Method Article

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potężne techniki sekwencjonowania nowej generacji oferują solidną i wszechstronną analizę w celu zbadania, jak funkcjonują sieci regulacyjne genów siatkówki podczas rozwoju i w stanach chorobowych. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki pozwala na kompleksowe profilowanie zmian ekspresji genów obserwowanych w rozwoju siatkówki i chorobie na poziomie komórkowym, podczas gdy jednokomórkowe ATAC-Seq pozwala na analizę dostępności chromatyny i wiązania czynników transkrypcyjnych w podobnej rozdzielczości. W tym artykule opisano zastosowanie tych technik w rozwijającej się siatkówce i zademonstrowano MULTI-Seq, w którym poszczególne próbki są znakowane zmodyfikowanym kompleksem oligonukleotydowo-lipidowym, co umożliwia naukowcom zarówno zwiększenie zakresu indywidualnych eksperymentów, jak i znaczne obniżenie kosztów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, jak geny mogą wpływać na los komórki, odgrywa kluczową rolę w badaniu procesów takich jak choroba i rozwój embrionalny. Złożone relacje między czynnikami transkrypcyjnymi a ich genami docelowymi można pogrupować w sieci regulacji genów. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że te sieci regulacyjne genów znajdują się w centrum zarówno choroby, jak i rozwoju w liniach ewolucyjnych1. Podczas gdy wcześniejsze techniki, takie jak qRT-PCR, koncentrowały się na pojedynczym genie lub zestawie genów, zastosowanie technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości pozwala na profilowanie całych transkryptomów komórkowych.

RNA-seq oferuje wgląd w transkryptomikę na dużą skalę2,3. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) daje badaczom możliwość nie tylko profilowania transkryptomów, ale także łączenia określonych typów komórek z profilami ekspresji genów4. Osiąga się to bioinformatycznie poprzez wprowadzanie indywidualnych profili komórkowych do algorytmów sortowania przy użyciu znanych markerów genetycznych5. Multipleksowanie przy użyciu sekwencjonowania indeksów znakowanych lipidami (MULTI-seq) oferuje bezprecedensową różnorodność w liczbie profili scRNA-Seq, które można zebrać6. Ta technika oparta na lipidach różni się od innych technik indeksowania próbek, takich jak haszowanie komórek, które opierają się na obecności antygenów powierzchniowych i przeciwciał o wysokim powinowactwie zamiast integracji błony plazmatycznej7. Nie tylko możliwe jest teraz profilowanie profili ekspresji genów na typy komórek, ale różne eksperymenty mogą być łączone w jedną bibliotekę sekwencjonowania, co znacznie obniża koszt indywidualnego eksperymentu z sekwencją scRNA6. Koszt sekwencjonowania scRNA może wydawać się zaporowy w eksperymentach fenotypowania, w których analizowanych jest wiele różnych genotypów, warunków lub próbek pacjentów, ale multipleksowanie pozwala na połączenie do 96 próbek w jednej bibliotece6.

Profilowanie ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania scRNA nie było jedyną techniką opartą na sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości, która zrewolucjonizowała obecne zrozumienie tego, jak mechanizmy molekularne decydują o losie komórki. Podczas gdy zrozumienie, które transkrypty genów są obecne w komórce, umożliwia identyfikację typu komórki, równie ważne jest zrozumienie, w jaki sposób organizacja genomu reguluje rozwój i postęp choroby. Wczesne badania polegały na wykrywaniu rozszczepienia sekwencji niezwiązanych z histonami za pośrednictwem DNazy, a następnie sekwencjonowaniu powstałych fragmentów DNA w celu identyfikacji regionów otwartej chromatyny. W przeciwieństwie do tego, test pojedynczej komórki do sekwencjonowania chromatyny z dostępem do transpozonu (scATAC-seq) pozwala naukowcom badać DNA za pomocą udomowionego transpozonu w celu łatwego profilowania otwartej chromatyny na poziomie pojedynczego nukleotydu8. Przeszło to podobne skalowanie do scRNA-seq i teraz badacze mogą identyfikować poszczególne typy komórek i profilować fenotypy w tysiącach indywidualnych genomów8.

Połączenie scRNA-seq i scATAC-seq umożliwiło badaczom profilowanie tysięcy komórek w celu określenia populacji komórek, organizacji genomu i sieci regulacyjnych genów w modelach chorób i procesach rozwojowych9,10,11,12. W tym miejscu autorzy opisują, jak po raz pierwszy wykorzystać MULTI-seq do skondensowania fenotypowania niezliczonych modeli zwierzęcych i zastosować sparowane scRNA-seq i scATAC-seq, aby lepiej zrozumieć krajobraz chromatyny i sieci regulacyjne w tych modelach zwierzęcych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt do tych badań zostało przeprowadzone przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, zgodnie z wytycznymi ARRIVE, i zostało przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. MULTI-seq

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotuj i zrównoważ inhibitor owamukoidów, 10 mg inhibitora owamukoidów i 10 mg albuminy na ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), przez 30 minut przed użyciem13. Zrównoważyć z 95% O2:5% CO2 w inkubatorze.
      1. Przygotuj roztwór dysocjacji papainy, 20 jednostek/ml papainy i 0,005% DNazy w EBSS, podczas tego etapu inkubacji13,
        UWAGA: Jedna fiolka roztworu DNazy wystarczy na 5 próbek. W przypadku wykonywania MULTI-seq na więcej niż 5 próbkach może być konieczne rozpuszczenie dodatkowych fiolek.
    2. Przygotować roztwory oligonomodów modyfikowane lipidami.
      1. Wykonaj unikalne rozcieńczenie kodu kreskowego dla każdej próbki, łącząc 0,5 μl 100 μM roztworu podstawowego kodu kreskowego z 4,5 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
      2. Aby przygotować roztwór kotwica:kod kreskowy w stosunku molowym 1:1, połącz 4,4 μl 10 μM rozcieńczenia kodu kreskowego, 0,9 μl 50 μM roztworu kotwicy i 16,7 μl PBS i umieść na lodzie. Końcowe stężenie zarówno dla pasm kodów kreskowych, jak i pasm kotwiczących powinno wynosić 2 μM.
      3. Aby przygotować roztwór kotwicy, należy połączyć 0,88 μl 50 μM roztworu kotwy współkotwiczącej i 21,12 μl PBS i umieścić na lodzie. Końcowe stężenie kotwy powinna wynosić 2 μM. Pomnóż objętości w tym kroku przez 1,1x liczbę próbek.
    3. Aby uzyskać 1% BSA w PBS, rozpuść 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 ml PBS i umieść na lodzie.
    4. Aby wytworzyć PBS z inhibitorem RNazy, połącz 2,5 μl 40 μl inhibitora RNazy z 197,5 μl PBS i przechowuj na lodzie. Pomnóż objętości w tym kroku przez 1,1-krotność liczby próbek.
  2. Dysocjacja próbki
    1. Eutanazja zwierząt poprzez zwichnięcie szyjki macicy i/lub zamartwienie CO2 zgodnie z wymogami instytucjonalnymi IACUC. Metoda eutanazji będzie zależała od wymagań instytucjonalnych i użytego organizmu modelowego.
    2. Wypreparować siatkówkę z obu oczu w zimnym PBS pod mikroskopem preparacyjnym i przenieść do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety do przenoszenia.
    3. Przenieść 500 μl roztworu papainy do probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
    4. Umieścić próbki w roztworze papainy i natychmiast zakryć probówki.
    5. Probówki zawierające próbki inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut. Odwracać fiolki 3 razy co 10 minut. Próbki powinny stopniowo dysocjować z każdą rundą inwersji.
    6. Umieścić fiolki z powrotem w temperaturze pokojowej i rozcierać każdą próbkę 3-4 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml ustawionej na 300 μl.
