Method Article

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potężne techniki sekwencjonowania nowej generacji oferują solidną i wszechstronną analizę w celu zbadania, jak funkcjonują sieci regulacyjne genów siatkówki podczas rozwoju i w stanach chorobowych. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki pozwala na kompleksowe profilowanie zmian ekspresji genów obserwowanych w rozwoju siatkówki i chorobie na poziomie komórkowym, podczas gdy jednokomórkowe ATAC-Seq pozwala na analizę dostępności chromatyny i wiązania czynników transkrypcyjnych w podobnej rozdzielczości. W tym artykule opisano zastosowanie tych technik w rozwijającej się siatkówce i zademonstrowano MULTI-Seq, w którym poszczególne próbki są znakowane zmodyfikowanym kompleksem oligonukleotydowo-lipidowym, co umożliwia naukowcom zarówno zwiększenie zakresu indywidualnych eksperymentów, jak i znaczne obniżenie kosztów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, jak geny mogą wpływać na los komórki, odgrywa kluczową rolę w badaniu procesów takich jak choroba i rozwój embrionalny. Złożone relacje między czynnikami transkrypcyjnymi a ich genami docelowymi można pogrupować w sieci regulacji genów. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że te sieci regulacyjne genów znajdują się w centrum zarówno choroby, jak i rozwoju w liniach ewolucyjnych1. Podczas gdy wcześniejsze techniki, takie jak qRT-PCR, koncentrowały się na pojedynczym genie lub zestawie genów, zastosowanie technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości pozwala na profilowanie całych transkryptomów komórkowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt do tych badań zostało przeprowadzone przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, zgodnie z wytycznymi ARRIVE, i zostało przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. MULTI-seq

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotuj i zrównoważ inhibitor owamukoidów, 10 mg inhibitora owamukoidów i 10 mg albuminy na ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), przez 30 minut przed użyciem13. Zrównoważyć z 95% O2:5% CO2 w inkubatorze.
      1. Przygotuj roztwór dysocjacji papainy, 20 jednostek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten przepływ pracy przedstawia strategię badania fenotypów rozwojowych i procesów regulacyjnych za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek. Multipleksowanie próbek MULTI-seq umożliwia wstępny, tani test fenotypowania, podczas gdy sparowane pobieranie i utrwalanie próbek dla scRNA-seq i scATAC-seq pozwala na bardziej dogłębne badanie (Rysunek 1).

Kodowanie kreskowe MULTI-seq umożliwia połączone sekwencjonowanie wielu próbek i ich późniejszą obliczeniową dekonwol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siła MULTI-seq wynika z bezproblemowej integracji danych z wielu warunków eksperymentalnych lub modeli oraz ogromnych korzyści pod względem kosztów i ograniczenia efektów wsadowych. Wykorzystanie MULTI-seq zapewnia laboratoryjną niespotykaną głębię fenotypowania. Niegenetyczne metody multipleksowania, takie jak haszowanie komórek lub haszowanie jąder, otworzyły drzwi do multipleksowanych próbek dzięki zastosowaniu przeciwciał z kodami kreskowymi 7,19,20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Lindzie Orzolek z Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core za pomoc w sekwencjonowaniu wytworzonych bibliotek oraz Lizhi Jiang za wykonanie explantacji siatkówki ex vivo.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 &mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L końcówki
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100 µ Prośba o rozwiązanie dotyczące kodów kreskowych Mz laboratorium Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= prawdziwy
100% etanolMillipore SigmaE7023-500ML
100% metanolMillipore Sigma322415-100ML
10x uchwyt na chipy10x Genomics1000195
10x kontroler chromu i Zestaw akcesoriów10x GenomicsPN-120263
15mL Probówka wirówkowa JakośćBiologicznaP886-229411
40 µ m Filtr siatkowy FlowMi CellBel-ArtH13680-0040
50 &mikro; M Anchor SolutionSigma lub prośba z laboratorium Gartnerahttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=true
50 µ M Co-Anchor SolutionSigma lub prośba z laboratorium Gartnerahttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= prawdziwy
system analizatora fragmentów 5200Agilent
70 um FlowMiBel-ArtH13680-0070
Wirówka Allegra X-12RVWRBK392302
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647
Chromium Next GEM Chip G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem Zestaw odczynników jednokomórkowych ATAC v1.110x GenomicsPN-1000175
Chrom Single Cell 3' GEM, Biblioteka i Zestaw kulek żelowych v3.110x GenomicsPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
Mikroskop preparacyjnyLeica
DNA LoBind Probówki, 1,5 mlEppendorf22431021
Dry-Ice
EVA Pianka Patelnia do loduTequipment04393-54
FA 12-kapilarna Array Short, 33 cmAgilentA2300-1250-3355
Kąpiel wodna Fisherbrand IsotempFisher Scientific15-460-20Q
Forma Inkubator z płaszczem wodnymThermoFisher Scientific3110
Glicerol 50% roztwór wodnyRicca Chemical Company3290-32
Komora liczenia Hausser Scientific Bright-LineFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq lub NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
Niska jakość bufora TEBiologiczna351-324-721
Roztwór chlorku magnezu 1 MSigma-AldrichM1028
Stojak na separator magnetyczny do probówek 1,5 mlMillipore Sigma20-400
Magnetyczny stojak separatora na 200 i mikro; Probówki L10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma lub IDTZobacz listę
MyFuge Mini WirówkaBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstytutSigma-Aldrich74385
Woda wolna od nukleazMikropipety Fisher ScientificAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000Eppendorf
Worthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7,4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Bufor Qiagen EBQiagen19086
Wirówka lodówkowa 5424 REppendorf2231000655
Jednorazowe tłuczki do peletów bez RNazFisher Scientific12-141-368
RNasin Plus Inhibitor RNazyPromegaN2615
RPI starterSigma lub IDTZobacz listę
Zestaw pojedynczych indeksów N, zestaw A10x GenomicsPN-1000212
Zestaw pojedynczego indeksu T Zestaw A10x GenomicsPN-1000213
Roztwór chlorku sodu 5 MSigma-Aldrich59222C
Zestaw odczynników SPRIselectBeckman CoulterB23318
Standardowe jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8-tubowy pasekUSA Scientific1402-4700
Roztwór chlorowodorku Trizma, pH 7,4Sigma-AldrichT2194
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% (w/v)Corning25-900-CI
Uniwersalny podkładI5 Sigma lub IDTZobacz listę
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838
filtrujące do pipet Filtr siatkowy M5310AA sekwencji System dysocjacji papainy sekwencjisekwencji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles