Artykuł metodologiczny

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/62226

⸱

25 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nośniki leków na bazie lipidów były używane w klinicznie i komercyjnie dostępnych systemach dostarczania ze względu na ich małe rozmiary, biokompatybilność i wysoką skuteczność enkapsulacji. Zastosowanie nanocząstek lipidowych (LNP) do enkapsulacji kwasów nukleinowych jest korzystne dla ochrony RNA lub DNA przed degradacją, a jednocześnie wspomaga wychwyt komórkowy. LNP często zawierają wiele składników lipidowych, w tym lipid jonizowalny, lipid pomocniczy, cholesterol i lipid sprzężony z glikolem polietylenowym (PEG). LNP mogą łatwo kapsułkować kwasy nukleinowe ze względu na jonizowalny lipid, który przy niskim pH jest kationowy i pozwala na kompleksowanie z ujemnie naładowanym RNA lub DNA. W tym przypadku LNP powstają przez enkapsulację informacyjnego RNA (mRNA) lub plazmidowego DNA (pDNA) przy użyciu szybkiego mieszania składników lipidowych w fazie organicznej i składnika kwasu nukleinowego w fazie wodnej. Mieszanie to odbywa się za pomocą precyzyjnej platformy mieszania mikroprzepływowego, co pozwala na samoorganizację nanocząstek przy zachowaniu przepływu laminarnego. Rozmiar hydrodynamiczny i polidyspersyjność są mierzone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Efektywny ładunek powierzchniowy na LNP jest określany przez pomiar potencjału zeta. Skuteczność enkapsulacji charakteryzuje się przy użyciu barwnika fluorescencyjnego do ilościowego oznaczania uwięzionego kwasu nukleinowego. Reprezentatywne wyniki wskazują na powtarzalność tej metody oraz wpływ różnych parametrów formulacji i procesu na opracowane LNP.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nośniki leków są używane do ochrony i dostarczania terapii o typowych korzystnych właściwościach, takich jak niska cytotoksyczność, zwiększona biodostępność i lepsza stabilność1,2,3. Nanocząstki polimerowe, micele i cząstki na bazie lipidów były wcześniej badane pod kątem enkapsulacji i dostarczania kwasów nukleinowych4,5,6,7. Lipidy są stosowane w różnych typach systemów nanonośników, w tym liposomach i nanocząstkach lipidowych, ponieważ są biokompatybilne z wysoką stabilnością8. LNP mogą z łatwością kapsułkować kwasy nukleinowe w celu dostarczania genów9,10. Chronią one kwas nukleinowy przed degradacją przez proteazy surowicy podczas krążenia ogólnoustrojowego11 i mogą poprawić dostarczanie do określonych miejsc, ponieważ topografia powierzchni i właściwości fizyczne LNP wpływają na ich biodystrybucję12. LNP poprawiają również penetrację tkanek i wychwyt komórkowy9. Poprzednie badania wykazały sukces enkapsulacji siRNA w LNP13, w tym pierwszy komercyjnie dostępny LNP zawierający siRNA terapeutyczny w leczeniu polineuropatii dziedzicznej amyloidozy transtyretyny14, który został zatwierdzony przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków w 2018 roku. Ostatnio LNP są badane pod kątem dostarczania większych ugrupowań kwasu nukleinowego, a mianowicie mRNA i DNA9. W 2018 roku badania kliniczne przechodziły ~ 22 systemy dostarczania kwasów nukleinowych na bazie lipidów14. Dodatkowo, mRNA zawierające LNP są obecnie wiodącymi kandydatami i zostały wykorzystane w szczepionce przeciwko COVID-1915,16. Potencjalny sukces tych niewirusowych terapii genowych wymaga tworzenia małych (~100 nm), stabilnych i jednorodnych cząstek o wysokiej enkapsulacji kwasu nukleinowego.

Użycie jonizowalnego lipidu jako głównego składnika preparatu LNP wykazało korzyści dla kompleksacji, enkapsulacji i efektywności dostarczania14. Lipidy ulegające jonizacji zazwyczaj mają stałą dysocjacji kwasowej (pKa) < 7; na przykład dilinoleylometylo-4-dimetyloaminomaślan (D-Lin-MC3-DMA), jonizowalny lipid stosowany w zatwierdzonym przez FDA preparacie LNP, ma pKa 6,4417. Przy niskim pH grupy aminowe na jonizowalnym lipidie stają się protonowane i naładowane dodatnio, co pozwala na składanie się z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi na mRNA i DNA. Stosunek grup aminowych, "N" do fosforanów, grup "P" służy do optymalizacji montażu. Stosunek N/P zależy od użytych lipidów i kwasów nukleinowych, który różni się w zależności od preparatu18. Po utworzeniu pH można dostosować do pH obojętnego lub fizjologicznego, aby umożliwić podawanie terapeutyczne. Przy tych wartościach pH jonizowalny lipid jest również deprotonowany, co nadaje LNP neutralny ładunek powierzchniowy.

Jonizowalny lipid pomaga również w endosomalnej ucieczce19,20. LNP ulegają endocytozie podczas wychwytu komórkowego i muszą zostać uwolnione z endosomu w celu dostarczenia ładunku mRNA do cytoplazmy komórki lub ładunku DNA do jądra21. Wewnątrz endosomu znajduje się zazwyczaj bardziej kwaśne środowisko niż podłoże zewnątrzkomórkowe, co sprawia, że jonizowalny lipid jest dodatnio naładowany22,23. Dodatnio naładowany jonizowalny lipid może wchodzić w interakcje z ujemnymi ładunkami na endosomalnej błonie lipidowej, co może powodować destabilizację endosomu umożliwiając uwolnienie LNP i kwasu nukleinowego. Obecnie badane są różne jonizowalne lipidy pod kątem poprawy skuteczności zarówno dystrybucji LNP, jak i ucieczki endosomalnej14.

Inne typowe składniki LNP obejmują lipidy pomocnicze, takie jak lipid fosfatydylocholiny (PC) lub fosfoetanoloaminy (PE). 1,2-Dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC) są powszechnie stosowanymi lipidami pomocniczymi24,25. Wykazano, że DOPE tworzy odwróconą sześciokątną fazę II (HII) i zwiększa transfekcję poprzez fuzję membranową26, podczas gdy DSPC uważa się za stabilizujący LNP dzięki swojej cylindrycznej geometrii27. Cholesterol jest również włączony do preparatu w celu zwiększenia sztywności błony, co w konsekwencji pomaga w stabilności LNP. Wreszcie, glikol polietylenowy (PEG) sprzężony z lipidami jest zawarty w preparacie, aby zapewnić niezbędną barierę steryczną, która pomaga w samoorganizacji cząstek27. PEG poprawia również stabilność przechowywania LNP, zapobiegając agregacji. Co więcej, PEG jest często używany jako komponent stealth i może wydłużyć czas cyrkulacji LNP. Jednak ta cecha może również stanowić wyzwanie dla rekrutacji LNP do hepatocytów poprzez endogenny mechanizm celowania napędzany przez apolipoproteinę E (ApoE)28. W związku z tym w badaniach zbadano długość łańcucha acylowego dla dyfuzji PEG z LNP, stwierdzając, że krótkie odcinki (C8-14) dysocjują od LNP i są bardziej podatne na rekrutację ApoE w porównaniu z dłuższymi długościami acylu28. Ponadto wykazano, że stopień nasycenia ogona lipidowego, do którego sprzężony jest PEG, wpływa na rozkład tkankowy LNPs29. Ostatnio wykazano, że Tween 20, który jest powszechnie stosowanym środkiem powierzchniowo czynnym w preparatach leków biologicznych i ma długi nienasycony ogon lipidowy, ma wysoką transfekcję w drenujących węzłach chłonnych w porównaniu z PEG-DSPE, który w dużej mierze transfekował mięsień w miejscu wstrzyknięcia29. Ten parametr można zoptymalizować, aby osiągnąć pożądaną biodystrybucję LNP.

Konwencjonalne metody tworzenia LNP obejmują metodę hydratacji cienkowarstwowej i metodę wtrysku etanolu27. Chociaż są to łatwo dostępne techniki, są one również pracochłonne, mogą skutkować niską wydajnością enkapsulacji i są trudne do skalowania w górę27. Postęp w technikach mieszania zaowocował metodami, które można bardziej zwiększyć skalę, przy jednoczesnym opracowaniu bardziej jednorodnych cząstek27. Metody te obejmują mieszanie ze złączem T, mieszanie w jodełkę naprzemiennie i mikroprzepływowe ogniskowanie hydrodynamiczne27. Każda metoda ma unikalną strukturę, ale wszystkie pozwalają na szybkie wymieszanie fazy wodnej zawierającej kwas nukleinowy z fazą organiczną zawierającą składniki lipidowe, co skutkuje wysoką enkapsulacją kwasu nukleinowego27. W tym protokole wykorzystuje się szybkie i kontrolowane mieszanie przez wkład mikroprzepływowy, który wykorzystuje konstrukcję mieszania w jodełkę. Protokół ten określa przygotowanie, składanie i charakterystykę kwasów nukleinowych zawierających LNP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat całego procesu znajduje się w Rysunek 1.

1. Przygotowanie

UWAGA: Sterylne filtrowanie jest tutaj wysoce zalecane w celu usunięcia wszelkich cząstek, które mogą mieć wpływ na jakość kwasu nukleinowego i LNP.

  1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
    1. Przygotuj 1x PBS przy użyciu 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl w wodzie wolnej od nukleaz i dostosuj pH do 7,4.
    2. Sterylizuj przez filtrację próżniową przy użyciu filtra o wielkości porów 0,22 μm.
  2. Bufor cytrynianowy
    1. Przygotować bufor cytrynianowy, używając 5 mM cytrynianu sodu, 5 mM kwasu cytrynowego i 150 mM chlorku sodu w wodzie wolnej od nukleaz i dostosować do pH 4,5.
    2. Sterylizuj przez filtrację próżniową przy użyciu filtra o wielkości porów 0,22 μm.
      UWAGA: Bufor cytrynianu należy przygotować tylko wtedy, gdy mRNA jest kwasem nukleinowym, który zostanie zamknięty w LNP. Jeśli DNA będzie zamknięte w kapsułkach, pomiń 1.2 i przejdź do 1.3.
  3. Bufor kwasu jabłkowego
    1. Przygotować bufor kwasu jabłkowego przy użyciu 20 mM kwasu jabłkowego i 30 mM chlorku sodu w wodzie wolnej od nukleaz i dostosować do pH 3,0.
    2. Sterylizuj przez filtrację próżniową przy użyciu filtra o wielkości porów 0,22 μm.
      UWAGA: Bufor kwasu jabłkowego musi być przygotowany tylko wtedy, gdy DNA jest kwasem nukleinowym, który zostanie zamknięty w LNP. Pomiń 1.3, jeśli mRNA ma być kapsułkowane. Bufor cytrynianowy jest używany do kapsułkowania mRNA, ponieważ niższe pH 3,0 z buforem kwasu jabłkowego może prowadzić do zwiększonego prawdopodobieństwa degradacji mRNA. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie mieszanki lipidów

  1. Jeśli lipidy podstawowe są w postaci proszku, rozpuścić je w czystym 200-procentowym etanolu.
  2. Oblicz wymaganą mieszaninę składników lipidowych na podstawie pożądanego stosunku molowego. Stosunek molowy 50:10:39:1 (jonizowalny lipid:pomocnik lipid:cholesterol:PEG) zostanie tutaj użyty jako przykład dla całkowitego stężenia lipidów wynoszącego 10 mM. Tabela 1 przedstawia stężenia i objętości potrzebne dla każdego z tych składników.
    UWAGA: Przy obliczaniu objętości potrzebnej do osiągnięcia stężenia mieszaniny lipidów w etanolu (EtOH) dla mieszalnika mikroprzepływowego, uwzględnia się całkowitą objętość, aby zapewnić, że dodatek EtOH nie wpływa na stężenia lipidów. Na przykład objętość lipidów jonizowalnych wynoszącą 68,5 μl oblicza się, mnożąc stężenie 5 mM w etanolu przez całkowitą objętość mieszanki lipidowej wynoszącą 533 μl, a następnie dzieląc przez podstawowe stężenie lipidów wynoszące 38,9 mM.
  3. Dodać odpowiednią ilość każdego podstawowego roztworu lipidów do szklanej fiolki, aby umożliwić mieszanie składników z przerywanym wirowaniem. Dodać 200 proof etanolu, aby uzyskać całkowitą mieszaninę 533 μL. Dla przykładu w tabeli 1 jest to 254 μl etanolu.
    UWAGA: Do wyprodukowania 1 ml LNP w jednym cyklu potrzeba 342,5 μl roztworu lipidowego. Wynika to z mieszaniny wodnego kwasu nukleinowego z organicznym roztworem lipidowym w stosunku 3:1, przy czym pewna objętość jest odrzucana przed i po pobraniu próbki. Mieszanka 533 μl jest tworzona w celu zrekompensowania nadmiaru.

3. Przygotowanie roztworu kwasu nukleinowego

UWAGA: Przygotowanie i obchodzenie się z roztworami kwasów nukleinowych powinno odbywać się w sterylnym i wolnym od RNaz środowisku, jeśli to możliwe. Jeśli to możliwe, pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego z kwasem nukleinowym.

  1. Obliczać Stosunek N/P. Stosunek N / P to całkowita liczba jonizowalnych grup aminowych lipidowych (N) do całkowitej liczby ujemnie naładowanych grup fosforanowych kwasów nukleinowych (P). Stosunek N/P jest często parametrem, który można zoptymalizować podczas tworzenia LNP. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Oblicz liczbę N jednostek, korzystając z poniższego wzoru:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Stężenie jonizowalnych lipidów (tabela 1) wynosi 5 mM, co odpowiada 5 x 10-6 mol/ml. Wymagana objętość wstrzyknięcia lipidu wynosi 0,3425 ml. Na przykład, jeśli liczba jednostek N na cząsteczkę wynosi 1, przy użyciu powyższego równania w mieszaninie lipidów znajduje się 1,03 x 1018 jednostek N.
    2. Oblicz jednostki P dla żądanego stosunku N/P. Tutaj używany jest N/P = 36 na przykład.
      figure-protocol-2
  2. Oblicz niezbędne stężenie kwasu nukleinowego, aby uzyskać 2.86 x 1016 jednostek P, korzystając z poniższego równania.
    figure-protocol-3
    Gdzie liczba jednostek P na parę zasad dla mRNA wynosi 1, a DNA wynosi 2. W przypadku mRNA z 1,200 zasadami ilość mRNA wymagana dla N / P = 36 wynosi 3,96 x 10-11 moli.
  3. Obliczyć stężenie masowe mRNA wymagane dla N/P = 36, korzystając z poniższego równania.
    figure-protocol-4
    Średnia masa cząsteczkowa jednostki monofosforanu rybonukleotydu wynosi 322 g/mol30. W przypadku mRNA zawierającego 1,200 zasad masa cząsteczkowa mRNA wynosi 386,400 g/mol. Wymagana objętość iniekcji roztworu kwasu nukleinowego wynosi 1,028 ml. Zatem potrzebne stężenie mRNA wynosi 1,488x10-5 g/ml, czyli 14,88 μg/mL.
  4. Uzupełnić 1,5 ml 14,88 μg/ml mRNA w buforze cytrynianowym.
    UWAGA: Gdy DNA będzie zamkniętym w kwas nukleinowym, użyj buforu kwasu jabłkowego, aby uzupełnić roztwór kwasu nukleinowego.

4. Gruntowanie kanałów mikroprzepływowych

UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z wytycznych producenta urządzenia.

  1. Wprowadź parametry zalewania do oprogramowania urządzenia, klikając odpowiednie pola (Tabela 2).
    UWAGA: Zalecany jest współczynnik przepływu 3:1 i natężenie przepływu 4-12 ml/min27,31 . W przedstawionych tutaj badaniach wykazano, że jest to optymalne, a także przez producenta. Można to zmienić, jeśli jest to interesujące dla aplikacji.
  2. Otwórz pokrywę instrumentu i umieść wkład mikroprzepływowy w obracającym się bloku.
  3. Pobrać co najmniej 0,5 ml etanolu do strzykawki o pojemności 1 ml, upewniając się, że na końcówce strzykawki nie ma pęcherzyków ani szczelin powietrznych. Załadować strzykawkę do prawego wlotu wkładu.
  4. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml 1,5 ml wodnego buforu (cytrynian dla RNA i kwas jabłkowy dla DNA), upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza ani szczelin. Załadować tę strzykawkę do lewego wlotu wkładu.
  5. Włóż dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml do uchwytów klipsów, aby służyły jako pojemniki na odpady.
  6. Kliknij Uruchom w oprogramowaniu urządzenia, aby rozpocząć mieszanie, upewniając się, że parametry są wprowadzane prawidłowo.
  7. Gdy instrument przestanie zalewać, co jest sygnalizowane wyłączeniem dolnego niebieskiego światła, otwórz pokrywę i odpowiednio wyrzuć stożkowe rurki i strzykawki.

5. Formacja LNP

UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z wytycznych producenta urządzenia.

  1. Zaktualizuj oprogramowanie o parametry receptury, klikając odpowiednie pola (Tabela 2).
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml mieszanką lipidów (przygotowaną w kroku 2). Usunąć wszelkie szczeliny powietrzne lub pęcherzyki powietrza na końcówce strzykawki i włożyć strzykawkę po prawej stronie wkładu.
  3. Pobrać roztwór kwasu nukleinowego (przygotowany w kroku 3) do strzykawki o pojemności 3 ml, upewniając się, że w końcówce strzykawki nie ma pęcherzyków ani szczelin powietrznych. Włożyć strzykawkę do lewego wlotu wkładu.
    UWAGA: Objętości są dostarczane do przygotowania 1 ml roztworu LNP. Ten instrument może zawierać strzykawki o rozmiarach do 10 ml, a objętości można odpowiednio skalować bez wpływu na wynik. Maksymalna objętość LNP, którą można przygotować w jednym preparacie, wynosi 12 ml.
  4. Oznacz stożkową probówkę o pojemności 15 ml wolną od RNaz nazwą próbki i włóż do lewego zacisku probówki. Umieść stożkowy pojemnik o pojemności 15 ml w prawym zacisku probówki.
  5. Zamknij pokrywę instrumentu i kliknij Uruchom, po potwierdzeniu poprawnego wprowadzenia parametrów.
  6. Po zakończeniu pracy przyrządu należy prawidłowo wyrzucić pojemnik na odpady i wkład. Zachować rurkę stożkową z próbką LNP.
  7. Rozcieńczyć LNP 5x PBS, aby zminimalizować zawartość etanolu do <5% (v/v).
    UWAGA: Ważne jest, aby rozcieńczyć LNP w PBS tak szybko, jak to możliwe po zmieszaniu mikroprzepływowym, aby zapobiec degradacji. Rozcieńczanie należy zawsze wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego i kontynuować pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez cały czas wymiany.

6. Wymiana bufora

UWAGA: Podano protokół do korzystania z filtrów ultra-wirówek. Chociaż metoda ta zapewnia bardziej efektywną czasowo wymianę, dializa może być w tym przypadku zastąpiona.

  1. Umyj wstępnie filtr ultrawirówkowy (wielkość porów 100 kDa) 2 ml PBS, odwirowując przy 1000 x g przez 5 minut. Opróżnij PBS z dolnej komory.
    UWAGA: PBS jest wybierany w celu zwiększenia pH do 7,4 ± 0,2, co jest fizjologicznie istotne i spowoduje, że jonizowalny lipid będzie miał neutralny ładunek.
  2. Dodać rozcieńczone LNP do górnej komory wstępnie umytego filtra wirówkowego i wirować przy 1000 x g przez 12 minut.
  3. Wyrzuć przepływ z dolnej komory. Wykonaj jeszcze dwa płukania, za każdym razem dodając 5 ml PBS do filtra ultrawirówkowego. Wirować przy tych samych parametrach. Nie ma maksymalnej głośności, którą należy utrzymać.
    UWAGA: Jeśli przygotowano zmniejszoną objętość LNP, należy odpowiednio zwiększyć objętość PBS dla każdego prania. Na przykład, jeśli w jednym cyklu przygotowano 2 ml LNP, sugeruje się 10 ml PBS na pranie.
  4. Kilkakrotnie odpipetować roztwór LNP do ścianek filtra ultrawirówkowego, aby zminimalizować straty LNP. Usunąć roztwór LNP z filtra ultrawirówkowego i przechowywać w fiolce wolnej od nukleaz. W razie potrzeby dodać PBS, aby uzyskać końcową objętość roztworu LNP wynoszącą 1 ml.
  5. W razie potrzeby przefiltrować przez wstępnie zwilżony filtr strzykawkowy 0,2 μm.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

7. Zmierz skuteczność enkapsulacji

  1. Przygotować krzywą wzorcową, wykonując 2-krotne seryjne rozcieńczenia roboczego roztworu kwasu nukleinowego w PBS, zaczynając od najwyższego stężenia 500 ng / ml i wykonując co najmniej pięć rozcieńczeń. Użyj PBS jako pustego miejsca.
  2. Przygotować rozcieńczenia próbki LNP. Rozcieńczyć próbki LNP PBS, aby uzyskać przybliżone teoretyczne stężenie, które leży wokół punktu środkowego krzywej wzorcowej (np. ~ 250 ng/ml kwasu nukleinowego oszacowanego na podstawie początkowego stężenia).
  3. Przygotuj roztwór odczynnika do kwantyfikacji RNA (do pomiarów mRNA) z TritonX-100, aby rozbić LNP i zmierzyć całkowitą ilość kwasu nukleinowego wewnątrz i na zewnątrz LNP. Roztwór ten zawiera 0,5% (v/v) odczynnika RNA, 0,4% (v/v) TritonX-100 i 99,1% (v/v) PBS.
  4. Przygotować roztwór odczynnika bez TritonX-100 w celu odmierzenia ilości kwasu nukleinowego niezamkniętego w LNPs. Roztwór ten zawiera 0,5% (v/v) odczynnika RNA i 99,5% (v/v) PBS.
    UWAGA: Jeśli LNP kapsułkują dwuniciowy DNA (dsDNA), taki jak plazmidowe DNA, zamiast tego użyj odczynnika dsDNA w 7.3 i 7.4, postępując zgodnie z tą samą procedurą.
  5. Na 96-dołkowej czarnej płytce zdolnej do fluorescencji załadować co najmniej cztery powtórzenia każdego z LNP i roztworów wzorcowych kwasów nukleinowych przygotowanych w 7.1 i 7.2.
  6. Do połowy powtórzeń wzorców i próbek dodać równą objętość odczynnika zawierającego TritonX-100. Pozwoli to określić ilościowo całkowitą ilość kwasu nukleinowego.
  7. Do pozostałych studzienek wzorców i próbek dodać równą objętość odczynnika bez TritonX-100. Pozwoli to określić ilościowo ilość kwasu nukleinowego, który nie jest zamknięty w LNP.
  8. Potrząsać płytką przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić dokładne wymieszanie wzorców i próbek z dodanym odczynnikiem, zamierzając zachować środki ostrożności w celu uniknięcia ekspozycji na światło.
  9. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali wzbudzenia 480 nm i długości fali emisji 520 nm.
  10. Obliczyć stężenie kwasu nukleinowego poza LNP, korzystając z krzywej wzorcowej wykonanej z dodatkiem odczynnika bez TritonX-100. Pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia zastosowany w ppkt 7.2.
  11. Obliczyć stężenie kwasu nukleinowego zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz LNP, korzystając z krzywej wzorcowej wykonanej z dodatkiem odczynnika zawierającego TritonX-100. Pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia zastosowany w ppkt 7.2.
  12. Obliczyć stężenie kwasu nukleinowego wewnątrz, odejmując stężenie kwasu nukleinowego na zewnątrz (obliczone z kroku 7.10) od całkowitego stężenia kwasu nukleinowego zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz (obliczone z kroku 7.11)
  13. Określić ilościowo skuteczność kapsułkowania na podstawie stosunku stężenia kwasu nukleinowego wewnątrz LNP (obliczonego na podstawie kroku 7.12) do całkowitego stężenia kwasu nukleinowego (obliczonego na podstawie kroku 7.11).
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

8. Korekty koncentracji

  1. W razie potrzeby dostosuj stężenie kwasu nukleinowego w roztworze LNP, korzystając z wyników wydajności enkapsulacji.
  2. Jeśli pożądany jest mniej stężony roztwór, rozcieńczyć roztwór PBS, aby osiągnąć pożądane stężenie.
  3. Jeśli pożądane jest bardziej stężone roztwór, należy wykonać dodatkowe cykle wirowania za pomocą filtra ultrawirówkowego.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

9. Zmierz rozmiar hydrodynamiczny LNP i polidyspersyjność

  1. Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu LNP 40x PBS, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.
    UWAGA: W razie potrzeby rozcieńczenie to można zmienić. Ta wartość rozcieńczenia jest sugerowana, ponieważ wykorzystuje niewielką objętość roztworu podstawowego LNP, zapewniając jednocześnie wysokiej jakości wyniki.
  2. Za pomocą półmikro kuwety zmierz średnicę hydrodynamiczną i wskaźnik polidyspersyjności. Dodaj roztwór LNP do kuwety i włóż do instrumentu. Skonfiguruj procedurę operacyjną w oprogramowaniu urządzenia, aby uwzględnić typ pomiaru, szczegóły próbki (materiał, dyspergator, temperatura i typ celi) oraz instrukcje pomiaru (liczba przebiegów). Kliknij przycisk Start, gdy wszystko będzie gotowe, aby rozpocząć pobieranie pomiarów.

10. Zmierz potencjał zeta LNP

  1. Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu LNP 40x wodą wolną od nukleaz, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.
    UWAGA: Woda wolna od nukleaz jest używana jako rozpuszczalnik do pomiarów potencjału zeta w celu zminimalizowania wpływu o wysokiej zawartości soli na przewodność.
  2. Używając złożonej kapilarnej komórki zeta, zmierz potencjał zeta.
    1. Dodaj roztwór LNP do kuwety aż do linii napełniania. Włóż do instrumentu, upewniając się, że elektrody stykają się z instrumentem.
    2. Skonfiguruj procedurę operacyjną w oprogramowaniu urządzenia, aby uwzględnić typ pomiaru, szczegóły próbki (materiał, dyspergator, temperatura i typ celi) oraz instrukcje pomiaru (liczba przebiegów). Kliknij przycisk Start, gdy wszystko będzie gotowe, aby rozpocząć pobieranie pomiarów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele partii LNP o tym samym składzie lipidowym i stosunku N/P wynoszącym 6 zostało opracowanych w oddzielnych dniach, aby wykazać powtarzalność techniki. Partie 1 i 2 skutkowały nakładającymi się rozkładami wielkości o podobnej polidyspersyjności (Rysunek 2A) Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w wielkości lub skuteczności enkapsulacji między dwiema różnymi partiami (Rysunek 2B). Skuteczność hermetyzacji była wysoka dla każdej partii (>98,5%), a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powtarzalność, szybkość i przesiewanie o małej objętości to istotne zalety stosowania mieszania mikroprzepływowego do tworzenia LNP w porównaniu z innymi istniejącymi metodami (np. hydratacja filmu lipidowego i wstrzykiwanie etanolu). Wykazaliśmy powtarzalność tej metody bez wpływu na skuteczność enkapsulacji lub wielkość cząstek obserwowaną dla różnych partii LNP. Jest to podstawowe kryterium, aby każda terapia, w tym LNP, stała się klinicznie dostępna.

Opisana tutaj technika wykorzystuje nap...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy Sanofi. Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów ani konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję Atulowi Saluja, Yatinowi Gokarnowi, Marii-Teresie Peracchii, Walterowi Schwengerowi i Philipowi Zakasowi za ich wskazówki i wkład w rozwój LNP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Glikol 1,2-dimyrystoylo-rac-glicero-3-metoksypolietylenowy-2000 (C-14 PEG)Avanti Polar Lipids880151P
10 &mikro; l Końcówki filtrów połówkowych  (wolne od RNaz, DNaz i DNA)USA Scientific1121-3810
1000 & mikro; l Końcówki filtra połówkowego (bez RNazy, DNazy, DNA)USA Scientific1111-2831
20 i mikro; l Skośne końcówki filtrów (bez RNazy, DNazy, DNA)USA Scientific1120-1810
200 i mikro; l Gramaturowane końcówki filtrujące (bez RNazy, DNazy, DNA)USA Scientific1120-8810
3β-hydroksy-5-cholesten, 5-cholesten-3β-ol (cholesterol)Sigma-AldrichC8667
BD Slip Tip Sterylne strzykawki (strzykawka 1 ml)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD Slip Tip Sterylne strzykawki (strzykawka 3 ml)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer Igły strzykawkowe ogólnego zastosowania (BD Blunt Fill Needle 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
Wirówka stołowaRedlica
96-dołkowe płytkiThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech MARKA BIO-CERT Probówki wirówkowe bez RNaz, DNaz i DNA (1,5 ml)Thermo Fisher Scientific14-380-813
Kwas cytrynowyFisher Scientific02-002-611
Corning 500 ml Filtr próżniowy/system butelek do przechowywania, pory 0,22 umCorning430769
Jednorazowe składane komórki kapilarneMalvernDTS1070
Alkohol etylowy, czysty 200 proofSigma-Aldrich459844
Fisher Marka Półmikro kuwetaThermo Fisher Scientific14955127
Rurki stożkowe Invitrogen (15 ml) (bez DNaz-RNaz)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeFiltry odśrodkowe Sigma Amicon UltraThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr Stołoweprecyzyjne Nanyosystemy
Woda wolna od nukleazThermo Fisher ScientificAM9930
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw do oznaczaniaThermo Fisher Scientific  P7589
Zestaw do oznaczania RNA RiboGreen Quant-iTThermo Fisher ScientificR11490
Chlorek soduFisher Scientific02-004-036
Cytrynian sodu, dwuwodny, granulowanyFisher Scientific02-004-056
Urządzenia molekularneSpectraMax i3x
Zetasizer NanoMalvern
Beckman

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250(2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745(2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959(2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enkapsulacja kwas w nukleinowychdostarczanie mRNAdostarczanie plazmidowego DNAdynamiczne rozpraszanie wiat apotencja zetawydajno enkapsulacjiniewirusowe dostarczanie gen w

Powiązane artykuły