    7. Pozwól, aby wszelkie kawałki niezdysocjowanej tkanki pozostałe po roztarciu osiadły.
    8. Usunąć mętną zawiesinę komórek, unikając wszelkich kawałków niezdysocjowanej tkanki i umieścić zawiesinę komórek każdej próbki w nowej, sterylnej probówce z zakrętką o pojemności 15 ml.
    9. Odwirować zawiesiny komórkowe o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Na etapie wirowania należy przygotować pożywkę do zawieszania komórek.
      1. Zmieszać 857 μl EBSS (fiolka 1) z 95 μl odtworzonego roztworu inhibitora albuminy i owomukoidu w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml z zakrętką. Dodać 48 μl roztworu DNazy zaoszczędzonego z 1.1.1. Pomnóż objętości w tym kroku przez 1,1-krotność liczby próbek.
    11. Odrzucić supernatant, uważając, aby zatrzymać osady komórkowe i natychmiast ponownie zawiesić osady komórek w 1 ml roztworu do ponownego zawieszania komórek, przygotowanego w kroku 1.2.10.
    12. Przygotuj nieciągły gradient gęstości.
      1. Do każdej próbki dodać 1,6 ml roztworu inhibitora jajowomukoidów do nowej sterylnej probówki z zakrętką o pojemności 15 ml i ostrożnie ułożyć zawiesinę komórek na wierzchu. Interfejs między dwiema warstwami gradientu powinien być widoczny, ale pewne mieszanie nie wpływa na wyniki.
    13. Odwirować nieciągłe gradienty gęstości przy 70 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Zdysocjowane komórki powinny osadzać się na dnie probówek, podczas gdy fragmenty błony pozostają na granicy faz
      14. .
    14. Odrzucić supernatant i dodać 200 μl PBS w celu przepłukania granulowanych komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    15. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 180 μl PBS z inhibitorem RNazy. Przepuść komórki przez sitko o wielkości 40 μm do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Kodowanie kreskowe komórek
    1. Dodać 20 μl roztworu kotwica:kod kreskowy do każdej próbki i delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Upewnij się, że każda próbka otrzyma unikalny roztwór kotwica: kod kreskowy i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
      1. Przygotuj materiały wymagane do generowania żelu w emulsji (GEM) i kodowania kreskowego podczas tej inkubacji14.
    2. Dodać 20 μl roztworu współkotwiczącego do każdej próbki i delikatnie odpipetować, aby wymieszać. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
    3. Dodać 1 ml lodowatego 1% BSA w PBS do każdej próbki i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego i dodać 400 μl lodowatego 1% BSA do PBS. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      1. Powtórz krok 1.3.4, co daje w sumie 2 prania. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 400 μl lodowatego 1% BSA w PBS.
    5. Określić stężenie komórek dla każdej próbki za pomocą hemocytometru.
      1. Określ całkowitą liczbę komórek do załadowania dla każdej próbki. Zazwyczaj jest to całkowita liczba pożądanych komórek podzielona przez liczbę próbek. Jeśli jednak kontrpróba biologiczna dla jednego schorzenia została utracona, jego udział może zostać podzielony między inne kontrpróby biologiczne z tego stanu.
      2. Podziel liczbę komórek pożądaną dla każdej próbki przez stężenie komórek w tej próbce obliczone w kroku 3.5, aby określić objętość wymaganą do załadowania żądanej liczby komórek.
    6. Połączyć objętości obliczone w kroku 3.5.2 z każdej próbki w nowej sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozsądne jest podwojenie objętości pobranej z każdej próbki w przypadku niepowodzenia wytwarzania GEM.
      1. Określić "końcowe" stężenie komórek w połączonych próbkach za pomocą hemocytometru.
  4. Generowanie GEM i kody kreskowe
    1. Użyj połączonych próbek, aby wygenerować i oznaczyć znakiem kreskowym GEMs14.
  5. Oczyszczanie po GEM-RT i amplifikacja cDNA
    1. Przygotuj materiały do oczyszczania odwrotnej transkryptazy po GEM i amplifikacji cDNA zgodnie z instrukcjami producenta z następującymi modyfikacjami14. Wykonaj czyszczenie po GEM-RT według wyboru rozmiaru14.
      1. Zwiększyć objętość przygotowanego 80% etanolu o 2 ml.
      2. Przygotuj mieszankę do amplifikacji cDNA na ice14. Dodaj 1 μl startera 2,5 μM MULTI-seq do mieszaniny amplifikacji cDNA. Wiruj przez 5 s i wiruj przez 5 s w mini wirówce stołowej.
    2. Wykonaj amplifikację cDNA14. W tym momencie cDNA może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin.
    3. Wykonaj czyszczenie cDNA przez wybór rozmiaru14. Endogenny transkrypt cDNA może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin lub w temperaturze -20 °C przez okres do 4 tygodni.
      1. Nie wyrzucać supernatantu z pierwszej rundy wyboru wielkości. Ta frakcja zawiera przykładowe kody kreskowe. Przenieść supernatant do nowej sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      2. Przechowywać supernatant na lodzie.
    4. Vortex w celu ponownego zawieszenia odczynnika do wyboru wielkości na bazie kulek paramagnetycznych i dodać 260 μl odczynnika do wyboru wielkości na bazie kulek paramagnetycznych (końcowy 3,2x) i 180 μl 100% izopropanolu (1,8x) do supernatantu. Odpipetować mieszaninę 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór się usunie. Następnie usunąć i wyrzucić supernatant.
    6. Dodaj 500 μl 80% etanolu do kulek i odstaw na 30 sekund. Usuń i wyrzuć supernatant.
      1. Powtórz w sumie 2 prania.
    7. Krótko odwiruj kulki i wróć do stojaka magnetycznego. Uruchom minutnik na 2 minuty.
    8. Usuń pozostały etanol za pomocą pipety P10 i wysusz kulki na powietrzu na stojaku magnetycznym przez pozostałą część 2 minut. Nie przekraczać 2 minut.
    9. Wyjmij kulki ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś w 100 μl buforu elucyjnego (EB). Dokładnie odpipetować w celu ponownego zawieszenia.
    10. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    11. Wróć do stojaka magnetycznego i poczekaj, aż roztwór zniknie.
    12. Przenieść supernatant do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    13. Powtórz kroki od 1.5.4 do 1.5.12. Zmniejsz o połowę objętość buforu EB użytego w kroku 1.5.9.
    14. Określ stężenie i rozkład wielkości DNA kodu kreskowego za pomocą zestawu do oznaczania wysokiej czułości dsDNA oraz fluorometru i analizatora fragmentów15,16. DNA z kodem kreskowym może być przechowywane w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 72 godziny lub w temperaturze -20 °C przez okres do 4 tygodni.
  6. Budowa biblioteki kodów kreskowych
    1. Przygotuj 1 ml 80% etanolu.
    2. Przygotuj bibliotekę kodów kreskowych Mistrzowska mieszanka PCR w sterylnej probówce paskowej do PCR: połącz 26,25 μl 2x gotowej mieszanki do PCR na gorąco, 2,5 μl 10 μM uniwersalnego startera i5, 2,5 μl 10 μM startera RPI, 3,5 ng cDNA z kodem kreskowym (objętość określona przez stężenie z kroku 5.14) i wystarczającą ilość wody wolnej od nukleaz, aby doprowadzić końcową objętość do 50 μl.
      1. Użyj unikalnego startera RPI dla każdej biblioteki kodów kreskowych, jeśli wiele bibliotek MULTI-seq jest sekwencjonowanych razem.
    3. Poddać wzorcową mieszankę biblioteki kodów kreskowych przygotowaniu biblioteki PCR: 95 °C przez 5 minut; 10 cykli po 98 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 1 min; a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
    4. Wir do ponownego zawieszenia odczynnika do wyboru rozmiaru na bazie kulek paramagnetycznych.
    5. Wyjmij produkt PCR z termocyklera i dodaj 80 μl (1,6x) odczynnika do wyboru wielkości na bazie kulek paramagnetycznych. Dokładnie odpipetować.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić na separatorze magnetycznym w wysokiej pozycji i poczekać, aż roztwór się klaruje.
    7. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    8. Dodać 200 μl 80% etanolu do kulek i odstawić na 30 s. Usunąć i wyrzucić supernatant.
      1. Powtórz krok 1.6.8, co daje w sumie 2 prania.
    9. Krótko odwirować probówkę i umieścić na separatorze magnetycznym w dolnym położeniu. Uruchom minutnik na 2 minuty.
    10. Usuń pozostały etanol za pomocą pipety P20 i wysusz kulki na separatorze magnetycznym na powietrzu przez pozostałą część 2 minut. Nie przekraczać 2 minut.
    11. Wyjąć probówkę z separatora magnetycznego i ponownie zawiesić kulki w 25 μl buforu EB. Dokładnie wymieszaj pipetą, aby ponownie zawiesić kulki.
    12. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    13. Wróć do separatora magnetycznego w dolnym położeniu i poczekaj, aż roztwór się usunie. Przenieść supernatant do nowej probówki z paskami do PCR.
    14. Określ ilościowo bibliotekę ekspresji i bibliotekę kodów kreskowych, stężenie i rozkład wielkości fragmentów za pomocą zestawu do oznaczania wysokiej czułości adsDNA oraz analizatora fluorometru i fragmentów.
  7. 3' Budowa biblioteki ekspresji genów
    1. Wykonaj konstrukcję biblioteki ekspresji genów 3' zgodnie z instrukcjami producenta14.
  8. Sekwencjonowanie
    1. Oprócz endogennej biblioteki cDNA amplifikowanej w kroku 7, prześlij bibliotekę kodów kreskowych amplifikowaną w kroku 6. Dla uproszczenia należy przesłać te biblioteki osobno lub jako opłacalny środek dołączyć podwielokrotność materiału do kodowania kreskowego próbki z endogenną biblioteką cDNA. Docelowa liczba próbek to 20 000-50 000 cDNA i 3 000-5 000 odczytów kodów kreskowych na komórkę.
    2. Konwertuje wynikowe pliki bcl sekwencjonowania na pliki fastq przez cellranger mkfastq i zlicza macierze wygenerowane z nich przez cellranger count.
    3. Dekonwolucja próbek po analizie Cellranger za pomocą pakietu deMULTIplex r dostępnego w repozytorium MULTI-seq GitHub (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. Sparowane scRNA-seq i scATAC-seq

  1. Błyskawiczne zamrażanie tkanek do scATAC-seq i wiązanie metanolu komórek siatkówki do scRNA-seq
    1. Przygotowanie podłoża
      1. Aby przygotować roztwory do dysocjacji siatkówki, powtórz kroki 1.1.1 i 1.1.4.
      2. Przygotuj kąpiel z suchym lodem etanolowym w małym wiaderku z lodem.
      3. Przygotuj 15 ml 70% etanolu, dodając 10,5 ml etanolu do 4,5 ml wody wolnej od nukleaz.
      4. Dodaj tyle suchego lodu do wiadra na lód (najlepiej w postaci granulek), aby 15 ml płynu uniosło się, aby po prostu przykryć lód. Dodaj 15 ml etanolu.
      5. Umieść PBS na lodzie i 1 ml porcji 100% metanolu w wygodnej zamrażarce o temperaturze -20 °C.
    2. Przygotowanie próbki
      1. Wykonaj kroki 1.2.1 i 1.2.2, aby wyizolować siatkówkę; jednak tym razem umieść każdą siatkówkę w oddzielnej probówce do mikrowirówki.
      2. W przypadku próbek przeznaczonych do scATAC-seq należy usunąć płyn z probówki mikrowirówki za pomocą pipety P200 i natychmiast zakryć probówkę i umieścić ją w łaźni etanolowo-suchej w celu błyskawicznego zamrożenia próbki.
      3. W przypadku próbek przeznaczonych do sekwencjonowania scRNA, aby zdysocjować komórki, powtórz kroki od 1.2.3 do 1.2.15 na wypreparowanej siatkówce.
      4. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
      5. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
      6. Dodać 1 ml schłodzonego PBS i delikatnie odpipetować 10 razy lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie zawieszone.
      7. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
        1. Powtórz kroki od 2.1.2.5 do 2.1.2.7, co daje w sumie 2 prania.
      8. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
      9. Dodaj 100 μl schłodzonego PBS i delikatnie mieszaj 10x lub do całkowitego zawieszenia komórek.
      10. Rozpocznij wirowanie rurki przy najniższym ustawieniu prędkości. Dodawać kroplami 900 μl schłodzonego metanolu (-20 °C), kontynuując delikatne wirowanie probówki, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.
      11. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut.
      12. Określ stężenie utrwalonych komórek za pomocą hemocytometru.
      13. Ocenić skuteczność etapu utrwalania za pomocą błękitu trypanowego. Wysoki odsetek żywotnych komórek wskazuje, że wymagany jest dłuższy czas utrwalania.
      14. Zamrożoną tkankę i utrwalone komórki przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Izolacja jąder z tkanki zamrożonej w technologii flash dla scATAC-seq
    1. Przygotowanie podłoża
      1. Przygotować bufor rozcieńczający lizę, łącząc 9,77 ml wody wolnej od nukleaz, 100 μl 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μl 1 M NaCl, 30 μl 1 M MgCl2 i 0,1 g BSA.
      2. Przygotować bufor do rozcieńczania lizy z wyprzedzeniem, np. dzień wcześniej, i przechowywać w temperaturze 4 °C. W dniu sporządzenia protokołu umieścić na lodzie.
      3. Zrównoważyć 20x bufor jąder dostarczony przez producenta zestawu scATAC od -20 °C do temperatury pokojowej. Wirować i krótko odwirować.
      4. Przygotować 1x bufor do lizy, inkubując 5% roztwór digitoniny w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, aż osad się rozpuści. Następnie połączyć 2 ml buforu rozcieńczającego lizę, 20 μl 10% Tween-20, 20 μl substytutu Nonidet P40 (alternatywnie może być oznaczony jako IGEPAL) i 4 μl digitoniny.
      5. Przechowywać 1x bufor do lizy na lodzie.
      6. Aby przygotować 0,1x bufor do lizy, połącz 1,8 ml buforu rozcieńczającego do lizy z 200 μl 1x buforu do lizy i przechowuj na lodzie.
      7. Aby przygotować bufor do przemywania należy połączyć 2 ml buforu rozcieńczającego do lizy i 20 μl 10% Tween-20 i przechowywać na lodzie.
      8. Aby przygotować rozcieńczony bufor jąder, należy połączyć 950 μl wody wolnej od nukleaz z 50 μl buforu jąder (20x) i przechowywać na lodzie.
    2. Izolacja jąder
      1. Nie rozmrażaj próbki przed lizą. Dodać 500 μl schłodzonego 0,1-krotnego buforu do lizy do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej zamrożoną próbkę. Natychmiast homogenizować 15x za pomocą tłuczka do granulek.
      2. Inkubować przez 5 minut na lodzie. Przygotuj materiały wymagane do transpozycji scATAC podczas tego etapu inkubacji17.
      3. Odpipetować 10x wymieszać z pipetą o pojemności 1 ml i inkubować przez 10 minut na lodzie. Kompletne przygotowanie materiałów wymaganych do transpozycji scATAC podczas tego etapu inkubacji, jeśli nie zostało jeszcze zakończone. Nie ma potrzeby przygotowywania większej ilości rozcieńczonego buforu jąder.
      4. Dodać 500 μl schłodzonego buforu do płukania do zlizowanych komórek. Mieszanie pipet 5x.
      5. Przepuść zawiesinę przez sitko o wielkości 70 μm do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Filtruj jednorazowo ~300 μL za pomocą nowego sitka do komórek 70 μm.
      6. Zebrany przepływ przepuścić przez sitko o wielkości 40 μm do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie.
      7. Oznaczyć stężenie jąder za pomocą hemocytometru. Na podstawie stężenia jąder i całkowitej objętości zawiesiny komórkowej oblicz całkowitą liczbę zdysocjowanych jąder.
      8. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant bez rozrywania osadu jądrowego.
      9. Aby utworzyć zapas jąder na podstawie całkowitej liczby jąder określonej w kroku 2.2.2.7, należy ponownie zawiesić jądra w wystarczająco rozcieńczonym buforze jąder, aby osiągnąć pożądane stężenie jąder.
        UWAGA: Pożądane stężenie jąder jest oparte na docelowym odzyskiwaniu jąder dla eksperymentu scATAC-seq i jest określane na podstawie wytycznych dotyczących koncentracji jąder, które można znaleźć w protokole producenta17. Na przykład, jeśli ostatecznie pożądane jest 10 000 jąder, pożądane stężenie jąder dla zapasu jąder wynosi od 3 080 do 7 700 jąder / μl. Najlepiej byłoby dążyć do środka zakresu koncentracji.
      10. Oznaczyć stężenie jąder za pomocą hemocytometru.
      11. Natychmiast przystąp do transpozycji scATAC przy użyciu przygotowanego jądra stock17.
  3. Rehydratacja komórek utrwalonych metanolem do stosowania w scRNA-Seq
    1. Przygotowanie nośnika
      1. Aby przygotować bufor do przemywania / rozcieńczania, rozpuścić 0,01 g BSA w 1 ml PBS. Następnie dodaj 12,5 μl 40 U/μL inhibitora RNazy i delikatnie wymieszaj. Przechowywać na lodzie.
    2. Ponowne nawodnienie komórek
      1. Odwirować stałe komórki metanolu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy 3000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie usunąć supernatant.
      2. Dodać 200 μl schłodzonego buforu do przemywania / rozcieńczania do probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz w sumie 2 prania.
        UWAGA: Przygotuj materiały wymagane do generowania GEM i kodowania kreskowego w poprzednich dwóch krokach14.
      3. Aby przygotować zapas komórek, w oparciu o całkowitą liczbę komórek obliczoną w ppkt 2.1.2.12, należy ponownie zawiesić komórki w wystarczającej ilości buforu do przemłukania/rozcieńczania, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek. Preferowane stężenia komórek wynoszą od 700 do 1200 komórek/μl.
      4. Określ stężenie komórek w zapasie komórek za pomocą hemocytometru.
      5. Natychmiast przejdź do generowania GEM i kodów kreskowych za pomocą komórki stock14.
    3. Sekwencjonowanie
      1. Podczas przeprowadzania analizy przebiegu czasowego (np. w przypadku rozwoju lub choroby) należy sekwencjonować wiele próbek w serii multipleksowanej (tj. wiele bibliotek na jednej komórce przepływowej), aby ograniczyć różnice techniczne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten przepływ pracy przedstawia strategię badania fenotypów rozwojowych i procesów regulacyjnych za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek. Multipleksowanie próbek MULTI-seq umożliwia wstępny, tani test fenotypowania, podczas gdy sparowane pobieranie i utrwalanie próbek dla scRNA-seq i scATAC-seq pozwala na bardziej dogłębne badanie (Rysunek 1).

Kodowanie kreskowe MULTI-seq umożliwia połączone sekwencjonowanie wielu próbek i ich późniejszą obliczeniową dekonwol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siła MULTI-seq wynika z bezproblemowej integracji danych z wielu warunków eksperymentalnych lub modeli oraz ogromnych korzyści pod względem kosztów i ograniczenia efektów wsadowych. Wykorzystanie MULTI-seq zapewnia laboratoryjną niespotykaną głębię fenotypowania. Niegenetyczne metody multipleksowania, takie jak haszowanie komórek lub haszowanie jąder, otworzyły drzwi do multipleksowanych próbek dzięki zastosowaniu przeciwciał z kodami kreskowymi 7,19,20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Lindzie Orzolek z Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core za pomoc w sekwencjonowaniu wytworzonych bibliotek oraz Lizhi Jiang za wykonanie explantacji siatkówki ex vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 &mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L końcówki
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100 µ Prośba o rozwiązanie dotyczące kodów kreskowych Mz laboratorium Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= prawdziwy
100% etanolMillipore SigmaE7023-500ML
100% metanolMillipore Sigma322415-100ML
10x uchwyt na chipy10x Genomics1000195
10x kontroler chromu i Zestaw akcesoriów10x GenomicsPN-120263
15mL Probówka wirówkowa JakośćBiologicznaP886-229411
40 µ m Filtr siatkowy FlowMi CellBel-ArtH13680-0040
50 &mikro; M Anchor SolutionSigma lub prośba z laboratorium Gartnerahttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=true
50 µ M Co-Anchor SolutionSigma lub prośba z laboratorium Gartnerahttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= prawdziwy
system analizatora fragmentów 5200Agilent
70 um FlowMiBel-ArtH13680-0070
Wirówka Allegra X-12RVWRBK392302
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647
Chromium Next GEM Chip G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem Zestaw odczynników jednokomórkowych ATAC v1.110x GenomicsPN-1000175
Chrom Single Cell 3' GEM, Biblioteka i Zestaw kulek żelowych v3.110x GenomicsPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
Mikroskop preparacyjnyLeica
DNA LoBind Probówki, 1,5 mlEppendorf22431021
Dry-Ice
EVA Pianka Patelnia do loduTequipment04393-54
FA 12-kapilarna Array Short, 33 cmAgilentA2300-1250-3355
Kąpiel wodna Fisherbrand IsotempFisher Scientific15-460-20Q
Forma Inkubator z płaszczem wodnymThermoFisher Scientific3110
Glicerol 50% roztwór wodnyRicca Chemical Company3290-32
Komora liczenia Hausser Scientific Bright-LineFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq lub NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
Niska jakość bufora TEBiologiczna351-324-721
Roztwór chlorku magnezu 1 MSigma-AldrichM1028
Stojak na separator magnetyczny do probówek 1,5 mlMillipore Sigma20-400
Magnetyczny stojak separatora na 200 i mikro; Probówki L10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma lub IDTZobacz listę
MyFuge Mini WirówkaBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstytutSigma-Aldrich74385
Woda wolna od nukleazMikropipety Fisher ScientificAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000Eppendorf
Worthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7,4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Bufor Qiagen EBQiagen19086
Wirówka lodówkowa 5424 REppendorf2231000655
Jednorazowe tłuczki do peletów bez RNazFisher Scientific12-141-368
RNasin Plus Inhibitor RNazyPromegaN2615
RPI starterSigma lub IDTZobacz listę
Zestaw pojedynczych indeksów N, zestaw A10x GenomicsPN-1000212
Zestaw pojedynczego indeksu T Zestaw A10x GenomicsPN-1000213
Roztwór chlorku sodu 5 MSigma-Aldrich59222C
Zestaw odczynników SPRIselectBeckman CoulterB23318
Standardowe jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8-tubowy pasekUSA Scientific1402-4700
Roztwór chlorowodorku Trizma, pH 7,4Sigma-AldrichT2194
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% (w/v)Corning25-900-CI
Uniwersalny podkładI5 Sigma lub IDTZobacz listę
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838
filtrujące do pipet Filtr siatkowy M5310AA sekwencji System dysocjacji papainy sekwencjisekwencji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96(2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224(2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345(2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598(2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907(2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles