Artykuł metodologiczny

Ocena i kwantyfikacja mikropęcherzyków nabłonkowych w błonie śluzowej okrężnicy za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

DOI:

10.3791/62204

⸱

11 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy nową metodę wizualizacji konkretnego miejsca, w którym zwiększa się przepuszczalność transkomórkowa i parakomórkowa w błonie śluzowej jelita grubego w stanie zapalnym. W tym teście stosujemy barwnik fluorescencyjny o mocy 10 kDa sprzężony z dekstranem utrwalanym lizyną, aby uwidocznić obszary o wysokiej przepuszczalności (HPR) w błonie śluzowej okrężnicy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe wyściełające błonę śluzową jelit tworzą fizyczną barierę, która oddziela zawartość światła od śródmiąższu. Upośledzenie bariery nabłonkowej wiąże się z rozwojem różnych patologii, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD). W błonie śluzowej objętej stanem zapalnym nadżerki powierzchowne lub mikronadżerki, które uszkadzają monowarstwy nabłonka, odpowiadają miejscom o wysokiej przepuszczalności. Za powstawanie mikronadżerek zaangażowanych jest kilka mechanizmów, w tym złuszczanie komórek i apoptoza. Te mikronadżerki często reprezentują mikroskopijne szczeliny nabłonkowe losowo rozmieszczone w okrężnicy. Wizualizacja i kwantyfikacja tych luk w nabłonku stała się ważnym narzędziem do badania funkcji bariery nabłonkowej jelit. W tym miejscu opisujemy nową metodę wizualizacji określonej lokalizacji, w której zwiększa się przepuszczalność transkomórkowa i parakomórkowa w błonie śluzowej okrężnicy objętej stanem zapalnym. W tym teście stosujemy barwnik fluorescencyjny o mocy 10 kDa sprzężony z dekstranem utrwalanym lizyną, aby uwidocznić obszary o wysokiej przepuszczalności (HPR) w błonie śluzowej okrężnicy. Dodatkowe zastosowanie markerów śmierci komórki ujawniło, że HPR obejmuje ogniska apoptozy, w których dochodzi do wytłaczania/złuszczania nabłonka. Opisany tutaj protokół zapewnia proste, ale skuteczne podejście do wizualizacji i ilościowego określania mikronadżerek w jelicie, co jest bardzo przydatnym narzędziem w modelach chorób, w których bariera nabłonkowa jelit jest naruszona.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona śluzowa przewodu pokarmowego (GI) tworzy fizyczną barierę, która oddziela środowisko zewnątrzkomórkowe od wewnętrznego środowiska gospodarza, i bierze udział w wchłanianiu składników odżywczych, wody i elektrolitów. Bariera jelitowa obejmuje warstwę śluzu utworzoną z glikoprotein, monowarstwę komórek nabłonkowych, a leżąca poniżej blaszka właściwa jest odporna i znajdują się komórki zrębu. Komórki nabłonka jelitowego tworzące barierę fizyczną są połączone ze sobą różnymi kompleksami białkowymi, w tym połączeniem adherens (AJ), złączem ścisłym (TJ) i desmosomami (DMs). Upośledzenie funkcji bariery nabłonkowej zwiększa przepuszczalność jelit i umożliwia translokac....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych (CICUAL) CINVESTAV.

1. Przygotowanie materiałów i odczynników

  1. Wstępnie podgrzej roztwór Hartmanna (130 mM NaCl, 28 mM mleczanu, 4 mM KCl, 1,5 mM CaCl2) do 37 °C, bulgocząc 95% O2/5% CO2 . Utrzymać fizjologiczne pH roztworu (7.4).
  2. Do analizy biernej przepuszczalności parakomórkowej należy przygotować roztwór roboczy, rozpuszczając 1 mg/ml FITC-Dekstranu (4 kDa) i 1 mg/ml RITC-Dekstranu (10 kDa) we wstępnie podgrzanym roztworze Hartmanna.
  3. Przygo....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W zapalnej błonie śluzowej, powierzchowne nadżerki lub mikronadżerki zagrażają integralności monowarstwy komórek nabłonka i reprezentują miejsca o wysokiej przepuszczalności7,8. Aby ocenić takie możliwości, przeanalizowaliśmy bierną przepuszczalność błony śluzowej okrężnicy w zapalnym modelu zapalenia jelita grubego z siarczanem sodu i dekstranem. Krótko mówiąc, przez 5 dni myszy C57BL/6J otrzymywały 2,5% DSS (w/v, 40-50 kDa) rozpuszczonego w wodzie pitnej. Model.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Homeostaza nabłonkowa wynikająca z równoważenia proliferacji komórek i apoptozy nabłonkowej utrzymuje prawidłową i funkcjonalną barierę jelitową. Wielu zaburzeniom klinicznym, takim jak IBD, towarzyszą lub charakteryzują się zmianami przepuszczalności jelit, zapaleniem błony śluzowej i zaburzeniem homeostazy nabłonka1. Wzajemne oddziaływanie tych procesów jest nadal wysoce kontrowersyjne. Dlatego opracowanie nowych podejść badawczych w celu prawidłowego zbadania tych procesów jest ważnym tematem w.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania były częściowo wspierane przez grant SEP-Conacyt (nr 179 dla NV/PND) oraz wspierane przez sektorowe fundusze na badania i edukację poprzez grant na nauki podstawowe od Conacyt (nr A1-S-20887 dla PND). Pragniemy wyrazić naszą wdzięczność Normie Trejo, M.V.Z. Raúlowi Castro Lunie, M.C. Leonelowi Martínezowi, Felipe Cruzowi Martínezowi, Victorowi Manuelowi Garcíi Gómezowi i M.V.Z. Ricardo Gaxiola Centeno za ich pomoc i wsparcie techniczne.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aktywne przeciwciało kaspazy-3 (1:1000)Sygnalizacja komórkowa9664Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175)(5AE1) MAb królika
Alexa Fluor 488  przeciw królikowi (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 przeciw szczurom (1:1000)InvitrogenA21209
(Leica TCS SP8x)Detektory LeicaHyD  i laser światła białego
Przeciwciało E-Cadherin (1:750)SigmaMABT26Szczurze przeciwciało monoklonalne Delma-1
Etanol 70%Generic
Fixable-DextranInvitrogenD22914Dextran, Alexa Fluor, 10 000 MW, anionowy, utrwalany
FITC DextranSigma46944Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran M. Wt. 4 kDa
Roztwór HartmannaInkubator PiSAHT PiSA
(AutoFlow NU-8500)Czytnik mikropłytek Nuaire
(Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell Czarno-biała płyta polistyrenowaThermoFisher Scientific
ParaformaldehydeSigmaP6148
Faloidyna (1:1000)InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 Falloidyna
RITC DekstranSigmaR8881-100MGRodamina B Izotiocyjanian-Dekstran. M. Wt. 10 kDa
Przeciwciała drugorzędowe (1:10000)LaboratoriaPrzeciwciała drugorzędowe sprzężone z HRP
Nici do szwówOgólnyPleciony jedwab i pleciony poliester Preferowane są szwy chirurgiczne.
ZO-1 (1:1000)Invitrogen40-2200Rb anty-ZO-1
Mikroskop konfokalny Jackson ImmunoResearch

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel d....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bariera nab onkowamikroerozjeprzepuszczalno jelitowaz uszczanie kom rekogniska apoptycznebarwnik fluorescencyjnyfunkcja bariery
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły