Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62240

⸱

4 grudnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje generowanie wolnych od integracji iPSC z fibroblastów tkanek płodu poprzez dostarczanie plazmidów epizodycznych przez nukleofekcję, a następnie opisuje metody używane do charakterystyki iPSC i różnicowania neuronów.

Streszczenie

Aneuploidie chromosomowe powodują poważne wady wrodzone, w tym wady rozwojowe ośrodkowego układu nerwowego i śmierć płodu. Prenatalne badania genetyczne mają charakter czysto diagnostyczny i nie wyjaśniają mechanizmu choroby. Chociaż komórki z płodów aneuploidalnych są cennym materiałem biologicznym zawierającym aneuploidię chromosomową, komórki te żyją krótko, co ogranicza ich wykorzystanie w dalszych eksperymentach badawczych. Generowanie modeli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) jest skuteczną metodą przygotowania komórek do wiecznego zachowania cech aneuploidalnych. Są samoodnawiające się i różnicują w wyspecjalizowane komórki, co przypomina rozwój embrionalny. W związku z tym iPSC służą jako doskonałe narzędzia do badania wczesnych zdarzeń rozwojowych. Zespół Turnera (TS) jest rzadkim schorzeniem związanym z całkowitym lub częściowym brakiem chromosomu X. Zespół charakteryzuje się niepłodnością, niskim wzrostem, zaburzeniami endokrynologicznymi, metabolicznymi, autoimmunologicznymi i sercowo-naczyniowymi oraz defektami neuropoznawczymi. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę fibroblastów z tkanki płodowej TS (45XO), generowanie wolnych od integracji TSiPSC poprzez dostarczenie plazmidów przeprogramowujących epizodyczne przez nukleofekcję, a następnie charakteryzację. Przeprogramowanie TSiPSC poddano początkowo badaniom przesiewowym za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną żywych komórek, a następnie przeprowadzono szeroko zakrojone badania pod kątem biomarkerów pluripotencji. Wybrane kolonie poddano mechanicznej sekcji, kilkukrotnej pasażacji, a do dalszych eksperymentów wykorzystano stabilne, samoodnawiające się komórki. W komórkach stwierdzono ekspresję czynników transkrypcyjnych pluripotencji OCT4, NANOG, SOX2, markerów powierzchniowych komórek SSEA 4 i TRA1-81 typowych dla pluripotencjalnych komórek macierzystych. Oryginalny kariotyp 45XO został zachowany po przeprogramowaniu. TSiPSC były zdolne do tworzenia ciał zarodkowych i różnicowania się w komórki endodermy, mezodermy i ektodermy wyrażające biomarkery specyficzne dla linii ((SRY BOX17), (MIOZYNOWY KOMOROWY ŁAŃCUCH CIĘŻKI α/β), (βIII TUBULINA)). Egzogenne plazmidy episomalne zostały utracone spontanicznie i nie zostały wykryte po pasażie 15 w komórkach. Te TSiPSC są cennym zasobem komórkowym do modelowania wadliwego rozwoju molekularnego i komórkowego powodującego deficyty neurokognitywne związane z zespołem Turnera.

Wprowadzenie

Aneuploidie prowadzą do wad wrodzonych/wad wrodzonych i utraty ciąży u ludzi. ~50%-70% próbek z powodu utraty ciąży wykazuje nieprawidłowości cytogenetyczne. Zarodki aneuploidalne utracone we wczesnym okresie ciąży nie mogą być łatwo pozyskane do analizy eksperymentalnej, co rodzi potrzebę opracowania innych modeli ściśle reprezentujących ludzką embriogenezę. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z komórek, u których zdiagnozowano zaburzenia genetyczne, wykorzystano do modelowania reprezentatywnych nieprawidłowości genetycznych i ich wpływu na rozwój płodu1,2,3,4. Te iPSC przypominają komórki epiblastu rozwijającego się zarodka i mogą podsumowywać wczesne zdarzenia tworzenia się zarodka. Pozwalają one zrozumieć i scharakteryzować program rozwojowy linii komórkowych i wzorce we wczesnych zarodkach ssaków. iPSC pochodzące wcześniej z fibroblastów skóry i amniocytów z prenatalnych testów diagnostycznych zespołów aneuploidalnych, takich jak monosomia X (zespół Turnera), trisomia 8 (zespół Warkany'ego 2), trisomia 13 (zespół Pataua) i częściowa trisomia 11; 22 (zespół Emanuela) dostarczyły cennych spostrzeżeń na temat nieudanego rozwoju4.

Zespół Turnera (TS) jest rzadkim schorzeniem charakteryzującym się niepłodnością kobiet, niskim wzrostem, zaburzeniami endokrynologicznymi i metabolicznymi, zwiększonym ryzykiem chorób autoimmunologicznych oraz predyspozycjami do chorób sercowo-naczyniowych5. Chociaż jest to jedyny możliwy do przeżycia zespół monosomii, jest on również śmiertelny dla rozwijającego się zarodka, powodując samoistne poronienia6. Osoby, które przeżyły z TS, mają różne zmiany materiału chromosomu X w swoich komórkach. Kariotypy wahają się od całkowitej utraty jednego chromosomu X (45,XO) do mozaik, takich jak 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, obecność chromosomów pierścieniowych, obecność materiału chromosomu Y, itd5.

Diagnoza zespołu jest zazwyczaj przeprowadzana poprzez kariotypowanie krwi osób z objawami i pobieranie próbek kosmówek (CVS) w celu wykrycia wczesnych zespołów aneuploidii. Ponieważ zespoły aneuploidii stanowią ~ 30% poronień spontanicznych, rutynowe jest kariotypowanie produktu poczęcia (POC) po poronieniu spontanicznym. Te komórki płodowe, w tym kosmki kosmówkowe posiadające nieprawidłowości cytogenetyczne i pochodzące z nich iPSC, stanowią cenne źródło materiału biologicznego do badania zespołów aneuploidii4,6. TS iPSC zostały wcześniej utworzone z amniocytów poprzez retrowirusowe przeprogramowanie4, fibroblasty kosmków kosmówkowych (uzyskane w diagnostyce prenatalnej) poprzez retrowirusowe przeprogramowanie6, z komórek jednojądrzastych krwi7 poprzez przeprogramowanie wirusa Sendai oraz z fibroblastów skóry osób z TS poprzez przeprogramowanie lentiwirusowe4. Ponieważ głównym celem naszego laboratorium jest zrozumienie niepowodzeń rozwojowych, wygenerowaliśmy TS iPSC z POC, a konkretnie komponent kosmków kosmówkowych samoistnego poronienia8. Wszystkie komórki wyizolowane z tej tkanki płodowej miały kariotyp 45XO i dały iPSC o tym samym kariotypie. Te iPSC są wyjątkowe, ponieważ są pierwszymi, które są generowane z abortowanego płodu i stanowią cenne źródło do badania niepowodzeń ciąży związanych z aneuploidią. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię generowania iPSC z tego unikalnego źródła komórek poprzez przeprogramowanie episomalne.

Wczesne metody generowania iPSC wykorzystywały transdukcję wirusa i transpozony do dostarczania czynników przeprogramowujących. Metody indukowania komórek do pluripotencji ewoluowały od stosowania integrujących wektorów retrowirusowych9, wektorów lentiwirusowych podlegających akcyzie10,11 i metod opartych na transpozonach12 do nieintegrujących wektorów adenowirusowych13 i wektorów opartych na wirusie Sendai14. Przeprogramowanie oparte na retrowirusach i lentiwirusach, choć skuteczne, obejmuje integrację czynników przeprogramowujących z chromosomami gospodarza, powodując mutacje insercyjne, które mają nieprzewidziane skutki w iPSC. Co więcej, przeprogramowanie oparte na wirusach zapobiega translacyjnemu zastosowaniu iPSC. Systemy oparte na RNA15 i bezpośrednie dostarczanie białek16 zostały zbadane w celu całkowitego wyeliminowania potencjalnych zagrożeń związanych z użyciem wirusów i transfekcji DNA. Jednak te metody okazały się nieskuteczne.

W 2011 roku, Okita i wsp. poinformowali o poprawie efektywności przeprogramowania za pomocą plazmidów episomalnych wzmocnionych supresją TP53 przez shRNA. Zastąpili również cMYC nietransformującym LMYC (MYC związanym z drobnokomórkowym rakiem płuca) w celu zwiększenia bezpieczeństwa hiPSC. Te plazmidy episomalne wyrażają 5 czynników przeprogramowujących: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC i shRNA dla TP5317,18. Wektory te są utrzymywane poza chromosomem i tracone z przeprogramowanych komórek po ciągłej hodowli, dzięki czemu linie są wolne od transgenów w ciągu 10-15 pasaży. Nukleofekcja to wyspecjalizowana forma elektroporacji, która dostarcza kwasy nukleinowe bezpośrednio do jądra komórek gospodarza. Jest to skuteczna metoda dostarczania plazmidów przeprogramowujących do różnych typów komórek. Plazmidy episomalne są opłacalne i rekompensują wysokie koszty nukleofekcji. Metoda ta jest skuteczna i powtarzalna w zoptymalizowanych warunkach, dając stabilne iPSC z różnych komórek somatycznych. W niniejszym protokole opisano metodę wytwarzania iPSC z fibroblastów wyizolowanych z tkanki płodu poprzez nukleofekcję plazmidów przeprogramowujących episomalne. Oto szczegółowe protokoły izolacji fibroblastów z kosmków kosmówkowych płodu, oczyszczania plazmidu, nukleofekcji, pobierania kolonii z płytki przeprogramowującej i tworzenia stabilnych iPSC.

