Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez świnie (piPSC) w neuronalne komórki progenitorowe (NPC)

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę chemicznego różnicowania i hodowli nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych przez świnie pluripotencjalnych komórek macierzystych (piPSC).

Streszczenie

neurony pochodzące z iPSC są atrakcyjnymi modelami in vitro do badania neurogenezy i wczesnych zmian fenotypowych w chorobach psychicznych, głównie gdy większość modeli zwierzęcych używanych w badaniach przedklinicznych, takich jak gryzonie, nie jest w stanie spełnić kryteriów przełożenia wyników na praktykę kliniczną. Ssaki naczelne, psy i świnie są uważane za bardziej odpowiednie modele do celów badań biomedycznych i opracowywania leków, głównie ze względu na ich fizjologiczne, genetyczne i anatomiczne podobieństwa do ludzi. Model trzody chlewnej zyskał szczególne zainteresowanie neuronauką translacyjną, umożliwiając testowanie bezpieczeństwa i allotransplantacji. W tym artykule opisano wytwarzanie iPSC świń wraz z ich dalszym różnicowaniem w nerwowe komórki progenitorowe (NPC). Wygenerowane komórki wykazywały ekspresję markerów NPC Nestin i GFAP, potwierdzone przez RT-qPCR, i były dodatnie dla Nestin, b-tubuliny III i Vimentiny przez immunofluorescencję. Wyniki te pokazują dowody na generowanie komórek podobnych do NPC po indukcji in vitro za pomocą inhibitorów chemicznych z dużego modelu zwierzęcego, interesującego i odpowiedniego modelu dla badań medycyny regeneracyjnej i translacyjnej.

Wprowadzenie

Mimo że wielu badaczy stara się lepiej zrozumieć mechanizmy komórkowe i patologiczny rozwój chorób neurologicznych u ludzi, istnieje wiele ograniczeń w stosowaniu technik nieinwazyjnych na ludziach, takich jak rezonans magnetyczny (MRI), oraz niemożność, w większości przypadków, zastosowania technik inwazyjnych, takich jak śledzenie szlaku i zapis wewnątrzkomórkowy¹. Wyzwaniem jest również uzyskanie pośmiertnej tkanki mózgowej dobrej jakości, ponieważ przedłużające się stany agonalne dawców mogą wpływać na mózg i zakłócać badania². W związku z tym istnieje potrzeba, aby modele zwierzęce, które są wykorzystywane od kilkudziesięciu lat w badaniach translacyjnych, były do dziś zarówno istotne, jak i wątpliwe. Wybór konkretnego modelu zwierzęcego staje się centralną kwestią w niedawnym projektowaniu i planowaniu eksperymentów, co jasno pokazuje, że w celu uzyskania spójnych wyników, wybór najbardziej odpowiedniego modelu wymaga dogłębnej wiedzy nie tylko na temat fizjologii różnych gatunków, ale także, co ważne, na temat konkretnych celów badań³.

Jednak modele zwierzęce często mają ograniczenia podczas kapitulacji struktury i rozwoju ludzkiego mózgu, ponieważ mają pewne unikalne cechy rozwojowe, anatomiczne, molekularne i genetyczne. W związku z tym nieco trudno jest interpretować i ekstrapolować dane zebrane od zwierząt wykorzystywanych w badaniach, takie jak dane od gryzoni¹.

Wśród szerokiej gamy dostępnych obecnie modeli zwierzęcych, w tym modeli transgenicznych, niektóre duże zwierzęta są uważane za bardzo cenne, takie jak naczelne inne niż ludzie, psy i świnie⁴. Fizjologiczne, genetyczne i anatomiczne podobieństwa między ludźmi a świniami pod względem wielkości narządów podkreślają znaczenie tych modeli w opracowywaniu podejść diagnostycznych i terapeutycznych. W szczególności model trzody chlewnej zyskał szczególne zainteresowanie neuronauką translacyjną, umożliwiając testowanie bezpieczeństwa i allotransplantacji. Był on wykorzystywany w badaniach związanych ze schorzeniami układu krążenia, płuc, przewodu pokarmowego, a w szczególności do testowania nowych terapii (np. w badaniach medycyny regeneracyjnej z komórkami macierzystymi^{5, 6}).

W tym kontekście, modele in vitro, a dokładniej neurony pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), są atrakcyjnymi modelami umożliwiającymi badanie neurogenezy i wczesnych zmian fenotypowych w chorobach psychicznych, głównie gdy większość modeli zwierzęcych używanych w badaniach przedklinicznych, takich jak gryzonie, nie jest w stanie spełnić kryteriów pozwalających na przełożenie wyników na praktykę kliniczną.

Użycie iPSC przyniosło ogromne korzyści neuronauce, umożliwiając modelowanie chorób in vitro, szczególnie dzięki użyciu neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC (NPC), ponieważ NPC okazały się być interesującym narzędziem do modelowania chorób in vitro^7,8,9. iPSC zostały pomyślnie wygenerowane od pacjentów z chorobą Alzheimera¹⁰, schizofrenia¹¹, oraz wiele innych chorób, takich jak choroba Parkinsona, zespół Retta, rdzeniowy zanik mięśni, zespół Downa i stwardnienie zanikowe boczne, opracowane przez Mungenast i współpracowników². Przedkliniczne systemy modeli zwierzęcych zostały również zgłoszone przy użyciu NPC pochodzących z iPSC jako funkcjonalnych przeszczepów kręgosłupa z wykrytą minimalną lub żadną odpowiedzią immunologiczną^12,13,14.

Tutaj opisano wytwarzanie iPSC świń i dalsze różnicowanie chemiczne w domniemane neuronalne komórki progenitorowe (Rysunek 1 i Rysunek 2). Wygenerowane komórki wykazywały ekspresję markerów NPC Nestin i GFAP, potwierdzonych przez RT-qPCR, i były dodatnie dla Nestin, β-tubuliny III i Wimentyny przez immunofluorescencję. Wyniki te pokazują dowody na generowanie komórek podobnych do NPC po indukcji in vitro za pomocą inhibitorów chemicznych z dużego modelu zwierzęcego, który jest ważnym i odpowiednim modelem dla badań nad medycyną regeneracyjną i translacyjną.

Protokół

Te eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Wydziału Nauk o Zwierzętach i Inżynierii Żywności Uniwersytetu w São Paulo (numery zezwoleń: nr 5130110517 i nr 4134290716).

UWAGA: Wszystkie procedury związane z hodowlą komórkową i inkubacją są wykonywane w kontrolowanej atmosferze (38,5 °C i 20%_CO2 w powietrzu, maksymalna wilgotność). Pasażowanie komórkowe przeprowadzono przez 5-minutową inkubację z odczynnikiem dysocjacyjnym, a komórki odzyskano po odwirowaniu (300 x g).

