Method Article

Ocena i kwantyfikacja mikropęcherzyków nabłonkowych w błonie śluzowej okrężnicy za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy nową metodę wizualizacji konkretnego miejsca, w którym zwiększa się przepuszczalność transkomórkowa i parakomórkowa w błonie śluzowej jelita grubego w stanie zapalnym. W tym teście stosujemy barwnik fluorescencyjny o mocy 10 kDa sprzężony z dekstranem utrwalanym lizyną, aby uwidocznić obszary o wysokiej przepuszczalności (HPR) w błonie śluzowej okrężnicy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe wyściełające błonę śluzową jelit tworzą fizyczną barierę, która oddziela zawartość światła od śródmiąższu. Upośledzenie bariery nabłonkowej wiąże się z rozwojem różnych patologii, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD). W błonie śluzowej objętej stanem zapalnym nadżerki powierzchowne lub mikronadżerki, które uszkadzają monowarstwy nabłonka, odpowiadają miejscom o wysokiej przepuszczalności. Za powstawanie mikronadżerek zaangażowanych jest kilka mechanizmów, w tym złuszczanie komórek i apoptoza. Te mikronadżerki często reprezentują mikroskopijne szczeliny nabłonkowe losowo rozmieszczone w okrężnicy. Wizualizacja i kwantyfikacja tych luk w nabłonku stała się ważnym narzędziem do badania funkcji bariery nabłonkowej jelit. W tym miejscu opisujemy nową metodę wizualizacji określonej lokalizacji, w której zwiększa się przepuszczalność transkomórkowa i parakomórkowa w błonie śluzowej okrężnicy objętej stanem zapalnym. W tym teście stosujemy barwnik fluorescencyjny o mocy 10 kDa sprzężony z dekstranem utrwalanym lizyną, aby uwidocznić obszary o wysokiej przepuszczalności (HPR) w błonie śluzowej okrężnicy. Dodatkowe zastosowanie markerów śmierci komórki ujawniło, że HPR obejmuje ogniska apoptozy, w których dochodzi do wytłaczania/złuszczania nabłonka. Opisany tutaj protokół zapewnia proste, ale skuteczne podejście do wizualizacji i ilościowego określania mikronadżerek w jelicie, co jest bardzo przydatnym narzędziem w modelach chorób, w których bariera nabłonkowa jelit jest naruszona.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona śluzowa przewodu pokarmowego (GI) tworzy fizyczną barierę, która oddziela środowisko zewnątrzkomórkowe od wewnętrznego środowiska gospodarza, i bierze udział w wchłanianiu składników odżywczych, wody i elektrolitów. Bariera jelitowa obejmuje warstwę śluzu utworzoną z glikoprotein, monowarstwę komórek nabłonkowych, a leżąca poniżej blaszka właściwa jest odporna i znajdują się komórki zrębu. Komórki nabłonka jelitowego tworzące barierę fizyczną są połączone ze sobą różnymi kompleksami białkowymi, w tym połączeniem adherens (AJ), złączem ścisłym (TJ) i desmosomami (DMs). Upośledzenie funkcji bariery nabłonkowej zwiększa przepuszczalność jelit i umożliwia translokację szkodliwych substancji i patogenów ze światła do śródmiąższu1. Istnieje coraz więcej chorób, w których bariera nabłonkowa jest naruszona, takich jak choroby zapalne jelit (IBD), takie jak choroba Leśniowskiego-Crohna (CD), wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i nieokreślone zapalenie jelita grubego (IC). Częstość występowania IBD wzrasta na całym świecie, a na Zachodzie częstość występowania zbliża się do 0,5%. Chociaż przyczyny IBD są niejasne, nadmierna odpowiedź immunologiczna/zapalna wywołana w ścianie jelita bezpośrednio przyczynia się do przerwania bariery nabłonkowej poprzez ograniczenie przywrócenia homeostazy nabłonka jelitowego2,3,4. Ponadto pacjenci z długotrwałym zapaleniem jelita grubego są narażeni na wysokie ryzyko zachorowania na raka jelita grubego (CRC)5. Inne patologie związane z przerwaniem bariery nabłonkowej jelit to zespół jelita drażliwego, otyłość, celiakia, nadwrażliwość na gluten bez celiakii i alergie pokarmowe6. Z tych powodów istnieje pilna potrzeba opracowania podejść eksperymentalnych, które umożliwią analizę integralności bariery nabłonkowej jelit w modelach zwierzęcych naśladujących patogenezę zachodzącą u ludzi.

