Artykuł metodologiczny

Test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62218

⸱

9 marca 2021

1School of Natural Resources and Environment, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisany jest tani, dostępny protokół do oceny regeneracji motyli po szoku zimna w warunkach otoczenia.

Streszczenie

Fizjologia ekologiczna, szczególnie ektotermów, jest coraz ważniejsza w tym zmieniającym się świecie, ponieważ wykorzystuje pomiary cech gatunków i środowiska do badania interakcji między organizmami a ich otoczeniem, aby lepiej zrozumieć ich przetrwanie i przystosowanie. Tradycyjne testy termiczne są kosztowne pod względem czasu, pieniędzy i sprzętu, dlatego często ograniczają się do małych rozmiarów próbek i niewielu gatunków. Przedstawiono nowatorski protokół, który generuje szczegółowe dane na temat indywidualnego zachowania i fizjologii dużych, wolantowych, lądowych owadów, na przykładzie motyli. W artykule opisano metody testu odzyskiwania po szoku zimnym, który można przeprowadzić w terenie w warunkach otoczenia i nie wymaga kosztownego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta została wykorzystana do zrozumienia strategii reakcji i regeneracji na szok termiczny motyli tropikalnych, generując dane na poziomie indywidualnym dla całych społeczności motyli. Metody te mogą być stosowane zarówno w odległych warunkach terenowych, jak i w salach lekcyjnych, a także mogą być wykorzystywane do generowania istotnych ekologicznie danych fizjologicznych oraz jako narzędzie dydaktyczne.

Wprowadzenie

Integracja fizjologii termicznej i ekologii pod koniec lat siedemdziesiątych i na początku lat osiemdziesiątych1,2 zapoczątkowała dziedzinę fizjologii ekologicznej. Szeroko zakrojone badania termiczne przeprowadzone na ektotermach podkreślają synergie ekologiczno-fizjologiczne w różnych kontekstach ekoewolucyjnych3,4,5. Badania nad fizjologią termiczną organizmów ektotermicznych zyskały ostatnio na popularności w obliczu zmian klimatycznych i zmienionych krajobrazów termicznych na całym świecie6,7. Oprócz dostarczania informacji do badań w akademickiej dziedzinie fizjologii ekologicznej, testy fizjologii termicznej mogą być szeroko dostępne dla badaczy i mogą służyć jako praktyczne podejście do nauczania na wszystkich poziomach. Składniki wydajności cieplnej, w tym limity termiczne i skutki szoków temperaturowych, mają fundamentalne znaczenie dla ekologii, zachowania i historii życia zwierząt8,9.

Konkretnie, ekonotermy są używane do rozwiązywania problemów fizjologii, ponieważ endotermia dyktuje nierozerwalny związek między temperaturą otoczenia a temperaturą organizmu. Zakres temperatur, które organizmy mogą wytrzymać (ich krytyczny zakres termiczny od minimum do maksimum) oraz temperatury, w których ich zachowania i dopasowanie są maksymalizowane (optimum termiczne), są często zakorzenione w procesach ekologicznych i ewolucyjnych. Te cechy fizjologiczne mają coraz większe znaczenie, ponieważ wzrastają temperatury, zarówno średnie, jak i ekstremalne10. Na przykład zmiany abiotyczne, w tym wzrost temperatury, które towarzyszą niszczeniu i fragmentacji siedlisk, wpłynęły na społeczności ektotermów, w tym anuranów, ograniczając fizjologicznie wrażliwe gatunki (o wąskiej tolerancji termicznej) do małych pozostałości plam siedlisk11,12.

Ocena kluczowych elementów wydajności cieplnej może być kosztowna zarówno pod względem czasu, jak i zasobów, a tradycyjnie wymaga sprzętu laboratoryjnego i standardowych warunków. Co więcej, konwencjonalne testy często nie odzwierciedlają zakresu warunków otoczenia doświadczanych w naturze przez dane zwierzę13, ponieważ temperatura w podobnych eksperymentach fizjologicznych jest dokładnie kontrolowana i często nie ma związku z warunkami otoczenia doświadczanymi przez zwierzę. Ta kontrola temperatury może zmniejszyć zrozumienie różnic w poszczególnych odpowiedziach2,14. Fizjolodzy oparli się na laboratoryjnych eksperymentach z ogrzewaniem i chłodzeniem, wykorzystując programowalne kąpiele wodne do stałego ogrzewania lub chłodzenia otoczenia zwierzęcia w celu uzyskania informacji na temat krzywych wydajności termicznej15.

Zazwyczaj, zwierzęta są umieszczane w fiolkach z termoparą, a ich temperatura otoczenia jest stale zmieniana poprzez kontrolowanie temperatury otaczającej łaźni wodnej. Badacze mierzą czas potrzebny do osiągnięcia zmienionego stanu fizjologicznego (np. śpiączka chłodząca, powalenie) oraz temperaturę, w której nastąpiła zmiana statusu16,17. Już od minimum 500 USD narzędzia te są duże, ciężkie i wymagają dodatkowego sprzętu technicznego (np. komputera, termopar). W związku z tym podstawowe narzędzia do przeprowadzania klasycznych metod oceny wydajności cieplnej są: 1) niedostępne ekonomicznie dla wszystkich, 2) nieodpowiednie do oznaczania zwierząt zbyt dużych, aby można je było umieścić w zwyczajowych fiolkach używanych dla małych muchówek, oraz 3) nieprzenośne do użytku w odległych warunkach polowych. Przestrzeganie powszechnej praktyki skutkowało ograniczoną reprezentacją w taksonomii i warunkach eksperymentalnych18,19,20.