1. Przeprogramowanie fibroblastów świń na iPSC

1. Przygotowanie do eksperymentu
   1. Przygotuj fibroblasty i 293 pożywki hodowlane składające się ze zmodyfikowanej pożywki Dulbecco (IMDM) firmy Iscove, uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,1 mM aminokwasów endogennych i 1% antybiotyków (penicylina/streptomycyna), chyba że zaznaczono inaczej.
   2. Przygotuj pożywkę hodowlaną iPSC (pożywkę przeprogramowującą) składającą się z DMEM/F12 o niskiej osmolalności (zoptymalizowanej pod kątem wzrostu ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) uzupełnionej 20% zamiennikiem surowicy, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM glutaminy, 3,85 μM β-merkaptoetanolu, 10 ng/ml bFGF i 1% antybiotyków.
   3. W razie potrzeby wysiewaj fibroblasty embrionalne myszy (MEF) do kolby T75 (10 ml), aby uzyskać 70-80% konfluencji następnego dnia (około 6 x 10⁵ na T75). Następnego dnia inaktywować przez inkubację trwającą 2 godziny i 30 minut z 200 μl 0,5 mg/ml mitomycyny C (dodać mitomycynę do MEF zawierającego T75 bez wcześniejszej zmiany pożywki).
   4. Po okresie inkubacji odzyskać komórki po inkubacji roztworem dysocjacyjnym przez 5 minut i wysiewać do studzienek uprzednio pokrytych żelatyną na płytce 6-dołkowej o stężeniu 1x10,5.
   5. Pokryć studzienki przez inkubację w 0,1% roztworze żelatyny przez 20 minut w temperaturze 37 °C (około 1 ml roztworu żelatyny na studzienkę w celu pokrycia całego dołka) i natychmiast zawiesić. Następnie usuń roztwór i zastąp go pożywką hodowlaną (2 ml na studzienkę).
2. Transfekcja i produkcja lentiwirusa
   1. Posadź 293 komórki w kolbach hodowlanych T75, aż osiągnie około 90% zgrywania.
   2. Dysocjować komórki i wysiać 5 x 10⁶ komórek na nową kolbę T75 bez antybiotyków.
   3. Następnego dnia należy przygotować dwa roztwory na kolbę (T75) do transfekcji: 1: 1,5 ml IMDM (bez antybiotyków, bez surowicy) o odpowiednim stężeniu każdego wektora (12 μg OSKM; 1,2 μg TAT; 1,2 μg REV; 1,2 μg hgpm2 i 2,4 μg generacji VSVG_2°, ); i 2: 1,5 ml IMDM (bez antybiotyków, bez surowicy) plus 36 μl odczynnika do lipofekcji (lub zgodnie z zaleceniami producenta) ¹⁵.
   4. Wymieszaj roztwory i inkubuj przez 15 minut.
   5. W międzyczasie zastąp pożywkę z 293 komórek, dodając tylko 7 ml IMDM uzupełnionego 10% FBS na kolbę.
   6. Po okresie inkubacji dodać 3 ml odczynnika do lipofekcji + plazmidy do każdej kolby. Wymień medium na IMDM 10% FBS po 6 godzinach (opcjonalnie).
   7. Zebrać pożywkę (pełna objętość - 10 ml na T75) w punktach czasowych 24, 48 i 72 godzin. Przefiltruj go za pomocą filtra PVDF o średnicy 0,45 mm i zważ w celu zrównoważenia przed ultrawirowaniem.
   8. Wirować przez 1 h 30 min godzinę przy 48 960 x g.
   9. Odlać sklarowany sklarat i inkubować pozostałą zawartość (około 200 μl) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   10. Zawiesić zawiesić wirusowe granulki, delikatnie pipetując kilka razy w górę iw dół, a następnie podajeć podwielokrotny roztwór wirusa.
3. Transdukcji
   1. Wysiew 2x10⁴ fibroblasty na dołek płytki 6-dołkowej. Uwzględnij studzienki do analizy molekularnej (np. PCR) i kontroli transdukcji (np. analizy GFP) (opcjonalnie).
   2. Następnego dnia należy usunąć 1 ml pożywki i dodać 1 μl bromku heksadimetryny (8 μg/ml) i 50 μl roztworu wirusa.
   3. Inkubować przez 3 do 4 godzin, a następnie całkowicie zmienić pożywkę (2 ml) (dzień 0).
   4. Hoduj komórki przez 5 dni, zmieniając podłoże co 2 dni.
   5. Uprzednio przygotować 0,1% płytki pokryte żelatyną i MEF, jak opisano w ppkt 1.1.3.
   6. Aby zdysocjować komórki i ponownie umieścić je w pożywce przeprogramowującej, należy przemyć studzienki za pomocą 1 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS). Usuń PBS.
   7. Dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do dołka i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   8. Przenieść komórki do stożkowej probówki i odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g i ponownie zawiesić je w 1-3 ml pożywki hodowlanej iPSC.
   9. Policzyć komórki za pomocą komory Neubauera lub licznika komórek i wysiać je w stężeniu 1-2 x 10⁴ do uprzednio 0,1% pokrytych żelatyną i pokrytych MEF studzienek.
   10. Zmieniaj pożywkę hodowlaną iPSC co 2 dni.
   11. Kolonie iPSC (przy przejściu 0, P0) pojawią się po około 10 dniach okresu przeprogramowania. Ręcznie wybierz morfologicznie typowe kolonie (zaokrąglone krawędzie i komórki o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy) za pomocą igły 26 G, aby oddzielić kolonię i otaczające MEF-y.
   12. Przenieść 1 kolonię na nową studzienkę, indywidualnie, używając końcówki pipety o pojemności 10 lub 100 μl, w celu hodowli klonalnej i scharakteryzowania przypuszczalnych linii komórkowych iPSC.
4. Pasażowanie iPSC świń
   1. Ręczne przechodzenie i zbieranie kolonii
      1. Wyczyść i przenieś odwrócony mikroskop do okapu z przepływem laminarnym.
      2. Sterylizuj mikroskop światłem ultrafioletowym (UV) przez 15 minut.
      3. Umyj wcześniej studzienki pokryte żelatyną i MEF PBS przed przeniesieniem kolonii. Usuń PBS.
      4. Dodać 2 ml pożywki iPSC.
      5. Zlokalizuj interesującą Cię kolonię w studni, która będzie używana.
      6. Używając skosu igły strzykawki insulinowej, oddziel kolonię od otaczających komórek.
      7. Jeśli kolonia jest mała, odłącz ją od studzienki, pipetując pożywkę w górę i w dół jej granic za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
      8. Jeśli jest to większa kolonia, pokrój ją igłą na kilka mniejszych segmentów.
      9. Odessać kolonię lub fragmenty kolonii za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
      10. Przenieś go do nowej studni.
   2. Enzymatyczne pasażowanie linii klonalnych
      1. Umyj studzienki za pomocą PBS. Usuń PBS.
      2. Dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego do dołka i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
      3. Przenieś około 100 μl komórek do nowej studzienki. Ilość ta może się różnić w zależności od różnych linii komórkowych; Dlatego zaleca się codzienną analizę wizualną zbieżności.

