Badanie wpływu temperatury na zarodkowanie i wzrost nanocząstek za pomocą mikroskopii elektronowej transmisji ciekłych komórek

Podsumowanie

Kontrola temperatury podczas eksperymentów z mikroskopią elektronową w fazie ciekłej otwiera nowe perspektywy badania dynamiki nanocząstek w środowiskach ciekłych, naśladując ich powstawanie lub stosowanie mediów. Korzystając z niedawno opracowanych ogniw cieczy grzewczej, bezpośrednio obserwowaliśmy wpływ temperatury na procesy zarodkowania i wzrostu nanocząstek złota w wodzie.

Streszczenie

Kontrola temperatury to najnowsze osiągnięcie, które daje dodatkowy stopień swobody w badaniu nanochemii za pomocą mikroskopii elektronowej z transmisją komórek ciekłych. W artykule opisano, jak przygotować eksperyment ogrzewania in situ do badania wpływu temperatury na powstawanie nanocząstek złota napędzanych radiolizą w wodzie. Protokół eksperymentu jest dość prosty i obejmuje specjalną płynną celę o równomiernej zdolności grzewczej do 100 °C, uchwyt TEM z cieczową komórką z możliwością przepływu i zintegrowany interfejs do kontrolowania temperatury. Pokazujemy, że na mechanizmy zarodkowania i wzrostu nanocząstek złota drastycznie wpływa temperatura w płynnej komórce. Wykorzystując obrazowanie STEM i nanodyfrakcję, ewolucja gęstości, rozmiaru, kształtu i struktury atomowej rosnących nanocząstek jest ujawniana w czasie rzeczywistym. Algorytmy zautomatyzowanego przetwarzania obrazu są wykorzystywane do wyodrębniania użytecznych danych ilościowych z sekwencji wideo, takich jak zarodkowanie i tempo wzrostu nanocząstek. Podejście to dostarcza nowych danych wejściowych do zrozumienia złożonych procesów fizykochemicznych zachodzących podczas syntezy nanomateriałów w fazie ciekłej.

Wprowadzenie

Nanocząstki metali (NPs) mają obiecujące właściwości fizykochemiczne, które mogą być wykorzystywane w różnych dziedzinach, takich jak wykrywanie optyczne¹, medicine² lub energy³. Synteza chemiczna na mokro jest bardzo wszechstronną metodą wytwarzania nanocząsteczek metalowych o dobrze zdefiniowanym rozmiarze i kształcie. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano wiele strategii mających na celu przejęcie kontroli nad syntezą nanocząsteczek: wzrost za pośrednictwem nasion⁴, metoda blokowania twarzy⁵, synteza kontrolowana kinetycznie⁶, selektywne trawienie⁷ lub synteza kontrolowana temperaturą⁸. O ile jednak reakcje chemiczne napędzające syntezę są dość proste, o tyle mechanizmy zarodkowania i wzrostu już nie, ponieważ wiele parametrów odgrywa rolę w procesach powstawania, a ich indywidualny wpływ jest trudny do odtworzenia na podstawie migawek ex situ powstałych nanomateriałów wyekstrahowanych z ich pożywki formacyjnej w danych punktach czasowych syntezy. Aby naprawdę zrozumieć procesy zarodkowania i wzrostu oraz ustalić sposoby ich kontrolowania, musimy zastosować narzędzia in situ, które umożliwiają ich obserwację w czasie rzeczywistym w precyzyjnie kontrolowanym środowisku ciekłym.

Pod tym względem, mikroskopia elektronowa z transmisją komórek ciekłych (LCTEM) jest bardzo potężną metodą rzucającą nowe światło na syntezę nanocząstek metalicznych9^,10,11,12,13. Poprzez obrazowanie dynamiki poszczególnych nanostruktur bezpośrednio w ich ciekłych ośrodkach do formowania, technika ta umożliwiła głębsze zrozumienie mechanizmów zarodkowania i wzrostu, w szczególności roli defektów kryształów, morfologii zarodków i ligandów organicznych, które umożliwiają kierowanie kierunkowym wzrostem lub procesami trawienia oraz otrzymywanie nanomateriałów o określonych kształtach (nanopręty, nanogwiazdy, nanopłytki, nanopowłoki)^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}. Kiedy wiązka elektronów TEM oddziałuje z cieczami, procesy radiolizy wytwarzają silne związki redukujące i utleniające, które modyfikują skład chemiczny roztworu w napromieniowanym obszarze i mogą być wykorzystywane do napędzania procesów wzrostu lub trawienia. Co ciekawe, wiadomo, że stężenie produktów radiolitycznych wzrasta wraz z szybkością dawki elektronów, parametrem, który można precyzyjnie dostroić w mikroskopie elektronowym²⁰. W związku z tym ta zależność radiolizy od dawki do dawki została wykorzystana do kontrolowania szybkości reakcji i ujawnienia efektów kinetycznych na procesy powstawania i końcową morfologię nanostruktur^11,15,20.

Chociaż temperatura jest kluczowym parametrem w syntezie nanomateriałów, jej efekty nie zostały do tej pory dokładnie zbadane przez LCTEM, ponieważ komercyjne ogniwa cieczowe z niezawodną kontrolą temperatury zostały opracowane dopiero niedawno. Jednak takie badania in situ są niezbędne do rozwikłania złożonej kinetyki i efektów termodynamicznych wywoływanych przez zmiany temperatury. Rzeczywiście, z jednej strony wzrost temperatury ma drastyczny wpływ na procesy fasetowania podczas wzrostu, przyspiesza dyfuzję atomową i molekularną w cieczy oraz modyfikuje szybkość reakcji. Z drugiej strony, diagram nanofazowy nanostruktur jest również bardzo wrażliwy na temperaturę. W tym artykule wykorzystujemy niedawno opracowane ogniwa grzewcze do śledzenia radiolitycznego wzrostu nanocząstek złota w wodzie z kontrolą temperatury w zakresie od temperatury pokojowej do 100 °C. Ta metodologia łącząca obrazowanie STEM i dyfrakcję w środowisku, które coraz bardziej zbliża się do rzeczywistych warunków syntezy, zmniejsza lukę między obserwacjami TEM in situ a syntezami w skali laboratoryjnej.

Protokół

1. Wyrównaj transmisyjny mikroskop elektronowy do obrazowania STEM HAADF

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wyrównania mikroskopu.
2. Użyj konwencjonalnej suszonej próbki, aby wyrównać mikroskop. Nie używaj próbki cieczy.
3. Aby zminimalizować prędkość wzrostu, zminimalizuj szybkość dawki elektronów (patrz sekcja dyskusji), co oznacza użycie małej apertury kondensatora i małego rozmiaru plamki w celu zmniejszenia prądu wiązki.

2. Obsługa e-chipów

UWAGA: Komercyjne uchwyty na płyny pasują do prawie wszystkich TEM, ale używają uchwytu, który jest specjalnie zaprojektowany dla marki mikroskopu i nabiegunnika. Płynne ogniwo składa się z dwóch chipów krzemowych opartych na MEMS zwanych E-chipami, z których oba są podłożami krzemowymi z oknem 500 x 50 μm pokrytym amorficzną warstwą azotku krzemu (SiN) o grubości 50 nm, która jest przezroczysta dla elektronów (Rysunek 1A). Te dwa e-chipy mają różne rozmiary. Mały ma wymiary 2 x 2 mm ze złotymi przekładkami, które ustalają odległość między dwoma E-chipami (tutaj 150 nm) i grubość cieczy. Duży z nich ma wymiary 4 x 6 mm i ma opór osadzony wewnątrz podłoża krzemowego, który umożliwia równomierne podgrzewanie próbki cieczy (Rysunek 1B). Ze względu na sposób, w jaki są wytwarzane w pomieszczeniach czystych, E-chipy mają dwie różne strony: jedną, w której okno wygląda na małe (tutaj nazywane przednią stroną), a drugą, w której okno jest duże w kształcie zlewu (tutaj zwane tylną stroną).

1. Podczas obchodzenia się z chipami elektronicznymi nigdy nie dotykaj okienka pęsetą i nie chwyć wiórów za boki. Aby uniknąć zarysowania powierzchni podłoża silikonowego, użyj pęsety z końcówką węglową.
2. Jeśli umieszczasz E-chip na powierzchni, upewnij się, że tylna strona styka się z powierzchnią, ponieważ folia SiN jest delikatna i osadza się na przedniej stronie.

3. Czyszczenie pojemnika na płynną komórkę (przed eksperymentem)

1. Zdejmij pokrywę zakrywającą końcówkę uchwytu. Usuń atrapy płynnych komórek za pomocą pęsety. Usuń uszczelkę używaną z atrapami komórek cieczy.
   UWAGA: Fikcyjne komórki płynne to komórki płynne bez okienka SiN i tylko krzem. Służą do przechowywania uchwytu kuwety cieczowej w pompie próżniowej. Zwróć uwagę na stan mosiężnych, ponieważ z czasem łatwo się kruszą. W szczególności, jeśli są uszkodzone, należy je wymienić. W przeciwnym razie odkręcenie ich po eksperymencie może być trudne, a drobne zanieczyszczenia mogą również zakłócić ładowanie próbki.
2. Ręcznie wstrzyknąć 2 ml wody destylowanej do wnętrza uchwytu za pomocą strzykawek i zewnętrznej rurki PEEK, aby podłączyć ją do tylnej części uchwytu.
   UWAGA: Wewnątrz uchwytu znajdują się 3 tunele mikroprzepływowe. Wszystkie trzy należy oczyścić wodą. Zwróć uwagę na wodę wypływającą z przodu uchwytu: jeśli woda jest zabarwiona z powodu poprzedniego eksperymentu, kontynuuj wlewanie wody do uchwytu, aż płyn nie będzie odbarwiony.
3. W przypadku wstrzykiwania roztworu do ciekłej komórki podczas eksperymentu (w naszym przypadku 1 mM HAuCl₄ w wodzie), napełnij tym roztworem rurkę uchwytu próbki.
4. Osusz końcówkę uchwytu na płynną kucię za pomocą pistoletu pneumatycznego.

4. Przygotowanie ogniwa płynnego (E-chipsy)

1. Czyszczenie komórek cieczy.
   1. Napełnij szklaną szalkę Petriego acetonem.
   2. Napełnij szklaną szalkę Petriego metanolem.
      UWAGA: Ze względu na toksyczność metanolu, szalkę Petriego z metanolem należy umieścić pod wyciągiem. Z metanolem należy obchodzić się przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego (rękawic).
   3. Umieść jeden mały i jeden duży E-chip na szalce Petriego z acetonem i odczekaj 2 minuty.
      UWAGA: E-chipy są pokryte warstwą ochronną, którą należy usunąć przed eksperymentem. Aceton usunie fotorezyst i oczyści E-chipy z zanieczyszczeń. Aby usprawnić czyszczenie, roztwór można delikatnie wymieszać.
   4. Umieść oba E-chipy na szalce Petriego z metanolem i odczekaj 2 minuty. Metanol usunie E-chipy z acetonu i reszty zanieczyszczeń.
      UWAGA: Przenoszenie E-chipów między acetonem a metanolem musi odbywać się tak szybko, jak to możliwe, aby nie dopuścić do wyschnięcia E-chipów na powietrzu.
   5. Wysuszyć płynne komórki za pomocą pistoletu pneumatycznego. Przytrzymaj E-chip za pomocą pęsety podczas korzystania z pistoletu pneumatycznego. Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno spustu pistoletu pneumatycznego, w przeciwnym razie E-chip może wypaść z pęsety. Jeśli wypadną, wznów czyszczenie acetonem i metanolem.
   6. Sprawdź integralność okienka azotku krzemu za pomocą lornetki lub mikroskopu optycznego (Rysunek 2).
      UWAGA: Upewnij się, że szyby obu E-chipów są czyste i nie są uszkodzone. Jeśli E-chipy nie wydają się czyste, spróbuj ponownie włożyć je z powrotem do acetonu i metanolu. Jeśli brud nadal znajduje się na szybie lub jeśli szyba jest stłuczona, należy wymienić E-chipy na nowe.
   7. Plazmowo czyść E-chipy mieszaniną argonu i tlenu przez 2 minuty. Czyszczenie plazmowe E-chipów pozwala im być hydrofilowymi. Oto szczegóły konfiguracji czyszczenia plazmowego: przepływ argonu = 35 sccm, przepływ tlenu = 11,5 sccm, limit czasu przepływu gazu = 20 s, cel RF do przodu = 50 W, zakres RF do przodu = 5 W, maksymalne odbite RF = 5 W.
2. Ładowanie komórek płynu do uchwytu TEM ( Rysunek 3).
   1. Załaduj pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym do uchwytu ogniwa cieczowego ( Rysunek 3B). Sprawdź, czy zastosowana uszczelka jest czysta. Jeśli nie, wyczyść go szybko wodą destylowaną. Wysuszyć go za pomocą czystej bibuły filtracyjnej. Aby usunąć zanieczyszczenia i włókna z uszczelki, kilkakrotnie wciśnij ją między dwa arkusze parafilmu.
   2. Umieść mały E-chip w uchwycie na ogniwa cieczowe ( Rysunek 3C). Aby zmniejszyć wyginanie się folii SiN w kierunku próżni mikroskopu, należy umieścić okienka komórki cieczowej w konfiguracji skrzyżowanej. Dlatego okienko małego E-chipa musi być równoległe do długości uchwytu i skierowane do góry. Upewnij się, że mały E-chip jest dobrze włożony do uszczelki.
   3. Przygotować próbkę cieczy (w tym przypadku 1 mM HAuCl₄ w wodzie).
   4. Upuść ≈2 μl próbki cieczy na mały E-chip za pomocą mikropipety (Rysunek 3D). Jeśli mały E-chip został odpowiednio oczyszczony plazmowo, wodna próbka cieczy rozprowadzi się równomiernie po powierzchni chipa.
   5. Usuń nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej. Za pomocą ostro przyciętego kawałka bibuły filtracyjnej zmniejsz grubość warstwy cieczy na małym chipie E, aż utworzy płaską kopułę.
   6. Umieść duży E-chip w uchwycie na ogniwa cieczowe (Rysunek 3E). Umieść duży E-chip na małym przodem do dołu (przednie boki dwóch chipów muszą być skierowane do siebie). Elektrody na dużym chipie E muszą stykać się z podkładką elektrody na uchwycie.
   7. Przesuń pokrywkę z powrotem na uchwyt na kuwetę z płynem. Stopniowo dokręcaj każdą (Rysunek 3F).
   8. Wysusz ewentualną ciecz wychodzącą z E-chipów za pomocą małej wyciętej bibuły filtracyjnej. Sprawdź, czy po obu stronach komórek cieczy nie wypływa ciecz, obracając uchwyt kuwety cieczowej wokół jej osi.
3. Przetestuj uszczelnienie próżniowe celi cieczowej w przepompowni. Jeśli poziom podciśnienia pompy osiągnie 5 x ^10-2 Pa, kontynuuj protokół. Jeśli nie, sprawdź integralność okna (najprawdopodobniej jest uszkodzone) i uruchom protokół od początku z nowym zestawem E-chipów.
4. Sprawdź po raz ostatni integralność okienka z azotku krzemu za pomocą lornetki lub mikroskopu optycznego. Czasami ogniwo cieczowe będzie w stanie utrzymać podciśnienie w przepompowni, nawet jeśli okno zostanie wybite. Dzieje się tak dlatego, że gdy szyba pęknie i płyn wyleje się na zewnątrz, może tworzyć agregaty soli na pękniętej części okna, zakrywając w ten sposób otwór. Jeśli tak się stanie, przygotuj nowy zestaw E-chipów.
5. Załaduj uchwyt kuwety cieczowej do TEM i sprawdź poziom podciśnienia. Nawet jeśli ogniwo cieczowe utrzymywało podciśnienie w przepompowni i nie ma widocznego problemu z oknem, mikrowyciek ogniwa cieczowego może uniemożliwić osiągnięcie poziomu próżni wymaganego do działania TEM. Jeśli mikroskop nie może osiągnąć wymaganego poziomu podciśnienia do działania (2-5 x ^10-5 Pa), wyjmij uchwyt próbki i przygotuj nowy zestaw E-chipów.

5. Użyj uchwytu na płyn w trybie przepływu

1. Napełnij 2 strzykawki kilkoma mililitrami roztworu do wstrzyknięcia (w naszym przypadku 1 mM HAuCl₄ w wodzie).
2. Podłączyć 2 zewnętrzne rurki PEEK do strzykawek. Umieścić 2 strzykawki na pompach strzykawkowych. Włóż zewnętrzne rurki PEEK do 2 wejść uchwytu na kuwetę cieczową. Włóż jedną dodatkową zewnętrzną rurkę PEEK do wyjścia uchwytu kuwety cieczowej.
3. Wstrzyknąć roztwór o natężeniu przepływu 5 μl/min do każdego wlotu.

6. Ogrzewanie środowiska cieczy

1. Podłącz zasilacz do uchwytu. Podłącz zasilanie do komputera, na którym zainstalowane jest oprogramowanie grzewcze.
2. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie grzewcze. Włącz zasilacz.
3. Kliknij przycisk sprawdzania urządzenia. Jeśli oprogramowanie wskazuje "zaliczone", eksperyment można kontynuować. W przeciwnym razie duży E-chip może mieć problem (nieprawidłowe ładowanie E-chipa, uszkodzone elektrody...).
4. Kliknij zakładkę Eksperyment. Kliknij Ręcznie, aby aktywować ręczny tryb ogrzewania.
5. Wybierz docelową temperaturę i odpowiednio zmień szybkość temperatury. Naciśnij przycisk Zastosuj, aby podgrzać E-chipy do docelowej temperatury (Rysunek 4).
   UWAGA: E-chipy można podgrzać do 100 °C. Jeśli do eksperymentu używany jest roztwór wodny (jak w naszym przypadku), należy unikać podgrzewania E-chipów powyżej 90 °C. W przeciwnym razie próbka cieczy może wyschnąć. Podczas podgrzewania cieczy temperatura może chwilowo wzrosnąć powyżej temperatury docelowej, a następnie spaść z powrotem do żądanej temperatury. Użyj niskiej szybkości ogrzewania, aby zminimalizować takie przeregulowania (1 °C/s jest w porządku).
6. Kliknij Otoczenie, aby powrócić do temperatury otoczenia (25 °C). Kliknij Zatrzymaj, aby nagle zatrzymać ogrzewanie. Kliknij zakładkę Zakończ sesję, aby zakończyć eksperyment z ogrzewaniem.

7. Obrazowanie STEM wzrostu nanocząstek

1. Używaj mikroskopu w trybie STEM za pomocą detektora HAADF. Udać się do nieskazitelnie czystego obszaru próbki, w pobliżu rogu okienka obserwacyjnego, w którym gęstość cieczy jest minimalna. Zdobądź filmy przedstawiające wzrost nanocząstek w różnych temperaturach cieczy (Rysunek 5).
   UWAGA: Nanocząsteczki złota natychmiast pojawiają się i rosną w skanowanym obszarze. Nagrywanie wideo z liczbą klatek na sekundę jednego obrazu na sekundę jest dobrym kompromisem do obserwacji procesów wzrostu z dobrym stosunkiem sygnału do szumu i dobrą rozdzielczością czasową.

8. Nanodyfrakcja pojedynczych nanocząstek STEM

1. Uzyskaj obraz STEM HAADF kilku nanoobiektów. Uzyskaj wzór dyfrakcyjny poszczególnych nanocząstek wybranych na obrazie za pomocą oprogramowania STEMx (Rysunek 6).
   UWAGA: Nanodyfrakcja STEM to technika, która pozwala na uzyskanie wzoru dyfrakcyjnego pojedynczych nanocząstek w cieczy podczas eksperymentów wzrostowych²².
2. Po uzyskaniu obrazu STEM HAADF wybierz kilka nanoobiektów na obrazie, a oprogramowanie STEMx automatycznie zsynchronizuje pozycję sondy i kamery CCD, aby uzyskać wzór dyfrakcyjny w każdej pozycji sondy. Aby uniknąć nakładania się plam dyfrakcyjnych, należy użyć małego kąta zbieżności sondy STEM (w naszym przypadku 7,4 mrad) za pomocą małej apertury kondensatora (w naszym przypadku 10 μm).

9. Czyszczenie pojemnika na ogniwa cieczowe (po eksperymencie)

UWAGA: Tutaj opisujemy standardową procedurę czyszczenia pojemnika na płynną kuwetę. Jeśli to czyszczenie nie jest wystarczająco skuteczne, możliwe jest użycie rozcieńczonego kwasu azotowego i metanolu w celu wypłukania ewentualnych agregatów nanocząstek w uchwycie ciekłej kuwety. Należy wcześniej zapoznać się z dokumentacją kompatybilności chemicznej uchwytu kuwety cieczowej. W każdym przypadku zawsze kończ czyszczenie wstrzyknięciem wody destylowanej.

1. Zdejmij pokrywę. Usuń zużyte e-chipy. Usuń uszczelkę wewnętrzną.
   UWAGA: Zużyte E-chipy można przechowywać w przystosowanym pudełku. Następnie możliwe jest przeprowadzenie analiz ex situ TEM lub SEM nanoobiektów, które pozostały przyczepione do okien SiN po rozszczelnieniu liquid-cell¹⁵. Nie zaleca się ponownego wykorzystania E-chipów do kolejnego eksperymentu in situ, ale nadal jest to możliwe, jeśli folia SiN nie została przerwana podczas rozszczelniania płynnej komórki. Następnie można przeprowadzić eksperymenty z przerostem w innym rozpuszczalniku. ²³
2. Wstrzyknąć 5 ml wody destylowanej do rurki wlotowej i wylotowej uchwytu kuwety cieczowej.
3. Wyczyść końcówkę uchwytu kuwety ciekłej za pomocą kąpieli ultradźwiękowej przez 20 minut. Podkładkę kontaktową można zanurzyć w wannie. Zanurzaj tylko tę część, która jest przykryta pokrywką. Nie zanurzaj otworów wentylacyjnych w płynie.
4. Osusz uchwyt na ogniwa cieczowe za pomocą pistoletu pneumatycznego.
5. Włóż z powrotem uszczelkę używaną z atrapami komórek płynu. Włóż z powrotem atrapy komórek płynu i pokrywkę.
6. Przechowywać uchwyt próbki w stacji próżniowej.

10. Analiza po eksperymencie z użyciem Fidżi (ImageJ)

UWAGA: Zaleca się podzielenie każdej klatki nagranego filmu na pojedyncze obrazy. Celem tego etapu analizy po eksperymencie jest przekształcenie oryginalnych filmów nanocząstek w binarne filmy, które mogą być analizowane przez Fidżi. Filtr medianowy jest stosowany w celu zwiększenia kontrastu nanocząstek na tle (rysunki 7B i 7E). Jest to niezbędne, aby ułatwić binaryzację wideo.

1. Otwórz katalog plików zawierający obrazy wideo na Fidżi, klikając Plik | Import | Sekwencja obrazów. Pojawi się okno opcji sekwencji. Wybierz odpowiedni obraz początkowy (jeśli początek filmu ma zostać odrzucony). Wprowadź numer przyrostu sekwencji obrazów (odpowiada on liczbie klatek potrzebnych do dotarcia skanu STEM do dolnej części obrazu). Zaznacz pole Konwertuj na 8-bitową skalę szarości. Zapisz sekwencję obrazów w formacie tiff.
2. Wytnij wszystkie niepożądane artefakty z filmu (na przykład pasek skali lub krawędź okna komórki płynu).
3. Kliknij Proces | Filtry | Mediana, aby zastosować filtr mediany do wszystkich obrazów. Zapisz przetworzoną sekwencję obrazów w formacie tiff.
   UWAGA: Pojawi się okno z pytaniem o promień używany dla filtra mediany. Użyliśmy promienia 2 pikseli, ale możesz użyć różnych parametrów. Na Fidżi dostępne są również inne filtry, które można wykorzystać do usprawnienia przetwarzania obrazu. W szczególności algorytm odejmowania tła może być użyty do obniżenia intensywności tła, jeśli jest ono niejednorodne. W tym celu kliknij pozycję Proces | Odejmij tło. W naszym przypadku proces ten tworzy małe białe plamy w tle pierwszych obrazów, które mogą być interpretowane jako fałszywe nanocząstki. Dlatego nie użyliśmy tego procesu, ale powinniśmy go wypróbować na innych zestawach danych, ponieważ rosnąca grubość cieczy od rogu do środka płynnej komórki zwykle wywołuje niejednolitą intensywność tła na obrazach LCTEM o małym powiększeniu.
4. Kliknij na Obrazek | Dostosuj | Próg. Poruszaj się ręcznie, aby uzyskać lepszą precyzję progu binaryzacji, aż tylko nanocząstki zostaną pokolorowane na czerwono. Naciśnij przycisk Zastosuj. Pojawi się okno Konwertuj stos na binarny. Usuń zaznaczenie opcji Oblicz próg dla każdego obrazu. Zapisz binarną sekwencję obrazów w formacie tiff (rysunki 7C i 7F).
   UWAGA: Zaleca się sprawdzenie, czy próg jest zadowalający w każdej klatce filmu.
5. Wykonaj ten krok tylko wtedy, gdy podczas filmu występuje odwrócenie kontrastu nanocząstek. Kliknij na Proces | Binarny | Rozszerzać. Zrób to jeszcze raz, jeśli to konieczne. Kliknij Proces | Binarny | Wypełnij otwory (Rysunek 7G, zobacz sekcję dyskusji).
6. Kliknij Analizuj | Analizuj cząstki. Określ zakres wielkości analizowanych nanocząstek obserwowanych podczas eksperymentu. Sprawdź Summarize.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przynajmniej określić minimalny rozmiar obserwowanych nanocząstek. Bez niego małe czarne kropki (szum), które pojawiają się w binarnej sekwencji obrazu, będą uważane za nanocząstki. Jako pierwszą próbę wybierz rozmiar najmniejszych nanocząstek zidentyfikowanych przez oko, ale potem konieczny jest proces prób i błędów, aby zrozumieć wpływ tego parametru i zoptymalizować automatyczną analizę danych (patrz sekcja dyskusji). Przed tym krokiem, aby pobrać obszar nanocząstek, kliknij Analizuj | Ustaw wymiary i sprawdź obszar. Dostępne są inne pomiary.
7. Zapisz okna Wyniki i Podsumowanie. Liczba nanocząstek dla każdej klatki znajduje się w oknie Podsumowanie danych.

Wyniki

Rysunek 5 przedstawia dwie serie obrazów STEM HAADF tworzących się nanocząstki złota, wykonane w ciągu 80 sekund w temperaturze 25 °C i 85 °C. We wszystkich tych eksperymentach zarodkowanie i wzrost nanocząstek jest napędzany przez radiolizę wody. Wśród związków chemicznych generowanych przez zjawiska wywołane wiązką elektronów, silne środki redukujące (tj. Wodne elektrony i rodniki wodorowe) mogą redukować kwas tetrachloroaurowy, prowadząc do powstania nanokryształu złota na granicy faz między oknami SiN a cieczą. Te dwie obserwacje in situ przeprowadzone z tą samą szybkością dawki elektronów potwierdzają, że obecna metoda pozwala na zobrazowanie drastycznego wpływu temperatury na powstawanie nanocząstek w ciekłych ośrodkach. W niskiej temperaturze obserwujemy wzrost bardzo gęstego zespołu małych nanocząstek, podczas gdy w wysokiej temperaturze uzyskuje się kilka dużych i dobrze fasetowanych nanostruktur. Ponieważ kontrast obrazów STEM HAADF jest proporcjonalny do grubości nanocząstek złota, widzimy, że podczas tych eksperymentów wzrostu powstają dwie populacje obiektów: wysoce kontrastowe nanocząstki 3D i duże nanostruktury 2D o trójkątnym lub sześciokątnym kształcie i niższym kontraście (oznaczone czerwonymi strzałkami w Rysunek 5).

Metoda analizy wideo opisana w tym protokole pozwala na ilościowe określenie procesów zarodkowania i wzrostu poprzez pomiar w czasie liczby nanocząsteczek i ich średniej powierzchni w obserwowanym obszarze. Jak widać na Rysunek 8, w niskiej temperaturze w ciągu kilkudziesięciu sekund obserwacji powstaje ponad 800 nanocząstek, podczas gdy w wysokiej temperaturze powstaje tylko 30 nanocząstek. Oprócz dwóch trójkątnych i sześciokątnych nanopłytek, wszystkie nanocząstki są już obecne na pierwszym obrazie obserwacji w wysokiej temperaturze. Rysunek 9 pokazuje, że średnia powierzchnia nanocząstek wzrasta 40 razy szybciej w temperaturze 85 °C niż w temperaturze 25 °C.

Rysunek 6 przedstawia typowy obraz STEM i wzór dyfrakcyjny dwóch nanocząstek złota, które zostały wybrane bezpośrednio na obrazie (oznaczone czerwonymi strzałkami na Rysunek 6A). Tutaj możemy zidentyfikować sześcienną strukturę złota zorientowaną na powierzchni zorientowanej wzdłuż osi strefy [001] (Rysunek 6B) i [112] (Rysunek 6C).

Rysunek 1: Schemat chipów elektronicznych i końcówki uchwytu ogniwa cieczy.(A) Duży e-chip z rezystancją używaną do podgrzewania ogniwa cieczowego (na górze) i małym chipie E (na dole). (B) Oba chipy elektroniczne są ładowane do uchwytu na ogniwa cieczowe. Elektrody dużego układu E-chip stykają się z elektrodami uchwytu ogniwa cieczowego. Rezystancja dużego układu E może podgrzać ogniwo cieczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zdjęcia z mikroskopu optycznego E-chipów ilustrujące: (A) Nienaruszone okno SiN, które jest niezbędne do eksperymentu. (B) Uszkodzona płytka krzemowa na krawędzi E-Chip. Ten rodzaj E-chipów może być używany, jeśli uszkodzony obszar znajduje się poza obszarem mokrym po uszczelnieniu ogniwa płynnego (tj. jeśli uszkodzenie znajduje się poza obszarem określonym przez O-ringi). (C) Pozostałości na powierzchni E-chipa. Jeśli takie pozostałości nie pozostawią się po powtórzeniu procesów czyszczenia (patrz sekcja 4.1), nie należy używać E-chipa. (od D do F) Uszkodzone okna SiN (bezużyteczne E-chipy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zdjęcia krok po kroku procesu ładowania płynnej celi do uchwytu TEM. (A) Sam uchwyt na próbkę. (B) Umieść uszczelkę O-ring we wnęce. (C) Włóż mały E-chip do pierścieni uszczelniających uszczelki. (D) Umieść kroplę roztworu na małych E-chipach. (E) Umieść duży E-chip na małym. (F) Uszczelnij całą komorę cieczy, przykręcając pokrywę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zrzut ekranu oprogramowania grzewczego kontrolującego temperaturę ogniwa cieczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Seria zdjęć STEM HAADF w małym powiększeniu przedstawiająca wzrost nanocząstek złota. a) w temperaturze 25 °C. b) w temperaturze 85 °C. Odpowiedni czas jest wskazany w lewym dolnym rogu każdego obrazu. Nanostruktury 2D są oznaczone czerwonymi strzałkami. Wszystkie obrazy są pozyskiwane z tą samą szybkością dawki elektronów wynoszącą 3,4 elektronu·^s-1·^nm-2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Nanodyfrakcja pojedynczych nanocząstek STEM. (A) Obraz STEM używany do selekcji nanocząstek dyfrakcyjnych (pozycje sondy podczas akwizycji dyfrakcyjnej są oznaczone czerwonymi strzałkami). (B,C) Wzór dyfrakcyjny dwóch wybranych nanocząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przetwarzanie i analiza danych obrazów STEM HAADF przy użyciu Fidżi. Obrazy zostały uzyskane 40 sekund po rozpoczęciu wzrostu. (od A do C) Obraz uzyskany w temperaturze 25 °C. (od D do G) Obraz uzyskany w temperaturze 85 °C. (a,d) Surowy obraz STEM. (B,E) Przetworzony obraz (filtr mediany). (C,F) Obraz binarny. (G) Dwukrotnie stosuje się dylatację pikseli, a następnie stosuje się proces "wypełniania otworów". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Wykres przedstawiający liczbę nanocząsteczek złota w funkcji czasu w temperaturze 25 °C i 85 °C. Dwie krzywe w temperaturze 25°C są mierzone automatycznie przy minimalnym rozmiarze wykrywania (S_min) wynoszącym 20 (czerwony) i 50 (niebieski) pikseli². Zielone kropki zmierzone po 12 i 60 sekundach akwizycji reprezentują liczbę nanocząstek zliczonych ręcznie na filmie zarejestrowanym w temperaturze 25 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Wykresy przedstawiające średnią powierzchnię nanocząstek złota w funkcji czasu dla 25 °C i 85 °C. Zielone kropki reprezentują ręczne pomiary średniej powierzchni nanocząstek w danych punktach czasowych filmu uzyskanego w temperaturze 85°C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Seria zdjęć STEM HAADF w dużym powiększeniu przedstawiająca wzrost pojedynczej nanokostki złota w temperaturze 85 °C. Ta seria obrazów została uzyskana z szybkością dawki elektronów wynoszącą 83,6 elektronu.s-1.nm-2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany protokół umożliwia śledzenie zarodkowania i wzrostu nanocząstek złota napędzanych radiolizą w ciekłym medium o kontrolowanej temperaturze. W połączeniu z automatycznym przetwarzaniem wideo pozwala na pomiar wpływu temperatury na kluczowe parametry syntezy nanocząstek, takie jak gęstość, wielkość, kształt i struktura atomowa nanocząstek. Te cenne dane wejściowe pozwalają ocenić wpływ temperatury na zarodkowanie i tempo wzrostu, wykryć możliwe przejścia fazowe i uwidocznić procesy fasetowania, które dyktują ostateczny wynik roztworów koloidalnych. Wraz z możliwością kontrolowania składu ośrodków reaktywnych, TEM z płynnymi komórkami z kontrolowaną temperaturą jest kolejnym krokiem w kierunku bezpośredniej obserwacji procesów zarodkowania i wzrostu różnych nanostruktur w realistycznych warunkach syntezy. Interpretacja wyników przedstawionych w tym artykule oraz ich porównanie z modelami zarodkowania i wzrostu zostanie omówiona w innym miejscu. W tym miejscu chcemy zwrócić uwagę na kilka aspektów metodologicznych, które należy wziąć pod uwagę, aby przeprowadzić odpowiednie eksperymenty TEM in situ.

Przede wszystkim kluczowe jest zidentyfikowanie efektów wiązki elektronów w ośrodku reakcyjnym, ponieważ mogą one drastycznie wpłynąć na wyniki eksperymentu. W tym przypadku, ponieważ radioliza wody jest siłą napędową powstawania nanocząstek, prędkość wzrostu gwałtownie wzrasta wraz z szybkością dawki elektronów, co będzie miało wpływ na ostateczny kształt nanoobiektów^11,15. Dlatego, aby zbadać wpływ temperatury na zarodkowanie i wzrost nanocząstek, konieczne jest porównanie eksperymentów wzrostowych uzyskanych przy tej samej szybkości dawki elektronów. W trybie STEM szybkość dawki elektronów odpowiada prądowi wiązki (w elektronach na sekundę) podzielonemu przez rozmiar obrazu (w nm²). Dlatego stała szybkość dawki elektronów oznacza utrzymanie tego samego prądu wiązki (tj. tej samej apertury kondensatora i tego samego rozmiaru plamki) i tego samego powiększenia dla każdego eksperymentu. Kwantyfikacja prądu wiązki w warunkach obrazowania za pomocą kamery CCD lub kubka Faradaya jest ważna dla interpretacji i odtworzenia danych. Powiększenie i wynikająca z niego szybkość dawki powinny być dobrane w zależności od tego, czy chce się zobrazować wzrost dużego zespołu nanocząstek w celu uzyskania statystycznie istotnych wyników dotyczących kinetyki wzrostu (rysunek 5), czy też mechanizmy wzrostu w skali pojedynczej nanocząstki w celu zidentyfikowania preferencyjnych miejsc adsorpcji na powierzchni nanocząstek (rysunek 10). Jeśli procesy zarodkowania i wzrostu są zbyt szybkie, szczególnie przy dużym powiększeniu, należy wybrać małą aperturę kondensora i mały rozmiar plamki, aby zminimalizować szybkość dawki. Zarodkowanie i wzrost nanocząstek może również spowolnić poprzez zmniejszenie stężenia prekursora metalu w analizowanym roztworze, ale należy pamiętać, że stężenie produktów radiolitycznych będzie rosło wraz z temperaturą. Ogólnie rzecz biorąc, ważne jest również, aby wziąć pod uwagę historię napromieniania elektronów całej próbki. Tutaj, na przykład, jeśli szybko przeprowadzi się kilka eksperymentów wzrostowych w obszarach blisko siebie, gęstość nanocząstek zmniejszy się z czasem, ponieważ stężenie prekursorów złota w badanym obszarze maleje. Efekt ten można zminimalizować, rozdzielając eksperymenty wzrostu zarówno w przestrzeni, jak i w czasie oraz używając uchwytu cieczy w trybie przepływowym.

Algorytmy śledzenia interfejsów są niezwykle pomocne w automatyzacji analizy filmów i uzyskiwaniu wyników ilościowych dotyczących zarodkowania i wzrostu dużych zespołów nanocząstek. Warto jednak zauważyć, że etap binaryzacji obrazu jest zawsze specyficzny dla danych, co oznacza, że filtry i przetwarzanie danych, które muszą być zastosowane na obrazach, aby zoptymalizować wykrywanie granicy faz nanocząstka/ciecz, będą się różnić w zależności od eksperymentu. Ponadto konieczne jest porównanie wyników tych automatycznych analiz z ręcznymi pomiarami wykonanymi na kilku obrazach, aby zoptymalizować przepływ pracy przetwarzania obrazu i poznać jego ograniczenia. Tutaj, na przykład, wielokrotne rozpraszanie w coraz gęstszych nanocząstkach 3D powstających w wysokiej temperaturze indukuje odwrócenie kontrastu ich jądra po 30 sekundach obserwacji, ponieważ kątowe poszerzenie rozproszonych elektronów powoduje spadek zebranego sygnału w zakresie kątowym detektora pierścieniowego. Aby kontynuować pomiar rzeczywistej powierzchni tych nanocząstek, zastosowaliśmy proces danych "wypełniania" po binaryzacji obrazu, który wypełnia wewnętrzny okrąg kontrastów w kształcie pierścienia (Rysunek 7F,G). Musieliśmy jednak użyć niewielkiej dylatacji obiektów, aby upewnić się, że te kontrasty w kształcie pierścieni są zawsze w pełni połączone. Ten ostatni etap prowadzi do nieznacznego przeszacowania średniej powierzchni nanocząstek w pomiarach automatycznych (rys. 9). Podobnie w przypadku detekcji nanocząstek musimy zdefiniować minimalny rozmiar wykrywanych obiektów (S_mim), aby uniknąć wykrycia szumu, ale ten parametr wpływa na mierzoną szybkość zarodkowania. Jak widać na rysunku 8, liczba wykrytych nanocząstek wzrasta na początku eksperymentu, aby osiągnąć plateau. Gdy S_min jest duże (50 pikseli² odpowiada 1543 nm²), automatyczne i ręczne pomiary zgadzają się co do poziomu tego plateau (835 nanocząstek po 60 sekundach), ale wykrywanie nanocząstek jest opóźnione w automatycznej analizie, ponieważ 835 nanocząstek jest ręcznie zliczanych już po 12 s, ale nie jest automatycznie wykrywane aż do później. Ten wydłużony czas wykrywania prowadzi do niedoszacowania szybkości zarodkowania. Zmniejszenie S_min do 20 pikseli2^(tj. 617^nm2) zmniejsza błąd czasu zarodkowania zespołu nanocząstek, ale prowadzi do przeszacowania gęstości nanocząstek, szczególnie na wczesnym etapie eksperymentów (rysunek 8), co również wpływa na szybkość zarodkowania. Detekcja oraz pomiary wielkości i kształtu nanoobiektów o bardzo dynamicznym zachowaniu i niskim stosunku sygnału do szumu stanowią powszechne wyzwanie w TEM w fazie ciekłej, które można jeszcze udoskonalić przy użyciu innych metod segmentacji i odszumiania²⁴ lub podejść opartych na uczeniu maszynowym²⁵.

Wreszcie, co nie mniej ważne, przygotowanie celi cieczy i czyszczenie zbiornika cieczy musi być wykonane bardzo ostrożnie, aby uniknąć zanieczyszczenia pożywki reakcyjnej.

Ogólnie rzecz biorąc, kontrolowanie temperatury próbki podczas analiz LCTEM daje możliwość zbadania wpływu termicznego na reakcje chemiczne zachodzące na granicy faz ciał stałych i cieczy. Dlatego mamy nadzieję, że obecna metoda utoruje drogę do innych eksperymentów TEM in situ, mających na celu ujawnienie dynamiki twardych, miękkich lub biologicznych materiałów w ciekłych mediach o kontrolowanej temperaturze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop elektronowy 2100 Plus
Aceton	Merck
Mikroskop elektronowy ARM 200F	Jeol
lub mikroskop
Pęseta z końcówką węglową
	Oprogramowanie firmy Protochips
Woda rozproszona
Atrapy e-chipów	Protochipsy
Uszczelka/O-ringi	Protochipsy
Wodny roztwór złota	Merck		1 mM HAuCl4 - Przygotowane wcześniej
Duże podgrzewanie cieczy E-chip	Protochips
Metanol	Kamera Merck
One View	Szalka
Liczba : 2
Czerwona rurka			Numer: 3
Śrubokręt z momentem
Mały płynny E-chip	Protochips		Przekładki 150 nm
Detektor STEM HAADF	Jeol
STEMx	Numer
strzykawki			: 2
Pompa strzykawkowa	Numer aparatu		: 2
Pompa próżniowa	Gatan