Podczas gdy pełne krzywe wydajności termicznej mogą informować o rozmieszczeniu gatunków, historii życia, cechach i zachowaniu, między innymi, kwantyfikacja mniejszej liczby i prostszych wskaźników termicznych może być bardziej efektywna i nadal niezwykle pouczająca. Testy fizjologiczne, mierzące początek śpiączki chłodowej i późniejszą regenerację po szoku zimnym, hartowanie na zimno i korygowanie zachowań, są skutecznymi i wykonywalnymi wskaźnikami zastępczymi dla krytycznego minimum termicznego organizmu8. Opisany tutaj jest test szoku zimnego przydatny do uzyskiwania danych fizjologicznych od dużych lądowych owadów ektotermicznych. Test jest niedrogi, dostępny i łatwy do wykonania w warunkach terenowych lub w klasie. Dane dotyczące regeneracji po szoku zimna generowane przez ten protokół mogą być łączone z danymi dotyczącymi cech na poziomie gatunku lub poszczególnych osób w celu uzyskania odpowiedzi na pytania dotyczące fizjologii ekologicznej i/lub wykorzystania do nauczania uczniów o zasadach fizjologicznych.

Protokół

1. Identyfikacja interesujących gatunków

  1. Zidentyfikuj interesujące Cię gatunki, aby określić czas regeneracji po szoku zimnym. Należy pamiętać, że każda grupa będzie się różnić pod względem czasu potrzebnego do wywołania śpiączki chłodnej (tj. punktu, w którym owad jest nadal żywy, ale nie porusza się i nie reaguje). Podobnie, w oparciu o organizm i wykorzystanie danych, należy wybrać różne punkty odcięcia, w których należy przerwać eksperyment, jeśli osobnik (osobniki) główny (główne) nie latają (patrz sekcja 4).
    UWAGA: Ten protokół został zaprojektowany i opracowany do stosowania na Lepidoptera. Ma jednak zastosowanie do dużych, wolantowych, lądowych owadów, w szczególności tych, które mogą być przechowywane płasko w szklanych otoczkach ograniczających ruch i uszkadzających (np. motyle i ważki/ważki).

2. Przeprowadzenie postępowania przygotowawczego

  1. Przeprowadź postępowanie przygotowawcze na małej próbie osób w celu określenia kluczowych parametrów. Postępuj zgodnie z sekcjami od 3 do 5 poniższego protokołu z 5-10 osobami w celu przeprowadzenia postępowania przygotowawczego.
    1. Przetestuj czas potrzebny na lodzie do wywołania śpiączki chłodnej (nie poruszania się), ale nie zabicia gatunków ogniskowych, wykonując krok 5.1, stosując zabiegi trwające 30 minut, 60 minut i 90 minut
      UWAGA: Czas potrzebny do wywołania śpiączki chłodnej będzie zależał od wielkości, lokalizacji i historii naturalnej/zachowania osobników.
    2. Opierając się na wynikach kroków 4.1-4.4 i wykorzystując wiedzę na temat ekologii owadów ogniskowych, wybierz czas, w którym zakończy się badanie, jeśli dana osoba nie osiągnie pełnego wyzdrowienia. Oprzyj tę granicę czasową również na ekologii gatunku, pamiętając, że po wielu minutach niezdolności do lotu wiele owadów jest przestarzałych.
      UWAGA: Na przykład, jeśli większość prób wstępnych kończy się lotem po 15 minutach, można zdecydować się na zakończenie prób po 25 minutach, aby upewnić się, że nawet wartości odstające mają szansę na pełne wyzdrowienie (tj. lot). Protokół ten opiera się na 30-minutowym czasie granicznym (krok 5.4).
  2. Wykorzystaj parametry z danych przedprocesowych, aby poinformować o gromadzeniu danych na potrzeby eksperymentów. Zmodyfikuj protokół opisany poniżej w oparciu o potrzeby organizmów ogniskowych, w tym czas przebywania w zawiesinie lodowej, czas, w którym należy zakończyć próby, oraz zachowania udokumentowane w arkuszu danych (np. dreszcze mogą być nieodpowiednim zachowaniem dla wybranego owada).
    1. Zdefiniuj konkretne pytania badawcze, na które należy odpowiedzieć za pomocą tych danych, jednocześnie doprecyzowując parametry.
      UWAGA: Na przykład, jeśli badacz jest zainteresowany wpływem długotrwałej ekspozycji na regenerację, czas przebywania w lodzie jest kluczową zmienną do modyfikacji. Jeśli naukowcy są zainteresowani różnicami w fizjologii między gatunkami o jasnym i ciemnym umaszczeniu, mogą wybrać dwa gatunki o wyraźnym kolorze lub zmodyfikować kolor skrzydeł owada, aby zmierzyć wpływ koloru skrzydeł na czas regeneracji. Co ważne, metoda ta jest w dużym stopniu dostosowywana do potrzeb i stawianych pytań badawczych (patrz sekcja dyskusji).

3. Kolekcja owadów

  1. Zbieraj owady przy użyciu odpowiednich metod, takich jak pułapki z przynętą i sieci entomologiczne (rysunek uzupełniający 1). Po pobraniu umieść każdą osobę w osobnej kopercie szklanej z unikalnym identyfikatorem.
  2. Przechowuj zwierzęta w zacienionym, chłodnym miejscu po schwytaniu i przed wystawieniem na eksperyment z szokiem zimnym. Zawsze wystawiaj zwierzę na eksperymentalne leczenie w ciągu 24 godzin od schwytania i ustandaryzuj ten czas w jak największym stopniu między próbami.
    1. Chociaż warunki przechowywania mogą się różnić, trzymaj owady z dala od bezpośredniego światła słonecznego. Jeśli to możliwe, umieść je w pomieszczeniu w chłodnym, ciemnym pomieszczeniu.
    2. Na polu upewnij się, że podczas przechowywania będą zacienione i chronione przed wiatrem (zdmuchiwaniem) i innymi drapieżnikami owadzimi, które mogą dostać się do kopert.

4. Przygotuj eksperyment z zimnym szokiem

  1. Napełnij lodówkę lodem i wodą. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość lodu, aby przetrwać przez co najmniej jedną godzinę i w razie potrzeby dodawaj lód okresowo, aby utrzymać środowisko w wodzie w temperaturze 0 °C.
  2. Wybierz od 1 do 4 osób centralnych do rundy eksperymentów, upewniając się, że każda osoba jest możliwa do zidentyfikowania.
    1. W przypadku korzystania z wielu gatunków należy użyć tylko jednego z nich, aby uniknąć mylenia osobników w arkuszu danych. Jeśli eksperymentujesz tylko z jednym gatunkiem, używaj tylko osobników, które można łatwo odróżnić, na przykład po złamanym skrzydle lub wyraźnym oznaczeniu.
    2. Jeśli cel eksperymentu nie jest związany z ubarwieniem skrzydeł, oznacz skrzydła unikalnymi identyfikatorami (np. numerami) cienkim markerem z filcową końcówką, aby odróżnić osobniki.
    3. Jeśli eksperymenty nie spełniają żadnego z powyższych kryteriów, przeprowadź eksperyment na jednej osobie na raz.
  3. Wypełnić wiersze arkusza danych informacjami odnoszącymi się do każdego badanego owada, w tym jego niepowtarzalnym identyfikatorem i użytecznym identyfikatorem w uwagach, takimi jak nazwa gatunku lub cecha wyróżniająca (tabela uzupełniająca 1).
  4. Umieść wszystkie osoby ogniskowe (nadal w indywidualnie oznaczonych kopertach) w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie z ciężarkiem (Tabela Materiałów) i umieść torbę w lodowatej wodzie na 60 minut (lub do momentu wywołania śpiączki chłodniczej; patrz dyskusja) (Rysunek Uzupełniający 2).
    1. Upewnij się, że waga jest ciężka (np. duże monety, duże podkładki lub gładkie kamienie) i wystarczająco duża, aby torba z owadami była zanurzona w lodowatej wodzie i prostopadła do powierzchni wody. Użyj obciążnika, który nie powoduje przecieków w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.
      UWAGA: Podczas gdy owady są nadal w stanie się zregenerować, jeśli są wystawione bezpośrednio na działanie wody w zanurzeniu, mokre koperty komplikują usunięcie każdego osobnika. Najlepiej jest, aby owady były suche w torbie.
  5. Rejestruj dane dotyczące temperatury i światła.
    1. Użyj rejestratora danych (patrz Tabela materiałów), aby zarejestrować dane dotyczące temperatury otoczenia i światła, wykonując krok 5.1 lub 5.2.
      1. Zaprogramuj rejestrator danych tak, aby zbierał dane o temperaturze i świetle w odstępach 10 sekund, zaczynając od czasu, gdy owady zostaną uwolnione.
      2. Oprzyj czas uruchomienia rejestratora danych na momencie, w którym owady zostały umieszczone w lodowatej wodzie. Upewnij się, że informacje z rejestratora danych (data, godzina) są zsynchronizowane, aby dane dotyczące warunków otoczenia mogły być później dopasowane do każdego indywidualnego owada ogniskowego.
    2. Użyj prostego termometru, aby ręcznie rejestrować dane dotyczące temperatury i światła w krótkich odstępach czasu (przez drugiego badacza).
      1. Zdecyduj o parametrach eksperymentalnych, które chcesz powiązać z czasem odzyskiwania, które można zmierzyć bez rejestratora danych. Stosuj różne zabiegi: cień/słońce; zmierzch/południe.
  6. Umieść siatkową klatkę dla owadów w odpowiednim miejscu, tak aby temperatura i światło były jak najbardziej jednorodne w klatce oraz aby podstawa klatki była podniesiona i mogła być stukana przez obserwatora.
  7. Umieść rejestrator danych na zewnątrz klatki lub wewnątrz klatki, aby nie został przewrócony lub w inny sposób dotknięty niewielkimi ruchami wewnątrz klatki. Jeśli nie korzystasz z rejestratora danych, ustaw odpowiednio termometr i/lub ustaw klatki w odpowiedniej konfiguracji.
    UWAGA: Rejestrator danych musi być umieszczony w taki sposób, aby rejestrowane warunki otoczenia były jak najbardziej zbliżone do tych, których doświadcza owad.

5. Rozpocznij eksperyment z zimnym szokiem

  1. Wyjąć zwierzęta z lodowatej kąpieli wodnej po 60 minutach (lub czasie uznanym za właściwy; patrz wyżej). Natychmiast wyjmij owady z plastikowej torby i wyjmij każdą osobę z koperty tak szybko, jak to możliwe, minimalizując przy tym obsługę (rysunek uzupełniający 3).
  2. Uruchom stoper, gdy tylko zwierzęta znajdą się w klatkach siatkowych (patrz przykładowe dane, tabela uzupełniająca 1).
  3. Postukaj ołówkiem w podstawę klatki, aby poruszyć regenerujące się owady.
    UWAGA: Dostarczanie bodźców podczas rekonwalescencji zapewnia, że owady ogniskowe wykazują stan regeneracji i zachowania, gdy tylko są do tego fizjologicznie zdolne (Dodatkowe wideo).
    1. Stukaj często i wystarczająco mocno, aby upewnić się, że zwierzę zareaguje, jeśli to możliwe, ale nie spowoduje reakcji.
      UWAGA: Na przykład, podczas stukania w klatkę, jeśli zwierzę zostanie katapultowane w powietrze i wyląduje w pozycji pionowej, ale nie porusza się, aby samodzielnie stać, nie jest to uważane za zachowanie "stojące", ponieważ organizm w rzeczywistości nie stał samodzielnie.
  4. Oznacz próbę jako zakończoną, gdy dana osoba odbyła lot (tj. wykazała, że w pełni wyzdrowiała). Zakończ próbę i uznaj, że owad osiągnął pełne wyzdrowienie, jeśli nie porusza się po 30 minutach.
  5. Usuń owady z klatki siatkowej i umieść osobniki z powrotem w oznaczonych kopertach pergaminowych. Uwolnić zwierzęta lub zatrzymać je w celu dalszego gromadzenia danych (np. indywidualnych cech wielkości, wagi).
  6. Jeśli korzystasz z rejestratora danych, przerwij zbieranie danych z rejestratora danych i zapisz plik danych o temperaturze i świetle podczas eksperymentu z odpowiednimi informacjami o dacie/godzinie.

6. Przetwarzanie danych

  1. Wprowadź dane przedstawione z arkusza danych do arkusza kalkulacyjnego (np. MS Excel).
  2. Jeśli korzystasz z rejestratora danych, dodaj dane dotyczące temperatury i światła dla każdej odpowiedzi każdej badanej osoby.
    1. Oblicz średnią i odchylenie standardowe temperatury i światła dla każdego zachowania każdej osoby.
      UWAGA: Ponieważ rejestrator danych rejestruje dane co 10 sekund, jeśli zachowanie w pozycji stojącej dla jednego zwierzęcia trwało 48 sekund, użyj pierwszych 5 wpisów z rejestratora danych dla tej próby.
    2. Powiąż każde zachowanie regeneracyjne każdej osoby z danymi abiotycznymi zarejestrowanymi przez rejestrator danych, zaokrąglając w górę lub w dół do 10 sekund w razie potrzeby.
  3. Kreślenie i analizowanie danych. Rysunek 1, na przykład, przedstawia wpływ temperatury i światła na czas regeneracji po szoku zimnym. Zbierz inne istotne dane (cechy gatunków, regionalne cechy siedlisk), aby zbadać ekologiczne i ewolucyjne wzorce cech fizjologicznych badanych grup.
    UWAGA: Rysunek 1 został narysowany przy użyciu pakietu ggplot2 w R. Poziom szczegółowości danych dotyczących warunków otoczenia będzie się różnił w zależności od przyrządów używanych do pomiaru warunków otoczenia. Jeśli używany jest rejestrator danych, można wygenerować rysunki o szczegółowości porównywalnej do Rysunek 2. Jeśli używany jest termometr, badacz nie będzie w stanie stworzyć wykresu opartego na świetle otoczenia. Podobnie, jeśli badacze używają kategorii światła lub temperatury, te wykresy rozrzutu można przekształcić w wykresy skrzynkowe lub inny odpowiedni szablon do zilustrowania tych zjawisk.

Wyniki

Dane zgromadzone w tym protokole pozwalają na badanie i partycjonowanie zmiennych istotnych dla fizjologii organizmów. Na przykład zarówno temperatura, jak i warunki oświetlenia wpływają na regenerację motyli po szoku termicznym (Rycina 1). Wykres ma na celu zbadanie interakcji między warunkami otoczenia a regeneracją po szoku termicznym. Przy użyciu motyli schwytanych w naturze za pomocą pułapek i siatek, 181 gatunków motyli wykazało wyraźną regenerację z letargu wywołanego szokiem termicznym (Rycina 2). Dane przedstawione na Rycynie 2 zostały zebrane przez trzech obserwatorów w ciągu około pięciu miesięcy (styczeń, luty, maj-lipiec 2020 r.) w Andach kolumbijskich. Eksperymenty zawsze przeprowadzano rano, dzień po odłowieniu motyli. Przy maksymalnej wydajności dwóch obserwatorów mogło jednocześnie monitorować po cztery motyle, powtarzając proces siedmiokrotnie (minimum 7,37 godziny), co pozwalało na przetestowanie 56 osobników w ciągu jednego poranka. Umożliwiło to zgromadzenie znacznej ilości danych z całych społeczności motyli, przy jednoczesnym uwzględnieniu i analizie danych dotyczących zmienności osobniczej. Ponieważ testy mogą być przeprowadzane w naturalnych warunkach środowiskowych, warunki regeneracji są reprezentatywne dla ich siedlisk i odzwierciedlają naturalną zmienność, jakiej organizmy doświadczają w naturze. Rycina 3 ilustruje nakładanie się temperatury i warunków oświetlenia w eksperymencie regeneracji po szoku termicznym z warunkami panującymi na pastwisku, z którego pobrano niektóre badane motyle.

Wykres punktowy, opóźnienie lotu motyli w zależności od temperatury (°C) i natężenia światła (LUX), porównanie gatunków.
Rysunek 1: Wykresy punktowe czasu regeneracji (w sekundach) motyli po szoku termicznym (zimnowym). (A) Średnia temperatura i (B) średnie LUX (natężenie światła) podczas regeneracji. Gatunki zostały pogrupowane i oznaczone kolorami według rodzin. Ogólnie, wraz ze wzrostem natężenia światła i temperatury, czas regeneracji po szoku termicznym ulega skróceniu, wykazując zmienność pomiędzy taksonami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zmienność czasu lotu w rodzinach motyli; kolorowy wykres danych porównujący sekundy do momentu lotu.
Rycina 2: Przykład wyników testu regeneracji po szoku termicznym u 181 gatunków motyli z Kolumbijskich Andów. Dane przedstawiają liczbę sekund, które upłynęły od wyjęcia motyla z zimna do momentu, w którym był on w stanie polecieć. Gatunki są uporządkowane i wyróżnione kolorami według Rodziny. Rycina ta obrazuje szeroki zakres taksonomiczny, w którym można z powodzeniem zastosować ten eksperyment, oraz różnorodność reakcji na regenerację po szoku termicznym u poszczególnych gatunków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres temperatury otoczenia; dane czerwone i niebieskie; przebieg czasowy; analiza warunków na pastwisku.
Rysunek 3: Temperatura otoczenia i LUX podczas prób regeneracji po szoku termicznym. Wykres temperatury otoczenia (kolor niebieski) i LUX (natężenie światła, kolor czerwony) zarejestrowane przez rejestratory danych umieszczone na pastwiskach, gdzie odbywał się odłów motyli (jasne kolory, warunki obejmują cały dzień) oraz warunki podczas prób regeneracji po szoku termicznym (ciemne kolory, tylko godziny poranne). Przedstawione warunki polowe i eksperymentalne ukazują zakres oraz średnie warunki, w jakich znajdowały się motyle podczas jednego tygodnia poboru prób i eksperymentów w terenie. Eksperymenty prowadzono wyłącznie we wczesnych godzinach (07:00-13:00 h), podczas gdy rejestratory danych były rozmieszczone w terenie przez tydzień (pokazano godziny świetlne, 06:00-18:00 h). Przedstawiono tutaj pokrywanie się warunków eksperymentalnych z warunkami otoczenia, w których przebywały motyle, co potwierdza ekologiczną relewantność przeprowadzania testów fizjologicznych w warunkach naturalnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dodatkowa Rycina 1: Procedura odłowu owadów docelowych-w tym przypadku motyli-przy użyciu pułapek Van-Somerena z przynętą oraz aktywnym odłowem siatką. Pułapki zwabiano przynętami z gnijcych ryb oraz gnijących owoców. W tle widoczna pułapka (bez przynęty), na pierwszym planie okaz w unikalnej kopercie na tle niebieskiego plastikowego pudełka kolekcjonerskiego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Torebki z maksymalnie czterema pojedynczymi motylami zanurzonymi w lodowej wodzie w lodówce. Torebki plastikowe zostały oznakowane godziną umieszczenia ich w lodowej wodzie, aby eksperymenty z szokiem termicznym mogły być przeprowadzane etapowo w ciągu poranka. Torebki plastikowe powinny być szczelnie zamknięte, aby zapobiec zamoczeniu okazów; jednak w tym przypadku zalanie torebek i koperty nie miało mierzalnego wpływu na regenerację motyli. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Dwaj obserwatorzy zbierają dane w terenie. Każda siatkowa klatka zawiera cztery unikalne motyle regenerujące się po szoku termicznym. Trójnik z polichlorku winylu w klatce mieści rejestrator danych, aby zapobiec bezpośredniej ekspozycji na słońce lub deszcz. Każdy obserwator posiada stoper, który został uruchomiony natychmiast po wypuszczeniu motyli do klatki. Klatki są uniesione na ławach, co pozwala obserwatorom na wstrząsanie podstawą klatki, aby zapewnić, by motyle zareagowały behawioralnie tak szybko, jak to fizjologicznie możliwe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Przykładowy arkusz danych. Arkusz zawiera unikalny identyfikator każdego motyla przypisany w terenie oraz cechy charakterystyczne (nazwa gatunku, kluczowe kolory) w notatkach. Odnotowano również dominującą pozycję motyla (tj. która strona skrzydeł była wystawiona na słońce) podczas okresu rekonwalescencji, oznaczoną jako D (grzbietowa) lub V (brzuszna). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wideo uzupełniające 1: Stukanie w klatkę w celu przyspieszenia regeneracji po szoku termicznym. W miarę jak motyle dochodzą do siebie, obserwator delikatnie stuka w podstawę klatki, aby wywołać zachowania, gdy tylko motyle będą do tego zdolne. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Badanie fizjologii termicznej obejmuje pomiary gatunków i cech środowiskowych, aby lepiej zrozumieć interakcje między organizmami a ich otoczeniem, które są kluczem do przetrwania i sprawności. Chociaż cechy termiczne zawsze stanowią integralną część zrozumienia historii naturalnej i ekologii roślin i zwierząt, mają one coraz większe znaczenie w obliczu zmian krajobrazu i klimatu11,21. Kilka grup ektotermicznych owadów lądowych, w szczególności Lepidoptera i Odonatan, jest stosunkowo dużych i licznych, wykazuje odrębne zachowania i jest podatnych na manipulacje. Przedstawiono tutaj skuteczny i tani test do skutecznego pomiaru reakcji fizjologicznych takich owadów. Protokół ten wymaga do przeprowadzenia testu ze źródła zdrowych organizmów, których czas pracy przed eksperymentem jest ograniczony. Chociaż liczba organizmów badanych w tym samym czasie jest elastyczna, liczba osobników ogniskowych w jednym eksperymencie będzie się różnić w zależności od celu gromadzenia danych i/lub liczby obserwatorów.

Na przykład protokół ten został opracowany w celu gromadzenia szczegółowych indywidualnych danych na temat motyli w całych społecznościach. W związku z tym reprezentatywne wyniki ilustrują wysiłki zmierzające do maksymalizacji gromadzenia danych dla osobników jak największej liczby gatunków i w różnych warunkach istotnych dla lokalnego środowiska. Niezależnie od liczby gatunków centralnych, ważne jest, aby obserwator był w stanie zidentyfikować każdego osobnika w klatce, który doświadcza powrotu do zdrowia. Jeżeli celem jest zebranie danych tylko od jednego gatunku, wówczas należy jednocześnie przebadać tylko jednego lub dwa osobniki (jeśli można je zidentyfikować na podstawie zużycia różnych skrzydeł lub jeśli są indywidualnie oznakowane). Uczestnicy badania muszą być wybrani zgodnie z konkretnym pytaniem badawczym lub planem studiów. W zależności od postawionego pytania i celu zbierania danych (na przykład badania lub klasa), wielkość próby i zbiór innych cech będą się różnić.

Aby zilustrować podstawowe składniki fizjologii wyjaśnione przez ten protokół (indukcja śpiączki chłodnej, etapy rekonwalescencji, rola warunków otoczenia), instruktor może wybrać dwa odrębne gatunki lub morfy jednego gatunku. Jeśli osoby ogniskowe różnią się tylko jedną kluczową cechą (np. kolorem), konieczna będzie mniejsza próba, a uczniowie mogą dokładnie badać związek między tą cechą a fizjologią organizmu. Naukowcy zainteresowani fizjologią ekologiczną mogą wykorzystać swoje dane eksperymentalne do zbadania złożonych pytań ekologicznych i ewolucyjnych. Badacze muszą upewnić się, że starannie wybierają owady ogniskowe, które bezpośrednio odpowiadają na ich pytania (np. na podstawie etapu życia, wieku, płci, lokalizacji) i, na podstawie liczby zaangażowanych zmiennych, określają odpowiednią wielkość próby. Rozmiary prób dla złożonych modeli będą większe niż te opisane powyżej.

Podczas zbierania danych dotyczących odzyskiwania behawioralnego ważne jest, aby klatka spoczywała nad ziemią, ponieważ obserwator musi być w stanie dotknąć dna klatki, aby wywołać zachowania regeneracyjne. Gwarantuje to, że organizm reaguje (stoi, lata), gdy tylko jest do tego fizjologicznie zdolny, a końcowe zachowanie regeneracyjne (lot) jest udokumentowane. Rejestrowanie warunków otoczenia podczas rekonwalescencji po szoku zimnym jest integralną częścią badania fizjologii termicznej, ponieważ protokół ten ma na celu badanie i wyjaśnienie roli środowiska w fizjologii organizmu. Rejestratory danych (patrz tabela materiałów) są przydatne do rejestrowania ustandaryzowanych pomiarów odpowiednich warunków (np. temperatury, światła, a nawet wilgotności). Jeśli jednak narzędzia te są niedostępne, odpowiednie warunki można zmierzyć w inny sposób, np. za pomocą termometru cyfrowego lub upraszczając zmienną warunki środowiskowe i stosując różne środowiska, takie jak cień i słońce. Protokół ten daje badaczowi możliwość pomiaru warunków podczas powrotu do zdrowia po szoku zimnym w oparciu o cel i zakres badania.

Chociaż metoda ta może być modyfikowana, aby lepiej odpowiadała określonym grupom taksonomicznym, zaleca się stosowanie dużych, lotnych owadów. Można uznać, że owady latające, które odzyskują zdolność samodzielnego latania, osiągnęły pełną regenerację. Opisana metoda została z powodzeniem zastosowana na motylach w tropikach i subtropikach. Opierając się na trendach termicznych danego obszaru (tj. zakresie temperatur doświadczanych w miejscu, które będą się zmieniać, wpływając w ten sposób na oczekiwania oparte na wysokości, szerokości geograficznej, pokryciu koron drzew), organizm może potrzebować więcej lub mniej niż jednej godziny w kąpieli lodowatej wody, aby wejść w śpiączkę chłodną. Wielkość organizmu może również wpływać na czas potrzebny do wejścia w śpiączkę chłodną. Kluczowe jest znalezienie czasu ekspozycji na zimno niezbędnego do wywołania śpiączki chłodnej (nie poruszania się), ale nie zabicia gatunków ogniskowych. Czas potrzebny do wywołania śpiączki chłodnej będzie zależał od wielkości, lokalizacji i historii naturalnej/zachowania osobników. Opierając się na wynikach opisanego w niniejszym artykule eksperymentu z szokiem zimnym i wykorzystując wiedzę na temat ekologii owadów ogniskowych, wybierz czas zakończenia badania, jeśli dana osoba nie osiągnie pełnego wyzdrowienia.

Opierając się na konkretnych pytaniach badacza, metoda ta może być stosowana zarówno w terenie, jak i w laboratorium, aby umożliwić zarówno naturalną zmienność środowiska, jak i kontrolę ważnych zmiennych. Test ten jest prosty i niedrogi i pomaga wypełnić istniejące luki w dziedzinie fizjologii termicznej. Łatwość tego protokołu sprawia, że można go stosować do różnych taksonów, otwierając pole do więcej niż organizmów przyjaznych w laboratorium. Nowość polegająca na wykonaniu znormalizowanego, ale termicznego testu w temperaturze otoczenia wypełnia lukę między wynikami laboratoryjnymi a terenowymi22. Wykorzystanie warunków otoczenia do regeneracji organizmów pomoże naukowcom w ustaleniu roli czynników środowiskowych i gatunkowych w fizjologii14,22. Wreszcie, ze względu na niski koszt i brak wymaganych materiałów, protokół ten może być stosowany w odległych lokalizacjach w terenie przy niewielkiej ilości sprzętu - idealny dla wielu biologów terenowych - a także w salach lekcyjnych, aby umożliwić młodym uczniom praktyczną naukę.

Oświadczenia

Autor nie ma sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Podziękowania dla Jareta Danielsa, Isabelli Plummer, Bretta Scheffersa i Dana Hahna za informacje na temat protokołu, który został po raz pierwszy opracowany. Dodatkowe podziękowania dla Jaime Haggarda, Sebastiána Durána i Indiany Cristóbala Róisa-Málavera za wdrożenie kilku iteracji tego protokołu i za wkład w kluczowe komponenty. Podziękowania należą się również anonimowemu recenzentowi za opinie na temat manuskryptu jako całości. Wsparcie zostało zapewnione przez McGuire Center for Lepidoptera i fundusz wydawniczy Biodiversity, College of Agricultural and Life Sciences, School of Natural Resources and Environment oraz wydział Ekologii i Ochrony Dzikiej Przyrody na UF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24 x 24 x 36 "Popup Hodowla i Klatka obserwacyjnaBioquip1466PBUpewnij się, że klatka jest lekko uniesiona nad ziemią, aby móc stukać o podłogę klatki podczas eksperymentów.
ChłodnicaDowolnaNA
Koperty pergaminoweBioquip1130B
HOBO Wisiorek Temperatura/Światło 8K Rejestrator danychPoczątekUA-002-08Jeśli rejestrator danych nie jest dostępny, badacze mogą zdecydować się na użycie termometru cyfrowego do rejestrowania temperatury otoczenia w regularnych odstępach czasu. Aby uzyskać dodatkowe informacje, zobacz krok 4.5 protokołu.
Stacja bazowa HOBO Optic USBOnsetBase-U-1
Lodowata wodaNANA
Owady (taksony ogniskowe)NADowolnaZbierz wystarczającą ilość próbek do testów, zapewniając replikację grup eksperymentalnych (np. Gatunki, miejsce pobierania próbek)
Złącze T z PVCDowolnaDowolna
zamykana plastikowa torbaDowolnaNA
Stoper/minutnikDowolnaNA
DowolnaNADuże monety lub małe kamienie do obciążania plastikowych toreb zapewnią, że próbki zostaną zanurzone w lodowatej wodzie. Idealna jest znormalizowana waga.
waga

Bibliografia

  1. Huey, B., Stevenson, R. D. Integrating thermal physiology and ecology of ectotherms a discussion of approaches. American Zoologist. 19 (1), 357-366 (1979).
  2. Huey, R. B., Slatkin, M. Cost and benefits of lizard thermoregulation. The Quarterly Review of Biology. 51 (3), 363-384 (1976).
  3. Kingsolver, J. G. Butterfly thermoregulario: Organismic mechanisms and population consequences. Journal of Research on the Lepidoptera. 24, 1-20 (1985).
  4. Kingsolver, J. G. Evolution and coadaptation of thermoregulatory behavior and wing pigmentation pattern in pierid butterflies. Evolution. 41 (3), 472-490 (1987).
  5. Kingsolver, J. G., Huey, R. B. Evolutionary analyses of morphological and physiological plasticity in thermally variable environments. American Zoologist. 38, 545-560 (1998).
  6. Malhi, Y., Wright, J. Spatial patterns and recent trends in the climate of tropical rainforest regions. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 359 (1443), 311-329 (2004).
  7. Sears, M. W., et al. Configuration of the thermal landscape determines thermoregulatory performance of ectotherms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10595-10600 (2016).
  8. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  9. Angilletta, M. Thermal adaptation: a theoretical and empirical synthesis. , Oxford University Press. (2009).
  10. Perkins-Kirkpatrick, S. E., Gibson, P. B. Changes in regional heatwave characteristics as a function of increasing global temperature. Scientific Reports. 7, 12256(2017).
  11. Frishkoff, L. O., Hadly, E. A., Daily, G. C. Thermal niche predicts tolerance to habitat conversion in tropical amphibians and reptiles. Global Change Biology. 21 (11), 3901-3916 (2015).
  12. Nowakowski, A. J., Otero Jiménez, B., Allen, M., Diaz-Escobar, M., Donnelly, M. Landscape resistance to movement of the poison frog, Oophaga pumilio, in the lowlands of northeastern Costa Rica. Animal Conservation. 16 (2), 188-197 (2013).
  13. Kingsolver, J. G., Buckley, L. B. Quantifying thermal extremes and biological variation to predict evolutionary responses to changing climate. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological Sciences. 372 (1723), 20160147(2017).
  14. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, 1956-1967 (2015).
  15. Sinclair, B. J., Williams, C. M., Terblanche, J. S. Variation in thermal performance among insect populations. Physiological and Biochemical Zoology. 85 (6), 594-606 (2012).
  16. Gotcha, N., Terblanche, J. S., Nyamukondiwa, C. Plasticity and cross-tolerance to heterogeneous environments: divergent stress responses co-evolved in an African fruit fly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (1), 98-110 (2018).
  17. Mutamiswa, R., Chidawanyika, F., Nyamukondiwa, C. Superior basal and plastic thermal responses to environmental heterogeneity in invasive exotic stemborer Chilo partellus Swinhoe over indigenous Busseola fusca (Fuller) and Sesamia calamistis Hampson. Physiological Entomology. 43 (2), 108-119 (2018).
  18. de Jong, M. A., Saastamoinen, M. Environmental and genetic control of cold tolerance in the Glanville fritillary butterfly. Journal of Evolutionary Biology. 31 (5), 636-645 (2018).
  19. DeVries, Z. C., Kells, S. A., Appel, A. G. Estimating the critical thermal maximum (CTmax) of bed bugs, Cimex lectularius: Comparing thermolimit respirometry with traditional visual methods. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 197, 52-57 (2016).
  20. De Keyser, R., Breuker, C. J., Hails, R. S., Dennis, R. L. H., Shreeve, T. G. Why small is beautiful: Wing colour is free from thermoregulatory constraint in the small lycaenid butterfly, Polyommatus icarus. PLoS One. 10 (4), 0122623(2015).
  21. Nowakowski, A. J., et al. Tropical amphibians in shifting thermal landscapes under land-use and climate change. Conservation Biology. 31 (1), 96-105 (2017).
  22. Niehaus, A. C., Angilletta, M. J., Sears, M. W., Franklin, C. E., Wilson, R. S. Predicting the physiological performance of ectotherms in fluctuating thermal environments. Journal of Experimental Biology. 215, 694-701 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza fizjologiczna w tereniefizjologia ektotermicznych organizm wspo eczno ci motyliindukowanie pi czki z zimnafizjologia ekologicznaregeneracja behawioralnarejestrator danych
Test fizjologii termicznej w terenie: odzyskiwanie po szoku zimna w warunkach otoczenia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.