Tutaj oceniliśmy pasywną parakomórkowość przewodu pokarmowego i przepuszczalność transkomórkową związaną z procesem zapalnym w nabłonku okrężnicy za pomocą prostej techniki. Aby zbadać transmuralny przepływ makrocząsteczek, zmierzyliśmy bierną dyfuzję FITC-dekstranu (4 kDa) i RITC-dekstranu (10 kDa) w workach okrężnicy ex vivo. Ponadto, wstrzykując fluorescencyjny dekstran o stężeniu 10 kDa utrwalany lizyną do światła worków jelitowych, zidentyfikowaliśmy obszary o wysokiej przepuszczalności w błonie śluzowej objętej stanem zapalnym. Zastosowanie markerów apoptozy i przeciwciał przeciwko białkom AJ pozwoliło nam wykazać, że obszary o wysokiej przepuszczalności w błonie śluzowej objętej stanem zapalnym odpowiadają specyficznym regionom, w których komórki nabłonkowe ulegają apoptozie, a połączenia komórka-komórka są zakłócone. Ta nowa technika może być wykorzystana do oceny integralności nabłonka w dowolnym modelu, w którym bariera nabłonkowa jelit jest naruszona.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych (CICUAL) CINVESTAV.

1. Przygotowanie materiałów i odczynników

  1. Wstępnie podgrzej roztwór Hartmanna (130 mM NaCl, 28 mM mleczanu, 4 mM KCl, 1,5 mM CaCl2) do 37 °C, bulgocząc 95% O2/5% CO2 . Utrzymać fizjologiczne pH roztworu (7.4).
  2. Do analizy biernej przepuszczalności parakomórkowej należy przygotować roztwór roboczy, rozpuszczając 1 mg/ml FITC-Dekstranu (4 kDa) i 1 mg/ml RITC-Dekstranu (10 kDa) we wstępnie podgrzanym roztworze Hartmanna.
  3. Przygotować roztwór 4 μg/ml Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) w roztworze Hartmanna. Roztwory robocze należy przechowywać w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i chronić przed światłem do czasu użycia.
    UWAGA: Konieczne będzie 300 μl roztworu roboczego na okrężnicę.
  4. Przygotuj szew chirurgiczny, wycinając dwa odcinki po 5 cm dla każdego jelita grubego. Zapętl szwy w niezamknięty węzeł.

