Ten protokół dostarcza szczegółowych wskazówek dotyczących początkowej i kontynuowanej pokoleniowej allotransplantacji guzów Drosophila do brzucha dorosłych gospodarzy w celu zbadania różnych aspektów nowotworu. Korzystając z aparatu do automatycznego wstrzykiwania, naukowcy mogą osiągnąć lepszą wydajność i wydajność guza w porównaniu z tymi osiąganymi tradycyjnymi, ręcznymi metodami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Allotransplantacja guza u Drosophila melanogaster za pomocą programowalnego wtryskiwacza Auto-Nanolitr
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje allotransplantację guzów u Drosophila melanogaster przy użyciu automatycznego aparatu iniekcyjnego nanolitrowego. Dzięki zastosowaniu aparatu do automatycznego wstrzykiwania przeszkoleni operatorzy mogą osiągnąć bardziej wydajne i spójne wyniki przeszczepu w porównaniu z tymi uzyskanymi przy użyciu wstrzykiwacza ręcznego. Tutaj omawiamy tematy w sposób chronologiczny: od skrzyżowania linii Drosophila, po indukcję i rozwarstwienie guza pierwotnego, przeszczepienie guza pierwotnego do nowego dorosłego gospodarza i kontynuację pokoleniowego przeszczepu guza do rozszerzonych badań. Jako demonstrację, tutaj używamy nadekspresji wewnątrzkomórkowych guzów pierścieniowych gruczołów ślinowych indukowanych nadekspresją Notch do przeszczepu pokoleniowego. Guzy te mogą być najpierw niezawodnie indukowane w mikrośrodowisku strefy przejściowej w wyimaginowanych pierścieniach gruczołów ślinowych larw, a następnie przeszczepiane i hodowane in vivo w celu zbadania dalszego wzrostu, ewolucji i przerzutów guza. Ta metoda allotransplantacji może być przydatna w potencjalnych programach badań przesiewowych leków, a także do badania interakcji między nowotworem a gospodarzem.
Wprowadzenie
Ten protokół zawiera krok po kroku wskazówki dotyczące allotransplantacji wyimaginowanych guzów pierścieniowych gruczołów ślinowych larw Drosophila (SG) do brzuchów dorosłych gospodarzy za pomocą automatycznego aparatu iniekcyjnego (np. Nanoject). Protokół ten zapewnia również wskazówki dotyczące późniejszej re-alloprzeszczepacji guzów do nowych pokoleń dorosłych gospodarzy, co daje możliwości dalszego badania podłużnego cech guza, takich jak ewolucja guza i interakcje guz-gospodarz. Protokół może być również stosowany w eksperymentach przesiewowych leków.
Ta metoda została opracowana w celu poprawy skuteczności przeprowadzania allotransplantacji guza u Drosophila za pomocą ręcznych wstrzykiwaczy1, które często są niespójne pod względem siły ssania i iniekcji, co prowadzi do nieoptymalnych wyników allotransplantacji guza. Aparat z automatycznym wstrzykiwaczem zapewnia lepszą kontrolę i może skutkować niższymi wskaźnikami śmiertelności much po przeszczepie allogenicznym. Przeszkolony operator mógł osiągnąć wskaźnik przeżywalności gospodarza na poziomie ponad 90% z automatycznym wstrzykiwaczem, w porównaniu do około 80%, gdy używany był ręczny wstrzykiwacz1. Ogólny wskaźnik nabywania guza wynosi 60%-80% w 8-12 dniu po przeszczepie allologicznym. Średni czas wstrzykiwania również uległ skróceniu z 30-40 s na muchę przy użyciu ręcznego wtryskiwacza do 20-25 s na muchę przy użyciu automatycznego wtryskiwacza.
Ten protokół jest jednym z pierwszych protokołów wykorzystujących aparat do automatycznego wstrzykiwania w allotransplantacji guza Drosophila. W niedawnym badaniu wykorzystano również autowstrzykiwacz do allotransplantacji nowotworowych nerwowych komórek macierzystych2. Wcześniej aparat do automatycznego wstrzykiwania był używany u Drosophila do badania zjadliwości bakterii3, infekcji pasożytniczych i obrony gospodarza4, a także do badań przesiewowych pod kątem bioaktywności różnych związków5. Nasz protokół dostosowuje aparat do wstrzykiwania guza do użytku w celu iniekcji nowotworowych i ma na celu zapewnienie badaczom Drosophila wyższej jakości i bardziej spójnych wyników, jednocześnie oszczędzając im znaczną ilość czasu. Protokół ten może być stosowany nie tylko do allotransplantacji nowotworów, ale może być również dostosowany do allotransplantacji tkanek typu dzikiego i zmutowanych o podobnym kalibrze6.
Guz Drosophila NICD używany w tym protokole został po raz pierwszy wprowadzony przez Yang et al.7 w strefie przejściowej pierścienia wyobrażeniowego SG, "gorącym punkcie guza", który wykazuje wysoki poziom endogennej kinazy janusowej/przetwornika sygnału i aktywatorów transkrypcji (JAK-STAT) oraz aktywność kinazy N-końcowej c-Jun (JNK). Dodatkowo strefa przejściowa ma wysoki poziom metaloproteinazy macierzy-1 (MMP1)7, co czyni ten region szczególnie sprzyjającym powstawaniu nowotworów. Aktywacja szlaku Notch poprzez samą nadekspresję NICD jest wystarczająca do konsekwentnego inicjowania powstawania guza. Guzy te mogą być następnie allotransplantowane, aby umożliwić badanie szerokiego zakresu tematów, w tym podziału komórek nowotworowych, inwazji i interakcji guz-gospodarz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie wyimaginowanego guza pierścieniowego SG
- Krzyżuj dorosłe muchy z genotypami UAS-NICD (samiec: 10-15 much) i Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (dziewicza samica: 10-15 much) i pozwól im rozmnażać się przez 1 dzień w temperaturze 18 °C. Wybrane dorosłe muchy powinny mieć 5-9 dni, aby zapewnić wysoką płodność.
- Pozwolić dorosłym muchom złożyć jaja w pokarmie dla much znajdującym się w fiolkach przez 24 godziny w temperaturze 18 °C, a następnie usunąć dorosłe muchy.
UWAGA: Pokarm dla much jest przygotowywany przy użyciu standardowego przepisu na mąkę kukurydzianą z Drosophila Stock Center8. Każda fiolka powinna zawierać około 10 ml pokarmu dla much. - Pozostawić jaja do inkubacji przez 6 dni w temperaturze 18 °C. W tym okresie wyklują się larwy.
- Przenieść fiolki zawierające larwy do inkubatora o temperaturze 29 °C i inkubować przez kolejne 7 dni.
UWAGA: Ten etap inkubacji jest opcjonalny w zależności od konkretnego projektu eksperymentalnego.
2. Przygotowanie dorosłego dzikiego typu Drosophila do allotransplantacji
- Znieczulenie dzikich lub odpowiednich zmutowanych dorosłych much za pomocą 100% CO2 i sortowanie much według płci. Zarówno samce, jak i samice much mogą być używane jako żywiciele guza.
- Przymocuj kawałek taśmy muchowej o długości 5 cm do szkiełka mikroskopowego lepką stroną do góry, przymocowując go dwoma mniejszymi kawałkami taśmy, po jednym na każdym końcu.
- Unieruchomić muchy, przyklejając ich skrzydła do taśmy. Używaj kleszczy podczas manewrowania muchami.
- Powtórz powyższy krok dla 60-80 dorosłych muszek używanych jako akceptory przeszczepów allogennych.
UWAGA: Najlepiej jest organizować muchy w równych rzędach, z osią ciała ustawioną równolegle do siebie, aby później proces wstrzykiwania był bardziej efektywny czasowo. Rysunek 1 pokazuje rzędy much-gospodarzy przyklejonych w ten sposób.
- Powtórz powyższy krok dla 60-80 dorosłych muszek używanych jako akceptory przeszczepów allogennych.
3. Montaż aparatu do automatycznego wtryskiwania
- Podłącz zarówno aparat do automatycznego wtryskiwacza, jak i przewód zasilający do skrzynki sterownika.
- Ustawić objętość wstrzykniętego wstrzykiwania na 59,8 nl. Pomoże to utrzymać odpowiednią ilość sił ssania i iniekcji podczas allotransplantacji.
- Umieść skrzynkę sterownika i automatyczny wtryskiwacz po przeciwnych stronach mikroskopu świetlnego.
UWAGA: W przypadku operatorów praworęcznych skrzynka sterownicza powinna być umieszczona po lewej stronie mikroskopu, a wtryskiwacz po prawej stronie. Odwrotnie dla operatorów leworęcznych. - Przygotuj szklaną kapilarnę 3,5'' do użycia, odcinając zamknięty koniec kleszczami.
- Zmiksuj jeden koniec szklanej kapilary za pomocą czterostopniowego ściągacza do mikropipet i podgrzej do wąskiego, zamkniętego końca, korzystając z następujących specyfikacji urządzenia: Ciepło = 650, Siła = 200 i Odległość = 8. Starannie umieść kapilary w aparacie ściągającym i uruchom program po wprowadzeniu powyższych ustawień.
- Użyj kleszczy, aby przyciąć kapilarnę pod kątem około 60°, aby uzyskać ostrzejszy koniec i łatwe wejście do odwłoka dorosłej muchy1. Zobacz Rysunek 2 dla przykładu dobrze przyciętej kapilary.
- Lekko odkręć nakrętkę wtryskiwacza. Przytrzymaj przycisk Opróżnij, aby przesunąć igłę wtryskiwacza, aż pojawi się 70%-80% jej całkowitej długości. Aby przyspieszyć postęp kapilarny, naciśnij raz przycisk Wypełnij, jednocześnie przytrzymując przycisk Opróżnij.
- Za pomocą strzykawki napełnij szklaną kapilarnę olejem mineralnym. Następnie ostrożnie włóż szklaną kapilarnę na igłę wtryskiwacza, aż ta ostatnia zostanie mocno przymocowana do gumowego korka wtryskiwacza. Teraz mocno dokręć nakrętkę wtryskiwacza.
- Zetrzyj pozostałości oleju mineralnego z zewnętrznej powierzchni szklanej pokrywy kapilarnej, aby uniknąć zanieczyszczenia podłoża podczas allotransplantacji.
4. Rozwarstwienie wyimaginowanego guza pierścieniowego SG
- Wybierz jedną z larw i przenieś ją na płytkę separacyjną wypełnioną 100 μl pożywki Schneidera, aby przygotować się do wycięcia guza pierścieniowego SG.
UWAGA: Tylko okazy, w których znajduje się guz, pozostaną jako larwy. Dzieje się tak, ponieważ wzrost guza opóźnia rozwój i progresję larw9. Dwie trzecie okazów nie będzie nosicielami guza, a zatem rozwinie się do poczwarek/dorosłych.- Do preparacji i allotransplantacji należy użyć mikroskopu stereoskopowego o zakresie powiększenia 10x-20x.
- Używając jednej pary kleszczy do przytrzymania środkowej części ciała larwy, uszczypnij głowę larwy za pomocą innej pary kleszczy i zastosuj siłę rozciągającą wzdłuż.
- Zlokalizuj SG larw w kształcie litery Y i odizoluj je od reszty tkanki larwalnej10.
- Wypreparuj i wyizoluj wyimaginowany guz pierścieniowy SG, usuwając sąsiednią tkankę. Zobacz Rysunek 3, aby zobaczyć obraz tego procesu preparacji.
- Powtórz kroki 4.1-4.4 dla dodatkowych 10 do 20 wyimaginowanych guzów pierścieniowych SG w oparciu o potrzeby badawcze.
5. Przeszczep allogeniczny pierwotnego wyimaginowanego guza pierścieniowego SG
- Zanurz naczynia włosowate w pożywce Schneidera zawierającej pierwotne imaginalne guzy pierścieniowe SG. Przytrzymaj przycisk Wypełnij, aby napełnić szklaną kapilarnę medium Schneidera aż do górnego segmentu 0.5 cm. Ten górny segment powinien pozostać wypełniony olejem mineralnym.
UWAGA: Przyspiesz ten proces, naciskając raz przycisk Opróżnij, jednocześnie przytrzymując przycisk Napełnij. - Zlokalizuj guz pierwotny i naciskaj przycisk Wypełnij, aż guz zostanie zasysany do naczynia włosowatego.
- Upewnij się, że guz znajduje się na końcu naczynia włosowatego lub kilka milimetrów od końca naczynia włosowatego. Pomaga to uniknąć dryfowania guza i zagubienia się w roztworze zawartym w naczyniach włosowatych. Zobacz Rysunek 4A, aby zobaczyć odpowiednią lokalizację guza, gdy znajduje się on w kapilarze.
- Zlokalizuj dorosłą muchę unieruchomioną do taśmy na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą kleszczy delikatnie przytrzymaj dolną część brzucha. Następnie przebij dolny boczny naskórek brzucha kapilarną. Naciskaj przycisk Opróżnij, aż guz dostanie się do nowego brzucha gospodarza. Zobacz Rysunek 4B, aby zobaczyć demonstrację tej techniki.
- Za pomocą kleszczy delikatnie ściśnij skrzydła gospodarza, aby usunąć go z taśmy. Umieścić żywiciela w nowej fiolce ze świeżym pokarmem. Najlepiej jest umieścić fiolkę bokiem na pierwsze 24 godziny po wstrzyknięciu. Każda fiolka powinna zawierać maksymalnie 20 much.
UWAGA: Niektóre muchy żywicielskie będą miały brakujące skrzydła i inne rany na ciele po wstrzyknięciu i mogą przykleić się do pokarmu dla much, jeśli fiolka zostanie umieszczona pionowo. - Powtórz kroki od 5.2 do 5.4, aby przeszczepić pozostałe pierwotne guzy do ich nowych dorosłychgospodarzy.
- Wyrzuć kapilary do pojemnika na ostre przedmioty i oczyść pozostałości oleju mineralnego z zewnętrznej części automatycznego wstrzykiwacza przed włożeniem urządzenia z powrotem do pudełka.
- Przechowywać fiolkę z żywicielami w temperaturze pokojowej przez 1 dzień, a następnie przenieść fiolkę do komory inkubacyjnej w temperaturze 29 °C. Przenieść żywicieli much do nowych fiolek co 2-3 dni.
- Codziennie monitoruj żywicieli much i obliczaj wskaźniki przeżywalności. Po tygodniu guzy powinny być widoczne pod mikroskopem stereoskopowym z adapterem fluorescencyjnym i mogą być stale monitorowane pod kątem ich wielkości i progresji.
6. Re-alloprzeszczep przeszczepionych guzów
- Około 10-14 dni po przeszczepie allogenicznym badanie przesiewowe w kierunku guzów, które wyrosły w jamie brzusznej gospodarza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
- Znieczulić gospodarza za pomocą CO2 i umieścić go na płytce rozwarstwiającej wypełnionej 100 μl pożywki Schneidera. Wypreparuj wyrośnięty przeszczepiony guza z gospodarza za pomocą dwóch par kleszczy.
- Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać brzuch, a drugiej pary, aby rozciąć naskórek brzucha, odsłaniając allogeniczny guz1.
- Ostrożnie odizoluj guz od przyczepionych tkanek gospodarza tak bardzo, jak to możliwe, używając markerów fluorescencyjnych jako wskazówek.
- Powtórz krok 6.2, aby przygotować się na dwa do trzech dodatkowych guzów przeszczepu allogenicznego.
- Przenieś płytkę preparacyjną zawierającą pobrane guzy na stolik mikroskopu świetlnego.
- Użyj sterylnych igieł i rozetnij guzy na mniejsze kawałki, które są odpowiednie dla wielkości naczyń włosowatych.
- Powtórz kroki 4.1-4.5, aby przygotować nową generację dorosłych gospodarzy i powtórz kroki 5.1-5.7, aby zakończyć allotransplantację guzów.
UWAGA: Wskaźniki sukcesu są na ogół wyższe w przypadku guzów innych niż pierwotne w porównaniu z guzami pierwotnymi. - Powtórz kroki 6.1-6.6 dla każdego kolejnego pokolenia much wykorzystanych w badaniu.
UWAGA: Wybierz linie żywicieli Drosophila odpowiednie do potrzeb eksperymentu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy przeprowadzono generacyjną allotrasplantację guzów z pierścienia imaginalnego SG z wykorzystaniem aparatu do nanolitrowych wstrzyknięć (autoinjektora), a następnie wykonano obrazowanie żywych guzów przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego, co pozwoliło na pogłębioną analizę wzrostu guzów, migracji komórek nowotworowych oraz interakcji między guzem a organizmem gospodarza. Podczas montowania much należy przykleić je do szkiełka przedmiotowego i unieruchomić za pomocą bloku z polidimet...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Allotransplantacja guza może pomóc naukowcom w rozwiązaniu pewnych problemów, które pojawiają się podczas wzrostu i progresji guza Drosophila. Jednym z takich wyzwań jest unikanie przedwczesnej śmierci larw lub dorosłych osobników noszących nowotwór podczas pierwotnego posiewu nowotworu12. W tym kontekście ciągła allotransplantacja guza pozwala guzom rosnąć w nieskończoność, co ułatwia podłużne badania wzrostu, przerzutów i ewolucji guza. Allotransplantacja guza jest również przydatna do ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować między autorami.
Podziękowania
Dziękujemy byłym członkom laboratorium, dr Sheng-An Yangowi i panu Juanowi-Martinowi Portilli za ich wkład w rozwój tego protokołu. Jesteśmy wdzięczni laboratorium dr Yan Songa w Szkole Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Pekińskiego za podzielenie się protokołem dotyczącym manualnej allotransplantacji. Dziękujemy również panu Calderowi Ellsworthowi i panu Everestowi Shapiro za krytyczną lekturę manuskryptu.
WMD otrzymało fundusze (GM072562, CA224381, CA227789) na tę pracę od National Institute of Health (https://www.nih.gov/) oraz finansowanie (IOS-155790) od National Science Foundation (htps://nsf.gov/). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, zbieraniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Zeiss | LSM 980 | Znany również jako "Zeiss LSM 980" |
| Pokarm dla much z mąki kukurydzianej | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Znany również jako "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Igła preparcyjna (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Płytka preparcyjna | Fisher Scientific | 12-565B | |
| Taśma muchowa | Fisherbrand | 159015A | |
| Adapter fluorescencyjny do mikroskopu stero | Mikroskopia elektronowa Nauki | SFA-UV | Znany również jako "Adapter fluorescencyjny NightSea" |
| Mikroskop fluorescencyjny | Zeiss | 495015-0001-000 | Znany również jako "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11251-10 | Znany również jako "Kleszcze Dumont #5" |
| Szklana kapilara (3,5 '') | Drummond | 3-000-203-G / X | |
| Klej | Elmer | E305 | Znany również jako "Elmer Washabale Clear Glue" |
| Mikroskop świetlny | Zeiss | 435063-9010-100 | Znany również jako ściągacz do mikropipet "Zeiss Stemi 305" |
| Świat Precision Instruments | PUL-1000 | Znany również jako "Czterostopniowy ściągacz do mikropipet" | |
| Aparat Nanoject | Drummond | 3-000-204 | Znany również jako "Nanoject II Auto-Nanolitr Injector" |
| strzykawka ThermoFisher 21720001 firmy Schneider (27G x1/2) | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| fiolka | Fisherbrand | AS507 | |
Bibliografia
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia. Development. 147 (22), (2020).
- Haller, S., Limmer, S., Ferrandon, D. Pseudomonas Methods and Protocols. , Springer. 723-740 (2014).
- Letinić, B., Kemp, A., Christian, R., Koekemoer, L. Inoculation protocol for the African malaria vector, Anopheles arabiensis, by means of nano-injection. African Entomology. 26 (2), 422-428 (2018).
- Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 753(2011).
- Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment. Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).
- Bloomington Drosophila Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , (2020).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
- Kennison, J. A. Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, H., Han, C. LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
- Mirzoyan, Z., et al. Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer. Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).
- Bangi, E. Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).
- Saavedra, P., Perrimon, N. Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).
- Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting. Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).
- Koyama, L. A. J., et al. Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila. PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