2. Wprowadzenie świńskich iPSC do NPC

1. Przygotowanie do eksperymentu
   1. Przygotuj pożywkę do indukcji neuronalnej (NIM) składającą się z 50% pożywki neuropodstawowej i 50% DMEM/F-12 uzupełnionej witaminą B27-Minus A (20 μL/mL), N2 (10 μL/ml), 1 mM glutaminą (10 μL/ml), penicyliną-streptomycyną (1 μL/ml). Przefiltrować roztwór w filtrze 0,22 μm i dodać inhibitor sygnalizacji BMP LDN193189 i inhibitor ALK SB431542 w końcowym stężeniu odpowiednio 0,1 μM i 10 μM.
   2. Pokryć studzienki na 6-dołkowej płytce 1 ml roztworu matrycowego i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut. Usunąć roztwór matrycy i dodać pożywkę E8 do hodowli iPSC.
   3. W 13 dniu protokołu indukcji przygotuj pożywkę do ekspansji neuronalnej (NEM) składającą się z 50% pożywki neuropodstawowej i 50% DMEM/F-12 uzupełnioną witaminą B27-Minus A (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), NEAA (10 μL/ml), 1 mM glutaminą (10 μL/ml), penicyliną-streptomycyną (1 μL/ml). Przefiltrować roztwór w filtrze 0,22 μm i dodać FGF2 i EGF do uzyskania końcowego stężenia 10 ng/ml.
2. Protokół indukcji
   1. Dzień przed osiągnięciem przez iPSC 100% konfluencji, przenieś komórki do nowej studzienki (podział 1:1). Umyj studzienkę, dodając 1 ml PBS. Usuń PBS.
   2. Dodać 1 ml 0,5 mM EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   3. Usuń EDTA i dodaj 1 ml pożywki hodowlanej E8.
   4. Delikatnie zmyj komórki ze studzienki i przenieś zawartość do nowej studzienki uprzednio pokrytej roztworem matrycy.
   5. Następnego dnia umyj studzienki PBS. Usuń PBS i dodaj 2 ml NIM.
   6. Zmieniaj pożywkę indukcyjną codziennie przez 14 dni.
   7. W dniu 14 umyj studzienki za pomocą PBS. Usuń PBS.
   8. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek do dołka i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   9. Przenieść komórki do stożkowej probówki i odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g i ponownie zawiesić je w 6 ml pożywki NEM.
   10. Dodać 60 μl (10 μl/ml) roztworu do odzysku po rozmrożeniu i przenieść 2 ml roztworu do każdego dołka pokrytego matrycą.
   11. Zmieniaj pożywkę NEM następnego dnia, a następnie co dwa dni.
       UWAGA: Uważa się, że każda studnia, która przeszła przez protokół indukcji, powoduje powstanie nowej linii NPC. Dlatego ich odpowiednich komórek nie należy mieszać.

3. Przejście NPC

1. Dobrze umyć 1 ml PBS. Usuń PBS.
2. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
3. Delikatnie umyj komórki studzienki i przenieś zawartość do stożkowej rurki.
4. Odwirowywać roztwór przez 5 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant i dodać 6 ml NEM.
5. Delikatnie homogenizować osad i przenieść 2 ml roztworu do nowego dołka uprzednio pokrytego roztworem matrycowym.

Wyniki

Charakterystyka piPSC
Charakterystyka miała na celu określenie stopnia nabycia pluripotencji przez przeprogramowane komórki. W tym celu przeprowadzono analizę tworzenia ciałek zarodkowych, barwienie immunofluorescencyjne na markery pluripotencji, analizę ekspresji genów oraz spontaniczną dyferencjację do ciałek zarodkowych (EBs).

Wygenerowane kolonie komórek wykazywały płaską, zwartą morfologię w skupiskach komórkowych z wyraźnie zdefiniowanymi granicami, co jest typowe dl...

Dyskusja

Dzięki temu protokołowi fibroblasty zostały przeprogramowane in vitro przy użyciu egzogennej ekspresji OCT4, SOX2, c-MYC i KLF4. Przeprogramowane komórki utrzymywano in vitro przez ponad 20 pasaży. Kiedy te linie zostały poddane różnicowaniu neuronów za pomocą inhibitorów chemicznych, wykazywały ekspresję markerów neuronalnych komórek progenitorowych Nestin i GFAP, potwierdzone przez RT-qPCR, i były dodatnie dla Nestin, β-tubuliny III i wimentyny przez immunofluorescencję. Co ciekawe, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
293FT	Invitrogen	# R70007
Płytki 6-dołkowe	Costar	# 3516
anty-B-tubulina III	abcam	# ab7751
anty-NANOG	abcam	# ab77095
anty-NESTIN	Millipore	# ABD69
anty-OCT4	Santa Cruz biotechnologia	# SC8628
anty-SOX2	abcam	# ab97959
anty-SSEA1	Millipore	# MAB4301
anty-TRA1-60	Millipore	# MAB4360
anty-VIMENTIN	abcam	# ab8069
B27-Minus Vitamin A	Life Technologies	# 12587010
DMEM/F-12	Life Technologies	# 11960
osioł anty-koza 488	Invitrogen	#  A11055
EGF	Sigma	# E9644
Surowica bydlęca	płodu Gibco	# 10099
FGF2	Peprotech	# 100-18B
GlutaMAX	Gibco	# 35050-061
Glutamina	Gibco	# 25030-081
kozia anty-mysz 594	Invitrogen	#  A21044
kozi anty-królik 488	Invitrogen	# A11008
Bromek heksadimetryny	Sigma Aldrich	# 107689
HighCapacity  zestaw	Life Technologies	# 4368814
IMDM	Gibco	# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	# 12660-012
Serum nokautujące zamiennik	Gibco	# 10828-028
LDN-193189	Sigma-Aldrich	# SML0559
Zestaw fosfatazy alkalicznej leukocytów	Sigma Aldrich	# 86R
Lipofectamina P3000&handel;	Invitrogen	# L3000-015
Matrigel	Corning	# 354277
Mitomycyna C	Sigma Aldrich	# M4287-2MG
N2	Life Technologies	# 17502048
Nanodrop ND-1000	Nanodrop Technologies, Inc.
Podłoże neurobazalne	Life Technologies	# 21103049
Aminokwasy endogenne	Gibco	# 11140-050
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	# 15140-122
Revita Cell	Gibco	# A2644501
Rnase out	Life Technologies	# 10777019
SB431542	Stemgent	# 72232
StemPro Accutase	Gibco	# A11105-01
SW28 rotor	Beckman Coulter	# 342207
Trizol	Life Technologies	# 15596026
TrypLE Express	Gibco	# 12604-021
β-merkaptoetanol	Gibco	# 21985-023