2. Sekcja i przygotowanie przewodu pokarmowego

  1. Wstrzymaj się z podawaniem stałego pokarmu przez 6 godzin przed eutanazją myszy. Zapewnij ad libitum wodę pitną.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, umieść myszy na suplementach odżywczych w żelu (oczyszczona woda, melasa, dynia, syrop kukurydziany, nasiona słonecznika, białko pszenicy, olej roślinny, kwas spożywczy, hydrokoloidy, elektrolity, włókno kukurydziane, mieszanka mineralna NIH-31M, mieszanka witamin NIH-31M).
  2. Eutanazja myszy w komorze CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z instytucjonalnymi protokołami etycznymi.
  3. Wysterylizuj brzuch i klatkę piersiową 70% etanolem.
  4. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie na środku brzucha i odsłoń jamę otrzewnej.
  5. W celach orientacyjnych oddziel i rozetnij jelito grube, przecinając koniec jelita cienkiego (końcowa część jelita krętego) tuż przed jelitem ślepym, a następnie na krawędzi odbytu. Użyj kleszczy chirurgicznych, aby delikatnie usunąć krezkę i umieścić okrężnicę w roztworze Hartmanna.
  6. Co ważne, aby zachować spójność między zwierzętami, zidentyfikuj podobne odcinki i użyj ich do oceny przepuszczalności. Zdecydowanie zaleca się korzystanie z regionów w pobliżu jelita ślepego.
  7. Użyj strzykawki insulinowej wyposażonej w plastikową kaniulę, aby delikatnie przepłukać zawartość świetlną obecną w okrężnicy. Jeśli stolec jest twardy, ostrożnie popchnij za pomocą kleszczy. Po usunięciu kału przemyć 3 razy 400 μl roztworu Hartmanna.
  8. Zawiąż obszar proksymalny (najbliższy kątnicy) i umieść wstępnie zawiązaną pętlę szwów w dystalnej części okrężnicy. Za pomocą strzykawki wyposażonej w plastikową kaniulę wypełnij worek jelitowy roztworem zawierającym sondę pożądania. Ostrożnie wyjmij plastikową kaniulę i zawiąż pętlę w okolicy dystalnej.
  9. Umieść worek jelitowy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 6 ml roztworu Hartmanna i inkubuj przez 1 godzinę w celu oceny biernego przepływu parakomórkowego FITC/RITC-Dekstranu lub 30 minut w celu przeanalizowania przepływu Alexa Fluor Fixable-Dextran.
    1. Utrzymuj stożkowe rurki zawierające worki jelitowe w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i chronić przed światłem.
  10. Do pomiaru przepuszczalności biernej za pomocą FITC/RITC-Dextran. Po 0 i 60 minutach pobrać próbkę o objętości 100 μl z probówki stożkowej i przenieść na płytkę 96-dołkową. Dodaj z powrotem 100 μl świeżego nośnika, aby uzupełnić utraconą objętość.
  11. Pomiar próbek i wzorców FITC/RITC na czytniku płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie/emisja FITC: 495 nm/519 nm; Wzbudzenie/emisja RITC: 570/595 nm).
  12. Aby zmierzyć przepuszczalność bierną za pomocą Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, usuń jelita, przetnij blisko węzła krawata chirurgicznego i przetnij jelito, aby odsłonić światło w celu usunięcia roztworu za pomocą sondy. Przemyj światło jelita 2 razy zimnym roztworem Hartmanna.
  13. Umieść chusteczkę w formie uprzednio wypełnionej związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.). Ustaw tkankę pionowo lub poziomo zgodnie ze stroną, która ma być podzielona na sekcje. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Zamrożone skrawki o długości 20 mikrometrów utrwalić 3,7% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy solą fizjologiczną buforowaną zimnymi fosforanami (PBS; 37 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2 PO4).
    UWAGA: Pionowe odcinki jelit mają tendencję do odpadania, jeśli płukanie jest bardzo mocne.
  2. Przepuszczać 0,2% TX-100/PBS przez 12 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy zimnym PBS.
  3. Blokuj 0,2% BSA/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj 3 razy zimnym PBS.
  5. Inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałami drugorzędowymi w roztworze blokującym. Umyj 3 razy zimnym PBS.
  6. Nałóż środek montażowy na nacięcia i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełka można przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze -20 °C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W zapalnej błonie śluzowej, powierzchowne nadżerki lub mikronadżerki zagrażają integralności monowarstwy komórek nabłonka i reprezentują miejsca o wysokiej przepuszczalności7,8. Aby ocenić takie możliwości, przeanalizowaliśmy bierną przepuszczalność błony śluzowej okrężnicy w zapalnym modelu zapalenia jelita grubego z siarczanem sodu i dekstranem. Krótko mówiąc, przez 5 dni myszy C57BL/6J otrzymywały 2,5% DSS (w/v, 40-50 kDa) rozpuszczonego w wodzie pitnej. Model...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Homeostaza nabłonkowa wynikająca z równoważenia proliferacji komórek i apoptozy nabłonkowej utrzymuje prawidłową i funkcjonalną barierę jelitową. Wielu zaburzeniom klinicznym, takim jak IBD, towarzyszą lub charakteryzują się zmianami przepuszczalności jelit, zapaleniem błony śluzowej i zaburzeniem homeostazy nabłonka1. Wzajemne oddziaływanie tych procesów jest nadal wysoce kontrowersyjne. Dlatego opracowanie nowych podejść badawczych w celu prawidłowego zbadania tych procesów jest ważnym tematem w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania były częściowo wspierane przez grant SEP-Conacyt (nr 179 dla NV/PND) oraz wspierane przez sektorowe fundusze na badania i edukację poprzez grant na nauki podstawowe od Conacyt (nr A1-S-20887 dla PND). Pragniemy wyrazić naszą wdzięczność Normie Trejo, M.V.Z. Raúlowi Castro Lunie, M.C. Leonelowi Martínezowi, Felipe Cruzowi Martínezowi, Victorowi Manuelowi Garcíi Gómezowi i M.V.Z. Ricardo Gaxiola Centeno za ich pomoc i wsparcie techniczne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aktywne przeciwciało kaspazy-3 (1:1000)Sygnalizacja komórkowa9664Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175)(5AE1) MAb królika
Alexa Fluor 488  przeciw królikowi (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 przeciw szczurom (1:1000)InvitrogenA21209
(Leica TCS SP8x)Detektory LeicaHyD  i laser światła białego
Przeciwciało E-Cadherin (1:750)SigmaMABT26Szczurze przeciwciało monoklonalne Delma-1
Etanol 70%Generic
Fixable-DextranInvitrogenD22914Dextran, Alexa Fluor, 10 000 MW, anionowy, utrwalany
FITC DextranSigma46944Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran M. Wt. 4 kDa
Roztwór HartmannaInkubator PiSAHT PiSA
(AutoFlow NU-8500)Czytnik mikropłytek Nuaire
(Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell Czarno-biała płyta polistyrenowaThermoFisher Scientific
ParaformaldehydeSigmaP6148
Faloidyna (1:1000)InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 Falloidyna
RITC DekstranSigmaR8881-100MGRodamina B Izotiocyjanian-Dekstran. M. Wt. 10 kDa
Przeciwciała drugorzędowe (1:10000)LaboratoriaPrzeciwciała drugorzędowe sprzężone z HRP
Nici do szwówOgólnyPleciony jedwab i pleciony poliester Preferowane są szwy chirurgiczne.
ZO-1 (1:1000)Invitrogen40-2200Rb anty-ZO-1
Mikroskop konfokalny Jackson ImmunoResearch

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel disease is associated with changes of enterocytic junctions. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (1), 216-228 (2001).
  3. Negroni, A., Cucchiara, S., Stronati, L. Apoptosis, Necrosis, and Necroptosis in the Gut and Intestinal Homeostasis. Mediators of Inflammation. 2015, 250762(2015).
  4. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  5. Choi, C. -H. R., Bakir, I. A., Hart, A. L., Graham, T. A. Clonal evolution of colorectal cancer in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (4), 218-229 (2017).
  6. González-González, M., Díaz-Zepeda, C., Eyzaguirre-Velásquez, J., González-Arancibia, C., Bravo, J. A., Julio-Pieper, M. Investigating Gut Permeability in Animal Models of Disease. Frontiers in Physiology. 9, (2019).
  7. Poulsen, S. S., Pedersen, N. T., Jarnum, S. "Microerosions" in rectal biopsies in Crohn's disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 19 (5), 607-612 (1984).
  8. Neumann, H., et al. Assessment of Crohn's disease activity by confocal laser endomicroscopy. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (12), 2261-2269 (2012).
  9. Laroui, H., et al. Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  10. John, L. J., Fromm, M., Schulzke, J. -D. Epithelial barriers in intestinal inflammation. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1255-1270 (2011).
  11. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145 (2), 407-415 (2013).
  12. Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53250(2016).
  13. Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57038(2018).
  14. Stamatovic, S. M., Johnson, A. M., Sladojevic, N., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Endocytosis of tight junction proteins and the regulation of degradation and recycling. Annals of the New York Academy of Sciences. 1397 (1), 54-65 (2017).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  17. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles