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zagęścić próbkę do objętości roboczej 8 ml za pomocą filtra odśrodkowego o sile 30 kDa. Wirować próbkę w temperaturze 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zmierzyć absorbancję białka przy 280 nm. Podobnie jak w kroku 2.10, określ stężenie białka.
  13. Obliczyć ilość lipidów wymaganą do uzyskania stosunku lipidów do białka wynoszącego 10:1 (LPR-mol/mol). Z wywaru chloroformowego dodać wymaganą ilość lipidów, jak obliczono w kroku 2.12, do kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml (RBF). Usunąć chloroform z RBF pod delikatnym strumieniem azotu. Umieść RBF na wysokiej próżni na 3 godziny. Uwodnić płaszcz lipidowy za pomocą 1 ml buforu 7. Inkubować RBF przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  14. Dodaj mieszaninę białek (z kroku 2.12) do RBF.
  15. Rozcieńczyć mieszaninę białko/lipid (od etapu 2.14) do końcowej objętości 50 ml w RBF. Stosować bufor 7 uzupełniony 1x inhibitorem proteazy rozpuszczonym w DMSO i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  16. Dializować w stosunku do 100 objętości buforu 7 przez 2 tygodnie (użyć rurki dializacyjnej o masie cząsteczkowej 12-14 kDa). Przez pierwsze 24 godziny należy wykonywać dializę w temperaturze pokojowej z dodatkiem świeżego buforu 7 co 8 godzin. Następnie należy zmieniać bufor raz na dobę i przeprowadzać dializę w temperaturze 4 °C.

3. Napełnianie wirnika ssNMR

  1. Po kroku 2.16 odwirować przez 30-60 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C, aby powstał osad. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
    UWAGA: Technika omówiona poniżej została zoptymalizowana dla wirnika 3.2 mm, ale ma zastosowanie do prawie każdej średnicy wirnika.
  2. Pobrać pipetę próbki do wirnika i delikatnie odwirować ją za pomocą wirówki stołowej.
    UWAGA: W zależności od konsystencji próbki można użyć narzędzia do zagęszczania próbki w celu zagęszczenia lub szpatułki zamiast pipety w celu umieszczenia próbki w wirniku.
  3. Powtórz ten proces 2-3 razy, aż wirnik zostanie napełniony do odpowiedniej wysokości i sprawdź, czy pozostało wystarczająco dużo miejsca na nasadkę, jak wskazuje linia znacznika na narzędziu do zagęszczania. Zamknij wirnik za pomocą narzędzia do pozycjonowania nasadki na równej powierzchni. Zaznacz połowę dolnej krawędzi wirnika.
    UWAGA: Nowe generacje wirników ssNMR są wyposażone w trwały znacznik laserowy na dolnej krawędzi do optycznego wykrywania częstotliwości wirowania wirnika. W przeciwnym razie sugeruje się użycie pióra Sharpie; ponieważ detektor MAS został zoptymalizowany specjalnie pod kątem atramentu sharpie.
  4. Użyj szkła powiększającego, aby sprawdzić, czy nasadka jest dobrze umieszczona.

4. Charakterystyka próbki za pomocą spektroskopii 2D 13C- 13C ssNMR

  1. Włóż wirnik do magnesu, korzystając z automatycznej procedury wirowania jednostki MAS, zakręć próbkę do żądanej częstotliwości MAS w zakresie od 10 do 20 kHz MAS, jednocześnie schładzając próbkę do ustawionej temperatury 270 K. Dostrój i dopasuj kanały 1H i 13C.
    UWAGA: Przy wyborze częstotliwości MAS należy unikać przypadkowego dopasowania odległości przesunięcia chemicznego między obszarem widmowym Cα a obszarem węgla karbonylowego do częstotliwości wirowania, tj. unikać warunku rezonansu rotacyjnego pierwszego rzędu41.
  2. Zoptymalizuj eksperyment zpolaryzacją krzyżową 1 H-13C42 (CP), zmieniając moc RF na kanale protonowym od 25 do 80 kHz. Typowe parametry to zasilanie RF 45 kHz przy 13C, 80-100 kHz heterojądrowe 1H-decoupling43 podczas akwizycji, opóźnienie recyklingu 1,8-2,0 s i 64 skanowania.
    1. Zoptymalizuj czas kontaktu CP, aby uzyskać maksymalną czułość sygnału na alifatycznych węglach.
    2. Określ długość impulsu 1H 90° w eksperymencie 13C-CP, mnożąc impuls początkowy przez cztery, tj. optymalizując impuls 360°, i zmieniaj długość, aż sygnał zniknie. Uwzględnij impuls prostokątny bezpośrednio po transferze CP i zoptymalizuj analogicznie długość impulsu 13C 90°.
  3. Przeprowadź eksperyment 2D 13 C-13C z dyfuzją spinową sterowaną protonami (PDSD), taki jak PARIS, z czasem transferu namagnesowania 30 ms, aby wykryć korelacje wewnątrzresztkowe i ocenić jakość próbki. Przenieś poziomy mocy, czas kontaktu i długości impulsów 90° z wcześniej zoptymalizowanego eksperymentu 13C-CP. Użyj czasu akwizycji 4-6 ms w wymiarze pośrednim. Przetwarzaj widmo za pomocą kwadratowych funkcji dzwonka sinusa (QSIN) lub, w przypadku próbek niewrażliwych, wykładniczego poszerzania linii w obu wymiarach.
  4. Wyodrębnij wycinki izolowanych szczytów poprzecznych i określ szerokość linii w połowie wysokości. Szerokość linii między ~0,3-1,0 13C ppm wskazuje na dobrze uporządkowaną próbkę, idealną do charakterystyki ssNMR, podczas gdy szerokość linii powyżej 1,0 13C ppm wskazuje na niejednorodność konformacyjną, która może zagrozić charakterystyce ssNMR. Widmo 2D CC PARIS BamA pokazane w Rysunek 3A jest przykładem dobrze uporządkowanego białka, które daje wysokiej jakości widma.

5. Przypisanie szkieletu za pomocą spektroskopii 3D ssNMR z detekcją 1H

  1. Akwizycja spektralnych odcisków palców 2D NH
    1. Umieścić próbkę w wirniku o średnicy 1,3 mm, jak opisano powyżej. Włóż wirnik do magnesu, obróć próbkę do 10-20 kHz MAS i schłodzić próbkę do ustawionej temperatury 240-250 K lub niższej, w zależności od specyfikacji głowicy sondy ssNMR. Użyj interfejsu jednostki MAS, aby stopniowo zwiększać częstotliwość MAS w krokach od 5 kHz do 60 kHz MAS.
    2. Zoptymalizuj amplitudy CP, czasy kontaktu i długości impulsów 90° w eksperymentach CP 13C i 15N. Użyj amplitud około 30-50 lub 70-100 kHz na kanałach heterojądrowych i zmieniaj amplitudę na kanale H 1od 80-180 kHz. Użyj opóźnienia recyklingu wynoszącego 0,7-1,2 s, wraz z 15 kHz heterojądrowym rozpranianiem protonów o małej mocy44. Zobacz także reference45, aby uzyskać więcej praktycznych informacji na temat konfiguracji eksperymentów CP ssNMR.
    3. Przeprowadź eksperyment 2D NH, aby ocenić rozdzielczość 1H. Przenieś 15parametrów N-CP i wykorzystaj czas akwizycji około 15 i 25 ms w wymiarach bezpośrednim i pośrednim. Dla pierwszego transferu od 1H do 15N CP należy zastosować wcześniej zoptymalizowany czas kontaktu. W przypadku transferu wstecznego od 15N do 1H należy użyć czasu kontaktu 0,7-1,0 ms, aby zminimalizować międzyszczątkowe przenoszenie namagnesowania.
    4. Użyj 50-250 ms tłumienia wody MISSISSIPPI46, w zależności od zawartości wody w próbce. Przetwarzaj widmo za pomocą kwadratowych funkcji dzwonka grzechu (QSIN) w obu wymiarach. Wyodrębnij wycinki izolowanych szczytów poprzecznych i określ szerokość linii w połowie wysokości. Przykład wysokiej jakości widma 2D NH25 jest pokazany dla wbudowanego w membranę BamA-P4P5 w Rysunek 3B.
  2. Przypisania sieci szkieletowej
    1. Zoptymalizuj eksperyment CP specyficzny dla 1D 15N do 13Cα47. Umieść nośnik 13C w środku obszaru Cα około 55 ppm. Użyj amplitudy 13C rf 20 kHz i zmieniaj amplitudę 15N od 35 do 45 kHz, aby uzyskać maksymalny transfer do sygnałów Cα i minimalny transfer do sygnałów karbonylowych. Zoptymalizuj czas kontaktu od 3 do 10 ms w krokach co 1 ms.
    2. Uruchom eksperyment 3D CαNH. Przenieś wszystkie amplitudy CP, czasy kontaktu i długości impulsów z wcześniej zoptymalizowanych kroków. Użyj około 10 ms i 30 ms w wymiarach akwizycji pośredniej i bezpośredniej. Przetwarzaj widmo za pomocą kwadratowych funkcji dzwonka grzechu (QSIN) we wszystkich trzech wymiarach.
    3. Zoptymalizuj transfer namagnesowania 1D Cα do CO DREAM48. Zacznij od transferu CP od 15N do 13Cα. Następnie przenieś namagnesowanie z Cα na CO za pomocą blokady wirowania na kanale 13C. Zmieniaj amplitudę RF od 20 do 35 kHz, aby uzyskać optymalny transfer. Zoptymalizuj czas transferu od 4 do 10 ms.
    4. Przeprowadzenie eksperymentu 3D Cα(CO)NH. Przenieś wszystkie amplitudy RF, czasy kontaktu i długości impulsów z wcześniej zoptymalizowanych kroków. Użyj około 10 ms i 30 ms w wymiarach akwizycji pośredniej i bezpośredniej. Przetwarzaj widmo za pomocą kwadratowych funkcji dzwonka grzechu (QSIN) we wszystkich trzech wymiarach.
    5. Powtórz i dostosuj kroki 1-4 dla analogicznych eksperymentów 3D CONH i CO(Cα)NH. Użyj tego kwartetu eksperymentów 3D do sekwencyjnych spacerów Cα i CO, aby przypisać szkielet białkowy, jak pokazano na przykładzie KcsA w Rysunek 428.

6. Dynamika białek za pomocą spektroskopii ssNMR wykrytej przez 1H

  1. W przypadku badań 15N T1 należy użyć wcześniej zoptymalizowanego eksperymentu 2D NH przy 60 kHz MAS i uwzględnić opóźnienie po pierwszym kroku polaryzacji krzyżowej od 1H do 15N. Weź udział w serii eksperymentów 2D NH i zmieniaj opóźnienie od 0 do 16 s, używając kroków, np. 0, 2, 4, 8 i 16 s.
  2. Wykreśl znormalizowane intensywności dla rozwiązanych sygnałów jako funkcję rosnącego czasu opóźnienia. Dopasuj zanik T1 do pojedynczych wykładników zgodnie z y = exp(-x/T1), gdzie y jest intensywnością sygnału w czasie zaniku x.
  3. Analogicznie, dla badań 15N T1rho, uwzględnij impuls spin-lock w programie impulsowym na kanale 15N o amplitudzie RF między 15-20 kHz po pierwszym kroku polaryzacji krzyżowej od 1H do 15N26,49. Przeprowadź serię eksperymentów 2D NH i zmień opóźnienie od 0 do 150 ms i dopasuj rozpad T1rho rozdzielczych sygnałów do pojedynczych wykładników. Poglądowe dane 15N T1rho są pokazane dla kanałów K+ osadzonych w membranie w Rysunek 527,28.

7. Dynamiczna polaryzacja jądrowa

UWAGA: Następujące kroki przygotowawcze odnoszą się do użycia komercyjnych konfiguracji DNP z wykorzystaniem 3,2 mm szafirowych wirników MAS (Rysunek 6)20. Stosowanie wirników cyrkonowych lub innych urządzeń DNP może prowadzić do niższych wzmocnień sygnału DNP.

  1. Zawiesić błonowy osad białkowy (z kroku 3.1) w 50 μl deuterowanego buforu DNP (60% (v/v) deuterowanego d8- i glicerolu oraz 15 mM AMUPol50. Do eksperymentów na częstotliwości 800 MHz zalecamy użycie 10 mM NATriPOL-351. Zobacz także reference52, aby uzyskać więcej praktycznych aspektów eksperymentów DNP ssNMR.
  2. Wirować przez 10-20 minut przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C, aby powstał osad. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
  3. Wstępnie schłodzić adapter odśrodkowy i elementy wirnika MAS o średnicy 3,2 mm w szafirze do temperatury <4 °C. Następujące kroki (7.4-7.7) należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec redukcji agentów DNP.
  4. Umieść rotor szafirowy o średnicy 3,2 mm w adapterze wirówki i napełnij go zawiesiną proteo-liposomów z kroku 7.2.
  5. Ostrożnie odpipetować zawieszoną próbkę białka błonowego do wewnętrznej ścianki wirnika za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Poczekaj, aż roztwór zsunie się na dno wirnika. Upewnij się, że nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
  6. Odwirowywać próbkę w wirniku przez 5-10 minut w temperaturze 4 500 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant zawierający nadmiar soku DNP, pipetując go ostrożnie, nie naruszając osadu komórkowego. Powtarzaj kroki 6.4-6.6, aż wirnik będzie pełny.
  7. Ostrożnie umieść przekładkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) za pomocą dystansowej na górze wirnika.
  8. Umieść wirnik pokrywą do dołu w tłoku wirnika53 i zanurz wirnik w ciekłym azocie. Odczekaj co najmniej 30-60 sekund, aby wirnik i próbka zamarzły.
  9. Uruchom wymiennik ciepła i schłodź sondę DNP do ~90K.
  10. Ustaw jednostkę MAS w trybie ręcznym i ustaw zmienną temperaturę (VT) na 135 l/h oraz przepływ gazu łożyskowego i napędowego na ~6 l/h.
  11. Włącz funkcję Eject (Wysuń) w konsoli MAS.
  12. Przenieś zamrożoną próbkę z kroku 7.8 z cieczy N2 do łapacza próbek i umieść ją w sondzie (patrz również reference53).
  13. Ręcznie zwiększ ciśnienie łożyska sondy (Bp) do ~500 mbar przed włączeniem "Insert". Jest to wskazane dla stabilnego i bezpiecznego wirowania wirnika.
  14. Zwiększ szybkość MAS do żądanej wartości, korzystając z procedury opisanej w reference53.
  15. Sprawdź ulepszenia DNP z mikrofalami i bez nich, korzystając ze standardowych eksperymentów CP 1D (zobacz także np. reference51,54) (Rysunek 7) przed przystąpieniem do wielowymiarowych eksperymentów, np. eksperymentów 2D CC opisanych w sekcji 3 tego artykułu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne żele do oczyszczania ciała inkluzji (Panel A) i ponownego składania ciał inkluzyjnych (Panel B3). Rysunek 2 potwierdza pomyślne oczyszczenie 13 C,15znakowanego N BamA-P4P5.

Rysunek 3A pokazuje typowe spektrum 2D 13 C-13C dobrze uporządkowanego białka błonowego, a Rysunek 3B pokazuje typowe, wysokiej jakości wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe odgrywają kluczową rolę w regulacji ważnych funkcji komórkowych zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych; W związku z tym zrozumienie ich mechanizmów działania na atomowych poziomach rozdzielczości ma kluczowe znaczenie. Istniejące techniki biologii strukturalnej posunęły się dość daleko w naukowym zrozumieniu białek błonowych, ale w dużej mierze opierały się na danych eksperymentalnych zebranych z systemów in vitro pozbawionych błon. W artykule przedstawiono podejście eksperymentalne,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częścią programów badawczych ECHO, TOP, TOP-PUNT, VICI i VIDI o numerach projektów 723.014.003, 711.018.001, 700.26.121, 700.10.443 i 718.015.00, które są finansowane przez Holenderską Radę ds. Badań Naukowych (NWO). Ten artykuł był wspierany przez iNEXT-Discovery (numer projektu 871037).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Molibdan amonuMerck277908
Chlorek amonu-15NCortecnetCN80P50
AmpicillinSigma AldrichA9518
AMUpolCortecnetC010P005
BenzonazaEMD Millipore Corp70746-3
Kwas borowyMerckB6768
błękit bromofenolowySigmaB0126
dichlorek wapniaMerck499609
chlorek cholinySigmaC-1879
Chlorek kobaltuMerck449776
Siarczan miedziMerckC1297
D-biotynaMerck8512090025
Tlenek deuteruCortecnetCD5251P1000
DimetylosulfotlenekMerckD9170
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma AldrichL6876
Kwas foliowySigmaF-7876
Glukoza 13C + 2HCortecnetCCD860P50
GlicerolHoneywellG7757
Glicerol (12C3, 99,95% D8, 98%)EurisotopeCDLM-8660-PK
glicerol (niewzbogacony)HoneywellG7757-1L
GlicynaSigma Aldrich50046
Chlorowodorek guanidynyRoth CarlNR.0037.1
Siarczan żelazaMerck307718
izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydThermofisherR0392
Rosół lizogenicznyMerckL3022
LizozymSigma AldrichL6876
Chlorek magnezu - sześciowodnyFluka63064
siarczan magnezuMerckM5921
fosforan monopotasowyMerck1051080050
mioinozytolSigmaI-5125
n-dodecyl-B-D-maltozydAcros Organics3293702509
N,N-dimetylododecyloaminy N-tlenek Merck40236
NicatinamidSigmaN-3376
Kwas pantotenowySigma21210-25G-F
proteazySigmaP8849
Pirydoksal-HClSigma AldrichP9130
RyboflawinaAldrichR170-6
Chlorek soduMerckK51107104914
Diwodorofosfat sodu - monohydratSigma Aldrich1,06,34,61,000
Dodecylosiarczan soduThermo-scientific28365
Wodorotlenek soduMerck1,06,49,81,000
SacharozaSigmaLife Science S9378
Tiamina-HClMerck5871
Tris-HClSigma Aldrich10,70,89,76,001
ChlorekMerck208086
E.coli BL21 DE3*New England BiolabsC2527
1,5 ml Ultra-probówkiBeckman Filtr odśrodkowy Coreder357448
30 kDaAmiconUFC903024
3,2 mm szafirowy rotor DNP z nasadkamiCortecnetH13861
Wkładka teflonowa 3,2 mmCortecnetB6628
3,2 mm pakowacz/rozpakowywanie próbekCortecnetB6988
3,2 mm Regular Wall MAS RotorCortecnetHZ16913
Rotor MAS o regularnych ściankach 3,2 mmZestaw narzędzi CortecnetHZ09244
do rotora cienkościennego 3,2 mmCortecnetB136904
Rotor MAS 1,3 mm + nasadkiCortecnetHZ14752
1,3 mmPakowacz próbek CortecnetHZ14714
1,3 mmCortecnetHZ14716
1,3 mm zmywaczdo nakrętekCortecnetHZ14706
Zestaw nasadek 1,3 mm NarzędzieCortecnetHZ14744
Rurki do dializy 12-14 kDaSpectra/Por132703
Sharpie -MerckHS15094
inhibitor Narzędzie do napełniania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  2. Kaplan, M., Pinto, C., Houben, K., Baldus, M. Nuclear magnetic resonance (NMR) applied to membrane-protein complexes. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 15(2016).
  3. Brown, L. S., Ladizhansky, V. Membrane proteins in their native habitat as seen by solid-state NMR spectroscopy. Protein Science. 24 (9), 1333-1346 (2015).
  4. Ladizhansky, V. Applications of solid-state NMR to membrane proteins. Biochimica Et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics. 1865 (11), Pt B 1577-1586 (2017).
  5. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. H. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 1-24 (2012).
  6. Shahid, S. A., et al. Membrane-protein structure determination by solid-state NMR spectroscopy of microcrystals. Nature Methods. 9 (12), 1212-1217 (2012).
  7. Wang, S. L., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nature Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  8. Herzfeld, J., Lansing, J. C. Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycle. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31 (1), 73-95 (2002).
  9. Ketchem, R. R., Hu, W., Cross, T. A. High-resolution conformation of gramicidin A in a lipid bilayer by solid-state NMR. Science. 261 (5127), 1457-1460 (1993).
  10. Lange, A., et al. Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR. Nature. 440 (7086), 959-962 (2006).
  11. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  12. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  13. Luca, S., et al. The conformation of neurotensin bound to its G protein-coupled receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10706-10711 (2003).
  14. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14 (3), 284-290 (2018).
  15. Krug, U., et al. The conformational equilibrium of the neuropeptide Y2 receptor in bilayer membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 59 (52), 23854-23861 (2020).
  16. Maly, T., et al. Dynamic nuclear polarization at high magnetic fields. Journal of Chemical Physics. 128 (5), (2008).
  17. Bajaj, V. S., Mak-Jurkauskas, M. L., Belenky, M., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Functional and shunt states of bacteriorhodopsin resolved by 250 GHz dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9244-9249 (2009).
  18. Linden, A. H., et al. Neurotoxin II bound to acetylcholine receptors in native membranes studied by dynamic nuclear polarization NMR. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19266-19269 (2011).
  19. Ong, Y. S., Lakatos, A., Becker-Baldus, J., Pos, K. M., Glaubitz, C. Detecting substrates bound to the secondary multidrug efflux pump EmrE by DNP-enhanced solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15754-15762 (2013).
  20. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  21. Becker-Baldus, J., et al. Enlightening the photoactive site of channelrhodopsin-2 by DNP-enhanced solid-state NMR spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), 9896-9901 (2015).
  22. Kaplan, M., et al. EGFR dynamics change during activation in native membranes as revealed by NMR. Cell. 167 (5), 1241-1251 (2016).
  23. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K+ channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  24. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14, 284(2018).
  25. Pinto, C., et al. Formation of the beta-barrel assembly machinery complex in lipid bilayers as seen by solid-state NMR. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Good, D. B., et al. Conformational dynamics of a seven transmembrane helical protein Anabaena Sensory Rhodopsin probed by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (7), 2833-2842 (2014).
  27. Medeiros-Silva, J., et al. (1)H-detected solid-state NMR studies of water-inaccessible proteins in vitro and in situ. Angewandte Chemie (International Edition in English). 55 (43), 13606-13610 (2016).
  28. Jekhmane, S., et al. Shifts in the selectivity filter dynamics cause modal gating in K(+) channels. Nature Communications. 10 (1), 123(2019).
  29. Schubeis, T., Le Marchand, T., Andreas, L. B., Pintacuda, G. 1H magic-angle spinning NMR evolves as a powerful new tool for membrane proteins. Journal of Magnetic Resonance. 287, 140-152 (2018).
  30. Sinnige, T., et al. Solid-state NMR studies of full-length BamA in lipid bilayers suggest limited overall POTRA mobility. Journal of Molecular Biology. 426 (9), 2009-2021 (2014).
  31. Sinnige, T., et al. Insight into the conformational stability of membrane-embedded BamA using a combined solution and solid-state NMR approach. Journal of Biomolecular NMR. 61 (3-4), 321-332 (2015).
  32. Sinnige, T., et al. Conformational plasticity of the POTRA 5 domain in the outer membrane protein assembly factor BamA. Structure. 23 (7), 1317-1324 (2015).
  33. Renault, M., Bos, M. P., Tommassen, J., Baldus, M. Solid-state NMR on a large multidomain integral membrane protein: the outer membrane protein assembly factor BamA. Journal of the American Chemical Society. 133 (12), 4175-4177 (2011).
  34. Doyle, D. A., et al. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280 (5360), 69-77 (1998).
  35. Wylie, B. J., Bhate, M. P., McDermott, A. E. Transmembrane allosteric coupling of the gates in a potassium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 185-190 (2014).
  36. Xu, Y., Zhang, D., Rogawski, R., Nimigean, C. M., McDermott, A. E. Identifying coupled clusters of allostery participants through chemical shift perturbations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2078-2085 (2019).
  37. vander Cruijsen, E. A. W., Prokofyev, A. V., Pongs, O., Baldus, M. Probing conformational changes during the gating cycle of a potassium channel in lipid bilayers. Biophysical Journal. 112 (1), 99-108 (2017).
  38. Varga, K., Tian, L., McDermott, A. E. Solid-state NMR study and assignments of the KcsA potassium ion channel of S. lividans. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (12), 1604-1613 (2007).
  39. Zhang, D., Howarth, G. S., Parkin, L. A., McDermott, A. E. NMR studies of lipid regulation of the K+ channel KcsA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. , 183491(2020).
  40. Schneider, R., et al. Solid-state NMR spectroscopy applied to a chimeric potassium channel in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (23), 7427-7435 (2008).
  41. Raleigh, D. P., Levitt, M. H., Griffin, R. G. Rotational resonance in solid-state Nmr. Chemical Physics Letters. 146 (1-2), 71-76 (1988).
  42. Schaefer, J., Stejskal, E. O. C-13 nuclear magnetic-resonance of polymers spinning at magic angle. Journal of the American Chemical Society. 98 (4), 1031-1032 (1976).
  43. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An improved broadband decoupling sequence for liquid crystals and solids. Journal of Magnetic Resonance. 142 (1), 97-101 (2000).
  44. Weingarth, M., Bodenhausen, G., Tekely, P. Low-power decoupling at high spinning frequencies in high static fields. Journal of Magnetic Resonance. 199 (2), 238-241 (2009).
  45. Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (127), (2017).
  46. Zhou, D. H., Rienstra, C. M. High-performance solvent suppression for proton detected solid-state NMR. Journal of Magnetic Resonance. 192 (1), 167-172 (2008).
  47. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Molecular Physics. 95 (6), 1197-1207 (1998).
  48. Verel, R., Baldus, M., Ernst, M., Meier, B. H. A homonuclear spin-pair filter for solid-state NMR based on adiabatic-passage techniques. Chemical Physics Letters. 287 (3-4), 421-428 (1998).
  49. Lewandowski, J. R., Sass, H. J., Grzesiek, S., Blackledge, M., Emsley, L. Site-specific measurement of slow motions in proteins. Journal of the American Chemical Society. 133 (42), 16762-16765 (2011).
  50. Sauvee, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie (International Edition in English). 52 (41), 10858-10861 (2013).
  51. Zhai, W., et al. Postmodification via thiol-click chemistry yields hydrophilic trityl-nitroxide biradicals for biomolecular high-field dynamic nuclear polarization. The Journal of Physical Chemistry. B. 124 (41), 9047-9060 (2020).
  52. Ghosh, R., Kragelj, J., Xiao, Y., Frederick, K. K. Cryogenic sample loading into a magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectrometer that preserves cellular viability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  53. Narasimhan, S., et al. Characterizing proteins in a native bacterial environment using solid-state NMR spectroscopy. Nature Protocols. , (2020).
  54. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  55. Weingarth, M., et al. Quantitative analysis of the water occupancy around the selectivity filter of a K+ channel in different gating modes. Journal of the American Chemical Society. 136 (5), 2000-2007 (2014).
  56. Lalli, D., et al. Proton-based structural analysis of a heptahelical transmembrane protein in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (37), 13006-13012 (2017).
  57. Schubeis, T., et al. A beta-barrel for oil transport through lipid membranes: Dynamic NMR structures of AlkL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21014-21021 (2020).
  58. Baker, L. A., Daniels, M., vander Cruijsen, E. A. W., Folkers, G. E., Baldus, M. Efficient cellular solid-state NMR of membrane proteins by targeted protein labeling. Journal of Biomolecular NMR. 62 (2), 199-208 (2015).
  59. Linser, R., et al. Proton-detected solid-state NMR spectroscopy of fibrillar and membrane proteins. Angewandte Chemie (International Edition in English). 50 (19), 4508-4512 (2011).
  60. Shukla, R., et al. Mode of action of teixobactins in cellular membranes. Nature Communications. 11 (1), 2848(2020).
  61. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nature Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  62. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K(+) channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  63. Narasimhan, S., et al. DNP-supported solid-state NMR spectroscopy of proteins inside mammalian cells. Angewandte Chemie (International Edition in English). 58 (37), 12969-12973 (2019).
  64. Wu, R., Stephenson, R., Gichaba, A., Noinaj, N. The big BAM theory: An open and closed case. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1862 (1), 183062(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Solid State NMRMembrane ProteinsProtein StructureLipid MembranesProton Detected NMRDynamic Nuclear PolarizationIsotope LabelingProtein DynamicsBeta Barrel ProteinsIon Channel KcsA
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły