Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oliwka dolna (IO), jądro w brzusznym rdzeniu, jest jedynym źródłem włókien pnących, które tworzą jedną z dwóch ścieżek wejściowych do móżdżku. Od dawna uważa się, że IO ma kluczowe znaczenie dla kontroli motorycznej, a jego aktywność jest obecnie uważana za centrum wielu hipotez dotyczących zarówno motorycznych, jak i poznawczych funkcji móżdżku. Podczas gdy jego fizjologia i funkcja zostały stosunkowo dobrze zbadane na poziomie pojedynczej komórki in vitro, obecnie nie ma doniesień na temat organizacji aktywności sieci IO u żywych zwierząt. Wynika to w dużej mierze z niezwykle trudnego położenia anatomicznego soczewki wewnątrzgałkowej, co utrudnia poddanie jej konwencjonalnym metodom obrazowania fluorescencyjnego, w których należy utworzyć ścieżkę wzrokową przez cały mózg zlokalizowaną grzbietowo do obszaru zainteresowania.
Tutaj opisujemy alternatywną metodę uzyskiwania najnowocześniejszych danych obrazowania wapnia na poziomie technologicznym z sieci IO. Metoda wykorzystuje skrajne brzuszne położenie IO i obejmuje zabieg chirurgiczny polegający na wprowadzeniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym (GRIN) przez wnętrzności szyi w celu zetknięcia się z brzuszną powierzchnią czujnika wapnia IGaMP6s wyrażającego IO u znieczulonych myszy. Przedstawiono reprezentatywny zapis obrazowania wapnia, aby wykazać możliwość rejestrowania aktywności neuronów IO po operacji. Chociaż jest to operacja niepozwalająca na przeżycie, a zapisy muszą być prowadzone w znieczuleniu, pozwala to uniknąć uszkodzenia krytycznych dla życia jąder pnia mózgu i pozwala na przeprowadzanie wielu różnych eksperymentów badających wzorce aktywności czasoprzestrzennej i integrację danych wejściowych w IO. Ta procedura z modyfikacjami może być stosowana do nagrań w innych, sąsiednich obszarach brzusznego pnia mózgu.
Wprowadzenie
Głównym celem neuronauki systemowej jest zrozumienie, w jaki sposób czasoprzestrzenne wzorce aktywności sieci neuronowych przyczyniają się do generowania zachowań zwierząt. W związku z tym metodologia obrazowania fluorescencyjnego wykorzystująca sondy wrażliwe na wapń stała się w ciągu ostatniej dekady głównym narzędziem do badania aktywności sieci neuronalnej u żywych zwierząt1,2, ponieważ umożliwia wizualizację takiej dynamiki w skalach przestrzennych, od pojedynczych komórek po obwody mezoskalowe. W ostatnich latach powszechne podejście, w którym obwody neuronalne w powierzchownych strukturach mózgu (takich jak kora mózgowa lub móżdżkowa) są obrazowane przez przezroczyste okno czaszki3 zostało uzupełnione o użycie soczewek o indeksie gradientowo-refrakcyjnym (GRIN)4 umożliwiając badanie dynamiki sieci w głębokich strukturach mózgu. Obecnie dostępne soczewki GRIN pozwalają na dotarcie do struktur o głębokości kilku milimetrów, takich jak ciało migdałowate myszy, hipokamp i zwoje podstawy5. Jednak wiele obszarów zainteresowania, takich jak różne jądra w brzusznym rdzeniu, leży znacznie głębiej, co plasuje je na krańcu zasięgu soczewki GRIN.
Tutaj opisujemy, jak przezwyciężyć tę trudność, korzystając ze stosunkowo łatwej dostępności rdzenia przez brzuszną część mózgu. Korzystając z dorosłych myszy, u których dolna oliwka (IO), jądro w brzusznym rdzeniu, zostało wirusowo transfekowane za pomocą czujnika wapnia GCaMP6s, opisujemy kroki chirurgiczne (zmodyfikowane w stosunku do metody opisanej pierwotnie w Khosrovani et al. 20076) w celu umieszczenia soczewki GRIN na brzusznej powierzchni mózgu znieczulonej myszy. Za pomocą mikroskopu miniaturowego demonstrujemy możliwość rejestrowania aktywności neuronalnej w tak ekstremalnie brzusznych obszarach mózgu. Chociaż procedura jest z konieczności operacją niemającą na celu przeżycia i nie można przeprowadzić żadnych eksperymentów na przytomnych zwierzętach, metoda ta pozwala na zbadanie nienaruszonej dynamiki sieci w kontekście stymulacji czuciowej lub innej stymulacji szlaku aferentnego, zapewniając wyraźne korzyści w porównaniu z podejściami ex vivo, takimi jak stosowanie preparatów z ostrych plastrów.
Protokół
Przestrzegano wszystkich obowiązujących międzynarodowych, krajowych i instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Podczas stereotaktycznego wstrzykiwania wektora wirusowego zastosowano aseptyczne techniki chirurgiczne.
1. Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektora wirusowego
UWAGA: Wirus niosący materiał genetyczny do ekspresji GCaMP6s (AAV9.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40) jest wstrzykiwany stereotaktycznie zgodnie z wcześniejszym opisem7,8, z następującymi modyfikacjami.
- Do wykonania pipety z długim i sztywnym zwężeniem do iniekcji do IO należy użyć szkła kwarcowego (średnica zewnętrzna: 1,14 mm, średnica wewnętrzna: 0,53 mm) zamiast szkła borokrzemianowego, wykorzystując laserową wyciągarkę kapilar z parametrami dostosowanymi zgodnie z instrukcją produktu. Po wyciągnięciu należy odciąć skalpelem 1-2 mm z końcówki pipety, aby uzyskać zwężenie o długości 8-10 mm z wewnętrzną średnicą końcówki 15-20 µm (Rycina 1a). Pipetę wykańczamy, nadając końcówce kształt igły pod kątem 30° za pomocą obrotowego skosowania mikro-pipet, co ułatwia penetrację mózgu i zmniejsza odgięcie pipety (Rycina 1a).
UWAGA: Powszechnie stosowane pipety ze szkła borokrzemianowego będą zbyt elastyczne, aby prawidłowo celować w głębokie obszary przy wyciągnięciu do tej długości. W niniejszym badaniu do podania wirusa za pomocą szklanej pipety użyto injektora nanolitrowego. Alternatywnie można zastosować precyzyjną strzykawkę szklaną lub injektor ciśnieniowy. - Należy upewnić się, że klatka piersiowa myszy spoczywa na podkładce termicznej w taki sposób, aby szyja nie była naciągnięta i ciało miało odpowiednie podparcie; należy zachować szczególną ostrożność podczas poziomowania czaszki przy mocowaniu myszy w ramie stereotaksycznej (Rycina 1b).
UWAGA: Różnica między bregmą a lambdą w wymiarze pionowym powinna być mniejsza niż 0,05 mm. - Jako współrzędne do celowania w główny jądro IO należy przyjąć 6,2 mm kuzaudalnie, ±0,5 mm lateralnie i 6,6 mm brzusznie względem bregmy (Rycina 1c).
UWAGA: Idealne wypoziomowanie mózgu znacznie zwiększy skuteczność wstrzykiwania wirusa do IO. Współrzędne muszą zostać potwierdzone przez eksperymentatora, ponieważ przewiduje się istotne różnice między laboratoriami, szczepami myszy i poszczególnymi badaczami. Do przygotowania materiału wideo do niniejszej publikacji wykorzystano jednego samca myszy C57Bl/6J. - Należy postępować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki pooperacyjnej i procedur utrzymywania zwierząt z transfekcją wirusową przez okres 3-4 tygodni.
Rysunek 1: Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego. (a) Kwarcowa pipeta szklana wyciągnięta laserowo posiada prosty stożek o długości 10-12 mm. Po wyciągnięciu należy odciąć 1-2 mm z końcówki. Pipetę wykańcza się poprzez ścięcie końcówki pod kątem 30°, nadając jej kształt igły. (b) Prawidłowe wstrzyknięcie zależy od właściwego ułożenia ciała myszy w aparacie stereotaktycznym. Należy podeprzeć klatkę piersiową myszy, aby zapobiec rozciągnięciu szyi. Głowę myszy należy wypoziomować poprzez wyrównanie bregmy i lambdy w płaszczyźnie poziomej. (c) Koordynaty IO względem bregmy przedstawiono w widoku grzbietowym (lewo) czaszki myszy oraz w przekroju czołowym (prawo góra) mózgu. Wstrzyknięcie dociera do części bocznej podjądra głównego (IOPr) oraz podjądra grzbietowego (IOD) kompleksu IO (prawo dół). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Przygotowanie narzędzi i materiałów eksploatacyjnych do operacji z dostępu brzusznego
- Przygotuj rurkę do intubacji, wycinając w końcówce cewnika 20G nacięcie o długości 5–6 mm i szerokości 0,8 mm, aby intubowane zwierzę mogło wydychać powietrze (Ryc. 2a).
UWAGA: Nacięcie jest niezbędne do wydechu zwierzęcia w przypadku stosowania standardowego waporyzatora izofluranu ze stałym przepływem powietrza. Jeśli oprócz waporyzatora używany jest respirator, cewnik można pozostawić nienaruszony. - Przygotuj tępą igłę do podtrzymywania tchawicy podczas tracheotomii. Odetnij ostry czubek igły 25G za pomocą szczypiec. Wygładź powierzchnię przełomu papierem ściernym. Zegnij tępą igłę w połowie pod kątem około 15° za pomocą szczypiec.
UWAGA: Zakrzywiona igła delikatnie unosi tchawicę, co może zmniejszyć jej deformację. - Rozcieńcz ketaminę o stężeniu 50 mg/mL solą fizjologiczną do poziomu 15%. Stężenie końcowe wynosi 7,5 mg/mL.
- Przygotuj czyste narzędzia chirurgiczne oraz materiały eksploatacyjne, w tym żel z lidokainą, sól fizjologiczną, gąbki żelatynowe, chłonne tampony, wazelinę oraz chusteczki do czyszczenia.
- Włącz waporyzator izofluranu. Ustaw podgrzewaną matę dla zwierząt na 38 °C.
- Obróć stożek nosowy aparatu stereotaktycznego o 180° w poziomie, tak aby mysz mogła zostać unieruchomiona w aparacie stroną brzuszną do góry. Dostosuj wysokość stożka nosowego tak, aby znajdował się na poziomie prętów usznych.
3. Podanie znieczulenia i przygotowanie myszy do operacji
- Zważ zwierzę za pomocą wagi i oblicz ilość rozcieńczonej ketaminy do wstrzyknięcia.
UWAGA: Całkowita wymagana ilość ketaminy wynosi 56,25 mg na kg masy ciała. Zatem objętość rozcieńczonej ketaminy wynosi 7,5 mL na kg masy ciała. Do wad stosowania samej ketaminy należą słaba relaksacja mięśni, tachykardia i zwiększony napięcie mięśniowe9. W niniejszym protokole ketamina jest jednak stosowana jedynie w celu zabezpieczenia okresu 10–20 s, podczas którego podawanie izofluranu zostaje przerwane z powodu tracheotomii. Dzięki maksymalnemu skróceniu tego etapu, efekt znieczulający izofluranu nie ulega znacznemu osłabieniu, a wady stosowania ketaminy są zminimalizowane. - Umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia wypełnionej wcześniej 5% izofluranem. Gdy zwierzę zostanie w pełni znieczulone, co objawia się utratą odruchu prostowania oraz głębszym i wolniejszym rytmem oddechowym, przełącz przepływ izofluranu na lejek nosowy aparatu stereotaksycznego i zmniejsz stężenie izofluranu do 2,5%.
- Uszyj zwierzę w aparacie stereotaksycznym stroną brzuszną do góry (Rycina 2b). Dostosuj wysokość i nachylenie lejka nosowego, aby upewnić się, że zwierzę może swobodnie oddychać. Utrzymuj zwierzę w cieple, używając uprzednio podgrzanej maty grzewczej.
UWAGA: Przykrycie dolnej części ciała zwierzęcia kawałkiem ręcznika papierowego lub folii aluminiowej może pomóc w utrzymaniu temperatury zwierzęcia. - Usuń owłosienie z okolic gardła i ud za pomocą golarki i kremu do depilacji (Rycina 2b). Na skórę w okolicy gardła nanieś miejscowo żel z lidokainą.
UWAGA: Czujnik nasycenia tlenem (SpO2) mocowany do uda, który zostanie użyty w procedurze 6, działa najlepiej na skórze pozbawionej włosów. - Monitoruj temperaturę zwierzęcia za pomocą termometru rektalnego (Rycina 2b).
- Wstrzyknij 1 mL ciepłej (37 °C) soli fizjologicznej do jamy otrzewnej, aby zrekompensować utratę płynów podczas operacji.
- Oceń głębokość znieczulenia poprzez silne uszczypnięcie palców kończyny tylnej. Nie powinna wystąpić żadna wykrywalna reakcja.
Rysunek 2: Przygotowanie do operacji z dostępu brzusznym. (a) Przygotowanie rurki do intubacji poprzez wykonanie nacięcia o długości 5-6 mm i szerokości 0,8 mm w końcówce cewnika 20G. (b) Umieszczenie zwierzęcia stroną brzuszną do góry w aparacie stereotaktycznym i regulacja kąta stożka nosowego w celu zapewnienia swobodnego oddychania zwierzęcia. Wygolenie skóry w okolicy gardła i ud. Przymocowanie czujnika SpO2 do uda w celu monitorowania parametrów życiowych myszy. Wprowadzenie rektalnej sondy temperatury do monitorowania temperatury ciała myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Tracheotomia i intubacja (20-25 min)
- Odsłanianie tchawicy.
- Wykonaj pionowe nacięcie skóry szyi wzdłuż linii środkowej. Oddziel skórę szyi od znajdujących się pod nią organów wewnętrznych, stosując metodę tępej dyssekcji, i usuń skórę, aby odsłonić gruczoły ślinowe (Rycina 3a-b, 4a).
- Uwolnij gruczoły ślinowe z tkanki łącznej i odsuń je bocznie za pomocą pęsety, aby odsłonić tchawicę pokrytą mięśniem mostkowo-tarczowym (Rycina 3b-c).
UWAGA: Na odsłonięte tkanki można nałożyć wazelinę, aby utrzymać ich wilgotność. Unikaj nakładania jej w okolicy tchawicy, aby zachować czystość w kolejnych krokach.
- Tracheotomia
- Wstrzyknij pierwszą dawkę rozcieńczonej ketaminy (7,5 mg/mL) dopasowaną do masy ciała w dawce 5 mL/kg (37,5 mg/kg) drogą dostępu dootrzewnowego.
