Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62233

⸱

10 lutego 2021

 , 
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Streszczenie

Systemy sensoryczne zbierają wskazówki niezbędne do kierowania zachowaniem, ale zwierzęta muszą rozszyfrować, które informacje są biologicznie istotne. Lokomocja generuje sygnały aferentne, które zwierzęta muszą oddzielić od odpowiednich sygnałów sensorycznych otaczającego środowiska. Na przykład, gdy ryba pływa, przepływ generowany przez falowanie ciała jest wykrywany przez neuromasty mechanoreceptywne, składające się z komórek rzęsatych, które tworzą system linii bocznych. Komórki rzęsate następnie przekazują informacje o ruchu płynów z czujnika do mózgu za pośrednictwem neuronów doprowadzających czuciowo. Jednocześnie wyładowanie wynikające z polecenia motorycznego jest przekazywane do komórek rzęsatych, aby zapobiec przeciążeniu sensorycznemu. Uwzględnienie hamującego wpływu predykcyjnych sygnałów motorycznych podczas lokomocji ma zatem kluczowe znaczenie przy ocenie czułości systemu linii bocznej. Opracowaliśmy podejście elektrofizjologiczne in vivo do jednoczesnego monitorowania aktywności neuronu doprowadzającego tylnej linii bocznej i brzusznych korzeni ruchowych u larw danio pręgowanego (4-7 dni po zapłodnieniu), które mogą utrzymywać się przez kilka godzin. Zewnątrzkomórkowe zapisy neuronów aferentnych uzyskuje się za pomocą techniki luźnego zacisku łatowego, która może wykryć aktywność jednego lub wielu neuronów. Zapisy korzeni brzusznych są wykonywane przez skórę za pomocą szklanych elektrod w celu wykrycia aktywności neuronów ruchowych. Nasz protokół eksperymentalny daje możliwość monitorowania endogennych lub wywołanych zmian w bodźcach sensorycznych w zachowaniach motorycznych u nienaruszonych, zachowujących się kręgowców.

Wprowadzenie

Neurony aferentne systemów mechanosensorycznych przekazują informacje z komórek rzęsatych do mózgu podczas słyszenia i równowagi. Elektrofizjologia może ujawnić wrażliwość neuronów aferentnych poprzez bezpośrednie zapisy. Podczas gdy łatanie całych komórek z komórek rzęsatych może być trudne, nagrywanie z dalszych neuronów doprowadzających jest łatwiejsze i umożliwia ocenę potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na kontrolowane stymulacje1,2,3. Stymulacja komórek rzęsatych prowadzi do ich ugięcia, co modyfikuje struktury mechanosensoryczne, wywołując w ten sposób wzrost potencjałów czynnościowych (skoków) w neuronach doprowadzających4,5,6. Przy braku bodźców zewnętrznych, neurony aferentne również spontanicznie rosną z powodu wycieku glutaminianu z komórek rzęsatych do aferentnych zakończeń postsynaptycznych 7,8 i wykazano, że przyczyniają się do utrzymania czułości9,10. Rejestracja aktywności aferentnej za pomocą zacisku krosowego umożliwia obserwację czułości komórek rzęsatych i dynamiki sygnału, które nie są możliwe przy użyciu technik o niższej rozdzielczości czasowej, takich jak w mikrofonach11,12 lub funkcjonalne obrazowanie wapnia13,14,15. Poniższy protokół pozwoli na rejestrowanie aktywności aferentnej równolegle z poleceniami motorycznymi, aby ujawnić natychmiastowe zmiany wrażliwości komórek rzęsatych.

Danio pręgowany (Danio rerio) wykorzystuje komórki rzęsate zawarte w neuromasztach, które tworzą system linii bocznych, do wykrywania ruchu wody względem ich ciała, co jest tłumaczone na sygnały neuronowe niezbędne do nawigacji16,17,18, unikanie drapieżników, chwytanie zdobyczy19,20, oraz schooling21. Przepływ wody może być również generowany samodzielnie przez ruchy pływania22,23,24, repiraration22,25,26, oraz feeding27. Zachowania te obejmują powtarzające się ruchy, które mogą męczyć komórki rzęsate i upośledzać czucie. Dlatego tak ważne jest, aby system linii bocznej rozróżniał bodźce przepływu zewnętrznego (eksaferentnego) i generowanego przez siebie (reaffeentnego). Wyładowanie wynikające z tego tłumi samodzielnie generowane sygnały przepływu podczas lokomocji u danio pręgowanego. Ten hamujący predykcyjny sygnał motoryczny jest przekazywany przez zstępujące neurony do receptorów czuciowych w celu modyfikacji danych wejściowych lub przerwania przetwarzania reaferentnego sprzężenia zwrotnego28,29. Przełomowe prace, które przyczyniły się do naszego wczesnego zrozumienia tego systemu sprzężenia zwrotnego, opierały się na preparatach in vitro, w których łączność i endogenna aktywność obwodu neuronalnego nie były zachowane28,30,31,32,33,34,35. Protokół ten opisuje podejście do zachowania nienaruszonego obwodu neuronalnego, w którym utrzymywana jest endogenna dynamika sprzężenia zwrotnego, umożliwiając w ten sposób lepsze zrozumienie następstwa wyładowania in vivo.

Protokół opisany tutaj opisuje, jak monitorować aktywność neuronów doprowadzających i ruchowych w tylnej linii bocznej jednocześnie u larw danio pręgowanego. Charakterystyka dynamiki sygnału aferentnego przed, w trakcie i po poleceniach motorycznych zapewnia wgląd w endogenne sprzężenie zwrotne w czasie rzeczywistym z ośrodkowego układu nerwowego, które moduluje wrażliwość komórek rzęsatych podczas lokomocji. Protokół ten określa, jakie materiały będą musiały zostać przygotowane przed eksperymentami, a następnie opisuje, jak sparaliżować i przygotować larwy danio pręgowanego. Protokół opisuje, w jaki sposób ustanowić stabilny luźny zapis plamy neuronów doprowadzających i zewnątrzkomórkowy zapis korzenia brzusznego (VR) neuronów ruchowych. Reprezentatywne dane, które można uzyskać za pomocą tego protokołu, przedstawiono na przykładowej osobie, a analizę przeprowadzono na wielu powtórzeniach protokołu eksperymentalnego. Wstępne przetwarzanie danych odbywa się za pomocą niestandardowych skryptów napisanych w programie MATLAB. Ogólnie rzecz biorąc, ten paradygmat eksperymentalny in vivo może zapewnić lepsze zrozumienie sensorycznego sprzężenia zwrotnego podczas lokomocji w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i opieka nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Florydy.

1. Przygotowanie materiałów do zapisów elektrofizjologicznych

  1. Zrób naczynie do nagrywania z dnem z elastomeru silikonowego.
    1. Dozuj cienką warstwę samomieszających się składników elastomeru silikonowego (np. Sylgard) do naczynia do hodowli tkankowych ze szklanym dnem, aż zrówna się z krawędzią płytkiej studzienki. Wystarczy około 0,5 ml.
    2. Przykryj i utwardź naczynie przez minimum 48 godzin w temperaturze pokojowej.
  2. Zrób szpilki do rozwarstwiania.
    1. Dostarczyć ładunek ujemny (5 V) do 100 ml zlewki z wytrawiaczem (3M KOH) za pomocą zasilacza prądu stałego i podłączyć drut wolframowy (0.002 cala; średnica 50.8 μm) do dodatnio naładowanego wyjścia.
      UWAGA: Przewody ujemny i dodatni nie powinny stykać się ze sobą podczas tej procedury, ponieważ może to spowodować ryzyko powstania iskier, które mogą stanowić potencjalne zagrożenie pożarowe.
    2. Wytrawiaj drut wolframowy, szybko i wielokrotnie zanurzając końcówkę drutu w kąpieli trawiącej, aż końcówka zwęzi się do ostrego końca. Pod mikroskopem stereoskopowym odetnij drut około 1 mm od końcówki za pomocą żyletki o prostej krawędzi. Powtórz jeszcze trzy razy, a następnie włóż szpilki do utwardzonej naczynia do nagrywania za pomocą drobnych kleszczyków.
  3. Przygotuj elektrody rejestrujące.
    1. Przeciągnij rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego (średnica wewnętrzna: 0,86 mm, średnica zewnętrzna: 1,50 mm) za pomocą poziomego ściągacza do mikropipet z żarnikiem pudełkowym do elektrod z końcówką o średnicy 30 μm z lekkim stożkiem (Rysunek 1 Ai), która będzie używana do rejestrowania neuronów aferentnych z tylnej linii bocznej.
    2. Przeciągnij dodatkową rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego do pary elektrod o mniejszych średnicach końcówek (1-5 μm). Trzymając po jednej elektrodzie w każdej ręce, delikatnie przesuwaj końcówki w poprzek siebie, aby rozbić je pod kątem ~30°. Za pomocą mikrokuźni wypoleruj skośną końcówkę, aż będzie gładka. Ostateczna średnica końcówki powinna wynosić od 30 do 50 μm i będzie używana jako elektroda rejestrująca korzeń brzuszny (VR) (Rysunek 1 Aii).
    3. Zaznacz bok elektrody VR z krawędzią czołową trwałym tuszem, aby pomóc w ustawieniu otworu końcówki w dół podczas wkładania elektrody do uchwytu pipety głowicy (krok 3.2).
      UWAGA: Mechaniczna modyfikacja elektrody rejestrującej VR jest nieprecyzyjna i krok 1.3.2 może wymagać wielu prób, aż do uzyskania odpowiedniej morfologii końcówki przed polerowaniem. Elektroda rejestrująca VR jest ścięta tak, aby dopasować się do krzywizny ciała larw. Po wyprodukowaniu elektroda rejestrująca VR może być używana wielokrotnie, o ile końcówka pozostaje czysta i czysta między eksperymentami.
  4. Wygeneruj protokół w programach do rejestracji elektrofizjologii.
    1. Upewnij się, że prawa scena czołowa jest podłączona do wejścia kanału 1 z tyłu mikroelektrody prąd i napięcie clamp amplifier dla nagrań neuronów aferentnych, a lewa scena czołowa jest podłączona do wejścia kanału 2 dla nagrań VR.
      UWAGA: Specyfikacja komputerowa wzmacniacza cęgowego prądu i napięcia wymaga minimalnego procesora 1 Ghz lub lepszego, systemu Windows XP Pro lub Mac OS X 10.46.6, napędu CD-ROM z 512 MB pamięci RAM, 500 MB miejsca na dysku twardym i 2 portów USB.
    2. Otwórz sterowane komputerowo oprogramowanie wzmacniacza.
    3. Ustaw Kanał 1 i Kanał 2 na bieżący tryb clamp, klikając przycisk IC dla każdego kanału.
    4. Wprowadź następujące parametry zarówno na zakładkach I-Clamp 1, jak i I-Clamp 2 . Wyjście pierwotne: 100x potencjał membrany AC (100 000 mV/mV), wzmocnienie: 1 000, Bessel: 1 kHz, AC: 300 Hz, zakres: obejście. Wyjście wtórne: 100x potencjał membranowy AC (100 mV/mV) , wzmocnienie: 1 , filtr dolnoprzepustowy: 10 Hz.
    5. Zapisz parametry kanału jako Ch1_Aff i Ch2_VR.
    6. Zainstaluj i otwórz oprogramowanie do elektrofizjologii opaski krosowej.
    7. Kliknij Konfiguruj i wybierz Lab Bench, aby skonfigurować sygnały analogowe, dodając Ch1_Aff i Ch2_Vr do kanałów digitizera (np. Analog IN #0 i Analog IN #1), które są podłączone koncentrycznym BNC do odpowiednich wyjść skalowanych kanału 1 i kanału 2 amplifier. Kliknij OK.
      UWAGA: Minimalne wymagania komputerowe dla digitizera to: procesor 1 GHz lub lepszy, Windows XP Pro lub Mac OS X 10.46.6, napęd CD-ROM 512 MB RAM, 500 MB miejsca na dysku twardym i 2 porty USB.
    8. Kliknij Pobierz i wybierz Nowy protokół.
    9. Na karcie Mode/Rate (Tryb/Rate) wybierz opcję Gap Free; w obszarze Acquisition Mode (Tryb akwizycji) ustaw Trial Length (Długość próby) na opcję Use available disk space (tj. nagrywaj do momentu zatrzymania) lub żądany set Duration (gg:mm:ss), a następnie ustaw Sampling rate per signal (Hz) na 20 000, aby zmaksymalizować rozdzielczość.
    10. Na karcie Inputs (Wejścia) wybierz kanały Analog IN (Analog In Channels), które zostały wcześniej skonfigurowane (w kroku 1.4.6), a następnie wybierz Ch1_Aff i Ch2_VR dla odpowiedniego kanału.
    11. Na karcie Wyjścia wybierz Cmd 0 i Cmd 1 odpowiednio dla kanału #0 i kanału #1.
      1. Podłącz polecenie kanału 1 na wzmacniaczu do wyjścia analogowego 0 na digitizerze za pomocą koncentrycznego BNC i powtórz dla kanału 2 polecenie na wyjście analogowe 1.
    12. Pozostałe karty mogą pozostać w ustawieniach domyślnych. Kliknij OK i zapisz protokół.

2. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj roztwór Hanka: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 4,2 mM NaHCO4; pH 7,3. Rozcieńczyć do 10% roztworu Hanka, dodając do wywaru odpowiednią objętość wody dejonizowanej.
  2. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2,1 mM CaCl2, 10 mM glukozy, 10 mM bufor HEPES; pH 7,8 skorygowane za pomocą NaOH. Próżniowy roztwór zewnątrzkomórkowy przepuszcza przez filtr o wielkości porów 0,22 μm.
  3. Przygotuj α -bungarotoksynę: Rozpuść 1 mg liofilizowanej α-bungarotoksyny w 10 ml roztworu zewnątrzkomórkowego, aby uzyskać 0,1% rozcieńczenia.
  4. Przygotuj roztwór do eutanazji: 50% (mg / L) buforowany MS-222 klasy farmaceutycznej w 10% roztworze Hanka.
    UWAGA: α-bungarotoksyna jest silną neurotoksyną, która paraliżuje mięśnie poprzez blokowanie receptorów cholinergicznych. Wymagane są rękawice i zalecana jest ochrona oczu podczas obchodzenia się z paralitykiem.

3. Przygotowanie larw do zapisów elektrofizjologicznych

  1. Unieruchomić larwy danio pręgowanego.
    1. Użyć larw z wyhodowanej laboratoryjnie populacji danio pręgowanego (Danio rerio; 4-7 dni po zapłodnieniu) i przechowywać w roztworze zarodkowym (10% roztwór Hanka) w temperaturze 27 °C.
    2. Przenieść larwy z pomieszczenia na małą szalkę Petriego (35 mm) za pomocą pipety transferowej z dużą końcówką i usunąć jak najwięcej otaczającego roztworu.
      UWAGA: Usunięcie roztworu dla zarodków zapobiega rozcieńczeniu paralityka i zwiększa jego skuteczność. Róg chusteczki zadaniowej może być użyty do usunięcia pozostałego roztworu zarodków i bardzo ważne jest, aby nie kontaktować się z larwami ani nie pozostawiać larw wystawionych na działanie powietrza.
    3. Zanurzyć larwy w 10 μl 0,1% α-bungarotoksyny na około 5 minut.
      UWAGA: Czas potrzebny do unieruchomienia larw różni się w zależności od preparatu. Zdrowy preparat zależy od ścisłego monitorowania utrzymującego się szybkiego przepływu krwi i obniżonych reakcji motorycznych. Krótkotrwała nadmierna ekspozycja na paralityka może prowadzić do powolnego pogorszenia ogólnego stanu zdrowia preparatu, nawet po dokładnym wypłukaniu. Najlepiej jest zastosować płukanie, zanim larwa zostanie całkowicie unieruchomiona, gdy nadal wykazuje oznaki subtelnych wibracji mięśni.
    4. Sparaliżowane larwy przemyć roztworem zewnątrzkomórkowym i kąpać się przez 10 min.
      UWAGA: Wymywanie pozwala larwie przejść od subtelnych wibracji mięśni do całkowitego paraliżu. Ponadto α-bungarotoksyna jest antagonistą podjednostki α9 nikotynowego receptora acetylocholiny (nAChR), która jest krytycznym składnikiem endogennego obwodu sprzężenia zwrotnego, który obserwuje ten protokół; Wykazano jednak, że efekt ten jest odwracalny w komórkach rzęsatych Xenopus i zebrywanego po 10-minutowym wypłukaniu36,29.
  2. Przypnij rybę do naczynia do nagrywania.
    UWAGA: Znieczulenie (np. MS-222, Tricaine) nie jest wymagane podczas przygotowywania larw danio pręgowanego (4-7 dpf), ponieważ koliduje to ze zdrowiem zwierząt. W rzeczywistości larwy danio pręgowanego są zwolnione z niektórych protokołów dotyczących kręgowców.
    1. Za pomocą pipety transferowej przenieś larwę z kąpieli z roztworem zewnątrzkomórkowym do naczynia rejestrującego z silikonowym dnem. Napełnij pozostałą część naczynia roztworem zewnątrzkomórkowym.
    2. Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie umieść larwy za pomocą kleszczyków z cienką końcówką powyżej środka maty silikonowej, boczną stroną do góry, z przednim i tylnym końcem ciała biegnącym odpowiednio od lewej do prawej. Następnie chwyć wytrawioną szpilkę z maty silikonowej za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i włóż szpilkę, prostopadle do silikonu, przez grzbietową strunę grzbietową larw bezpośrednio grzbietowo do odbytu. Włóż drugą szpilkę przez strunę grzbietową w pobliżu końca ogona, a trzecią szpilkę włóż przez grzbiet struny grzbietowej pęcherza gazowego (Rysunek 1B).
      UWAGA: Podczas wkładania szpilek ważne jest, aby celować w środek szerokości struny grzbietowej, aby zapobiec uderzeniu w przepływ krwi lub uszkodzeniu otaczających mięśni. Struna grzbietowa jest grzbietowa w stosunku do tylnego nerwu linii bocznej, więc przy prawidłowym przypinaniu nie oczekuje się uszkodzenia neuronów czuciowych linii bocznej. Włożyć po pierwszym kontakcie, aby nie naruszyć otaczającej tkanki. Idealnie, średnica szpilki jest mniejsza niż połowa szerokości struny grzbietowej, aby zapewnić czyste wprowadzenie. Jeśli kołki przekraczają tę szerokość, powtarzaj krok 1.2, aż zostanie osiągnięta żądana szerokość kołka. Jeśli przepływ krwi zwalnia po przypinaniu, powtórz od kroku 1.3 z nową próbką.
    3. Włóż czwartą szpilkę przez pęcherzyk uszny, zapewniając lekki obrót w kierunku przedniego, gdy szpilka wkłada się do kapsułki (Rysunek 1B). Po lekkim odwróceniu należy zwrócić uwagę, czy tkanka między cleithrum a pęcherzykiem usznym ujawnia skupisko somatów doprowadzających.
      UWAGA: Wprowadzenie czwartego kołka pod kątem ma na celu zapewnienie odsłonięcia zwoju doprowadzającego tylnej linii bocznej, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez duży pęcherzyk uszny.

4. Zapis korzenia brzusznego

  1. Umieść przypięte larwy pod 10-krotnym obiektywem zanurzonym w wodzie na pionowym mikroskopie z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC) o stałym stopniu i ustaw szczeliny przegrody mięśniowej bloków mięśniowych równolegle do lewego wektora podejścia do skraju głowy (Rysunek 1B).
    1. Mikroskop DIC ze stałym stopniem unoszący się na optycznym stole powietrznym działa najlepiej, aby zapobiec zakłóceniom nagrań przez wibracje. Korzystając z pozycjonera z napędem, mikroskop może następnie swobodnie poruszać się wokół stałego stolika, w którym zamontowane są stopnie przygotowawcze i głowice (Rysunek 1C).
    2. Umieść przewód uziemiający w roztworze wanny i upewnij się, że jest podłączony do lewej głowicy.
  2. Napełnij elektrodę rejestrującą VR 30 μl roztworu zewnątrzkomórkowego za pomocą elastycznej końcówki do pipety z żelem i włóż do lewego uchwytu na pipety w głowicy.
  3. Opuścić pipetę rejestrującą do roztworu naczynia za pomocą mikromanipulatora, stosując nadciśnienie (1-2 mmHg) wytwarzane przez przetwornik pneumatyczny. W 10-krotnym powiększeniu upewnij się, że otwór końcówki jest skierowany w dół.
    1. Przetwornik pneumatyczny należy podłączyć do portu uchwytu pipety za pomocą silikonowej rurki.
  4. Umieść elektrodę VR na przegrodzie mięśniowej
    1. Używając ponownie mikromanipulatora, opuść końcówkę elektrody VR, aż znajdzie się w pozycji nad larwą. Zwiększ powiększenie do 40-krotnego zanurzenia.
    2. Przenieś końcówkę elektrody przez przegrodę mięśniową między dwoma miomerami brzusznymi do linii bocznej, aż szczelina zostanie wyśrodkowana w otworze końcówki elektrody VR (Rysunek 1D).
    3. Opuść pipetę, aż opóźniona krawędź otworu końcówki delikatnie zetknie się z nabłonkiem. Po pierwszym kontakcie należy obrócić pipetę po przekątnej, aby upewnić się, że krawędź natarcia styka się i może wytworzyć uszczelnienie.
    4. Zastosować podciśnienie (~100 mm Hg) za pomocą przetwornika pneumatycznego i przytrzymać.
      UWAGA: Właściwa orientacja pipety VR względem przegrody mięśniowej i ciągłe podciśnienie optymalizuje wykrywanie aktywności neuronów ruchowych z wysokim stosunkiem sygnału do szumu przez skórę.
  5. Wykryj aktywność neuronów ruchowych.
    1. Lewy stopień główny powinien być podłączony do wzmacniacza, który przekazuje wzmocniony sygnał do digitizera, który wyprowadza wspomniany sygnał do oprogramowania elektrofizjologii patch clamp, które ma być monitorowane na sąsiednim komputerze (patrz sekcja 1.4).
    2. W oprogramowaniu do zaciskania krosowego kliknij przycisk Odtwórz na pasku narzędzi, aby monitorować sygnał VR (Rysunek 1E).
    3. Upewnij się, że zapis VR jest osiągany po zaobserwowaniu aktywności neuronów ruchowych z dobrze stereotypową dynamiką sygnału impulsowego29,37 (Rysunek 1E).
      UWAGA: Fikcyjne napady pływackie to wzorce aktywności neuronów ruchowych VR, które kontynuują transmisję pomimo paraliżu preparatu. Dlatego fikcyjne pływanie jest dostępnym sposobem określania stanu behawioralnego zwierzęcia i mierzenia parametrów lokomotorycznych przy jednoczesnym wykonywaniu zapisów neuronów aferentnych, które wymagają unieruchomionego przygotowania. W naszych rękach, po uzyskaniu nagrania VR, zdrowy preparat będzie wywoływał dobrowolne fikcyjne napady pływania co kilka sekund. Pamiętaj, że zdrowy preparat utrzymuje szybki przepływ krwi. Należy pamiętać, że uzyskanie wystarczającego sygnału VR może zająć kilka minut, a stosunek sygnału do szumu może ulec poprawie po wstępnym wykryciu. Ze względu na oszczędność czasu dopuszczalne jest przejście do punktu 5.
    4. Jeśli zapis VR nadal nie zostanie uzyskany po wykonaniu sekcji 5, zwolnij podciśnienie, podnieś elektrodę i powtórz od kroku 4.4.2 na innej przegrodzie mięśniowej, jeśli zdrowie larw jest nadal optymalne.

5. Zapis neuronu aferentnego

  1. Napełnij aferentną elektrodę rejestrującą 30 μl roztworu zewnątrzkomórkowego; włóż do prawego uchwytu na pipety w głowicy (Rysunek 1B, C) i opuść do roztworu naczynia, stosując nadciśnienie (1-2 mm Hg) wytwarzane przez przetwornik pneumatyczny.
  2. Zlokalizuj i luźno przymocuj do tylnego zwoju doprowadzającego do linii bocznej.
    1. Za pomocą mikromanipulatora opuść końcówkę elektrody doprowadzającej, aż utrzyma się nad cleithrum.
    2. Zwiększ powiększenie do 40-krotnego zanurzenia i zlokalizuj przecięcie nerwu tylnej linii bocznej i cleithrum. Podążaj za nerwem linii bocznej przed przednio, od cleithrum do miejsca, w którym włókna unerwiają tylny boczny zwój aferentny, który można odróżnić po dyskretnym skupisku somy (Rysunek 1F).
    3. Umieść końcówkę elektrody nad zwojem doprowadzającym i opuść pipetę, aż końcówka zetknie się z nabłonkiem. Delikatnie manewruj elektrodą tak, aby cały obwód końcówki stykał się ze zwojem doprowadzającym.
    4. Zastosuj podciśnienie (20-50 mm Hg) za pomocą przetwornika pneumatycznego i przytrzymaj.
      UWAGA: Podciśnienie wywierane na zwój aferentny jest łagodniejsze niż ssanie stosowane podczas zapisu korzenia brzusznego. Zwiększenie podciśnienia może poprawić stosunek sygnału do szumu, ale zdrowie neuronów aferentnych pogarsza się pod wpływem długotrwałego agresywnego ssania, co zmniejsza prawdopodobieństwo udanego nagrania.
  3. Rejestruj aktywność neuronów aferentnych.
    1. Upewnij się, że prawy stopień główny jest podłączony w podobnej kolejności, jak opisano w kroku 4.5.1.
    2. W pClamp10 kliknij przycisk Odtwórz na pasku narzędzi, aby jednocześnie monitorować neuron aferentny i sygnał VR.
    3. Upewnij się, że zapis całej komórki, luźnej łaty neuronów aferentnych jest osiągany, gdy skoki pojawiają się spontanicznie, mniej więcej co 100-200 ms1,29 (Rysunek 1E).
    4. Stopniowo zwiększaj ciśnienie elektrody rejestrującej neuron aferentny z powrotem do atmosfery (0 mm Hg) i przytrzymaj do końca zapisu.

6. Akwizycja danych

  1. Nagrywanie symultaniczne.
    1. Po wykryciu aktywności neuronu aferentnego i neuronu ruchowego, kliknij przycisk Nagraj na pasku narzędzi w pClamp10, aby przechwycić jednoczesne nagrania bez przerw w obu kanałach.
    2. Nagrywaj przez żądany czas trwania (Rysunek 1E).
      UWAGA: Zapis w zdrowym preparacie może trwać wiele godzin i pozostawać w reakcji na bodźce zewnętrzne.
    3. Zapisz nagranie jako obsługiwany typ pliku (.abf, pClamp10), aby zachować metadane, takie jak parametry akwizycji.

7. Eutanazja

  1. Zastosuj nadciśnienie (10 mm Hg) zarówno do elektrod aferentnych, jak i rejestrujących VR za pomocą przetworników pneumatycznych i podnieś elektrody z naczynia rejestrującego za pomocą mikromanipulatorów.
  2. Przenieś czaszę nagrywającą z mikroskopu DIC stopnia stałego do stereoskopu preparacyjnego.
  3. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką usunąć wolframowe szpilki z struny grzbietowej i torebki usznej, a następnie przenieść larwy za pomocą pipety transferowej na szalkę Petriego (35 mm) zawierającą 5 ml roztworu do eutanazji przez co najmniej 5 minut.

8. Wstępne przetwarzanie i analiza danych

UWAGA: Wstępne przetwarzanie i analiza danych będzie wymagało podstawowej wiedzy na temat kodowania wiersza poleceń.

  1. Przekonwertuj plik nagrania do przetwarzania wstępnego.
    1. Zainstaluj oprogramowanie Matlab.
    2. Pobierz niestandardowy skrypt abfload.m38 i zapisz plik w tym samym folderze, w którym przechowywany jest plik z nagraniem raw.
    3. W oknie edytora Matlab otwórz abfload.m i kliknij Uruchom na pasku narzędzi. Wybierz opcję Zmień folder, jeśli zostanie wyświetlony monit.
    4. Wykonaj funkcję w oknie poleceń z plikiem nagrania raw jako wejściem,
      > [d,si,h] = abfload('[nazwa pliku nagrania RAW].abf')
      i zapisz wyjściowy obszar roboczy pod nazwą pliku, która zawiera oznaczenie larwy, wiek i datę eksperymentu, na przykład [numer próby]_[wiek w DPF]_[nazwa pliku nagrania RAW (domyślnie zawiera datę eksperymentu)].
      UWAGA: Przekonwertowana nazwa pliku powinna zawierać tylko liczby całkowite wyznaczone przez podkreślenie.
  2. Wykonaj wstępne przetwarzanie danych.
    1. Pobierz skrypt Matlab AffVR_preprocess.m i powiązane funkcje, napisane na zamówienie przez autorów.
    2. W oknie Edytor otwórz AffVR_preprocess.m.
    3. W obszarze Zmienne dostosuj dolną granicę progów wykrywania szczytów zarówno dla nagrań aferentnych, jak i VR (odpowiednio spk_detect_lb i vr_detect_lb, linie 8 i 14) w zależności od zarejestrowanego stosunku sygnału do szumu.
      UWAGA: Wykrywanie impulsów opiera się na ręcznym progowaniu w celu sortowania i izolowania sygnałów z więcej niż jednego neuronu doprowadzającego według amplitudy. Podstawowy szum i aktywność z innych jednostek są odfiltrowywane przez progowanie tak, aby obejmowało tylko amplitudy skoków w granicach procentu (np. spk_detect_lb) maksimum (np. spk_detect_ub). Progowanie zapewnia również dokładne grupowanie skoków aktywności motorycznej w serie i zbiorowe fikcyjne napady pływackie. Ogólnie rzecz biorąc, zacznij od dolnej granicy progu wynoszącej 0,5 i stopniowo zmniejszaj, aż do uzyskania dokładnego wykrywania. Na przykład ustawienie spk_detect_lb na 0,5 i spk_detect_ub na 1,0 wykryje wszystkie skoki równe lub większe niż 50% maksymalnej amplitudy impulsu i wykluczy szum lub dodatkowe neurony o niższych amplitudach szczytów (Rysunek 2A). Alternatywnie można również obniżyć spk_detect_ub z 1,0, aby wykluczyć neurony o wyższych amplitudach kolców w celu wyizolowania neuronów o niższych amplitudach kolców. Wstępne przetwarzanie danych wyjściowych figur (patrz krok 7.2.6) poinformuje o konieczności regulacji i powtórzenia od kroku 7.2.2.
    4. W oknie Edytora kliknij Uruchom, aby uruchomić AffVR_preprocess.m.
    5. Przejdź do poprzednio przekonwertowanego pliku danych .mat (patrz krok 7.1.3); wybierz i kliknij Otwórz, aby rozpocząć automatyczne przetwarzanie wstępne.
      UWAGA: Gdy skrypt niestandardowy jest uruchomiony, w oknie poleceń pojawią się dane wyjściowe informujące o jego postępie w krokach przetwarzania, takich jak "filtrowanie danych ...", "wykrywanie aktywności korzenia brzusznego ..." i "generowanie liczb...".
    6. Rysunki wygenerowane przez AffVR_preprocess.m zobrazują wykrywanie aferentnych skoków i VR oraz wskażą, czy należy dostosować jakiekolwiek zmienne analizy (Rysunek 2).
    7. Wpisz "Y" na klawiaturze, aby zapisać wstępnie przetworzone metadane w folderze preprocess_output.
    8. Wstępnie przetworzone dane zostaną automatycznie wyświetlone jako data_out.xls.
  3. Przeanalizuj wstępnie przetworzone dane zgodnie z potrzebami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po prawidłowym unieruchomieniu larw danio-pręgowanego oraz uzyskaniu rejestracji z zwoju aferentnego bocznej linii tylnej i korzeni brzusznych (VR), aktywność zarówno neuronów aferentnych, jak i motorowych może być mierzona jednocześnie. Kanały rejestracji są wyświetlane przy użyciu protokołów rejestracji bez przerw (krok 1.4) w celu ciągłego monitorowania aktywności aferentnej i VR. W czasie rzeczywistym można zaobserwować spadki spontanicznej częstotliwości wyładowań aferentnych współbieżnie z aktywnością VR, co wskazu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany protokół eksperymentalny daje możliwość monitorowania endogennych zmian w bodźcach sensorycznych w zachowaniach motorycznych u nienaruszonych, zachowujących się kręgowców. W szczególności szczegółowo opisano podejście in vivo do wykonywania jednoczesnych zewnątrzkomórkowych zapisów neuronów aferentnych linii bocznej i brzusznych korzeni ruchowych u larw danio pręgowanego. Spontaniczna aktywność aferentna została wcześniej scharakteryzowana u danio pręgowanego bez uwzględnienia potencjalnej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Wdzięcznie dziękujemy za wsparcie ze strony Narodowego Instytutu Zdrowia (DC010809), Narodowej Fundacji Nauki (IOS1257150, 1856237) oraz Whitney Laboratory for Marine Biosciences dla J.C.L. Chcielibyśmy podziękować byłym i obecnym członkom Liao Lab za inspirujące dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka 100 mlPYREX1000resceptacle do wytrawiania
10x obiektyw do zanurzenia w wodzieOlympusUMPLFLN10xWmałe powiększenie do pozycjonowania larw i rejestrowania elektrody
40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzieOlympusLUMPLFLN40XWwiększe powiększenie do pozycjonowania końcówki elektrody i ustanawiania zacisku krosowego
abfload.mdodatkowy plik kodowania,napisany na zamówienie skrypt MATLAB do konwersji surowych nagrań elektrofizjologicznych do plików .mat
AffVR_preprocess.mdodatkowy plik kodowania,niestandardowy skrypt MATLAB do wstępnego przetwarzania danych nagrania
koncentryczne BNCThorLabs2249-C-12łączące kanały wzmacniacza i digitizera; wymagają 4
kapilar ze szkła borokrzemianowego z żarnikiemWarner InstrumentyG150F-3średnica wewnętrzna: 0,86, średnica zewnętrzna: 1,50; szkło kapilarne używane do formowania elektrod rejestrujących
burst_detectdodatkowy plik kodowanianiestandardowo napisana funkcja MATLAB niezbędna do uruchomienia komputera AffVR_preprocess.m
NIENIE każdy komputer powinien działać
Zasilacz prądu stałegoTenma72-420służy do elektrycznego wytrawiania kołków preparacyjnych
digitizer elektrofizjologiiAxon Instruments, Urządzenia molekularneAxon DigiData 1440Aumożliwia akwizycję filamentu danych typu patch-clamp
Sutter Instrument CompanyFB255BFilament pudełkowy 2,5 mm stosowany w ściągaczach do mikropipet
Szczypce drobnoziarnisteFine Science ToolsDumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Nr kat. 11295-10służy do manipulowania larwami i wprowadzania szpilek
stopień stały DIC mikroskopMikroskop OlympusBX51WIsłuży do wizualizacji i ustanawiania zapisów typu patch-clamp
elastyczna, stożkowa końcówka do pipetyFisher Scientific02-707-169elastyczne końcówki umożliwiają wprowadzenie do elektrody rejestrującej w celu dozowania roztworu zewnątrzkomórkowego na końcówce
FluoroDishWorld Precision Instruments Inc.FD3510-100nakrywka ze szklanym dnem naczynie do nagrywania
KimWipe KimTech34155chusteczka zadaniowa służy do odprowadzania nadmiaru płynu z larw
Kwik-GardWorld Precision Instruments Inc.710172samomieszający się elastomer sylgardowy
MATLABMathWorksR2020bOprogramowanie wiersza poleceń do wstępnego przetwarzania danych
wzmacniacz mikroelektrodAxon Instruments, Molecular DevicesMultiClamp 700Bdo nagrań dwukanałowych
MicroforgeNarishigeMF-830 microforgedo polerowania elektrody nagrywającej
mikromanipulator jednostka sterującaSiskiyouMC1000-eR/T4-osiowy koordynator wybierania do sterowania mikromanipulatorem
ściągacz do mikropipetSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97do wciągania szkła kapilarnego do elektrod rejestrujących
Jednostka sterująca mikroskopuSiskiyouMC1000eustawia mikroskop wokół stałego stolika i przygotowania
zmotoryzowany mikromanipulatorSiskiyouMX7600pozycjonuje scenę czołową i dołączoną elektrodę nagrywającą do nagrywania z zaciskiem krosowym
MultiClamp CommanderMolecular Devices2.2.2do pobrania ze strony pobierania Axon MultiClamp 700B Commander
optyczny stół powietrznyNewport CorporationVH3036W-OPTdo izolacji mikroskopu pływającego i minimalizującego wibracje podczas nagrań
pCLAMPMolecular Devices10.7.0do pobrania ze strony Axon pCLAMP 10 Akwizycja danych elektrofizjologicznych i Oprogramowanie do analizy Pobierz stronę
z markerem permanentnymSharpiezamówienie z amazon.comdo oznaczania krawędzi natarcia elektrody VR w celu zapewnienia prawidłowej orientacji podczas wkładania do uchwytu na pipety
szalka PetriegoFalcon35-3001służy do zanurzania larw w paralitycznym
uchwycie na pipetyUrządzenia molekularne1-HL-Utrzyma elektrodę nagrywającą i łączy się ze sceną czołową
przetwornik pneumatycznyFluke Biomedical InstrumentsDPM1Bdo sterowania elektrodą rejestrującą ciśnienie wewnętrzne
wodorotlenek potasuSigma-Aldrich221473-25Gwytrawiacz do trawienia szpilki rozwarstwiające
rurki silikonowerurki Tygon14-169-1Arurka do podłączenia przetwornika pneumatycznego do uchwytu pipety
spike_detectdodatkowy plikkodowaniaspecjalnie napisana funkcja MATLAB niezbędna do uruchomienia
mikroskopu stereoskopowegoAffVR_preprocess.m Carl ZeissStemi 2000-Csłuży do wizualizacji końcówek szpilek i podczas przygotowywania larw
żyletki o prostej krawędzi ŻyletkaCanopuszamów od amazon.comtnie drut wolframowy podczas wykonywania szpilek rozwarstwiających
swimbout_detectdodatkowego plikukodowanianiestandardowo napisana funkcja MATLAB niezbędna do uruchomienia
strzykawkiBecton Dickinson Compoany309602wypełniony roztworem zewnątrzkomórkowym do wstrzykiwania do elektrod rejestrujących
pipeta transferowaSigma-AldrichZ135003-500EAjednorazowa, niesterylna pipeta do przenoszenia larw
trikainy metanosulfonianSyndel12854Farmaceutyczny środek przeciwzapalniczy stosowany do eutanazji larw w dużych dawkach.
drut wolframowyWorld Precision Instruments Inc.7155000,002 cala, 50,8 cala; m średnica; służy do produkcji kołków rozpoznawczych
jednostka filtracji próżniowejSigma-AldrichSCGVU11REjednorazowe, sterylne, próżniowe jednostki filtracyjne używane do sterylizacji roztworu zewnątrzkomórkowego stosowany do elektrofizjologii dzwonek elektrody
zacisk napięciowy cęgi prądowe góraUrządzenia molekularneCV-7Bdostarczane ze wzmacniaczem MultiClamp 700B używanym jako lewy i prawy stopień główny
&alfa;-bungarotoksynaThermoFisherB1601do unieruchamiania larw przed zapisem
DOTYCZY Wzmacniacz patch clamp AffVR_preprocess.m

Bibliografia

  1. Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
  2. Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
  3. Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
  4. Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  5. Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988(2018).
  6. Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
  7. Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
  8. Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  9. Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
  10. Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
  11. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  12. Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  13. Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
  14. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388(2018).
  15. Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
  16. Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661(2012).
  17. Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727(2012).
  18. Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
  19. McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
  20. Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
  21. Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166(2018).
  22. Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
  23. Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
  24. Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587(2019).
  25. Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
  26. Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
  27. Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
  28. Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
  29. Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
  30. Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
  31. Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
  32. Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
  33. Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
  34. Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
  35. Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
  36. Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
  37. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  38. Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
  39. Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
  40. Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
  41. Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851(2018).
  42. Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
  43. von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463(1950).
  44. Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
  45. Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System linii bocznejaktywno neuron w aferentnychlarwy danio pr gowanegoelektrofizjologia patch clamploose patch clampobwody kom rek rz satychaktywno neuron w ruchowychrejestracja zewn trzkom rkowaprzetwarzanie sensorycznewy adowanie korelacyjne
Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.