Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

25.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62226

⸱

25 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Streszczenie

Nośniki leków na bazie lipidów były używane w klinicznie i komercyjnie dostępnych systemach dostarczania ze względu na ich małe rozmiary, biokompatybilność i wysoką skuteczność enkapsulacji. Zastosowanie nanocząstek lipidowych (LNP) do enkapsulacji kwasów nukleinowych jest korzystne dla ochrony RNA lub DNA przed degradacją, a jednocześnie wspomaga wychwyt komórkowy. LNP często zawierają wiele składników lipidowych, w tym lipid jonizowalny, lipid pomocniczy, cholesterol i lipid sprzężony z glikolem polietylenowym (PEG). LNP mogą łatwo kapsułkować kwasy nukleinowe ze względu na jonizowalny lipid, który przy niskim pH jest kationowy i pozwala na kompleksowanie z ujemnie naładowanym RNA lub DNA. W tym przypadku LNP powstają przez enkapsulację informacyjnego RNA (mRNA) lub plazmidowego DNA (pDNA) przy użyciu szybkiego mieszania składników lipidowych w fazie organicznej i składnika kwasu nukleinowego w fazie wodnej. Mieszanie to odbywa się za pomocą precyzyjnej platformy mieszania mikroprzepływowego, co pozwala na samoorganizację nanocząstek przy zachowaniu przepływu laminarnego. Rozmiar hydrodynamiczny i polidyspersyjność są mierzone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Efektywny ładunek powierzchniowy na LNP jest określany przez pomiar potencjału zeta. Skuteczność enkapsulacji charakteryzuje się przy użyciu barwnika fluorescencyjnego do ilościowego oznaczania uwięzionego kwasu nukleinowego. Reprezentatywne wyniki wskazują na powtarzalność tej metody oraz wpływ różnych parametrów formulacji i procesu na opracowane LNP.

Wprowadzenie

Nośniki leków są używane do ochrony i dostarczania terapii o typowych korzystnych właściwościach, takich jak niska cytotoksyczność, zwiększona biodostępność i lepsza stabilność1,2,3. Nanocząstki polimerowe, micele i cząstki na bazie lipidów były wcześniej badane pod kątem enkapsulacji i dostarczania kwasów nukleinowych4,5,6,7. Lipidy są stosowane w różnych typach systemów nanonośników, w tym liposomach i nanocząstkach lipidowych, ponieważ są biokompatybilne z wysoką stabilnością8. LNP mogą z łatwością kapsułkować kwasy nukleinowe w celu dostarczania genów9,10. Chronią one kwas nukleinowy przed degradacją przez proteazy surowicy podczas krążenia ogólnoustrojowego11 i mogą poprawić dostarczanie do określonych miejsc, ponieważ topografia powierzchni i właściwości fizyczne LNP wpływają na ich biodystrybucję12. LNP poprawiają również penetrację tkanek i wychwyt komórkowy9. Poprzednie badania wykazały sukces enkapsulacji siRNA w LNP13, w tym pierwszy komercyjnie dostępny LNP zawierający siRNA terapeutyczny w leczeniu polineuropatii dziedzicznej amyloidozy transtyretyny14, który został zatwierdzony przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków w 2018 roku. Ostatnio LNP są badane pod kątem dostarczania większych ugrupowań kwasu nukleinowego, a mianowicie mRNA i DNA9. W 2018 roku badania kliniczne przechodziły ~ 22 systemy dostarczania kwasów nukleinowych na bazie lipidów14. Dodatkowo, mRNA zawierające LNP są obecnie wiodącymi kandydatami i zostały wykorzystane w szczepionce przeciwko COVID-1915,16. Potencjalny sukces tych niewirusowych terapii genowych wymaga tworzenia małych (~100 nm), stabilnych i jednorodnych cząstek o wysokiej enkapsulacji kwasu nukleinowego.

Użycie jonizowalnego lipidu jako głównego składnika preparatu LNP wykazało korzyści dla kompleksacji, enkapsulacji i efektywności dostarczania14. Lipidy ulegające jonizacji zazwyczaj mają stałą dysocjacji kwasowej (pKa) < 7; na przykład dilinoleylometylo-4-dimetyloaminomaślan (D-Lin-MC3-DMA), jonizowalny lipid stosowany w zatwierdzonym przez FDA preparacie LNP, ma pKa 6,4417. Przy niskim pH grupy aminowe na jonizowalnym lipidie stają się protonowane i naładowane dodatnio, co pozwala na składanie się z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi na mRNA i DNA. Stosunek grup aminowych, "N" do fosforanów, grup "P" służy do optymalizacji montażu. Stosunek N/P zależy od użytych lipidów i kwasów nukleinowych, który różni się w zależności od preparatu18. Po utworzeniu pH można dostosować do pH obojętnego lub fizjologicznego, aby umożliwić podawanie terapeutyczne. Przy tych wartościach pH jonizowalny lipid jest również deprotonowany, co nadaje LNP neutralny ładunek powierzchniowy.

Jonizowalny lipid pomaga również w endosomalnej ucieczce19,20. LNP ulegają endocytozie podczas wychwytu komórkowego i muszą zostać uwolnione z endosomu w celu dostarczenia ładunku mRNA do cytoplazmy komórki lub ładunku DNA do jądra21. Wewnątrz endosomu znajduje się zazwyczaj bardziej kwaśne środowisko niż podłoże zewnątrzkomórkowe, co sprawia, że jonizowalny lipid jest dodatnio naładowany22,23. Dodatnio naładowany jonizowalny lipid może wchodzić w interakcje z ujemnymi ładunkami na endosomalnej błonie lipidowej, co może powodować destabilizację endosomu umożliwiając uwolnienie LNP i kwasu nukleinowego. Obecnie badane są różne jonizowalne lipidy pod kątem poprawy skuteczności zarówno dystrybucji LNP, jak i ucieczki endosomalnej14.

Inne typowe składniki LNP obejmują lipidy pomocnicze, takie jak lipid fosfatydylocholiny (PC) lub fosfoetanoloaminy (PE). 1,2-Dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC) są powszechnie stosowanymi lipidami pomocniczymi24,25. Wykazano, że DOPE tworzy odwróconą sześciokątną fazę II (HII) i zwiększa transfekcję poprzez fuzję membranową26, podczas gdy DSPC uważa się za stabilizujący LNP dzięki swojej cylindrycznej geometrii27. Cholesterol jest również włączony do preparatu w celu zwiększenia sztywności błony, co w konsekwencji pomaga w stabilności LNP. Wreszcie, glikol polietylenowy (PEG) sprzężony z lipidami jest zawarty w preparacie, aby zapewnić niezbędną barierę steryczną, która pomaga w samoorganizacji cząstek27. PEG poprawia również stabilność przechowywania LNP, zapobiegając agregacji. Co więcej, PEG jest często używany jako komponent stealth i może wydłużyć czas cyrkulacji LNP. Jednak ta cecha może również stanowić wyzwanie dla rekrutacji LNP do hepatocytów poprzez endogenny mechanizm celowania napędzany przez apolipoproteinę E (ApoE)28. W związku z tym w badaniach zbadano długość łańcucha acylowego dla dyfuzji PEG z LNP, stwierdzając, że krótkie odcinki (C8-14) dysocjują od LNP i są bardziej podatne na rekrutację ApoE w porównaniu z dłuższymi długościami acylu28. Ponadto wykazano, że stopień nasycenia ogona lipidowego, do którego sprzężony jest PEG, wpływa na rozkład tkankowy LNPs29. Ostatnio wykazano, że Tween 20, który jest powszechnie stosowanym środkiem powierzchniowo czynnym w preparatach leków biologicznych i ma długi nienasycony ogon lipidowy, ma wysoką transfekcję w drenujących węzłach chłonnych w porównaniu z PEG-DSPE, który w dużej mierze transfekował mięsień w miejscu wstrzyknięcia29. Ten parametr można zoptymalizować, aby osiągnąć pożądaną biodystrybucję LNP.

Konwencjonalne metody tworzenia LNP obejmują metodę hydratacji cienkowarstwowej i metodę wtrysku etanolu27. Chociaż są to łatwo dostępne techniki, są one również pracochłonne, mogą skutkować niską wydajnością enkapsulacji i są trudne do skalowania w górę27. Postęp w technikach mieszania zaowocował metodami, które można bardziej zwiększyć skalę, przy jednoczesnym opracowaniu bardziej jednorodnych cząstek27. Metody te obejmują mieszanie ze złączem T, mieszanie w jodełkę naprzemiennie i mikroprzepływowe ogniskowanie hydrodynamiczne27. Każda metoda ma unikalną strukturę, ale wszystkie pozwalają na szybkie wymieszanie fazy wodnej zawierającej kwas nukleinowy z fazą organiczną zawierającą składniki lipidowe, co skutkuje wysoką enkapsulacją kwasu nukleinowego27. W tym protokole wykorzystuje się szybkie i kontrolowane mieszanie przez wkład mikroprzepływowy, który wykorzystuje konstrukcję mieszania w jodełkę. Protokół ten określa przygotowanie, składanie i charakterystykę kwasów nukleinowych zawierających LNP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Schemat całego procesu przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przygotowanie buforów

UWAGA: W tym miejscu wysoce zaleca się sterylną filtrację buforów w celu usunięcia wszelkich cząsteczek, które mogłyby wpłynąć na jakość kwasów nukleinowych i LNP.

  1. Fosforanowy bufor solny (PBS)
    1. Przygotować 1x PBS, używając 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl oraz 2,7 mM KCl w wodzie wolnej od nukleaz, a następnie dostosować pH do 7,4.
    2. Sterylizować poprzez filtrację próżniową przy użyciu filtra o rozmiarze porów 0,22 µm.
  2. Bufor cytrynianowy
    1. Przygotować bufor cytrynianowy, używając 5 mM cytrynianu sodu, 5 mM kwasu cytrynowego oraz 150 mM chlorku sodu w wodzie wolnej od nukleaz, a następnie dostosować pH do 4,5.
    2. Sterylizować poprzez filtrację próżniową przy użyciu filtra o rozmiarze porów 0,22 µm.
      ​UWAGA: Bufor cytrynianowy należy przygotować tylko wtedy, gdy kwasem nukleinowym inkapsulowanym w LNP jest mRNA. W przypadku inkapsulacji DNA należy pominąć punkt 1.2 i przejść do punktu 1.3.
  3. Bufor z kwasem jabłkowym
    1. Przygotować bufor z kwasem jabłkowym, używając 20 mM kwasu jabłkowego oraz 30 mM chlorku sodu w wodzie wolnej od nukleaz, a następnie dostosować pH do 3,0.
    2. Sterylizować poprzez filtrację próżniową przy użyciu filtra o rozmiarze porów 0,22 µm.
      ​UWAGA: Bufor z kwasem jabłkowym należy przygotować tylko wtedy, gdy kwasem nukleinowym inkapsulowanym w LNP jest DNA. Pominąć punkt 1.3, jeśli inkapsulowane ma być mRNA. Do inkapsulacji mRNA stosuje się bufor cytrynianowy, ponieważ niższe pH 3,0 w buforze z kwasem jabłkowym może zwiększyć prawdopodobieństwo degradacji mRNA. W tym miejscu protokół można przerwać.

2. Przygotowanie mieszaniny lipidów

  1. Jeśli lipidy stokowe są w formie proszku, rozpuścić je w czystym etanolu 200 proof.
  2. Obliczyć wymaganą mieszaninę składników lipidowych na podstawie pożądanego stosunku molowego. Jako przykład dla całkowitego stężenia lipidów 10 mM zastosowano tutaj stosunek molowy 50:10:39:1 (lipid jonizowalny:lipid pomocniczy:cholesterol:PEG). Tabela 1 przedstawia stężenia i objętości potrzebne dla każdego z tych składników.
    UWAGA: Podczas obliczania objętości potrzebnej do uzyskania stężenia mieszaniny lipidowej w etanolu (EtOH) dla mikropłynnego mieszalnika, uwzględnia się objętość całkowitą, aby upewnić się, że dodanie EtOH nie wpływa na stężenia lipidów. Na przykład objętość lipidu jonizowalnego 68,5 µL oblicza się, mnożąc stężenie 5 mM w etanolu przez całkowitą objętość mieszaniny lipidowej 533 µL, a następnie dzieląc przez stężenie lipidu stokowego 38,9 mM.
  3. Dodać odpowiednią ilość każdego roztworu stokowego lipidów do szklanej fiolki, umożliwiając wymieszanie składników poprzez przerywane wirowanie w wortexie. Dodać etanol 200 proof do uzyskania całkowitej objętości mieszaniny 533 µL. Dla przykładu w Tabeli 1 jest to 254 µL etanolu.
    ​UWAGA: Do jednego cyklu w celu otrzymania 1 mL LNP potrzebne jest 342,5 µL roztworu lipidów. Wynika to ze stosunku mieszania 3:1 wodnego roztworu kwasów nukleinowych do organicznego roztworu lipidów, z uwzględnieniem części objętości odrzuconej przed i po pobraniu próbki. Przygotowuje się mieszaninę 533 µL, aby zrekompensować tę nadwyżkę.

3. Przygotowanie roztworu kwasów nukleinowych

UWAGA: Przygotowywanie i obchodzenie się z roztworami kwasów nukleinowych należy przeprowadzać w środowisku sterylnym i wolnym od RNaz, wszędzie tam, gdzie jest to możliwe. Prace z kwasami nukleinowymi należy w miarę możliwości wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznym).

  1. Oblicz stosunek N/P. Stosunek N/P to całkowita liczba jonizowalnych grup aminowych lipidów (N) w stosunku do całkowitej liczby ujemnie naładowanych grup fosforanowych kwasów nukleinowych (P). Stosunek N/P jest często parametrem, który można zoptymalizować podczas formowania LNP. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Oblicz liczbę jednostek N, korzystając z poniższego wzoru:
      Wzór na obliczenie jonizowalnych lipidów, związany z koncentracją molekularną w eksperymencie chemicznym.
      UWAGA: Stężenie jonizowalnych lipidów (Tabela 1) wynosi 5 mM, co jest równoważne 5 x 10-6 mol/mL. Wymagana objętość iniekcji lipidów wynosi 0,3425 mL. Na przykład, jeśli liczba jednostek N na cząsteczkę wynosi 1, stosując powyższe równanie, w mieszaninie lipidowej znajduje się 1,03 x 1018 jednostek N.
    2. Oblicz jednostki P dla pożądanego stosunku N/P. W tym przypadku jako przykład zastosowano N/P = 36.
      Równanie P=N/36=1,03x10^18/36=2,86x10^16; metoda obliczeń pomiaru statycznego.
  2. Oblicz niezbędne stężenie kwasu nukleinowego, aby uzyskać 2,86 x 1016 jednostek P, korzystając z poniższego równania.
    Wzór na mole kwasu nukleinowego: P/(liczba Avogadro × P na parę zasad × liczba zasad).
    Przy czym liczba jednostek P na parę zasad wynosi 1 dla mRNA i 2 dla DNA. Dla mRNA składającego się z 1200 zasad ilość mRNA wymagana dla N/P = 36 wynosi 3,96 x 10-11 mola.
  3. Oblicz masowe stężenie mRNA wymagane dla N/P = 36, korzystając z poniższego równania.
    Wzór na stężenie masowe; mRNA, kwantyfikacja kwasów nukleinowych; równanie, użytek edukacyjny.
    Średnia masa cząsteczkowa jednostki rybonukleotydomonofosforanu wynosi 322 g/mol30. Dla mRNA o długości 1200 zasad masa cząsteczkowa mRNA wynosi 386 400 g/mol. Wymagana objętość iniekcji roztworu kwasu nukleinowego wynosi 1,028 mL. Zatem potrzebne stężenie mRNA wynosi 1,488x10-5 g/mL, co odpowiada 14,88 µg/mL.
  4. Przygotuj 1,5 mL mRNA o stężeniu 14,88 µg/mL w buforze cytrynianowym.
    ​UWAGA: Gdy enkapsulowanym kwasem nukleinowym będzie DNA, do przygotowania roztworu kwasu nukleinowego należy użyć buforu kwasu jabłkowego.

4. Nasycanie kanałów mikroprzepływowych

UWAGA: Niniejszy protokół został opracowany na podstawie wytycznych producenta urządzenia.

  1. Wprowadź parametry przygotowania układu (priming) do oprogramowania instrumentu, klikając w odpowiednie pola (Tabela 2).
    UWAGA: Zalecany jest stosunek przepływów 3:1 oraz szybkość przepływu 4-12 mL/min27,31 . Parametry te okazały się optymalne w badaniach przedstawionych w niniejszej pracy, a także według producenta. Mogą one zostać zmienione, jeśli jest to istotne dla danej aplikacji.
  2. Otwórz pokrywę instrumentu i umieść kartridż mikroprzepływowy w bloku obrotowym.
  3. Naciągnij co najmniej 0,5 mL etanolu do strzykawki 1 mL, upewniając się, że w końcówce strzykawki nie ma pęcherzyków powietrza ani przerw w cieczy. Umieść strzykawkę w prawym wlocie kartridża.
  4. Napełnij strzykawkę 3 mL ilością 1,5 mL buforu wodnego (cytrynian dla RNA i kwas jabłkowy dla DNA), upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza ani przerw. Umieść strzykawkę w lewym wlocie kartridża.
  5. Włóż dwie probówki stożkowe 15 mL w uchwyty zaciskowe, aby służyły jako pojemniki na odpady.
  6. Kliknij Run w oprogramowaniu instrumentu, aby rozpocząć mieszanie, upewniając się, że parametry zostały wprowadzone prawidłowo.
  7. Gdy instrument zakończy przygotowanie układu, co zostanie zasygnalizowane zgaśnięciem niebieskiej lampki na dole, otwórz pokrywę i w odpowiedni sposób zutylizuj probówki stożkowe oraz strzykawki.

5. Formowanie LNP

UWAGA: Protokół ten został opracowany na podstawie wytycznych producenta urządzenia.

  1. Zaktualizuj oprogramowanie o parametry formulacji, klikając w odpowiednie pola (Tabela 2).
  2. Napełnij strzykawkę 1 mL mieszaniną lipidową (przygotowaną w kroku 2). Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z końcówki strzykawki i włóż strzykawkę do prawej strony kartridża.
  3. Pobierz roztwór kwasu nukleinowego (przygotowany w kroku 3) do strzykawki 3 mL, upewniając się, że w końcówce strzykawki nie ma pęcherzyków powietrza. Włóż strzykawkę do lewego wlotu kartridża.
    UWAGA: Podane objętości służą do przygotowania 1 mL roztworu LNP. Urządzenie to umożliwia zastosowanie strzykawek o pojemności do 10 mL, a objętości można odpowiednio skalować bez wpływu na wynik. Maksymalna objętość LNP, jaką można przygotować w jednej serii, wynosi 12 mL.
  4. Oznacz probówkę stożkową 15 mL wolną od RNaz nazwą próbki i umieść ją w lewym uchwycie do probówek. Umieść stożkową probówkę 15 mL na odpady w prawym uchwycie.
  5. Zamknij pokrywę urządzenia i kliknij Run po potwierdzeniu prawidłowego wprowadzenia parametrów.
  6. Po zakończeniu pracy urządzenia odpowiednio zutylizuj pojemnik na odpady oraz kartridż. Zachowaj probówkę stożkową z próbką LNP.
  7. Rozcieńcz LNP 5-krotnie w PBS, aby zredukować stężenie etanolu do <5% (v/v).
    UWAGA: Ważne jest, aby rozcieńczyć LNP w PBS jak najszybciej po mieszaniu mikrofluidycznym, aby zapobiec degradacji. Rozcieńczanie należy zawsze przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza i kontynuować pracę w tej komorze podczas wszystkich wymian buforów.

6. Wymiana buforu

UWAGA: Przedstawiono protokół wykorzystania filtrów do ultrawirowania. Choć ta metoda pozwala na bardziej efektywną czasowo wymianę buforów, w tym miejscu można zastosować dializę.

  1. Wstępnie przemyj filtr do ultrawirówki (rozmiar porów 100 kDa) 2 mL PBS, wirowując przy 1000 x g przez 5 min. Opróżnij PBS z dolnej komory.
    UWAGA: PBS wybrano w celu podniesienia pH do 7,4 ± 0,2, co jest wartością fizjologicznie istotną i spowoduje, że lipid jonizowalny będzie miał ładunek obojętny.
  2. Dodaj rozcieńczone LNP do górnej komory wstępnie przemytego filtra do ultrawirówki i wiruj przy 1000 x g przez 12 min.
  3. Odlej przesącz z dolnej komory. Wykonaj dwa kolejne przemycia, dodając za każdym razem 5 mL PBS do filtra do ultrawirówki. Wiruj przy tych samych parametrach. Nie ma określonej maksymalnej objętości, której należałoby przestrzegać.
    UWAGA: W przypadku przygotowania większej objętości LNP, odpowiednio zwiększ objętość PBS dla każdego przemycia. Na przykład, jeśli w jednej serii przygotowano 2 mL LNP, sugeruje się użycie 10 mL PBS na jedno przemycie.
  4. Kilkukrotnie pipetuj roztwór LNP przy ściankach filtra do ultrawirówki, aby zminimalizować straty LNP. Pobierz roztwór LNP z filtra do ultrawirówki i przechowuj w probówce wolnej od nukleaz. W razie potrzeby dodaj PBS, aby uzyskać końcową objętość roztworu LNP równą 1 mL.
  5. W razie potrzeby przefiltruj przez wstępnie zwilżony filtr strzykawkowy 0,2 µm.
    ​UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.

7. Pomiar wydajności enkapsulacji

  1. Przygotować krzywą wzorcową, wykonując 2-krotne rozcieńczenia seryjne roboczego roztworu kwasu nukleinowego w PBS, zaczynając od najwyższego stężenia 500 ng/mL i wykonując co najmniej pięć rozcieńczeń. W jako próbce ślepej wykorzystać PBS.
  2. Przygotować rozcieńczenia próbek LNP. Rozcieńczyć próbki LNP w PBS, aby uzyskać przybliżone stężenie teoretyczne znajdujące się w okolicach środka krzywej wzorcowej (np. ~ 250 ng/mL kwasu nukleinowego oszacowane na podstawie stężenia początkowego).
  3. Przygotować roztwór odczynnika do ilościowego oznaczania RNA (dla pomiarów mRNA) z TritonX-100 w celu rozbicia LNP i pomiaru całkowitej ilości kwasu nukleinowego wewnątrz i na zewnątrz LNP. Roztwór ten zawiera 0,5% (v/v) odczynnika do RNA, 0,4% (v/v) TritonX-100 oraz 99,1% (v/v) PBS.
  4. Przygotować roztwór odczynnika bez TritonX-100 w celu pomiaru ilości kwasu nukleinowego nieenkapsulowanego w LNP. Roztwór ten zawiera 0,5% (v/v) odczynnika do RNA oraz 99,5% (v/v) PBS.
    UWAGA: Jeśli LNP enkapsulują dwuniciowy DNA (dsDNA), taki jak plazmidowy DNA, w punktach 7.3 i 7.4 należy zamiast tego użyć odczynnika do dsDNA, postępując zgodnie z tą samą procedurą.
  5. W czarnej płytce fluorescencyjnej 96-dołkowej nanieść co najmniej cztery powtórzenia każdego z roztworów LNP i wzorców kwasu nukleinowego przygotowanych w punktach 7.1 i 7.2.
  6. Do połowy powtórzeń wzorców i próbek dodać taką samą objętość odczynnika zawierającego TritonX-100. Pozwoli to na określenie całkowitej ilości kwasu nukleinowego.
  7. Do pozostałych dołków ze wzorcami i próbkami dodać taką samą objętość odczynnika bez TritonX-100. Pozwoli to na określenie ilości kwasu nukleinowego nieenkapsulowanego wewnątrz LNP.
  8. Wstrząsać płytką przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby zapewnić dokładne wymieszanie wzorców i próbek z dodanym odczynnikiem, przestrzegając środków ostrożności w celu uniknięcia ekspozycji na światło.
  9. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek, przy długości fali wzbudzenia 480 nm i długości fali emisji 520 nm.
  10. Obliczyć stężenie kwasu nukleinowego poza LNP, korzystając z krzywej wzorcowej wykonanej z dodatkiem odczynnika bez TritonX-100. Pomnożyć wynik przez czynnik rozcieńczenia zastosowany w punkcie 7.2.
  11. Obliczyć stężenie kwasu nukleinowego zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz LNP, korzystając z krzywej wzorcowej wykonanej z dodatkiem odczynnika zawierającego TritonX-100. Pomnożyć wynik przez czynnik rozcieńczenia zastosowany w punkcie 7.2.
  12. Obliczyć stężenie kwasu nukleinowego wewnątrz, odejmując stężenie kwasu nukleinowego na zewnątrz (obliczone w kroku 7.10) od całkowitego stężenia kwasu nukleinowego wewnątrz i na zewnątrz (obliczonego w kroku 7.11).
  13. Wyznaczyć wydajność enkapsulacji z proporcji stężenia kwasu nukleinowego wewnątrz LNP (obliczonego w kroku 7.12) do całkowitego stężenia kwasu nukleinowego (obliczonego w kroku 7.11).
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.

8. Korekty stężenia

  1. W razie potrzeby należy skorygować stężenie kwasów nukleinowych w roztworze LNP, opierając się na wynikach wydajności enkapsulacji.
  2. Jeśli pożądane jest uzyskanie roztworu o mniejszym stężeniu, należy rozcieńczyć go buforem PBS do osiągnięcia wymaganego stężenia.
  3. Jeśli pożądane jest uzyskanie roztworu o większym stężeniu, należy przeprowadzić dodatkowe cykle wirowania z użyciem filtra do ultrawirowania.
    ​UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.

9. Pomiar rozmiaru hydrodynamicznego i polidyspersyjności LNP

  1. Rozcieńcz alikwot roztworu LNP 40-krotnie w PBS, aby uzyskać objętość końcową 1 mL.
    UWAGA: Rozcieńczenie to może zostać zmienione w razie potrzeby. Sugerowana jest ta wartość rozcieńczenia, ponieważ pozwala ona na zużycie niewielkiej objętości roztworu zapasu LNP, zapewniając jednocześnie wysoką jakość wyników.
  2. Za pomocą kuwety półmikroskopowej zmierz średnicę hydrodynamiczną oraz indeks polidyspersyjności. Wlej roztwór LNP do kuwety i umieść ją w urządzeniu. W oprogramowaniu instrumentu skonfiguruj procedurę operacyjną, określając typ pomiaru, szczegóły próbki (materiał, dyspergent, temperaturę i typ celi) oraz instrukcje pomiarowe (liczbę powtórzeń). Kliknij Start, gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia akwizycji pomiaru.

10. Pomiar potencjału zeta LNP

  1. Rozcień alikwot roztworu LNP 40-krotnie wodą wolną od nukleaz, aby uzyskać objętość końcową 1 mL.
    UWAGA: Jako rozpuszczalnik do pomiarów potencjału zeta stosuje się wodę wolną od nukleaz, aby zminimalizować wpływ buforów o wysokim zasoleniu na przewodnictwo.
  2. Za pomocą zgiętej kuwety kapilarnej do pomiaru potencjału zeta zmierz potencjał zeta.
    1. Wlej roztwór LNP do kuwety aż do linii napełnienia. Włóż ją do urządzenia, upewniając się, że elektrody mają kontakt z instrumentem.
    2. Skonfiguruj procedurę operacyjną w oprogramowaniu urządzenia, określając typ pomiaru, szczegóły próbki (materiał, dyspergent, temperatura i typ celi) oraz instrukcje pomiarowe (liczbę powtórzeń). Kliknij Start, gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia akwizycji pomiaru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W celu wykazania powtarzalności techniki, w osobnych dniach opracowano wiele partii LNP o tym samym składzie lipidowym i stosunku N/P równym 6. Partie 1 i 2 wykazały nakładające się rozkłady wielkości przy podobnej polidyspersyjności (Rycyna 2A). Nie zaobserwowano istotnych różnic w wielkości ani w wydajności enkapsulacji pomiędzy dwiema różnymi partiami (Rycyna 2B). Wydajność enkapsulacji była wysoka dla każdej z partii (>98,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powtarzalność, szybkość i przesiewanie o małej objętości to istotne zalety stosowania mieszania mikroprzepływowego do tworzenia LNP w porównaniu z innymi istniejącymi metodami (np. hydratacja filmu lipidowego i wstrzykiwanie etanolu). Wykazaliśmy powtarzalność tej metody bez wpływu na skuteczność enkapsulacji lub wielkość cząstek obserwowaną dla różnych partii LNP. Jest to podstawowe kryterium, aby każda terapia, w tym LNP, stała się klinicznie dostępna.

Opisana tutaj technika wykorzystuje nap...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Sanofi. Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów ani konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękuję Atulowi Saluja, Yatinowi Gokarnowi, Marii-Teresie Peracchii, Walterowi Schwengerowi i Philipowi Zakasowi za ich wskazówki i wkład w rozwój LNP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Glikol 1,2-dimyrystoylo-rac-glicero-3-metoksypolietylenowy-2000 (C-14 PEG)Avanti Polar Lipids880151P
10 &mikro; l Końcówki filtrów połówkowych  (wolne od RNaz, DNaz i DNA)USA Scientific1121-3810
1000 & mikro; l Końcówki filtra połówkowego (bez RNazy, DNazy, DNA)USA Scientific1111-2831
20 i mikro; l Skośne końcówki filtrów (bez RNazy, DNazy, DNA)USA Scientific1120-1810
200 i mikro; l Gramaturowane końcówki filtrujące (bez RNazy, DNazy, DNA)USA Scientific1120-8810
3β-hydroksy-5-cholesten, 5-cholesten-3β-ol (cholesterol)Sigma-AldrichC8667
BD Slip Tip Sterylne strzykawki (strzykawka 1 ml)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Slip Tip Sterylne strzykawki (strzykawka 3 ml)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer Igły strzykawkowe ogólnego zastosowania (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
Wirówka stołowaRedlica
96-dołkowe płytkiThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech MARKA BIO-CERT Probówki wirówkowe bez RNaz, DNaz i DNA (1,5 ml)Thermo Fisher Scientific14-380-813
Kwas cytrynowyFisher Scientific02-002-611
Corning 500 ml Filtr próżniowy/system butelek do przechowywania, pory 0,22 umCorning430769
Jednorazowe składane komórki kapilarneMalvernDTS1070
Alkohol etylowy, czysty 200 proofSigma-Aldrich459844
Fisher Marka Półmikro kuwetaThermo Fisher Scientific14955127
Rurki stożkowe Invitrogen (15 ml) (bez DNaz-RNaz)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeFiltry odśrodkowe Sigma Amicon UltraThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr Stołoweprecyzyjne Nanyosystemy
Woda wolna od nukleazThermo Fisher ScientificAM9930
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw do oznaczaniaThermo Fisher Scientific  P7589
Zestaw do oznaczania RNA RiboGreen Quant-iTThermo Fisher ScientificR11490
Chlorek soduFisher Scientific02-004-036
Cytrynian sodu, dwuwodny, granulowanyFisher Scientific02-004-056
Urządzenia molekularneSpectraMax i3x
Zetasizer NanoMalvern
Beckman

Bibliografia

  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250(2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745(2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959(2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enkapsulacja kwas w nukleinowychdostarczanie mRNAdostarczanie plazmidowego DNAdynamiczne rozpraszanie wiat apotencja zetawydajno enkapsulacjiniewirusowe dostarczanie gen w
Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.