UWAGA: Ketamina zaczyna działać po 3–5 min, dlatego pierwszą dawkę należy wstrzyknąć przed oddzieleniem tchawicy od otaczających ją mięśni i naczyń krwionośnych. Ketaminę podaje się w dwóch zastrzykach ze względu na zwiększone ryzyko efektów przedawkowania przy połączeniu z anestezją izofluranem. - Ostrożnie rozdziel mięsień mostkowo-tarczowy wzdłuż linii środkowej końcówką cienkiej pęsety, aby odsłonić tchawicę (Rycina 3c). Oddziel tchawicę od naczyń krwionośnych i przełyku za pomocą pęsety, stosując metodę tępej dyssekcji.
- Wstrzyknij dopasowaną do masy ciała drugą dawkę rozcieńczonej ketaminy (7,5 mg/mL) w ilości 2,5 mL/kg (18,75 mg/kg) drogą dostępu dootrzewnowego.
- Wsuń tępy igłę poprzecznie pod tchawicę, aby ją podeprzeć (Rycina 3d). Przytrzymaj igłę palcami, aby stabilizować tchawicę. Przeciągnij nić chirurgiczną wokół trzeciego pierścienia tchawicy, położonego ogonowo względem tarczycy, używając igły półkolistej (Rycina 3d). Wykonaj na tym pierścieniu tchawicy cztery węzły instrumentalne.
UWAGA: Nić przywiązana do pierścienia tchawicy służy do przymocowania tchawicy do klatki piersiowej zwierzęcia. Na tym etapie nie odcinaj nici od igły półkolistej. Pierścienie tchawicy zbudowane są z chrząstki, która jest elastyczna, lecz mniej wytrzymała niż kości. Nie zaciskaj nici zbyt mocno, aby nie doprowadzić do złamania pierścienia. - Chwyć skórę klatki piersiowej pęsetą. Przebij skórę klatki piersiowej tą samą igłą półkolistą, której użyto w poprzednim kroku, i przeciągnij nić przez skórę w celu przygotowania do przymocowania tchawicy do klatki piersiowej w następnym kroku (Rycina 3d).
- Delikatnie unieś tchawicę, pociągając za nić przywiązaną do pierścienia tchawicy, i przetnij tchawicę rostralnie względem zawiązanego pierścienia oraz ogonowo względem tarczycy. Przesuń ogonową część tchawicy w stronę klatki piersiowej. Unieś otwór tchawicy, wsuwając pod niego niewielki kawałek gąbki chirurgicznej.
UWAGA: Przed przecięciem tchawicy upewnij się, że po drugim zastrzyku ketaminy minęło ponad 5 min, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia. - Usuń pozostałą жидкоść z wnętrza otworu tchawicy za pomocą cienkiego paska chłonnej tkaniny czyszczącej. Przełącz przepływ izofluranu z maski stereotaktycznej na rurkę intubacyjną. Wprowadź rurkę intubacyjną do tchawicy na głębokość ok. 2 mm, upewniając się, że część nacięcia w rurce pozostaje poza tchawicą, aby umożliwić oddychanie (Rycina 3e, 4b).
UWAGA: Ostrożnie dostosuj kąt wprowadzenia rurki intubacyjnej oraz głębokość jej wsunięcia, aby mysz oddychała swobodnie i aby uniknąć uszkodzenia tchawicy. Na zewnętrzną stronę tchawicy można nałożyć wazelinę, aby zapobiec jej wysychaniu i zminimalizować ryzyko przerwania tkanki. - Przymocuj tchawicę do skóry klatki piersiowej, wykonując 3–4 węzły instrumentalne. Powiąż tchawicę nicią chirurgiczną, aby zabezpieczyć rurkę intubacyjną (Rycina 3e, 4b).
- Wstrzyknij pierwszą dawkę rozcieńczonej ketaminy (7,5 mg/mL) dopasowaną do masy ciała w dawce 5 mL/kg (37,5 mg/kg) drogą dostępu dootrzewnowego.
Rycina 3: Tracheotomia i intubacja myszy. (a-c) panele pokazują proces odsłaniania tchawicy. (a) Usuń skórę gardła, przecinając ją wzdłuż przerywanych linii. (b) Odchyl gruczoły ślinowe (SG) bocznie, aby odsłonić tchawicę przykrytą mięśniem mostkowo-tarczowym (SM). (c) Rozetnij SM wzdłuż przerywanej linii, aby odsłonić tchawicę. (d-e) panele pokazują tracheotomię. (d) Podtrzymaj tchawicę za pomocą tępej i zakrzywionej igły. Powiąż trzeci pierścień tchawicy gudałowo względem tarczycy, aby przymocować tchawicę do skóry klatki piersiowej. (e) Podawaj izofluran za pomocą rurki intubacyjnej z nacięciem na końcówce. Przymocuj tchawicę do skóry klatki piersiowej nicią chirurgiczną. Zabezpiecz rurkę intubacyjną, wiążąc ją z tchawicą. Pasek skali na panelu a=5 mm, dotyczy wszystkich paneli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Schematyczna ilustracja zabiegu chirurgicznego z dostępu brzusznego w widoku bocznym. (a) Rysunek schematyczny z zaznaczonymi istotnymi częściami anatomicznymi w ich względnym położeniu, gdy mysz jest ułożona stroną brzuszną do góry. Skróty: mięsień pokrywający atlas (AM), mięsień podłużny (LM), gruczoły ślinowe (SG), mięsień mostkowo-tarczowy (SM), tarczyca (TG). (b) Schemat rozmieszczenia rurki intubacyjnej w stosunku do tchawicy po zakończeniu tracheotomii. Tchawica jest zabezpieczona wiązaniami na skórze klatki piersiowej (T-trachea). Rurka intubacyjna (IT) jest zabezpieczona wiązaniami wokół końca tchawicy (T-tube). (c) Usunięcie guzka przedniego atlasu (AAT) w celu udrożnienia linii widzenia do IO. (d) Schemat opisujący rozmieszczenie miniaturowego mikroskopu (MM) i soczewki GRIN nad IO na potrzeby eksperymentu obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
5. Odsłanianie pnia mózgu (40-45 min)
- Naciąć mięsień tarczyco-gnykowy wzdłuż włókien mięśniowych za pomocą precyzyjnej pęsety. Odciąć wyizolowaną część nożyczkami sprężystymi (Rycina 3e).
- Ostrożnie uwolnić pozostałą część tchawicy i krtani z mięśni, aby zminimalizować uszkodzenia naczyń krwionośnych w mięśniach. Usunąć pozostałą część tchawicy i krtani. Uwolnić przełyk z przyległej tkanki za pomocą pęsety i odciąć go nożyczkami sprężystymi (Rycina 5a).
- Usunąć mięśnie pokrywające łuk brzuszny i guzek przedni atlasu za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek sprężystych (Rycina 5b).
UWAGA: Podczas usuwania mięśnia należy rozdzielić jego część końcówką precyzyjnej pęsety. Odciąć oddzieloną część nożyczkami sprężystymi. Powtarzać tę czynność wielokrotnie, aż do odsłonięcia łuku brzusznego atlasu, aby zminimalizować ryzyko przerwania naczyń krwionośnych. - Przeciąć łuki brzuszne atlasu kleszczykami kostnymi (Rycina 4c, 5c). Usunąć guzkiem przednim atlasu. Usunąć krew i płyny za pomocą gąbki chirurgicznej, aby odsłonić otwór wielki i pień mózgu (Rycina 4c, 5d).
- Poszerzyć otwór wielki poprzez usunięcie kości potylicznej kleszczykami kostnymi (Rycina 5d-e).
- Usunąć cienką chrząstkę powyżej otworu wielkiego za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek sprężystych. Ostrożnie oddzielić warstwę okostną opony twardej precyzyjną pęsetą, aby uzyskać wyraźny widok na brzuszną stronę pnia mózgu (Rycina 5f). Należy uważać, aby nie przerwać opony twardej.
Rysunek 5: Odsłonięcie pnia mózgu myszy do obrazowania wapnia. (a-f) panele przedstawiają proces odsłaniania pnia mózgu. (a) Usunięcie mięśnia mostkowo-tarczowego (SM) opisanego na Rysunku 3e. Odcięcie krtani i przełyku. (b) Usunięcie mięśnia podłużnego (LM) oraz mięśnia pokrywającego atlas (AM). (c) Przecięcie łuków brzusznych atlasu (AVA) kleszczykami kostnymi i usunięcie guzka przedniego atlasu (AAT). (d) Odcięcie kości potylicznej (OB) w celu poszerzenia otworu wielkiego (FM). (e) Poszerzony FM. (f) Usunięcie cienkiej chrząstki nad otworem wielkim. Odwarstwienie warstwy okostnej opony twardej. Kwadrat wskazuje obszar zawierający powierzchowne neurony IO. (g) Obrazowanie IO za pomocą soczewki GRIN. Pasek skali w a=5 mm, dotyczy a-c. Pasek skali w d=2 mm, dotyczy d-e. Pasek skali w f=2 mm. Pasek skali w g=2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
6. Obrazowanie wapnia
- Zaciśnij czujnik SpO2 na udzie myszy, aby monitorować parametry życiowe, takie jak częstość akcji serca, saturacja tlenem i częstość oddechów (Rycina 2b).
UWAGA: Częstość akcji serca powinna wynosić od 500 bpm do 600 bpm, saturacja tlenem powinna być wyższa niż 90%, a częstość oddechów powinna wynosić 50-70 oddechów na minutę10,11. - Zamocuj sondę z soczewką GRIN (długość 9 mm, średnica 1 mm) na pręcie implantacyjnym.
UWAGA: Przed obrazowaniem oczyść soczewkę GRIN za pomocą chusteczki czyszczącej nasączonej 70% etanolem, aby zapewnić dobrą jakość obrazu. - Ustabilizuj pręt implantacyjny na ramie stereotaktycznej i zamontuj miniaturowy mikroskop na pręcie implantacyjnym.
UWAGA: Przygotowanie miniaturowego mikroskopu do obrazowania powinno zostać wykonane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi użytkownika produktu. - Dodaj kilka kropel ciepłej soli fizjologicznej w obszarze pnia mózgu, aby zanurzyć soczewkę GRIN.
- Zbliż soczewkę GRIN do pnia mózgu (Rycina 4d, 5g). Włącz niebieską diodę LED wzbudzenia (455 ± 8) w miniaturowym mikroskopie. Zlokalizuj neurony IO przetransfekowane GCaMP6s, monitorując obraz fluorescencyjny z miniaturowego mikroskopu. Szukaj neuronów IO w obszarze o kształcie prostokąta, ok. 0,5-1,7 mm rostralnie w stosunku do pozostałego atlasu i ok. 0,6-1,1 mm bocznie od linii środkowej w powierzchownym obszarze brzusznej części pnia mózgu (Rycina 5f).
UWAGA: Podczas poszukiwania odpowiedniego pola widzenia do obrazowania IO, szukaj miejsca, w którym średnia średnica somat odpowiada średnicy somat neuronów IO (około 15 µm12). Sąsiednie obszary w formacji siateczkowatej rdzenia przedłużonego składają się ze znacznie większych komórek13,14. Zachowaj ostrożność podczas pionowego przesuwania soczewki GRIN, ponieważ zbyt silny nacisk na pień mózgu może doprowadzić do śmierci zwierzęcia.
7. Eutanazja zwierzęcia po zakończeniu procedury
- Po zakończeniu eksperymentu uśmierć zwierzę poprzez zwichnięcie szyi lub inną metodę zatwierdzoną przez lokalne przepisy dotyczące opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi.
- W przypadku dalszych badań histologicznych, najpierw zpodaj zwierzęciu znieczulenie za pomocą leku wstrzykiwanego, takiego jak kombinacja ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg i 10 mg/kg)15, przed perfuzją serca roztworem Ringera, a następnie roztworem utrwalającym w celu utrwalenia mózgu.
8. Przetwarzanie danych
- Przeprowadź wstępne przetwarzanie nagranego filmu z obrazowania wapniowego przed analizą danych.
UWAGA: Na tym etapie wykorzystano komercyjne oprogramowanie do przetwarzania danych dołączone do miniaturowego mikroskopu; kolejne kroki protokołu odnoszą się do tego programu. Alternatywnie do wstępnego przetwarzania i analizy można wykorzystać bezpłatne oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym, takie jak CaImAn16, MINIPIPE17 oraz MiniscoPy18.- Wczytaj nagrany film z obrazowania wapniowego do oprogramowania do przetwarzania danych.
- Kliknij przycisk Preprocess. Zdefiniuj obszar przycinania, wykluczając regiony pozbawione fluorescencyjnych neuronów, i przytnij film, aby zmniejszyć rozmiar pliku i przyspieszyć przetwarzanie.
- Kliknij przycisk Spatial Filter. Ustaw dolną i górną granicę odcięcia filtru przestrzennego odpowiednio na 0.005 pixel-1 oraz 0.5 pixel-1. Zastosuj filtr przestrzenny do każdej klatki filmu, aby zwiększyć kontrast i wygładzić obraz.
UWAGA: Filtr przestrzenny jest pasmowym filtrem Gaussa. Składniki o niskiej częstotliwości przestrzennej, pochodzące z komórek poza ogniskiem, mogą zakłócać korekcję ruchu w następnym kroku. Składniki o wysokiej częstotliwości przestrzennej mogą sprawić, że film będzie wydawał się mniej gładki. - Kliknij przycisk Motion Correction. Zastosuj korekcję ruchu do filmu, używając pierwszej klatki jako klatki referencyjnej, aby zredukować artefakty związane z ruchem wywołane przepływem krwi w pniu mózgu.
UWAGA: Korekcja ruchu wykorzystuje metodę rejestracji obrazu opracowaną przez Thevenaz et al19. - Wyeksportuj skorygowany pod względem ruchu film w formacie TIFF.
- Zastosuj algorytm CNMF-E20 do skorygowanego pod względem ruchu filmu w programie MATLAB w celu identyfikacji pojedynczych neuronów, postępując zgodnie z instrukcjami dla kodu CNMF-E MATLAB w repozytorium online21.
UWAGA: CNMF-E to podejście oparte na ograniczonej nieujemnej faktoryzacji macierzy, dostosowane do obrazowania jednofotonowego. Skrypty demonstracyjne w repozytorium mogą zostać zmodyfikowane i użyte do przetwarzania danych.
Wyniki
W tej części przedstawiamy reprezentatywny zapis uzyskany za pomocą opisanego sposobu. Rycina 6a pokazuje lokalizację silnie znakowanych komórek IO wizualizowanych podczas eksperymentu. Ciemne diagonalne prążki to naczynia krwionośne. Należy zwrócić uwagę na zmienną jasność poszczególnych komórek, wynikającą ze zmiennej wydajności transfekcji. Na panelu Rycina 6b przedstawiamy przebiegi średnio znormalizowanej intensywności fluorescencji (deltaF/F) uzyskane z somat wskazanych kolorami i numerami na panelu a. Odchylenia w górę reprezentują przejściowe wzrosty stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego. Zauważmy, jak różny poziom ekspresji GCaMP6s (odzwierciedlony w jasności komórek na panelu a) prowadzi do zmiennych stosunków sygnału do szumu (SNR).
Rycina 6: Przykład zapisu aktywności neuronów IO u znieczulonej myszy. (a) Reprezentatywna klatka obrazu z zapisu po filtrowaniu przestrzennym. Jasne punkty to somata neuronów IO, z których kilka wskazano jako obszary zainteresowania (ROI, kolorowe numery). Ciemne pasy to naczynia krwionośne. (b) Przykład przebiegów deltaF/F uzyskanych z obszarów ROI wskazanych na panelu a. Odchylenia w górę odzwierciedlają wzrost sygnału wapniowego. Pasek skali na a=10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Ponieważ zabieg chirurgiczny obejmuje operacje wykonywane w okolicy gardła z wieloma niezwykle krytycznymi strukturami (tętnice, nerwy), ważne jest, aby był on przeprowadzany przez badacza o wysokich umiejętnościach chirurgicznych. Poniżej podkreślamy i komentujemy kilka kluczowych punktów procedury; Należy jednak pamiętać, że żadna ilość pisemnych porad nie zastąpi doświadczenia, umiejętności i intuicji badacza.
Najważniejszym etapem operacji jest tracheotomia. Polega na przecięciu tchawicy, przełączeniu izofluranu ze stożka nosowego na rurkę intubacyjną, przymocowaniu tchawicy do skóry klatki piersiowej i związaniu tchawicy i rurki intubacyjnej razem. Wszystkie te operacje muszą być wykonywane w sposób płynny i szybki, aby uniknąć wypadków, takich jak nieodpowiednie znieczulenie, napływ płynu do tchawicy lub zsunięcie się rurki intubacyjnej. Przed przecięciem tchawicy należy pamiętać o protokole.
Krwotok jest jedną z głównych przyczyn śmierci zwierząt podczas tej operacji. Ponieważ obszar szyi jest gęsty od naczyń krwionośnych, cięcie powinno być wykonywane tylko wtedy, gdy linia wzroku jest czysta, aby uniknąć przecinania niewidocznych żył i tętnic. Dlatego mięśnie i tkanki łączne zasłaniające widzenie muszą zostać usunięte, a krew z popękanych naczyń włosowatych musi zostać oczyszczona przed przejściem.
Zwierzę może być utrzymywane przy życiu przez długi czas (ponad 8 godzin) od rozpoczęcia operacji. Jednak ważne jest, aby szybko zakończyć zabieg chirurgiczny, aby mieć więcej czasu na zbadanie neuronów pnia mózgu, gdy stan fizjologiczny zwierzęcia jest dobry. Doświadczony badacz może zakończyć całą procedurę w 70 minut.
Chociaż metoda zapewnia czysty widok brzusznych powierzchni mózgu, niestety nie jest to możliwe bez wykonania tracheotomii, a także usunięcia znacznej ilości tkanki w okolicy gardła. Dlatego nie można pozwolić, aby zwierzę obudziło się ze znieczulenia. Co więcej, nawet jeśli możliwe jest utrzymanie zwierzęcia przy życiu przez wiele godzin przy starannym dostosowaniu środka znieczulającego, utrzymaniu temperatury ciała i nawodnienia, nieuniknione jest, że długotrwałe eksperymenty ostatecznie doprowadzą do osłabienia stanu zwierzęcia. Do kompetencji badacza pozostawia się rozważenie maksymalnego czasu trwania stabilnych nagrań.
Innym potencjalnym ograniczeniem opisanej tutaj metody jest to, że ponieważ soczewka GRIN nie jest wprowadzana do miąższu mózgu, można badać tylko stosunkowo powierzchowne neurony (~150-200 μm). Podczas gdy chirurgiczne wszczepienie soczewki GRIN jest technicznie możliwe, metoda ostrej operacji nie daje neuronom wystarczająco dużo czasu na regenerację po stresie oksydacyjnym, a obecność krwi po implantacji prawdopodobnie pogorszy jakość obrazu ponad akceptowalność.
Pomimo powyższych obaw uważamy, że po raz pierwszy zaprezentowano metodę obrazowania in vivo neuronów IO. Pozwala na badanie aktywności czasoprzestrzennej neuronów IO w kontekście in vivo w obecności nienaruszonych aferentnych danych wejściowych z systemów sensorycznych, a także sygnałów z jąder móżdżku i połączenia międzymózgowiowego22, co do tej pory nie było możliwe. Dzięki tej metodzie funkcja IO może być teraz badana bardziej dogłębnie dzięki połączeniu stymulacji sensorycznej i optogenetycznej. W szczególności, wraz z ewolucją obrazowania napięciowego (takiego jak nasza niedawna metoda obrazowania napięcia w IO 23), mamy nadzieję, że przedstawiona metoda chirurgiczna zainspiruje wielu badaczy do podjęcia wyzwania zbadania, w jaki sposób IO przyczynia się do generowania kolców kompleksu móżdżku.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Andrew Scottowi z centrum medialnego OIST za pomoc w nagrywaniu i edycji wideo. Dziękujemy również Hugo Hoedemakerowi za pomoc w opracowaniu operacji odsłonięcia pnia mózgu oraz dr Kevinowi Dorgansowi za pomoc w rysowaniu diagramów do rysunków. Ponadto wielkie podziękowania dla Salvatore Lacavy za jego narrację głosową, a także dla wszystkich członków nRIM i zwierząt domowych za nieustanne wsparcie na rzecz dobrego samopoczucia w trudnych czasach COVID-19.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AAV. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Szew wchłanialny z igłą półokrągłą 6 mm | Natume, Japonia | L6-60N2 | igła haczykowa z gwintem |
| Trójkąty absorpcyjne | FST, Niemcy | 18105-03 | Gąbki chirurgiczne |
| Mikroskopy stereoskopowe | Leica, Niemcy | M50 | |
| Castroviejo uchwyt igły z zakrzywioną końcówką z blokadą | FST, Niemcy | 12061-01 | Narzędzie chirurgiczne |
| Waciki bawełniane | Sanyo, Japonia | HUBY-340 | |
| Delikatne kleszczyki do wiązania szwów | FST, Niemcy | 11063-07 | Narzędzie chirurgiczne |
| Delikatne kleszcze do wiązania szwów | FST, Niemcy | 11063-07 | Narzędzie chirurgiczne |
| Dumont #5/45 kleszcze | FST, Niemcy | 11251-35 | Narzędzie chirurgiczne |
| Nożyczki do cienkiej tęczówki | FST, Niemcy | 14060-09 | Narzędzie chirurgiczne |
| Friedman-Pearson rongeur zakrzywiona końcówka | FST, Niemcy | 16221-14 | Narzędzie chirurgiczne |
| Wchłanialna gąbka żelatynowa | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatyczna gąbka żelatynowa |
| Nanoiniekcja szklano-kapilarna | Neurostar, Niemcy | n/a | Do wstrzykiwania wektora wirusa |
| Graefe Kleszcze z ząbkowaną końcówką | FST, Niemcy | 11052-10 | Narzędzie chirurgiczne |
| Pręt implantacyjny | Inscopix, USA | n/a | Jest częścią systemu nVoke2. Został zaprojektowany tak, aby nVoke2 miniaturowy microscpe i można na nim zamontować soczewkę GRIN |
| IsoFlo | Zoetis, Wielka Brytania | bez | Isoflurane |
| KETALAR DO WSTRZYKIWAŃ DOMIĘŚNIOWYCH | Daiichi Sankyo, Japonia | n/a | Ketamina |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Chusteczki czyszczące | |
| Laserowy ściągacz do mikropipet | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Mikropipeta Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Zmotoryzowany stereotaktyczny oparty na Kopf, model 900 | Neurostar, Niemcy | nie dotyczy | Stereotaktyczna |
| mysz ramkowaOxPlus z czujnikiem temperatury w odbycie i pulsoksymetrem z zaciskiem uda | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Mierzy tętno zwierząt, nasycenie tlenem tętniczym (SpO2), częstość oddechów i temperaturę |
| nVoke2 integrarted System mikrokamer do obrazowania wapnia | Inscopix, USA | 1000-003026 | Mikroskop |
| miniaturowy Wagi kompaktowe Ohaus | Ohaus, USA | CS 200 | Waga służąca do ważenia zwierząt |
| Otsuka Sól fizjologiczna | Normalna Otsuka Pharmaceutical Factory, Japonia | n/a | |
| Fizjologiczno-biologiczny system regulatora temperatury | SuperTech Instruments, Węgry | TMP-5b | Podkładka termiczna do myszy |
| ProView Lens Probe Średnica 1,0 mm, długość 9,0 mm | Inscopix, USA | 1050-002214 | Soczewka z gradientowym indeksem załamania światła (GRIN) |
| Q114-53-10NP szklane kapilary | Sutter Instrument, USA | 112017 | Dostosowane kapilary ze szkła kwarcowego |
| Bezpieczny cewnik dożylny 20G | B. Braun, Niemcy | 4251652-03 | Cewnik Gauage 20 używany do przygotowania rurki |
| Papier ścierny | ESCO, Japonia | EA366MC | Służy do polerowania końcówki igły 25G w celu przygotowania zakrzywionej i igły |
| Ostrze skalpela | Muromachi Kikai, Japonia | 10010-00 | Służy do cięcia końcówki pipety ze szkła kwarcowego |
| System do znieczulenia wziewnego SomnoSuite o niskim przepływie | Kent Scientific, USA | SOMNO | Zapewnia precyzyjną kontrolę przepływu izofluranu |
| Wiertarka Surgic XT Plus | NSK | Y1002774 | Do wstrzykiwań wektorów wirusowych |
| Strzykawka 1 ml | Terumo, Japonia | SS-01T | |
| Igła strzykawkowa 25G | Top, Japonia | 00819 | Służy do produkcji i zgiętej igły |
| Igła strzykawkowa 26G | Terumo, Japonia | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Profesjonalny trymer | Thrive, Japonia | bez | golarki |
| Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe bingen | FST, Niemcy | 15004-08 | Narzędzie chirurgiczne |
| Wazelina | Hayashi Pure Chemical, Japonia | 22000255 | |
| Veet skóra wrażliwa | Veet, Kanada | n/a | Krem do depilacji |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japonia | 871214 |
Bibliografia
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023(2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
Przedruki i uprawnienia
