Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62206

⸱

12 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Streszczenie

Generowanie kardiomiocytów specyficznych dla pacjenta z pojedynczego pobrania krwi wzbudziło ogromne zainteresowanie medycyny precyzyjnej w zakresie chorób sercowo-naczyniowych. Różnicowanie serca od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) jest modulowane przez zdefiniowane szlaki sygnałowe, które są niezbędne do rozwoju embrionalnego serca. Opracowano liczne metody różnicowania serca na platformach 2D i 3D o różnej skuteczności i wydajności kardiomiocytów. To zaintrygowało badaczy spoza tej dziedziny, ponieważ różnorodność tych metod może być trudna do naśladowania. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół, który opracowuje solidne generowanie i ekspansję specyficznych dla pacjenta kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Najpierw opisujemy wysokowydajny protokół przeprogramowania iPSC z próbki krwi pacjenta przy użyciu wektorów wirusa Sendai bez integracji. Następnie szczegółowo opisujemy metodę różnicowania monowarstwowego za pośrednictwem małych cząsteczek, która może solidnie wytwarzać bijące kardiomiocyty z większości ludzkich linii iPSC. Ponadto wprowadzono skalowalny protokół ekspansji kardiomiocytów przy użyciu małej cząsteczki (CHIR99021), która może szybko rozszerzyć kardiomiocyty pochodzące od pacjentów do zastosowań przemysłowych i klinicznych. Na końcu przedstawiono szczegółowe protokoły identyfikacji molekularnej i charakterystyki elektrofizjologicznej tych iPSC-CM. Oczekujemy, że ten protokół będzie pragmatyczny dla początkujących z ograniczoną wiedzą na temat rozwoju układu sercowo-naczyniowego i biologii komórek macierzystych.

Wprowadzenie

Odkrycie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zrewolucjonizowało współczesną medycynę sercowo-naczyniową1,2. Ludzkie komórki iPS są zdolne do samoodnawiania się i wytwarzania wszystkich typów komórek w sercu, w tym kardiomiocytów, komórek śródbłonka, komórek mięśni gładkich i fibroblastów serca. Kardiomiocyty pochodzące z iPSC (iPSC-CMs) mogą służyć jako nieograniczone zasoby do modelowania genetycznie dziedzicznych chorób sercowo-naczyniowych (CVD) i testowania bezpieczeństwa kardiologicznego dla nowych leków3. W szczególności pacjenci z iPSC-CM są dobrze przygotowani do zbadania genetycznej i molekularnej etiologii chorób układu krążenia, które wynikają z defektów kardiomiocytów, takich jak zespół długiego odstępu QT4 i kardiomiopatia rozstrzeniowa (DCM)5. W połączeniu z edycją genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, iPSC-CM u pacjentów otworzyły bezprecedensową drogę do zrozumienia złożonych podstaw genetycznych chorób układu krążenia, w tym wrodzonych wad serca (CHD)6,7,8. Ludzkie iPSC-CM wykazały również potencjał, aby służyć jako autologiczne źródła komórek do uzupełniania uszkodzonego mięśnia sercowego podczas zawału serca9. W ostatnich latach kluczowe stało się generowanie wysokiej jakości ludzkich iPSC-CM o zdefiniowanych podtypach (przedsionkowych, komorowych i węzłowych) do regeneracji serca i testowania leków10.

Różnicowanie serca od ludzkich iPSC zostało znacznie zaawansowane w ciągu ostatniej dekady. Metody różnicowania przeszły od spontanicznego różnicowania opartego na ciele zarodkowym (EB) do chemicznie zdefiniowanego i ukierunkowanego różnicowania serca11. Kluczowe cząsteczki sygnałowe niezbędne do rozwoju embrionalnego serca, takie jak Wnt, BMP, Nodal i FGF, są manipulowane w celu zwiększenia różnicowania kardiomiocytów od ludzkich iPSC10,12. Znaczące postępy obejmują sekwencyjną modulację sygnalizacji Wnt (aktywacja, a następnie hamowanie) w celu uzyskania solidnej generacji kardiomiocytów z ludzkich iPSC13,14. Chemicznie zdefiniowane receptury różnicowania serca zostały zbadane, aby ułatwić produkcję na dużą skalę kardiomiocytów bijących15,16, które mają potencjał do ulepszenia do produkcji na poziomie przemysłowym i klinicznym. Co więcej, solidną ekspansję wczesnych ludzkich iPSC-CM osiąga się poprzez ekspozycję na konstytutywną aktywację Wnt przy użyciu małego chemicznego (CHIR99021)17. Ostatnio kardiomiocyty specyficzne dla podtypu są generowane poprzez manipulację szlakami sygnałowymi kwasu retinowego (RA) i Wnt w określonych oknach różnicowania podczas zaangażowania linii kardiomiocytów od ludzkich iPSC18,19,20,21,22.

W tym protokole szczegółowo opisujemy procedurę działania dla niezawodnego generowania i proliferacji ludzkich CM pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta. Przedstawiamy protokoły 1) przeprogramowania ludzkich PBMC na iPSC, 2) solidnej generacji bijących kardiomiocytów z ludzkich iPSC, 3) szybkiej ekspansji wczesnych iPSC-CM, 4) charakterystyki molekularnej ludzkich iPSC-CM oraz 5) elektrofizjologicznego pomiaru ludzkich iPSC-CM na poziomie pojedynczej komórki za pomocą patch clamp. Protokół ten obejmuje szczegółowe procedury eksperymentalne dotyczące przekształcania komórek krwi pacjenta w bijące kardiomiocyty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły eksperymentalne i świadoma zgoda dla ludzi zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) w Nationwide Children's Hospital.

1. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych, roztworów i odczynników

  1. Przygotowanie nośnika PBMC
    1. Wymieszaj 20 ml podstawowej pożywki hodowlanej PBMC (1x) i 0,52 ml suplementu. Dodać po 20 μl SCF i FLT3 (stężenie podstawowe: 100 μg/ml), po 4 μl IL3, IL6 i EPO (stężenie podstawowe: 100 μg/ml) oraz 200 μl alternatywy L-glutaminy (100x). Dokładnie je wymieszaj. Filtruj w sterylnym kapturze za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm. Nazwij to jako Kompletna Pożywka Krwi.
    2. Wymieszaj 20 ml podstawowej pożywki hodowlanej PBMC (1x) i 0,52 ml suplementu. Dodaj 200 μl alternatywy L-glutaminy (100x). Dokładnie je wymieszaj. Filtruj za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm. Nazwij to jako Suplement pożywki krwi.
  2. Przygotowanie kompletnego nośnika E8
    1. Zmieszać 500 ml podłoża podstawowego E8 i 10 ml suplementu E8 (rozmrożonego przez noc w temperaturze 4 °C), aby uzyskać pełne podłoże E8. Przed użyciem zrównoważyć do temperatury pokojowej (RT).
  3. Przygotowanie nośnika pasującego iPSC
    1. Dodać 40 μl inhibitora skał Y-27632 (rozcieńczenie 1:5 000, stężenie podstawowe: 10 mM) do 200 ml kompletnej pożywki E8. Dokładnie wymieszaj. Przed użyciem zrównoważyć do RT.
  4. Przygotowanie pożywki do różnicowania kardiomiocytów
    1. Podłoże I: Wymieszaj 500 ml RPMI1640 z 10 ml witaminy B27 bez suplementu insuliny (50x).
    2. Pożywka II: Dodać odpowiednią objętość surowca CHIR99021 (inhibitor GSK3) do pożywki I (CHIR99021 końcowym stężeniu 6 μM). Dokładnie wymieszaj.
    3. Podłoże III: Dodać odpowiednią objętość surowca IWR-1 (inhibitor Wnt) do pożywki I (końcowe stężenie IWR-1 5 μM). Dokładnie wymieszaj.
    4. Pożywka IV: Wymieszaj 500 ml RPMI1640 z 10 ml suplementu B27 (50x). Dokładnie wymieszaj.
    5. Podłoże V: Wymieszaj 500 ml RPMI1640 (bez glukozy) z 10 ml suplementu B27 (50x). Dokładnie wymieszaj.
    6. Pożywka VI: Dodać odpowiednią objętość CHIR99021 bulionu do pożywki IV (CHIR99021 końcowym stężeniu 2 μM). Dokładnie wymieszaj.
  5. Przygotowanie nośnika pasażującego iPSC-CM
    1. Dodać 10 ml zamiennika surowicy nokautującej (KSR) do 90 ml pożywki dożylnej (stężenie końcowe KSR: 10%). Dobrze wymieszaj.
  6. Przygotowanie podłoża do zamrażania iPSC-CM
    1. Dodaj 1 ml DMSO do 9 ml KSR (końcowe stężenia: 10% DMSO/90% KSR) i dobrze wymieszaj.
  7. Przygotować średnio powlekane płyty z matrycą membrany podstawnej
    1. Rozmrozić podłoże z matrycą błony podstawnej w temperaturze 4 °C przez noc i podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml. Dodaj 1 ml tej pożywki do 250 ml pożywki DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:250) i dokładnie wymieszaj. Nałożyć 2 ml rozcieńczonego roztworu na basenik na płytkę 6-dołkową i inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed użyciem.

2. Przeprogramowanie iPSC PBMC

  1. Oddziel PBMC od próbek krwi.
    1. Pobrać próbki krwi pacjenta (~5 ml) i przenieść do probówek do separacji komórek krwi (patrz tabela materiałów). Mieszaj, odwracając 10x.
    2. Wirować przy 1 500 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Ostrożnie wyjmij rurki i spryskaj je 70% etanolem. Pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego zdejmij nakrętki, nie naruszając komórek jednojądrzastych (warstwa kożuchowa). PBMC będą znajdować się w białawej warstwie tuż pod warstwą plazmy (Rysunek 1A). Zebrać całą warstwę buffy za pomocą pipety 1000 μl i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Policz numer komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Wirować probówkę o wymiarach 300 x g przez 25 minut przy temperaturze pokojowej.
    5. Odrzucić supernatant. Przemyć 10 ml DPBS (bez Ca2+/Mg2+).
    6. Wirować probówkę o wymiarach 300 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Usunąć supernatant. Zawiesić granulki komórkowe w 1 ml podłoża do zamrażania (KSR plus 10% DMSO). Dostosuj gęstość komórek, aby uzyskać 1 x 106 komórek na fiolkę.
    8. Umieścić kriowiale PBMC w pojemniku do zamrażania komórek i przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc. Następnego dnia przenieś do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Przeprogramowanie iPSC.
    1. Dodaj 3 ml pożywki z suplementem krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rozmrozić PBMC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść je do stożkowej rurki. Wirować z prędkością 300 x g przez 7 minut przy RT.
    2. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić PBMC z kompletną pożywką krwionośną. Zasiej je w dwóch dołkach z 24-dołkowymi płytkami do hodowli tkankowych (bez macierzy błony podstawnej).
    3. Inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia delikatnie usuń połowę starej pożywki (0,5 ml) i dodaj 0,5 ml świeżej pożywki Complete Blood Media.
    4. Zmieniaj multimedia co drugi dzień, odświeżając połowę starych nośników.
    5. Po tygodniu agresywnie przemyj studzienkę 1 ml suplementu pożywki krwiowej i przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    6. Policz numer komórki. Weź 2 x 10 5 komórek i odwiruj przy 300 x g przez 7 min.
    7. Odrzucić supernatant. Zawiesić komórki za pomocą 300 μl kompletnego podłoża krwionośnego. Wykonaj transfekcję poprzez dodanie odpowiedniej objętości wektorów przeprogramowania wirusa Sendai zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś je do jednego dołka na 24-dołkowej płytce (bez macierzy błony podstawnej). Inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.
    8. Następnego dnia wirować w temperaturze 300 x g przez 7 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml Complete Blood Media. Przenieść do jednej studzienki 6-dołkową płytkę wstępnie pokrytą matrycą z membrany podstawnej. To jest Dzień 1 (D1).
    9. Nie dotykaj talerza następnego dnia.
    10. Na D3 usuń 1 ml starego podłoża. Dodać 1 ml pożywki z suplementem krwi.
    11. Powtórz krok 2.2.10 na D5.
    12. Na D7 usuń 1 ml starego podłoża. Dodać 1 ml kompletnej pożywki E8.
    13. Na D8 powtórz krok 2.2.12.
    14. W D9 usuń stary nośnik. Dodać 2 ml kompletnej pożywki E8. Oczekuje się, że całkowicie przeprogramowane komórki przyłączą się i zaczną tworzyć kolonie.
    15. Odświeżaj się 2 ml kompletnej pożywki E8 każdego dnia.
    16. Około 2 tygodnie po transdukcji wirusa Sendai pojawią się duże kolonie iPSC, które będą gotowe do zbioru.
    17. Wytnij kolonie iPSC pod mikroskopem stereoskopowym w kapturze i przenieś poszczególne kolonie na 24-dołkową płytkę pokrytą matrycą membrany podstawnej, wstępnie załadowaną 0,5 ml pożywki pasażującej iPSC.
    18. Odświeżaj codziennie 0,5 ml kompletnej pożywki E8, aż kolonie iPSC osiągną wystarczająco duże rozmiary, aby można je było przenieść do nowej 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej.

3. Konserwacja i pasaż ludzkiego iPSC

  1. Gdy ludzkie iPSC osiągną ponad 90% konfluencji, usuń stare media. Spłucz raz 3 ml DPBS.
  2. Dodać 1 ml 0,5 mM EDTA do roztworu DPBS. Inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 5-8 min.
  3. Usuń EDTA przez aspirację. Dodać 1 ml pożywki pasażującej iPSC. Ręczne usuwanie iPSC.
  4. Pobrać 600-900 μl zawiesiny jednokomórkowej i ponownie umieścić je na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej (rozcieńczenie: 1:6 do 1:10). Inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Odświeżaj się 2 ml kompletnej pożywki E8 każdego dnia. Kultury iPSC zwykle osiągają zbieg po 3-4 dniach.

4. Chemicznie zdefiniowane różnicowanie kardiomiocytów

  1. Hodowla ludzkich iPSC w kompletnych pożywkach E8 aż do 95% zlewania (3-4 dni).
  2. Usuń stary nośnik. Dodaj 2 ml pożywki do różnicowania CM II (6 μM CHIR w RPMI1640 plus B27 minus suplement insuliny) do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. To jest D0. Nie dotykaj D1.
  3. Na D2 zastąp 2 ml pożywki różnicującej CM I (RPMI1640 plus B27 minus suplement insuliny).
  4. Na D3 zastąp 2 ml pożywki do różnicowania CM III (5 μM IWR-1 w RPMI1640 plus B27 minus suplement insuliny). Nie dotykaj D4.
  5. Na D5 zastąp 2 ml pożywki różnicującej CM I.
  6. Na D7 zastąp 2 ml pożywki różnicującej CM IV (RPMI1640 plus suplement B27). Następnie odświeżaj nośnik co drugi dzień.
  7. Na D11, gdy obserwuje się kurczące się komórki, zastąp 2 ml pożywki różnicującej CM V (bez glukozy).
  8. Na D13 zastąp 2 ml pożywki różnicującej CM V.
  9. Na D15 zastąp 2 ml pożywki do różnicowania CM IV.
  10. Na D17-D21 zastąp 2 ml pożywki do różnicowania CM dożylnie co drugi dzień.

5. Przejście ludzkich iPSC-CM

  1. Usuń stare podłoże i raz przepłucz komórki 3 ml DPBS.
  2. Nałożyć 1 ml roztworu dysocjacyjnego CM (patrz Tabela materiałów) do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 5-8 min.
  3. Mechaniczna dysocjacja iPSC-CM na pojedyncze komórki poprzez energiczne pipetowanie.
  4. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 2 ml pożywki pasażacyjnej CM (10% KSR w RMPI1640 plus suplement B27), aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny CM.
  5. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.
  6. Odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki z żądaną objętością pożywki pasującej CM. Zasiej je w talerzu/naczyniu pokrytym matrycą membrany podstawnej. Ludzkie iPSC-CM wznawiają bicie 1-3 dni po pasażu.

6. Ekspansja ludzkich iPSC-CM

  1. Przepłukać D10-12, ubijając iPSC-CM 3 ml DPBS na każde zagłębienie płytki 6-dołkowej raz. Dodać 1 ml roztworu dysocjacyjnego CM (krok 5.2). Inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 7-10 min.
  2. Mechaniczna dysocjacja iPSC-CM na pojedyncze komórki poprzez energiczne pipetowanie.
  3. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 2 ml pożywki pasażacyjnej CM, aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny CM.
  4. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.
  5. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki z odpowiednią ilością pożywki pasażującej CM. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Zasiaj milion iPSC-CM w 10-centymetrowej misce pokrytej matrycą membrany podstawnej.
  6. Następnego dnia usuń stare nośniki. Dodać 10 ml pożywki do proliferacji kardiomiocytów (pożywka VI: 2 μM CHIR99021). Zmieniaj nośnik co drugi dzień.
  7. Gdy iPSC-CM zlewają się po 7-9 dniach hodowli, powtórz etap pasażowania w celu dalszej ekspansji iPSC-CM.

7. Immunofluorescencja

  1. Przed barwieniem immunofluorescencyjnym należy wysiewać iPSC-CM na szkiełkach nakrywkowych pokrytych matrycą błony podstawnej, które umieszcza się na płytce 24-dołkowej (gęstość wysiewu: 0,5-1 x 106 komórek/ml). Utrzymuj iPSC-CM w hodowli przez co najmniej 4 dni.
  2. Umyj komórki za pomocą 1 ml DPBS jeden raz.
  3. Dodać 0,5 ml 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj komórki za pomocą 1 ml DPBS. Powtórz raz.
  5. Dodać 0,5 ml 0,1% Triton X-100 i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umyć dwukrotnie 1 ml DPBS.
  7. Dodać 0,5 ml 0,2% BSA do DPBS (roztwór blokujący). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  8. Dodać 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego roztworem blokującym (rozcieńczenie: 1:400-1:1000). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  9. Myć komórki za pomocą 0,5 ml roztworu blokującego przez 3 minuty z potrząsaniem. Powtórz dwa razy.
  10. Dodać 200 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  11. Przepłukać komórki trzykrotnie 0,5 ml DPBS, każdy przez 3 minuty z potrząsaniem.
  12. Wybarwić jądra przeciwstawne za pomocą DAPI (rozcieńczenie 1:2000) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Przepłucz komórki trzykrotnie 0,5 ml DPBS.
  14. Zamontuj komórki na szkiełkach nakrywkowych na szkiełku mikroskopowym za pomocą 5 μl nośnika montażowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem.

8. Przygotowanie próbki do cytometrii przepływowej

  1. Umyj ludzkie iPSC-CM 3 ml DPBS jeden raz.
  2. Dodać 1 ml roztworu dysocjacyjnego CM i inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 7-10 minut.
  3. Usuń komórki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Przenieś zawiesinę komórek do okrągłej probówki FACS przez nasadkę sitka. Probówka FACS jest wstępnie napełniona 1 ml pożywki pasażującej iPSC-CM (10% KSR) w celu zneutralizowania aktywności enzymu.
  4. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 min.
  5. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodać 250 μl roztworu utrwalającego/przepuszczalnego (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Dodać 1 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania. Krótko wirować i wirować z prędkością 300 x g przez 4 minuty.
  7. Odrzucić supernatant. Dodaj 100 μl rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych (1:200-1:500) do 1x buforu do trwałej ondulacji/płukania. Krótko wirować i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Przemyj komórki, dodając 1 ml buforu do trwałej ondulacji/prania. Krótko wirować i wirować z prędkością 300 x g przez 4 minuty.
  9. Odrzucić supernatant. Dodać 100 μl rozcieńczonych przeciwciał drugorzędowych (1:500-1:1,000). Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Chronić przed światłem, jeśli przeciwciała drugorzędowe są sprzężone z fluorescencją światłoczułą.
  10. Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania. Krótko wirować i wirować z prędkością 300 g przez 4 minuty.
  11. Odrzucić supernatant. Zawieś komórki za pomocą 400 μl buforu barwiącego FACS (PBS/4% FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu załadowania do urządzenia FACS.

9. QPCR w czasie rzeczywistym

  1. Usuń stare pożywki w hodowli iPSC-CM u ludzi. Dodaj 500-700 μl buforu do lizy komórek. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Lizat komórek Scape i przenieść do 1,5 ml probówki wolnej od RNaz. Natychmiast przystąpić do całkowitej ekstrakcji RNA lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Wyizolować całkowite RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Zmierzyć stężenie RNA i ocenić jakość całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru.
  4. Przeprowadź reakcję odwrotnej transkrypcji przy użyciu zestawu do syntezy cDNA. Całkowita objętość reakcji RT wynosi 20 μL, w tym 4 μL mieszaniny reakcyjnej (5x), 1 μL odwrotnej transkryptazy, 1 μg całkowitego RNA i wody wolnej od RNaz.
  5. Inkubować kompletną mieszaninę reakcyjną RT w termocyklerze, stosując następujący protokół: 25 °C przez 5 minut; 46 °C przez 20 minut; 95 °C przez 1 minutę; utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  6. Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:10 za pomocą wody wolnej od nukleaz. Skonfiguruj reakcję qPCR w czasie rzeczywistym, mieszając 1 μl matrycy cDNA, 1 μl starterów/sondy, 10 μl głównej mieszanki qPCR i 8 μl wody wolnej od nukleaz.
  7. Uruchom w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Protokół cykliczny to 50 °C 2 min (zatrzymanie), 95 °C 10 min (zatrzymanie), 95 °C 15 sekund, 60 °C 1 min, powtórz dla 40 cykli.
  8. Zbierz wartości CT dla każdego genu w każdej próbce. Względną obfitość mRNA oblicza się, odejmując wartość CT genu docelowego od wartości CT genu porządkowego. Względna ekspresja genów jest analizowana metodą 2-ΔΔCT.

10. Nagrywanie z użyciem clampu krosowego dla całej komórki

  1. Dysocjuj iPSC-CM na pojedyncze komórki za pomocą roztworu dysocjacji CM, jak opisano wcześniej.
  2. Komórki nasienne o małej gęstości na szkiełkach nakrywkowych pokrytych matrycą błony podstawnej. Hoduj je przez 3-4 dni w Media IV.
  3. Wyciągnij pipety (rezystancja 0,9-1,5 MΩ) z kapilar ze szkła borokrzemianowego za pomocą poziomego ściągacza do mikroelektrod.
  4. Inkubować komórki w roztworze Tyrode'a (pH = 7,35).
  5. Napełnij pipety roztworem elektrody (pH = 7,3) składającym się z następujących substancji chemicznych: 120 mM kwasu asparaginowego, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfokreatyny, 4 mM K-ATP i 2 mM fosfokinazy kreatyny.
  6. Umieść ogniwa w bieżącym trybie cęgowym, używając progu rozkurczowego 1,5-2 impulsu prądowego 5 ms przy 1 Hz.
  7. Rejestruj potencjały czynnościowe (AP) za pomocą wzmacniacza mikroelektrod i płytki akwizycyjnej sterowanej oprogramowaniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprogramowanie ludzkich iPSC z PBMC
Po 7 dniach precultury w pożywce Complete Blood Media, PBMC powiększają się, a ich jądra i cytoplazma stają się widoczne (Rysunek 1B), co wskazuje na gotowość do transfekcji wirusowej. Po transfekcji czynnikami reprogramującymi wirusa Sendai, PBMC będą przechodzić proces reprogramowania epigenetycznego przez kolejny tydzień. Zazwyczaj z transfekcji 1 x 105 PBMC otrzymujemy 30-50 kolonii iPSC...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas przeprogramowywania iPSC bardzo ważne jest, aby hodować PBMC przez 1 tydzień, aż zostaną powiększone o przezroczyste jądra i cytoplazmę. Ponieważ PBMC nie namnażają się, odpowiednia liczba komórek do transdukcji wirusa jest ważna dla pomyślnego przeprogramowania iPSC. Należy wziąć pod uwagę liczbę komórek PBMC, mnogość zakażenia (MOI) i miano wirusa i dostosować je w celu osiągnięcia optymalnych wyników transdukcji. W przypadku różnicowania serca początkowa gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie, aby iPSC osiągnęł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF i SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) grants 1R01HL124245, 1R01HL132520 i R01HL096962 (I.D.). Dr Ming-Tao Zhao był również wspierany przez fundusze startowe z Instytutu Badawczego Abigail Wexner w Nationwide Children's Hospital.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ABI 7300 Szybki system PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Wzmacniacz mikroelektrodUrządzenia molekularneWzmacniacz mikroelektrod
B27 suplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 bez insulinyThermo Fisher ScientificA1895601
BD Cytofix/Cytoperm Zestaw do utrwalania/permeabilizacjiBD Biosciences554714Roztwór do utrwalania/przepuszczalności, bufor do trwałej ondulacji/płukania
Probówka CPTBD Biosciences362753Probówka do separacji komórek krwi
CHIR99021Selleck ChemicalsS2924
CytoTune-iPS 2.0 Zestaw do przeprogramowania SendaiThermo Fisher ScientificA16517Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai
Digidata 1200BAxon InstrumentsPłytka akwizycyjna
Zestaw do miniprzygotowania bezpośredniego zolu Zestaw doekstrakcji RNAZymo ResearchR2050
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330057
Essential 8 mediumThermo Fisher ScientificA1517001E8 do hodowli iPSC
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Alternatywa dla L-glutaminy
Obniżony czynnik wzrostu Matrigel Corning356231Macierz błony podstawnej
iScript cDNA Snythesis KitBio-Rad1708891synteza cDNA
IWR-1-endoSelleck ChemicalsS7086
KnockOut Wymiana surowicy (KSR)Thermo Fisher Scientific10828028
pCLAMP 7.0molekularneOprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych
Rekombinowany ludzki EPOThermo Fisher ScientificPHC9631
Rekombinowany ludzki FLT3Thermo Fisher ScientificPHC9414
Rekombinowany ludzki IL3Peprotech200-03
Rekombinowany ludzki IL6Thermo Fisher Scientific
Rekombinowany ludzki SCFPeprotech300-07
RPMI 1640 średniThermo Fisher Scientific11875093
RPMI 1640 średni, bez glukozyThermo Fisher Scientific11879020
SlowFade Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificS36936Nośnik montażowy
StemPro-34 SFMThermo Fisher Scientific10639011Pożywka hodowlana PBMC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444964qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher ScientificA1217703CM roztwór dysocjacyjny
UltraPure 0,5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020roztwór dysocjacyjny iPSC
Y-27632 2HClSelleck ChemikaliaS1049
Urządzenia PHC0065

Bibliografia

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150(2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Generowanie kardiomiocyt wreprogramowanie iPSCreprogramowanie wirusem Sendair nicowanie kardiologiczner nicowanie monowarstwoweekspansja kardiomiocyt wpatch clampekspresja troponiny Taktywacja Wnt
Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.