Ten protokół opisuje generowanie wolnych od integracji iPSC z fibroblastów tkanek płodu poprzez dostarczanie plazmidów epizodycznych przez nukleofekcję, a następnie opisuje metody używane do charakterystyki iPSC i różnicowania neuronów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aneuploidie chromosomowe powodują poważne wady wrodzone, w tym wady rozwojowe ośrodkowego układu nerwowego i śmierć płodu. Prenatalne badania genetyczne mają charakter czysto diagnostyczny i nie wyjaśniają mechanizmu choroby. Chociaż komórki z płodów aneuploidalnych są cennym materiałem biologicznym zawierającym aneuploidię chromosomową, komórki te żyją krótko, co ogranicza ich wykorzystanie w dalszych eksperymentach badawczych. Generowanie modeli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) jest skuteczną metodą przygotowania komórek do wiecznego zachowania cech aneuploidalnych. Są samoodnawiające się i różnicują w wyspecjalizowane komórki, co przypomina rozwój embrionalny. W związku z tym iPSC służą jako doskonałe narzędzia do badania wczesnych zdarzeń rozwojowych. Zespół Turnera (TS) jest rzadkim schorzeniem związanym z całkowitym lub częściowym brakiem chromosomu X. Zespół charakteryzuje się niepłodnością, niskim wzrostem, zaburzeniami endokrynologicznymi, metabolicznymi, autoimmunologicznymi i sercowo-naczyniowymi oraz defektami neuropoznawczymi. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę fibroblastów z tkanki płodowej TS (45XO), generowanie wolnych od integracji TSiPSC poprzez dostarczenie plazmidów przeprogramowujących epizodyczne przez nukleofekcję, a następnie charakteryzację. Przeprogramowanie TSiPSC poddano początkowo badaniom przesiewowym za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną żywych komórek, a następnie przeprowadzono szeroko zakrojone badania pod kątem biomarkerów pluripotencji. Wybrane kolonie poddano mechanicznej sekcji, kilkukrotnej pasażacji, a do dalszych eksperymentów wykorzystano stabilne, samoodnawiające się komórki. W komórkach stwierdzono ekspresję czynników transkrypcyjnych pluripotencji OCT4, NANOG, SOX2, markerów powierzchniowych komórek SSEA 4 i TRA1-81 typowych dla pluripotencjalnych komórek macierzystych. Oryginalny kariotyp 45XO został zachowany po przeprogramowaniu. TSiPSC były zdolne do tworzenia ciał zarodkowych i różnicowania się w komórki endodermy, mezodermy i ektodermy wyrażające biomarkery specyficzne dla linii ((SRY BOX17), (MIOZYNOWY KOMOROWY ŁAŃCUCH CIĘŻKI α/β), (βIII TUBULINA)). Egzogenne plazmidy episomalne zostały utracone spontanicznie i nie zostały wykryte po pasażie 15 w komórkach. Te TSiPSC są cennym zasobem komórkowym do modelowania wadliwego rozwoju molekularnego i komórkowego powodującego deficyty neurokognitywne związane z zespołem Turnera.
Wprowadzenie
Aneuploidie prowadzą do wad wrodzonych/wad wrodzonych i utraty ciąży u ludzi. ~50%-70% próbek z powodu utraty ciąży wykazuje nieprawidłowości cytogenetyczne. Zarodki aneuploidalne utracone we wczesnym okresie ciąży nie mogą być łatwo pozyskane do analizy eksperymentalnej, co rodzi potrzebę opracowania innych modeli ściśle reprezentujących ludzką embriogenezę. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z komórek, u których zdiagnozowano zaburzenia genetyczne, wykorzystano do modelowania reprezentatywnych nieprawidłowości genetycznych i ich wpływu na rozwój płodu1,2,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
FCV zostały uzyskane ze Szpitala Manipal w Bengaluru, za zgodą Komitetu Etyki Szpitali Manipal.
UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się ze składem wszystkich i roztworów.
1. Izolacja fibroblastów z płodowych kosmków kosmówkowych (FCV)
- Pobieranie próbek i rozpad tkanek w kolagenazie
- Zebrać FCV w sterylnych warunkach w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przetransportować (w temperaturze pokojowej) do zakładu hodowli komórkowej.
- Przenieść kosmki na szalkę Petriego o średnicy 60 mm i umyć kilkakrotnie (mi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Generowanie wolnych od integracji iPSC z płodu po samoistnym poronieniu z kariotypem 45XO
Wyizolowano fibroblasty z FCV z kariotypem 45XO charakterystycznym dla zespołu Turnera (TS) i poddano je nukleofekcji episomalnymi plazmidami reprogramującymi w celu wygenerowania TSiPSC, które mogą być wykorzystane do dalszego modelowania zespołu, a w szczególności związanych z nim deficytów neurologicznych (Rycina 1a&b). Do eksperymentów z transfekcją wykorzys.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Generowanie stabilnych modeli komórkowych cytogenetycznie nieprawidłowej tkanki płodu jest niezbędne do utrwalenia wadliwego fenotypu. Droga iPSC jest najskuteczniejszą metodą przygotowania komórek do wiecznej konserwacji wadliwych właściwości20.
Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) wykazują właściwości samoodnawiania i różnicowania się w wyspecjalizowane komórki, przypominające zarodki o wczesnym rozszczepieniu21. W związku z tym PSC mogą .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Wsparcie finansowe dla powyższych badań zostało zapewnione przez Manipal Academy of Higher Education. Charakterystykę linii przeprowadzono częściowo w laboratorium M. M. Panickera z NCBS. Dziękujemy Laboratorium Diagnostycznemu Anand za pomoc w kariotypowaniu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,15% trypsyna | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-merkaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotencja i pożywka dla embrionów |
| 4', 6 diamidino-2-fenyloindol | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemia |
| Aktywina A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Testy |
| różnicowaniaFosfataza alkaliczna Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | Barwienie AP |
| AMAXA Nucleofector II | |||
| AmnioMAX II kompletne podłoża | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Podłoże specyficzne dla hodowli komórek kosmków kosmówkowych płodu |
| Ampicylina | HiMedia | TC021 | Oczyszczanie plazmidu |
| Anty mysie IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemia |
| Anty królik IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemia |
| Anty królik IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemia |
| Antybiotyk-Antybiotyk Grzybicze | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Kontrola zanieczyszczeń |
| Anty-E-Kadheryna | BD Nauki biologiczne | 610181 | Immunocytochemia |
| Anty-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemia |
| Anty-OCT3/4 | BD Nauki biologiczne | 611202 | Immunocytochemia |
| Anty-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemia |
| Anty-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemia |
| Anty-SSEA4 | BD Nauki biologiczne | 560073 | Immunocytochemia |
| Anty-TRA 1-81 | Milipore | MAB4381 | Immunocytochemia |
| podstawowa Czynnik wzrostu fibroblastów [FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pożywka pluripotencji |
| Czynnik morfogenetyczny kości 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Testy różnicujące |
| Bydło Albumina surowicy | Sigma Aldrich | A3059 | Kolagen blokujący |
| Ludzki typ IV | BD Biosciences | 354245 | Testy różnicowania |
| Mieszanka kolagenazy | Sigma Aldrich | C8051 | Trawienie kosmków kosmówkowych płodu |
| Deksametazon | Sigma Aldrich | D4902 | Testy różnicujące |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Testy różnicowania |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Trawienie restrykcyjne |
| Fibronektyna | Sigma Aldrich | F2518 | Testy różnicujące |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Pasaż |
| Lodowaty kwas octowy | HiMedia | AS001 | Utrwalacz do kariotypowania |
| Glukoza | Sigma Aldrich | G7528 | Testy różnicowania |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotencja i pożywka dla embrionów |
| Heparyna sodowa | Sigma Aldrich | H3149 | Testy różnicowania |
| Roztwór insuliny ludzkiej | Sigma Aldrich | I9278 | Testy różnicowania |
| Insulina Transferyna Selenit | Sigma Aldrich | I1884 | Testy różnicujące |
| Zestaw KAPA HiFi PCR | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Zatrzymanie mitotyczne do kariotypowania |
| Nokaut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotencja i zarodek |
| podłoże KnockOut Wymiana surowicy | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pożywka dla pluripotencji i zarodków |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Oczyszczanie plazmidu |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Testy różnicowania |
| MEM Aminokwasy endogenne | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotencja i pożywka dla embrionów |
| Metanol | HiMedia MB113 | Utrwalacz do kariotypowania | |
| Miozyna komorowy łańcuch ciężki &alfa;/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemia |
| NHDF Zestaw nukleofektorów | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofekcja |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Mocowanie komórek |
| pCXLE-hOCT3/ 4-SHP53-F | Addgene | 27077 | Przeprogramowanie epizodyczne Plazmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Plazmid przeprogramowania epizodycznego |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Przeprogramowanie episomalne Penicylina plazmidowa |
| Streptomycyna | Thermo Fisher Naukowy, | 15070063 | Pluripotencja i pożywka dla embrionów |
| Phalloidyna- Tetrametylorodamina B izotiocyjanian | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemia |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tabletka PBS rozpuszczona w 200 ml wody dejonizowanej i wysterylizowana w autoklawie Przechowywanie: Temperatura pokojowa. PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS. Przechowywanie: Temperatura pokojowa. |
| Zestaw do oczyszczania plazmidu - Midi prep | QIAGEN | 12143 | Oczyszczanie plazmidu |
| Roztwór chlorku potasu | HiMedia | MB043 | Hipotoniczny roztwór do kariotypowania |
| QIAamp DNA Zestaw krwi | Qiagen | 51104 | Izolacja genomowego DNA |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Pożywka do różnicowania hepatocytów |
| Cytrynian sodu | HiMedia | RM255 | Hipotoniczny roztwór do kariotypowania |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilizacja |
| Trypsyna-EDTA (0,05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subkultura fibroblasty kosmków kosmówkowych płodu |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Przygotowanie PBST& |
| beta; III tubulina | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemia |
| Y-27632 dichlorowodorek | Sigma Aldrich | Y0503 | Testy różnicujące |
Bibliografia
- Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
- Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
