Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Podsumowanie

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Streszczenie

Badanie przesiewowe fragmentów to technika, która pomaga zidentyfikować obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów. Biorąc pod uwagę, że kryształy białka docelowego są dostępne i wykazują powtarzalne właściwości dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości, krystalografia jest jedną z najbardziej preferowanych metod badania przesiewowego fragmentów ze względu na swoją czułość. Dodatkowo jest to jedyna metoda dostarczająca szczegółowych informacji 3D o trybie wiązania fragmentu, co jest niezbędne dla późniejszej racjonalnej ewolucji związku. Rutynowe stosowanie metody zależy od dostępności odpowiednich bibliotek fragmentów, dedykowanych środków do obsługi dużej liczby próbek, najnowocześniejszych synchrotronowych linii badawczych do szybkich pomiarów dyfrakcyjnych oraz w dużej mierze zautomatyzowanych rozwiązań do analizy wyników.

Tutaj prezentowany jest kompletny praktyczny przebieg pracy oraz dołączone narzędzia do przeprowadzania badań przesiewowych fragmentów krystalograficznych (CFS) w Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Przed tym przepływem pracy warunki namaczania kryształów, a także strategie gromadzenia danych są optymalizowane pod kątem powtarzalnych eksperymentów krystalograficznych. Następnie, zazwyczaj w procedurze jedno- lub dwudniowej, 96-elementowa biblioteka skoncentrowana na CFS, dostarczana w postaci wysuszonych, gotowych do użycia płytek, jest wykorzystywana do namaczania 192 kryształów, które są następnie indywidualnie chłodzone błyskawicznie. Końcowe eksperymenty dyfrakcyjne można przeprowadzić w ciągu jednego dnia na liniach BL14.1 i BL14.2 na pierścieniu magazynowania elektronów BESSY II obsługiwanym przez HZB w Berlinie-Adlershof (Niemcy). Przetwarzanie danych krystalograficznych, udoskonalanie struktur białkowych i identyfikacja trafień jest szybkie i w dużej mierze zautomatyzowane przy użyciu specjalistycznych potoków oprogramowania na dedykowanych serwerach, co wymaga niewielkiego wkładu użytkownika.

Korzystanie z przepływu pracy CFS w HZB umożliwia przeprowadzanie rutynowych eksperymentów przesiewowych. Zwiększa to szanse na pomyślną identyfikację uderzeń fragmentów jako punktów wyjścia do opracowania silniejszych spoiw, przydatnych do zastosowań farmakologicznych lub biochemicznych.

Wprowadzenie

Pierwszym krokiem w rozwoju leku jest badanie przesiewowe związków pod kątem interesującego celu. Tradycyjnie, duże biblioteki związków rzędu 100 000-1 000 000 wpisów są używane w wysokoprzepustowych testach biochemicznych w przemyśle farmaceutycznym. Strategia ta została uzupełniona o projektowanie leków oparte na fragmentach (FBDD), nowszą metodę, która gwałtownie wzrosła w ciągu ostatnich 20 lat i stała się główną strategią generowania wysokiej jakości potencjalnych kandydatów ze względu na kilka nieodłącznych zalet metody¹. Termin "fragment" odnosi się do małej cząsteczki organicznej zawierającej zwykle mniej niż 20 atomów niewodorowych lub ciężkich (HA). W związku z tym fragment jest znacznie mniejszy niż cząsteczki podobne do leku lub ołowiu (zwykle mniej niż 30 HA) badane w konwencjonalnych badaniach przesiewowych o wysokiej przepustowości. Fragmenty są spoiwami o słabym powinowactwie. Jednak w porównaniu z większymi cząsteczkami, fragmenty są bardziej wszechstronne, ponieważ nawet niewielka ich kolekcja może lepiej reprezentować odpowiednią przestrzeń chemiczną cząsteczek o tym samym rozmiarze². Ponadto, ewolucja przesiewania fragmentów w cząsteczkach ołowiu jest znacznie bardziej efektywna niż optymalizacja już większych cząsteczek^2,3,4,5. Oznacza to, że w oczekiwaniu na wystarczającą czułość detekcji, badania przesiewowe fragmentów mogą być skutecznie stosowane i dostarczają wysokiej jakości punktów wyjścia do dalszej ewolucji związków. Do badań przesiewowych fragmentów można zastosować kilka metod biofizycznych, z których najpopularniejsze to magnetyczny rezonans jądrowy, krystalografia rentgenowska, powierzchniowy rezonans plazmonowy i testy przesunięcia termicznego. Metody te są stosowane równolegle lub sekwencyjnie, w celu zwiększenia wiarygodności trafień i zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych. Jednak niedawno przeprowadzone badanie porównawcze ⁶ zasugerowało, że należy unikać kaskadowych sekwencyjnych badań przesiewowych ze względu na niewielkie nakładanie się różnych metod.

Krystalografia rentgenowska jest dobrze znaną metodą określania struktury w szczegółach atomowych, ale ostatnio została również opracowana jako narzędzie do celów przesiewowych^7,8. Ponieważ kryształy białek tolerują wysokie stężenia fragmentów (np. 100 mM), krystalograficzne badanie przesiewowe fragmentów (CFS) może konkurować z innymi metodami biofizycznymi w zakresie badań przesiewowych fragmentów, a nawet przewyższać je jako metoda przesiewowa pierwszego kroku^6,9. Jednak niezbędnym warunkiem wstępnym dla CFS jest zwalidowany system krystalizacji białka docelowego, który w powtarzalny sposób dostarcza kryształy o właściwościach dyfrakcyjnych do znacznie wysokiej rozdzielczości, zwykle lepszej niż 2 A.

Wyłączną zaletą CFS w porównaniu do wszystkich innych metodologii badania przesiewowego fragmentów jest dostarczanie szczegółowych informacji 3D na temat sposobu wiązania zidentyfikowanych fragmentów. Ta informacja strukturalna jest absolutnie kluczowa dla racjonalnej optymalizacji uderzeń fragmentów w spoiwa o wyższym powinowactwie. Ugruntowane strategie opracowywania to rozwijanie, scalanie i łączenie trafień fragmentów⁵. W ten sposób od samego początku zapewniona jest stosunkowo wysoka wydajność ligandów i można uniknąć wprowadzania niepotrzebnych lub przestrzennie nieodpowiednich grup, zmniejszając w ten sposób koszty syntezy chemicznej. Podsumowując, CFS ma niezrównane zalety jako strategia wyjściowa dla projektowania leków.

Biorąc pod uwagę, że konkretny cel biologiczny spełnia wysokie wymagania CFS dotyczące jakości kryształów, istnieją pewne główne czynniki, które maksymalizują szanse na pomyślny wynik takich kampanii przesiewowych. Zależy to od jakości użytej biblioteki fragmentów, od efektywnego przepływu pracy do przeprowadzenia eksperymentów przed eksperymentem dyfrakcyjnym, na synchrotronowych liniach badawczych o wystarczającej szybkości automatyzacji i gromadzenia danych, a także na sposobach i środkach do w dużej mierze zautomatyzowanego przetwarzania i analizy danych. W tym miejscu przedstawiono pełny przebieg procesu od eksperymentów z namaczaniem kryształów do identyfikacji trafienia, w sposób, w jaki został on z powodzeniem ustalony na liniach badawczych krystalografii makromolekularnej w BESSY II (Rysunek 1). Obiekt jest otwarty na współpracę dla użytkowników akademickich i przemysłowych. Ponadto użytkownicy akademiccy z krajów UE poza granicami Niemiec mogą bezpośrednio ubiegać się o dofinansowanie w ramach projektu iNEXT Discovery.

Istnieją niezbędne warunki wstępne, aby móc rozpocząć kampanię CFS i przeprowadzić protokół opisany w tej pracy: dostępne są dobrze dyfrakcyjne kryształy docelowego białka, które mogą być odtwarzalnie hodowane w dużych ilościach, które są stabilne w temperaturze otoczenia, i które zostały wyhodowane przy użyciu koktajlu krystalizacyjnego bez wysoce lotnych składników. Kolejnym warunkiem wstępnym jest przydatność sieci krystalicznej do eksperymentu. W odpowiedniej sieci interesujące miejsca białka docelowego muszą być wystawione w kierunku kanałów rozpuszczalnika, a tym samym dostępne. Kolejnym poprzedzającym krokiem, który jest opcjonalny, ale mimo to wysoce zalecany, aby zapewnić sukces w przebiegu kampanii CFS, jest optymalizacja warunków namaczania dla eksperymentu. Istotnymi statystykami porównawczymi są tutaj moc dyfrakcyjna kryształu i odpowiednie wskaźniki jakości danych, które są określane podczas procedury skalowania danych. Typowymi czynnikami do optymalizacji są tolerancja DMSO, stężenie buforu i krioprotektor. Chociaż nie jest to ścisły warunek wstępny, jak opisano poniżej, DMSO jako współrozpuszczalnik może pomóc w zwiększeniu rozpuszczalności fragmentów. Typowe testy powinny obejmować namaczanie 0, 3, 6 lub 10% (v/v) DMSO przez noc. Zwiększenie stężenia buforu do 200 lub 300 mM pomaga zapobiec utracie jakości dyfrakcji spowodowanej sporadycznymi efektami zmian pH wynikającymi z wysokich stężeń fragmentów, które mają być stosowane. Na koniec decydujące znaczenie ma ustalenie, czy i jaki dodatkowy krioprotektant jest wymagany i czy można go już włączyć do stanu namaczania. W wielu przypadkach jednak dodatkowa krioprotektorant nie jest potrzebny, ponieważ sam DMSO może działać jako krioprotektorant. Jeśli tak, zaoszczędzi to jeden krok obsługi w końcowym eksperymencie. Większość kryształów potrzebuje mniej krioprotektora, jeśli są chłodzone błyskawicznie na pętlach o odpowiedniej wielkości, minimalizując lub unikając otaczającego ługu macierzystego w jak największym stopniu. Jednak w rzadkich przypadkach warstwa ługu macierzystego jest rzeczywiście konieczna, aby zapobiec uszkodzeniu kryształu po błyskawicznym chłodzeniu.

Liczba trafień uzyskanych w kampanii CFS zależy nie tylko od lekowości docelowego białka i przydatności sieci krystalicznej (patrz wyżej), ale jest również zależna od jakości biblioteki. Jakość biblioteki obejmuje dwa aspekty: wybór związków do biblioteki i konfekcjonowanie związków (tj. w jakiej formie fizycznej są one prezentowane do eksperymentu). Do selekcji związków można zastosować różne strategie. Większość projektów bibliotecznych zakłada maksymalizację różnorodności chemicznej fragmentów. Strategicznym celem może być uwzględnienie właściwości chemicznej fragmentów w celu dalszego projektowania, co zostało zastosowane na przykład w bibliotece Diamond-SGC-iNEXT poised library¹⁰. Jeszcze innym strategicznym celem projektowania bibliotek może być maksymalizacja reprezentacji dostępnej na rynku przestrzeni chemicznej fragmentów poprzez grupowanie oparte na kształcie i farmakoforze, czego przykładem są biblioteki F2X opracowane w HZB¹¹. Dokładniej rzecz ujmując, opracowano 1103-członkowską bibliotekę F2X-Universal Library i reprezentujący 96-złożony podzbiór dla początkowych kampanii CFS, który nazywa się F2X-Entry Screen, a F2X-Entry Screen został pomyślnie zweryfikowany¹¹. Ekran wejściowy F2X jest podstawowym wyborem dla kampanii CFS w HZB. Następnie, większe kampanie mogą być realizowane za pomocą F2X-Universal Library lub biblioteki fragmentów EU-OPENSCREEN z 1056 członkami¹², która jest również oferowana w HZB. Obecnie biblioteki te są dostępne bezpłatnie dla użytkowników linii badawczych krystalografii makromolekularnej synchrotronu BESSY II w Berlinie na podstawie umowy o współpracy. Dotyczy to również użytkowników korzystających z propozycji iNEXT Discovery. Co więcej, F2X-Entry Screen jest dostępny dla wszystkich zainteresowanych naukowców na podstawie umowy o transferze materiałów.

Jeśli chodzi o fizyczną prezentację biblioteki, powszechnie przyjmuje się dwa podejścia: fragmenty są albo używane jako roztwory podstawowe DMSO, albo fragmenty są suszone i unieruchamiane na gotowych do użycia płytkach. W HZB zarówno F2X-Entry Screen, jak i nielotne związki z biblioteki F2X-Universal są prezentowane jako wysuszone związki w 3-soczewkowej 96-dołkowej niskoprofilowej płytce krystalizacyjnej MRC. Prezentacja fragmentów unieruchomionych na płytkach krystalizacyjnych ma dwie zasadnicze zalety: Po pierwsze, umożliwia transport płytek sitowych do domowego laboratorium użytkownika. W związku z tym przedstawione tutaj etapy namaczania i obróbki kryształów w ramach przepływu pracy (kroki 1-3) można przeprowadzić w dowolnym miejscu. Po drugie, można zastosować rozwiązanie wolne od DMSO. Dzięki temu cele wrażliwe na DMSO mogą być łatwo przesiewane, w dużej mierze zachowując oczekiwane współczynniki trafień¹¹. Jednak DMSO zwiększa rozpuszczalność fragmentów, dlatego warto wcześniej sprawdzić tolerancję DMSO wybranego układu kryształów, jak opisano powyżej.

Protokół opisany poniżej opisuje typowy eksperyment z 96-złożonym ekranem, takim jak F2X-Entry Screen. W tym celu należy przygotować na czas około 250 kryształów, które będą mogły być użyte na świeżo. Zdecydowanie zaleca się przygotowanie namoczeń dla wszystkich 96 związków w dwóch egzemplarzach. Zalecane, ale opcjonalne, jest przygotowanie dodatkowych próbnych próbek, które później pomogą w analizie danych przy użyciu podejścia PanDDA (PanDDA) do identyfikacji trafień¹³. Próbne moczenie definiuje się jako eksperymenty z moczeniem na kryształach białka przy użyciu tego samego roztworu do namaczania, co namoczenie fragmentów przez ten sam czas inkubacji, ale nie ma żadnych fragmentów. Jeżeli roztwór do namaczania jest równy warunkom krystalizacji, kryształy mogą być bezpośrednio zebrane z płytki krystalizacyjnej.

W zależności od możliwości zrobotyzowanego zmieniacza próbek, może być konieczne użycie różnych formatów krążków. W chwili obecnej próbki dla linii BL14.1 sterowanej przez HZB muszą być przygotowane w formacie Unipuck, próbki dla linii BL14.2 sterowanej przez HZB muszą być przygotowane w formacie krążka SPINE. W niniejszym protokole zakłada się przygotowanie w formacie Unipuck.

Protokół

1.Moczenie kryształów

1. Weź płytkę sitową (tutaj, płytkę F2X-Entry Screen, Rysunek 2) z zamrażarki -20 °C i umieść ją na ławce/stole na około 30 minut, aby wstępnie ogrzać ją do temperatury pokojowej, unikając w ten sposób wilgoci kondensacyjnej.
2. Ułóż miejsce pracy z dwoma ściśle rozmieszczonymi mikroskopami i wszystkimi potrzebnymi narzędziami (Rysunek 3A). Materiały są wymienione w Tabeli materiałów.
3. Wybierz 3-4 pętle o odpowiedniej wielkości do transferu kryształów, które mają być nasączone i umieść je blisko mikroskopów.
4. Napełnij wnęki szklanych płytek punktowych wodą dejonizowaną lub destylowaną.
5. Przygotuj 5 ml roztworu do namaczania.
6. Rozciąć worek z płytą sitową wstępnie podgrzaną do temperatury pokojowej.
7. Zdejmij pokrywkę i folię z płyty sitowej, trzymając talerz umieszczony na ławie/stole.
8. Zdekantować 5 ml roztworu do namaczania w zbiorniku odczynnika.
9. Napełnij każdy z 96 zbiorników 40 μl roztworu do namaczania za pomocą 12-kanałowej pipety.
10. Umieść ramkę EasyAccess na górze płyty ekranującej i zabezpiecz ją za pomocą dołączonych zacisków, wsuwając je na lewą i prawą stronę urządzenia.
    UWAGA: Ramka EasyAccess to specjalne urządzenie do obsługi wielu kryształów, które zostało opracowane w klasie HZB14. Umożliwia łatwy dostęp do każdej studni poprzez przesunięcie ruchomych płytek, jednocześnie chroniąc pozostałe studnie przed parowaniem.
11. Umieść płytkę przesiewową (wraz z ramką EasyAccess) pod pierwszym mikroskopem, a płytkę krystalizacyjną wraz z kryształami, które mają być nasączone pod drugim mikroskopem.
12. Dobrze rozsuń A1 płyty ekranującej, przesuwając odpowiednią płytkę ze szkła akrylowego ramki EasyAccess palcem lub dołączonym narzędziem piórowym.
13. Dodać 0,4 μl roztworu do namaczania ze zbiornika do fragmentu zawierającego studzienkę (lewa górna soczewka) za pomocą świeżej końcówki pipety. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropla zakrywa zaschnięty fragment, aby mógł się rozpuścić.
    UWAGA: Alternatywnie ten krok można wykonać za pomocą robota pipetującego przed montażem ramki EasyAccess. W ten sposób krople do namaczania ze wszystkich studzienek można było umieścić w jednej automatycznej procedurze. Jednak autorzy zalecają dodanie roztworu do namaczania bezpośrednio przed etapem namaczania, zgodnie z opisem, aby zapewnić, że fragment rozpuszcza się powoli i w obecności kryształu. Pozwala to uniknąć sytuacji, w której kryształ doświadcza nagłego wstrząsu po przeniesieniu do kropli o wysokim stężeniu fragmentów.
14. Pod drugim mikroskopem rozciąć folię uszczelniającą płytki krystalizacyjnej w jednym z dołków, w którym znajdują się docelowe kryształy.
15. Przenieś dwa kryształy za pomocą pętli o odpowiedniej wielkości zamontowanej na kryształowej różdżce do dołka A1 płytki przesiewowej pod pierwszym mikroskopem.
16. Umyj pętlę w przygotowanej szklanej płytce punktowej i osusz ją, delikatnie dotykając chusteczki. Rób to po każdym przeniesieniu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego roztworami do namaczania zawierającymi fragmenty.
17. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy kryształy zostały prawidłowo umieszczone.
18. Przejdź do następnego dołka (np. B1).
19. Powtórz kroki 1.13-1.18 ze wszystkimi 96 dołkami płytki przesiewającej, aż każda kropla do namaczania będzie zawierała dwa kryształy.
20. Wyjmij płytkę sitową (wraz z ramką EasyAccess) spod mikroskopu i umieść ją na ławce/stole.
21. Zdejmij ramkę EasyAccess z płyty ekranującej.
22. Uszczelnić płytkę sitową folią uszczelniającą i umieścić ją odpowiednio w inkubatorze do krystalizacji lub szafce, w której hodowano kryształy.
23. Inkubować przez optymalny czas namaczania. Nocleg jest zazwyczaj wygodny.
24. (Opcjonalnie) Przygotowanie około 40 kryształów apo (tj. udawane moczenie)
    1. Weź 3-soczewkową, 96-dołkową, niskoprofilową płytkę krystalizacyjną MRC i napełnij dwie kolumny 40 μl roztworu do namaczania na studzienkę za pomocą 12-kanałowej pipety.
    2. Umieść ramkę EasyAccess na płycie krystalizacyjnej i zabezpiecz ją dołączonymi zaciskami, wsuwając je na lewą i prawą stronę urządzenia.
    3. Otwórz płytkę ze szkła akrylowego studni A1.
    4. Umieść 0,4 μl roztworu do namaczania w każdej z dwóch lewych soczewek studzienki.
    5. Przenieś 2-3 kryształy do każdej kropli. Po każdym transferze umyj pętlę w przygotowanej szklanej płytce punktowej i wysusz, delikatnie dotykając chusteczki.
    6. Przejdź do następnego dołka (np. B1).
    7. Powtarzaj kroki 1.24.4-1.24.6, aż około 40 kryształów będzie gotowych do inkubacji.
    8. Wyjmij płytkę krystalizacyjną (wraz z ramką EasyAccess) spod mikroskopu na ławkę/stół i wyjmij ramkę EasyAccess.
    9. Uszczelnij płytkę krystalizacyjną folią uszczelniającą i umieść ją we wspomnianym wcześniej inkubatorze lub szafce do krystalizacji.
    10. Inkubować przez ten sam czas, co płytkę przesiewającą.

2.Zbieranie kryształów

1. Wyjąć płytkę(-y) inkubacyjną(-e) odpowiednio z inkubatora lub szafki.
2. Ułóż miejsce pracy za pomocą jednego mikroskopu i wszystkich potrzebnych narzędzi (Rysunek 3B). Materiały są wymienione w Tabeli materiałów.
3. Przygotuj piankę Unipuck dewar z 3 pokrywkami Unipuck (tj. obudowami próbki) i napełnij ją ciekłym azotem (LN₂).
   UWAGA: Przestrzegać odpowiednich środków ostrożności podczas pracy z LN₂ (tj. nosić okulary ochronne i używać odpowiedniego sprzętu ochronnego). Najlepiej jest zaopatrzyć się w świeży LN₂ kilka razy podczas sesji, aby uniknąć kondensacji wody w pojemniku LN₂. Wykonując całą poniższą procedurę, upewnij się, że poziom LN₂ w piance dewara zawsze sięga górnej krawędzi dewara. Upewnij się również, że LN₂ jest wolny od lodu; często wymieniaj LN₂ (np. raz na 45 minut) lub najpóźniej, jeśli zacznie gromadzić się lód. Następnie napełnij drugą piankę dewara i przenieś do niej Unipucks. Opróżnij lodowatą piankę dewara i usuń resztki lodu i wilgoci za pomocą suszarki.
4. Zdejmij folię z płyty ekranującej i umieść ramkę EasyAccess na górze.
5. Dobrze się rozsuń A1.
6. Zbierz dwa kryształy z kropli i schładzaj je błyskawicznie w LN₂ (jeden po drugim), zanurzając szybkim ruchem pionowym w LN₂, a następnie wkładając próbkę w odpowiednią pozycję krążka. Zrób odpowiednie notatki na przykładowym arkuszu śledzenia.
7. Etap krioochrony (jeśli to konieczne dla docelowych kryształów). W takim przypadku należy wykonać ten krok zamiast 2.6.
   1. Umieść 0,4 μl roztworu do namaczania, w tym krio-ochronie, na lewej dolnej soczewce studzienki.
   2. Przeciągnij pętlę z kryształem zamontowanym od kropli w lewej górnej soczewce powoli przez roztwór w lewej dolnej soczewce, trzymając kryształ w pętli, a następnie ostudź błysk w LN₂. Zbierz w ten sposób dwa kryształy.
      UWAGA: W krokach 2.6 i 2.7 upewnij się, że czas, w którym kryształ znajduje się w pętli i jest wystawiony na działanie powietrza, jest bardzo krótki. Zanurzanie (tj. pionowy spadek próbki w dewarze wypełnionym LN₂) powinno być wykonane tak szybko, jak to możliwe. Zapewnia to wysoką jakość próbki i zapobiega powstawaniu pierścieni lodowych w danych. Śledź próbki (tj. zwróć uwagę, czy kryształy mają uszkodzenia itp.), aby nadać priorytet duplikatom dla kolejnych pomiarów rentgenowskich, użyj do tego szablonu. Nawet jeśli kryształy mają pęknięcia, "włoski" lub inne wady spowodowane namaczaniem, nadal można ich używać i zawsze należy je zbierać. W przypadku, gdy kryształy rozpadły się na kilka kawałków, należy zebrać dwa z największych/najlepiej wyglądających kawałków. Rysunek 5 pokazuje kilka przykładów jak takie kryształy mogą wyglądać. Wszystkie pokazane kryształy dostarczyły nadal użytecznych zestawów danych w odpowiedniej kampanii¹¹, podkreślając, że warto zbierać kryształy po namoczeniu, nawet jeśli wystąpiły znaczne zmiany morfologiczne.
8. Przejdź do następnej studzienki i powtarzaj kroki 2.5 - 2.6./2.7, aż wszystkie trzy krążki zostaną wypełnione.
9. Dodaj podstawy Unipuck na wierzch pokrywek po wstępnym schłodzeniu ich w LN₂.
10. Przechowuj Unipucks na regałach magazynowych w dewarze transportowym lub magazynowym dewar.
11. Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie studzienki płyty sitowej zostaną przetworzone.
12. (opcjonalnie) Jeśli przygotowano sztucznie nasączone kryształy, zbierz je w podobny sposób, jak opisano wcześniej.
    UWAGA: Jeśli dwa kryształy dla każdego z 96 warunków płytki przesiewającej mogą być chłodzone błyskawicznie, będzie miejsce na 32 makietowane kryształy apo, aby wypełnić 14 Unipucks.
13. Przechowuj Unipucks w LN₂ do czasu pomiaru.

3.Gromadzenie danych

1. Przenieś Unipucks na linię BL14.1. Jeśli w kroku 2 użyto krążków SPINE, przenieś je do linii BL14.2.
2. Wykonaj standardowe pomiary na linii badawczej, korzystając ze szczegółowych zaleceń podanych poniżej. Szczegóły dotyczące obiektu i programu sterującego eksperymentem MXCuBE2 zostały przedstawione wcześniej^15,16. Rysunek 4 pokazuje wnętrze eksperymentalnych budek linii BL14.1 i BL14.2, a także przykładowy zrzut ekranu oprogramowania sterującego MXCuBE2 na linii BL14.1.
   1. Aby zmaksymalizować oszczędność czasu i przepływność, pomiń zbieranie obrazów testowych. Odległość od próbki do detektora zostanie ustalona na wartość, która jest odpowiednia dla górnej granicy rozdzielczości układu kryształów wyznaczonej we wcześniejszych eksperymentach. Jeśli strategia zbierania danych nie została wcześniej zoptymalizowana, zbierz 1800 obrazów o kącie 0,2 stopnia każde z czasem naświetlania 0,1 s na obraz.
   2. Najlepiej przetestować strategię zbierania danych we wcześniejszych eksperymentach przy użyciu nasączonych makietą kryształów apo. W przypadku grup przestrzeni o wyższej symetrii 1200 obrazów lub nawet 900 obrazów (tj. odpowiednio 240° lub 180°) da już kompletne zestawy danych z dobrymi statystykami, niezależnie od kąta początkowego zbierania danych.
      UWAGA: Wyższa redundancja i dokładniejsze cięcie mogą zapewnić lepszą jakość danych¹⁷. Jednak zastosowanie tej zaproponowanej tutaj strategii "wystarczająco, ale nie więcej" jest doskonałym kompromisem między jakością, czasem zbierania danych, a także wymaganiami obliczeniowymi do późniejszej analizy. W opisany sposób możliwe jest zebranie 200 danych w ciągu 24 godzin na liniach BL14.1 i BL14.2. Niemniej jednak próbki powinny być traktowane priorytetowo.
   3. Najpierw zbierz zestawy danych dyfrakcyjnych dla jednej próbki na warunek fragmentu, w oparciu o priorytetyzację w kroku 2.6./2.7 (tj. zbierz dane dla duplikatu o wyższym priorytecie).
   4. Dla tych doświadczeń, o których mowa w ppkt 3.2.3, w których zbieranie danych nie powiodło się, utracono dyfrakcję lub wystąpiły poważne pierścienie lodowe, należy zebrać dane dla drugiej zduplikowanej próbki odpowiedniego stanu fragmentu.
   5. Zbierz zestawy danych dyfrakcyjnych kryształów apo (jeśli zostały przygotowane zgodnie z krokami 1.24 i 2.12).
   6. Zbierz zestawy danych dyfrakcyjnych pozostałych duplikatów każdego warunku fragmentu.
   7. W programie MXCuBE2 dopasuj identyfikatory zbiorów danych kampanii CFS do następującego wzorca: -<>-[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (np. MyProtein-F2XEntry-B05a, gdzie "B05" oznacza studnię (tj. stan fragmentu na ekranie), a następujące po nim "a" oznacza pierwszy duplikat).

4.Przetwarzanie danych

1. Do analizy danych kampanii CFS użyj FragMAXapp, internetowego rozwiązania do sterowania analizą multipleksową w celu przetwarzania automatycznego udoskonalania i oceny trafień PanDDA danych CFS¹⁸ (et al. FragMAXapp, dane niepublikowane). W wersji FragMAXapp wdrożonej w HZB dostępne są następujące programy/potoki: XDSAPP¹⁹, Xia2-DIALS i Xia2-XDS²⁰, fspipeline⁷, DIMPLE²¹, Phenix LigFit²², PanDDA^13,23. Użyj dobrze dopracowanego modelu wejściowego białka docelowego jako danych wejściowych do automatycznego udoskonalania; W przeciwnym razie dokonaj skrupulatnego dopracowania jednego makiety kryształu w wysokiej rozdzielczości, który został zebrany podczas kampanii.
   UWAGA: Kluczowym elementem identyfikacji trafień jest PanDDA. Szczegóły są wyjaśnione w odpowiednich publikacjach^13,23. Krótko mówiąc, PanDDA automatycznie oblicza mapy gęstości elektronowej zestawu zestawów danych w kampanii CFS. Są one następnie przyjmowane jako niewiążące warunki fragmentów i uśredniane w celu wygenerowania tak zwanego modelu stanu podstawowego. Model stanu podstawowego jest następnie używany do wyprowadzenia lokalnych rozbieżności między każdą mapą gęstości elektronów a mapą stanu podstawowego, przy użyciu wskaźników Z związanych z wokselami. Następnie, dla obszarów o wysokich wynikach Z, tworzona jest tak zwana mapa PanDDA poprzez precyzyjne odejmowanie gęstości stanu podstawowego od odpowiedniej mapy. To znacznie zwiększa widoczność zdarzeń wiązania fragmentów.
2. Aby zmaksymalizować wynik PanDDA, należy zastosować podejście dwuetapowe. Po pierwsze, wykonanie uruchomienia PanDDA (pandda.analyse) ze standardowymi ustawieniami. Nawet jeśli zebrano makiety kryształów, ich tożsamość nie zostanie uwzględniona jako parametr (co jest jednak możliwe), aby umożliwić bezstronne wygenerowanie modelu stanu podstawowego przez PanDDA na podstawie wszystkich dostępnych danych. Następnie dane wyjściowe są oceniane przez użytkownika za pomocą tzw. inspekcji PanDDA w Coot²⁴. W tym miejscu należy odnotować trafienia ze stosunkowo dużą pewnością, kończąc pierwszy krok.
3. Po drugie, uruchom ponownie krok pandda.analyse z wyłączeniem wstępnych trafień (określonych w pierwszym kroku) z modelu stanu podstawowego za pomocą opcji wiersza poleceń --exclude_from_characterisation="". Więcej szczegółów można znaleźć na stronach pomocy PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). W ten sposób zestawy danych, które są wyraźnymi trafieniami, a zatem zasłaniałyby model stanu podstawowego, gdyby zostały uwzględnione, są ignorowane. Prowadzi to do ulepszenia modelu stanu podstawowego, a tym samym do poprawy ogólnych wyników. Na koniec przeprowadzana jest dokładna inspekcja PanDDA w celu zakończenia identyfikacji trafień.
   UWAGA: FragMAXapp zawiera również opcję wyjściową do zapisywania modelowanych stanów powiązanych lub przygotowania danych do przesłania PDB, więcej szczegółów na stronach FragMAX (https://fragmax.github.io/).

Wyniki

W ramach wcześniej zgłoszonych kampanii walidacyjnych F2X-Entry Screen¹¹, przeprowadzono trzy kampanie na linii badawczej BioMAX w MAX IV i jedną kampanię przeprowadzono na linii BL14.1 w HZB. W tej ostatniej kampanii szczególny zestaw warunków przesiewowych F2X-Entry przy użyciu warunków namaczania, które nie zawierały DMSO, został przebadany pod kątem kompleksu białkowo-białkowego drożdży Aar2 i podobnej do RNazy domeny drożdży Prp8 (AR). Wybrany zestaw warunków obejmuje trafienia, które zostały znalezione we wcześniejszej kampanii F2X-Entry Screen przeciwko AR w stanie nasiąkania zawierającym DMSO¹¹, (tj. w kampanii przeprowadzonej w HZB te trafienia były ponownie sprawdzane przy braku DMSO). Rysunek 7 pokazuje przegląd trafień uzyskanych po przeanalizowaniu danych za pomocą kombinacji FragMAXapp XDSAPP do przetwarzania, fspipeline do automatycznego udoskonalania i późniejszego znajdowania trafień za pomocą PanDDA.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie przebiegu eksperymentu z krystalograficznym badaniem fragmentów (CFS) z naciskiem na specjalne środowisko w Helmholtz-Zentrum Berlin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Formułowanie i pakowanie ekranu wejściowego F2X.Ekran z 96 związków jest dostępny na 3-soczewkowej 96-dołkowej niskoprofilowej płycie MRC, uszczelnionej folią i zapakowanej próżniowo. 96 związków sita suszy się z roztworów DMSO w dwóch z trzech soczewek każdej studzienki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Fotografia stołu warsztatowego CFS w laboratorium przygotowawczym HZB. Wyświetlane są zestawy narzędzi niezbędnych do A) namaczania i B) zbierania kryształów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Stacje końcowe do zbierania danych i oprogramowanie sterujące.A) Fotografia eksperymentalnej klatki linii badawczych HZB-MX BL14.1 (po lewej) i BL14.2 (po prawej)¹⁵. B) Zrzut ekranu interfejsu sterowania eksperymentem MXCuBE2¹⁶ używanego w BL14.1 do zbierania danych dyfrakcyjnych. W BL14.2 używany jest bardzo podobny interfejs. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zdjęcia niektórych próbek krystalicznych w środowisku kriogenicznym przed zebraniem danych. Obrazuje to zmienność morfologii kryształów po przeprowadzeniu namaczania fragmentów i zebraniu kryształów. Fotografie zostały wykonane na linii badawczej BioMAX (synchrotron MAX IV, Lund, Szwecja) dla próbek AR pobranych tam w ramach F2X-Entry Screen validation¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Zrzut ekranu przedstawiający klasę FragMaxApp¹⁸ zainstalowaną w HZB dla wygodnej analizy danych. Więcej szczegółów w: et al., FragMAXapp, dane niepublikowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przegląd wyników kampanii CFS F2X-Entry vs. AR (bez DMSO). Kompleks białkowy AR jest pokazany w widoku kreskówkowym, z Aar2 pokolorowanym na szaro i podobną do RNaseH domeną Prp8 pokolorowaną na niebiesko. Trafienia fragmentów kampanii są pokolorowane kolorami elementów (C - żółty, O - czerwony, N - niebieski, S - pomarańczowy, Cl - jasny cyjan). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przykładowy szablon arkusza śledzenia.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Aby kampania CFS zakończyła się sukcesem, konieczne jest przestrzeganie opisanych warunków wstępnych (patrz Wprowadzenie). Niezawodny system krystalizacji jest potrzebny do powtarzalnego wzrostu wielu dobrze dyfrakcyjnych kryształów, a dobrze wyrafinowana struktura jest potrzebna jako wejściowy model apo do automatycznego udoskonalania. Ważne jest również, aby sprawdzić, czy miejsce docelowe na białku (miejsce aktywne lub obszar interfejsu) jest dostępne dla fragmentów sieci krystalicznej. Bardzo ważne jest, aby wcześniej zoptymalizować warunki namaczania, aby upewnić się, że namaczanie nie pogorszy znacząco jakości kryształów. Zaniedbanie tych aspektów z dużym prawdopodobieństwem doprowadzi do nieoptymalnego eksperymentu, który będzie miał ograniczone zastosowanie i w najgorszym przypadku będzie wymagał powtórzenia całego eksperymentu.

Opisany powyżej protokół przedstawia procedury, które są przestrzegane podczas standardowej kampanii CFS. Jeśli wszystkie warunki wstępne są spełnione, co najmniej 90% wszystkich nasączonych kryształów powinno wykazywać dyfrakcję w wysokiej rozdzielczości w eksperymencie dyfrakcyjnym. Jeśli tak nie jest, czas namaczania może zostać skrócony do kilku godzin, a nawet minut. Ze względu na dobrą rozpuszczalność większości fragmentów, powinno to wystarczyć do uzyskania przyzwoitych wartości zajętości. Ponadto typowa kampania CFS spowoduje wskaźnik trafień na poziomie około 10% lub wyższym. W przypadku kampanii walidacyjnych F2X-Entry Screen¹¹ i trwających kampanii użytkowników z tą samą biblioteką zaobserwowano jeszcze wyższe wskaźniki trafień (20% i więcej, dane nie są pokazane).

Ogólnym zastrzeżeniem dotyczącym przesiewowych fragmentów krystalograficznych jest obecność krystalograficznych miejsc kontaktowych. Mogą one albo zasłaniać a priori znane miejsca aktywne (do sprawdzenia przed badaniem przesiewowym, patrz wyżej), albo te miejsca kontaktowe często zapewniają również kieszenie i gorące punkty, w których mogą wiązać się fragmenty. Takie uderzenia fragmentów będą artefaktami sieci krystalizacyjnej i prawdopodobnie nie będą wiązać się z białkiem w roztworze. Zdarzenia te występują częściej w eksperymentach z namaczaniem niż w eksperymentach z kokrystalizacją (prawdopodobnie ze względu na wyższe stężenia fragmentów stosowane w eksperymentach z namaczaniem). Jednak, jak wynika z wcześniejszych doświadczeń, stanowią one na ogół jedynie niewielką część uzyskiwanych trafień. Na przykład w kampanii walidacyjnej F2X-Entry Screen z użyciem endotiapepsyny (EP) i spliceosomalnego kompleksu białkowo-białkowego Prp^8RNaseH i Aar2 (AR), większość trafień wystąpiła w obiecujących miejscach¹¹. W przypadku EP 27 z 37 zaobserwowanych zdarzeń wiązania było zlokalizowanych w miejscu aktywnym (tj. w szczelinie peptydowej tej proteazy). 10 zdalnych zdarzeń wiązania składa się z dwóch zdarzeń wiązania wystawionych na działanie rozpuszczalnika i ośmiu zdarzeń wiązania kontaktowego kryształu (odpowiadających pięciu unikalnym trafieniom). Wykluczenie tych trafień z kryształowym kontaktem nadal odzwierciedlałoby ogólny wskaźnik unikalnych trafień na poziomie 24% w kampanii EP. Ważne jest również, aby zauważyć, że zdarzenia wiązania odległe od znanego miejsca aktywnego (z wyjątkiem krystalicznych spoiw kontaktowych) mogą być również potencjalnie interesujące (np. ujawniając nowe gorące punkty lub miejsca allosteryczne białka). W przypadku kampanii AR (w tej samej publikacji), spośród 23 zaobserwowanych zdarzeń wiązania, siedem było zlokalizowanych w kontaktach kryształów, jedno było zlokalizowane na bezpośrednim granicy dwóch białek, siedem było zlokalizowanych w znanych miejscach interakcji białko-białko z innymi partnerami wiążącymi w szerszym kontekście biologicznym (stąd różne etapy składania spliceosomu), osiem zdarzeń wiązania ujawniło dwa gorące punkty na AR o nieznanej jeszcze funkcji, a jedno było w rozpuszczalniku wystawionym na działanie rozpuszczalnika powierzchni^{Prp8 RnaseH}. W związku z tym, wyłączając zdarzenia na stykach kryształowych i singletonie^{Prp8 RnaseH} , liczba potencjalnie użytecznych zdarzeń wiązania wynosi 15 (co odpowiada 14 unikalnym trafieniom), co daje współczynnik trafień wynoszący 15,6%. Trafienia te mogą być punktem wyjścia do projektowania modulatorów interakcji białko-białko lub dla związków narzędziowych mających na celu zbadanie dwóch odkrytych gorących punktów Aar2. Podsumowując, również w zgodzie z prowadzonymi kampaniami użytkowników, często tylko niewielka część trafień w badaniu fragmentów krystalograficznych musi zostać pominięta jako artefakty. Będzie to jednak również w dużej mierze zależne od celu.

Jeśli wskaźnik trafień jest znacznie niższy, może to wskazywać na jeden z następujących problemów związanych z białkiem docelowym. Na przykład w kampanii CFS przeciwko wirusowej proteazie cysteinowej zaobserwowano wskaźnik trafień wynoszący tylko 3% (dane nie pokazane). Okazało się, że użyte białko było prawdopodobnie chemicznie zmodyfikowane w swoim miejscu aktywnym. W takim przypadku inny preparat białkowy może rozwiązać problem. Jeśli kryształy są bardzo nietolerancyjne DMSO, ekran F2X-Entry może być również używany bez DMSO, chociaż wyniki mogą się w pewnym stopniu różnić. Większość trafień uzyskanych w obecności DMSO pojawi się również pod jego nieobecność. Pojawią się również trafienia, których nie można zaobserwować przy braku DMSO, mimo że można je zaobserwować w jego obecności. I wreszcie, będą takie, które pojawią się tylko pod nieobecność DMSO.

Najpoważniejsza trudność występuje, gdy białko ulega indukowanemu ruchowi drgawkowemu po związaniu substancji. Najprawdopodobniej sieć krystaliczna nie będzie tolerować ruchu białka, a kryształy rozpadną się. W takim przypadku jedynym wyjściem jest ucieczka się do kokrystalizacji białka i fragmentów. Może to jednak prowadzić do powstania nowych form krystalicznych. W związku z tym duża część automatyzacji całego procesu nie będzie już działać wydajnie. Na szczęście w większości dotychczasowych kampanii CFS prowadzonych w HZB nie spotkano się z tego typu problemem. Może się zdarzyć, że słabe wiązanie fragmentu nie zapewnia wystarczającej ilości energii, aby wywołać ruch białka, w szczególności jeśli skrystalizowana konformacja jest stabilizowana przez siły upakowania kryształów.

Innym poważnym ograniczeniem metody, z którym autorzy zetknęli się do tej pory, jest sytuacja, w której koktajl krystalizacyjny (a więc roztwór do namaczania) zawiera związki lotne. Wtedy prawie niemożliwe staje się wykonanie całej obsługi kryształów w sensowny sposób.

Różne białka mogą w mniejszym lub większym stopniu zawierać miejsca podatne na działanie leków. Na przykład w interakcjach białko-białko zwykle pośredniczą rozszerzone płaskie powierzchnie, które są trudniejsze do celu. Szybkość wiązania fragmentów będzie zatem prawdopodobnie zależeć od struktury powierzchni molekularnej białka. W skrajnym przypadku białko może nie zawierać żadnych odpowiednich gorących punktów na powierzchni, które służą jako miejsca docelowe do wiązania fragmentów. Tym samym, mimo skrupulatnie przeprowadzonego eksperymentu, z seansu nie wynikną żadne trafienia fragmentów. Autorzy jednak do tej pory nie spotkali się z taką sytuacją.

Zasadniczo, korzystając z protokołu opisanego powyżej, nasączanie i zbieranie kryształów w ramach kampanii CFS można przeprowadzić w dowolnym laboratorium, które jest wyposażone do obróbki kryształów. To odróżnia metodologię w HZB od innych obiektów CFS i może być zaletą w niektórych przypadkach. Na przykład, jeśli kryształy nie mogą być łatwo ponownie wyprodukowane w innym miejscu lub jeśli podróżowanie eksperymentatorów jest ograniczone (np. w sytuacji pandemii na całym świecie), użytkownicy HZB otrzymują cały sprzęt (krążki, narzędzia, ramkę EasyAccess, uchwyty na próbki itp.) jako zestaw przenośny.

Jednak wymagania dotyczące dużej liczby pojemników na próbki i pojemności przechowywania kriogenicznego są nadal wygodniej spełniane w dedykowanych obiektach CFS. Co więcej, potrzeba gromadzenia wielu zestawów danych dyfrakcyjnych zdecydowanie przemawia za lokalizacją tych obiektów w pobliżu linii badawczych, które są nastawione na wysoką przepustowość próbek. Przykładami są linie badawcze I04-1 w Diamond Light Source i powiązanym obiekcie XChem w Wielkiej Brytanii ^8,25, linie badawcze MASSIF w ESRF we Francji²⁶ lub obiekt FragMAX w linii badawczej BioMAX w MAX IV w Szwecji¹⁸.

W przyszłości można sobie wyobrazić projektowanie eksperymentów CFS bez konieczności całkowitego obchodzenia się z kryształami. Odnotowano pierwsze postępy w tym kierunku. Na przykład poprzez akustyczny transfer cieczy umożliwiający mieszanie zarówno roztworów zawierających kryształy, jak i roztworów fragmentów bezpośrednio na siatkowych uchwytach na próbki²⁷. Inne podejście zastosowano do badań przesiewowych ligandów opartych na XFEL. W eksperymencie potwierdzającym słuszność zasady przygotowano zawiesinę krystaliczną w partii, a dane dotyczące namaczania i dyfrakcji przeprowadzono na krzemowym układzie docelowym²⁸. Podejścia te są jednak nadal w fazie rozwoju i są dalekie od zastosowania do szerokiego zakresu docelowych białek lub ich rutynowego stosowania w obiektach CFS.

Wraz z protokołem w tej pracy nakreślono szczegółowe instrukcje, jak skutecznie przeprowadzić kampanie CFS w prosty sposób w HZB (i gdzie indziej), a także podano ogólne wskazówki i przydatne praktyczne wskazówki dotyczące przygotowywania i przeprowadzania takich eksperymentów z większymi szansami na sukces. Ostatecznie, lepsze szanse i wskaźniki sukcesu w badaniach przesiewowych CFS w dużej mierze przyczyniają się do skutecznego zapewnienia punktów wyjścia do dalszego rozwoju związków narzędziowych lub kandydatów na leki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 &mikro; Pipet L	Eppendorf	EP3123000012
Piper 12-kanałowy, 100 &mikro; L	Eppendorf	EP4861000791
Suszarka nadmuchowa	TH-Geyer	9.106 788
Kryształ zawierający płytki			Zawiera kryształy do namoczenia
Inkubator			Zapewniający stałą temperaturę do eksperymentu krystalizacji, przy HZB: 20° C
Pętle MicroLoop o podwójnej grubości (LD) o różnych rozmiarach apertury	MiTeGen	różne, np. M5-L18SP-75LD	250 pętli w odpowiednim rozmiarze potrzebnym dla protokołu, mogą być dostarczone przez HZB
Ramka EasyAccess	HZB		Ramka EasyAccess to specjalne urządzenie do obsługi wielu kryształów, które zostało opracowane w HZB (Barthel i in., 2021).
Płyta F2X-Entry Screen	przez HZB		Siatka wejściowa F2X (Wollenhaupt i in., 2020)
Szklana płyta punktowa	VWR	MARI1406506
Ciekły azot			Co najmniej napełniona puszka o pojemności 5 litrów Puszka
do przechowywania ciekłego azotu
kryształowa różdżka	MiTeGen	M-R-1013198
Mikroskopy	Leica	n.a.MRC
3-soczewkowa 96-dołkowa niskoprofilowa płytka krystalizacyjna	SwissCI	3W96TLP-UVP	Do sztucznie nasączonych kryształów (opcjonalnie)
Zbiornik odczynnika	Carl Roth	EKT6.1	o pojemności 25 ml
Szablon			https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx
Skalpel	B. Braun	BA825SU
Folia uszczelniająca do płytek do mikromiareczkowania	GreinerBioOne	676070
Półkowe laski do wysyłki krążków (do Unipucks)	MiTeGen	M-CP-111-065	2 laski wykonane z aluminium; mogą być dostarczone przez rozwiązanie do
namaczania HZB			Potrzebne jest co najmniej 5 ml
Roztwór do namaczania, w tym krio-protectant, 150µ L			Potrzebne tylko wtedy, gdy roztwór do namaczania nie jest już krio-protektantem
Tkanki	Roth (Kimberly Clark Professional)	AA64.1
Transport dewar (Whartington dry shipper)	MiTeGen	TW-CX100	2 Dewary podróżne do przechowywania 2 lasek unuck, alternatywnie można użyć dewara do przechowywania typu VHC35 lub podobnego.
Dewary piankowe Unipuck z pokrywą	MiTeGen	M-CP-111-022	dwa dewary piankowe specjalnie nadające się do obsługi Unipuck opisane w protokole jeśli używane są krążki SPINE, może być konieczne zastosowanie różnych piankowych dewarów.
Zestaw startowy Unipuck	MiTeGen	M-CP-UPSK001	Może być dostarczony przez HZB
Unipucks	MiTeGen	M-CP-111-021	14 unipucks; może być dostarczony przez HZB