Konieczne jest potwierdzenie obecności cech pluripotencji w nowo wygenerowanych iPSC. Obejmuje to wykazanie czynników związanych z pluripotencją (np. ekspresja fosfatazy alkalicznej, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-kadheryna; zwykle wykazywane za pomocą testów immunofluorescencyjnych lub ekspresji genów), identyfikację trzech listków zarodkowych za pomocą testów różnicowania in vitro w celu potwierdzenia ich potencjałów różnicowania, kariotypowanie w celu określenia zawartości chromosomów, typowanie STR w celu ustalenia tożsamości z komórkami rodzicielskimi, weryfikacja utraty genów egzogennych, oraz bardziej rygorystyczne testy in vivo, takie jak tworzenie potworniaków i komplementacja tetraploidalna. Tutaj opisujemy protokoły charakterystyki kariotypowania, barwienia fosfatazą alkaliczną żywych komórek, wykrywania biomarkerów związanych z pluripotencją za pomocą immunofluorescencji, testów różnicowania in vitro oraz metody wykazywania utraty genów egzogennych19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

FCV zostały uzyskane ze Szpitala Manipal w Bengaluru, za zgodą Komitetu Etyki Szpitali Manipal.

UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się ze składem wszystkich i roztworów.

1. Izolacja fibroblastów z płodowych kosmków kosmówkowych (FCV)

  1. Pobieranie próbek i rozpad tkanek w kolagenazie
    1. Zebrać FCV w sterylnych warunkach w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przetransportować (w temperaturze pokojowej) do zakładu hodowli komórkowej.
    2. Przenieść kosmki na szalkę Petriego o średnicy 60 mm i umyć kilkakrotnie (minimum 4 razy) w PBS zawierającym 1x Antybiotyk Przeciwgrzybiczy Roztwór (PBS-AA). Całkowicie usunąć PBS-AA przez pipetowanie.
    3. Kosmki kosmówkowe należy traktować 1 ml mieszanki kolagenazy (5 mg/ml) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Zneutralizować pożywką do hodowli komórkowych zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), przenieść trawienie do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 225 x g przez 5 minut, aby zebrać rozpadnięte kosmki i uwolnione komórki w postaci osadu.
  2. Subkultura i ekspansja stada
    1. Płytka rozpadła się na płytki wraz z uwolnionymi komórkami w kolbie hodowlanej T25 zawierającej 5 ml kompletnej pożywki (np. AmnioMAX) i rosła aż do uzyskania zlewającej się hodowli fibroblastów.
    2. Rozszerz fibroblasty w kulturze, aby przygotować zapasy do użycia w kolejnych eksperymentach transfekcji i charakterystyki w następujący sposób:
      1. Dodać 2 ml 0,05% trypsyny do kolby T25 zawierającej fibroblasty FCV i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut w celu dysocjacji komórek.
      2. Po inkubacji zneutralizować trypsynę, dodając FBS (w tej samej objętości co trypsyna).
        UWAGA: Pożywka hodowlana zawierająca FBS może być również używana do neutralizacji trypsyny, gdy jest dodana w stosunku 1:3 trypsyna do podłoża.
      3. Zebrać zdysocjowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 225 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.
      4. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki.
      5. Przenieść po 500 μl na 60-milimetrowe szalki poddane działaniu kultur tkankowych i uzupełnić objętość do 5 ml. Ów stosunek rozszczepienia wynoszący 1:2 był też używany dla kolejnych fragmentów.
  3. Kriokonserwacja
    1. Przeprowadzić dysocjację enzymatyczną przy użyciu 0,05% trypsyny, jak opisano w krokach 1.2.2.1 - 1.2.2.3 i uzyskać osad komórkowy.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml mieszanki zamrażającej, zawierającej dimetylosulfotlenek dimetylu (DMSO) w stosunku 1:9: FBS.
    3. Przenieść zawartość do sterylnego kriowialnego i umieścić fiolkę w pojemniku do zamrażania.
    4. Zamrozić przez noc w temperaturze -80 °C, a następnie przenieść fiolki do ciekłego azotu (-196 °C) następnego dnia.

2. Izolacja i weryfikacja DNA plazmidów

  1. Przygotowanie komórek bakteryjnych
    1. Smugowe zapasy glicerolu E. coli zawierające trzy pojedyncze plazmidy pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK i pCXLE-hUL (z Addgene) na oddzielnych płytkach agarowych Luria Bertani-ampicillin.
    2. Zaszczepić pojedyncze kolonie w kulturach starterowych zawierających 5 ml pożywki Luria Bertani-ampicylina. Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (10 x g).
    3. Zaszczepić 200 μl tej kultury starterowej w 100 ml pożywki Luria Bertani-ampicillina. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
    4. Zbierać kulturę bakteryjną przez noc, wirując przy 6000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Izolacja plazmidu za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu Midi
    1. Zawiesić osad bakteryjny w 4 ml buforu do sporządzania zawiesiny.
    2. Dodać 4 ml buforu do lizy i dokładnie wymieszać, energicznie odwracając 4-6 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Dodaj 4 ml wstępnie schłodzonego buforu neutralizacyjnego i odwróć probówkę 4-6 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować na lodzie przez 15 minut.
    4. Wirować w temperaturze ≥20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant do świeżej probówki i ponownie odwirować w temperaturze ≥20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Zrównoważyć kolumnę, nakładając 4 ml buforu równoważącego.
    6. Nałożyć supernatant na kolumnę.
    7. Przemyć kolumnę dwukrotnie 10 ml buforu do przemywania wodą.
    8. Eluować DNA za pomocą 5 ml ciepłego (65 °C) buforu elucyjnego.
    9. Wytrącić DNA, dodając 3,5 ml izopropanolu do wymytego DNA. Dobrze wymieszaj. Wirować przy ≥15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant.
    10. Przemyć osad DNA 2 ml 70% etanolu i odwirować przy ≥15 000 x g przez 10 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant.
    11. Suszyć na powietrzu przez 5-10 min i rozpuścić DNA w odpowiedniej objętości wody klasy PCR, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/mL.
      UWAGA: Nie rozpuszczaj DNA w, ponieważ nie nadaje się do elektroporacji. Stary preparat plazmidowego DNA nie daje przeprogramowanych kolonii.
  3. Weryfikacja plazmidu za pomocą trawienia restrykcyjnego EcoRI
    1. Połącz 15 μl wody wolnej od nukleaz, 2 μl 10x buforu, 1 μg plazmidowego DNA i 1 μl enzymu EcoRI. Delikatnie wymieszaj.
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut w bloku grzewczym.
    3. Wymieszaj strawione próbki plazmidu z 6x barwnikiem ładującym żel DNA i elektroforezą na 1% żelu agarozowym w 1x buforze TAE z 0,5 μg / ml bromku etydyny. Dołącz standardową drabinę DNA. Wyobraź sobie żel po odpowiednim ustąpieniu DNA. Oczekiwane rozmiary pasm EcoRI pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F wynoszą 6,834 pz, 3,758 pz i 1,108 pz; pCXLE-hUL wynoszą 10 200 pz i 1 900 pz; pCXLE-hSK wynoszą 10 200 pz i 2 500 pz.

3. Nucleofekcja

  1. Granulowanie komórek
    1. Hodowla izolowanych fibroblastów kosmków kosmówkowych płodu w kolbie T25 w 5 ml kompletnej pożywki do 80-90% zgrywu.
    2. Umyj komórki dwukrotnie PBS i trypsynizuj zgodnie z opisem w krokach 1.2.2.1 - 1.2.2.3.
    3. Usunąć supernatant, zawiesić osad w 5 ml zredukowanej pożywki surowicy (np. Opti-MEM). Policz komórki za pomocą hemocytometru i weź 106 komórek do nukleofekcji. Wirować przy 225 x g przez 5 min. Całkowicie usunąć supernatant.
  2. Przygotowanie odczynnika i nukleofekcja
    1. Przygotuj odczynnik nukleofektorowy, mieszając 0,5 ml suplementu i 2,25 ml roztworu nukleofektora (oba znajdują się w zestawie).
    2. Dodać 100 μl roztworu nukleofektora do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać po 1 μg pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK i pCXLE-hUL do probówki. Delikatnie ponownie wymieszaj 106 komórek (z kroku 3.1.2) w tej mieszance.
    3. Przenieś zawiesinę komórka-DNA do kuwety, upewniając się, że próbka pokrywa dno kuwety (dostarczonej w zestawie) bez żadnych pęcherzyków powietrza. Zakręć kuwetę i włóż do uchwytu. Wybierz program nucleofector U-23 (dla wysokiej wydajności) i zastosuj.
    4. Wyjmij kuwetę z uchwytu i dodaj 1 ml kompletnej pożywki. Delikatnie przenieść zawartość na szalkę Petriego poddaną działaniu kultur tkankowych o średnicy 60 mm, wypełnioną 4 ml kompletnej pożywki (w sumie 5 ml pożywki). Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    5. Po 24 godzinach sprawdź, czy ogniwa są przyczepione. Całkowicie wymień podłoże.
      UWAGA: Tempo śmierci komórki jest wysokie w nukleofekcji, pozostawiając niewiele żywotnych komórek, które się przyłączają.
    6. Utrzymuj komórki w kompletnych pożywkach przez 10 dni i przejdź na pożywki pluripotencjjne przez następne 20 dni.
      UWAGA: Regularnie wizualizuj komórki, aby śledzić zmiany morfologiczne zachodzące w przeprogramowujących się komórkach (takie jak morfologia nabłonka i tworzenie zwartych kolonii), aby potwierdzić, czy eksperyment działa. Po 20 dniach hodowli w pożywkach pluripotencjjnych można zobaczyć około 25 kolonii iPSC.

4. Zbieranie i rozmnażanie kolonii iPSC

  1. Pobieranie kolonii z płytki przeprogramowującej
    1. Ręcznie wypreparować kolonie podobne do embrionalnych komórek macierzystych utworzone w naczyniu do przeprogramowywania za pomocą wyciągniętych szklanych pipet lub igieł strzykawkowych o pojemności 1 ml i przenieść na wcześniej przygotowaną płytkę z inaktywowanymi mysimi karmownikami zarodkowymi z pożywką pluripotencji lub ustalić kultury wolne od karmnika na płytkach pokrytych Matrigelem z mTESR medium.
      UWAGA: Mysie fibroblasty embrionalne (MEF) uzyskano za pomocą enzymatycznej izolacji z zarodków myszy (wypreparowanych od samic myszy w 13-14 dniu ciąży) i zostały mitotycznie dezaktywowane przez leczenie mitomycyną C. Ustal pojedyncze populacje klonów, hodując pojedyncze kolonie z przeprogramowania płytki w oddzielnych naczyniach lub mieszane populacje klonów, przenosząc wiele kolonii z płytki przeprogramowującej na pojedynczą szalkę.
  2. Mechaniczne przenoszenie pojawiających się kolonii do świeżych karmników i pasażowanie w celu wytworzenia stabilnych iPSC
    1. Rozmnażaj iPSC w pożywce pluripotencjjnej, karmiąc co drugi dzień i dzieląc 1:3 co 5-7 dni. Przygotuj wywar poprzez kriopkonserwację w zamrażającej mieszance KnockOut Serum Replacement i DMSO w stosunku 9:1,
      UWAGA: KnockOut Serum Replacement jest stosowany w mieszance zamrażającej do kriokonserwacji iPSC zamiast FBS, ponieważ składniki FBS mogą indukować różnicowanie komórek pluripotencjalnych podczas długotrwałej konserwacji.

5. Charakterystyka iPSC

UWAGA: Badania charakteryzacyjne, w tym PCR i barwienie immunologiczne dla biomarkera pluripotencji, zostały przeprowadzone po piątym numerze pasażu. Kariotypowanie wykonano przy późniejszym numerze pasażu.

  1. Kariotypowanie
    1. Na zlewającej się 60-milimetrowej szalce Petriego z iPSC należy poddawać działaniu colcemidu przez 45 minut w wilgotnym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    2. Zbierz przez 0,05% leczenie trypsyną i odwirowanie. Usunąć supernatant i odpipetować pozostałe ślady pożywki, aby poluzować osad komórkowy.
    3. Dodaj 5 ml roztworu hipotonicznego. Wymieszać za pomocą probówki odwracającej i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Wirować przy 225 x g przez 5 min.
      UWAGA: Uzyskany pellet powinien wydawać się puszysty.
    4. Powoli dodawaj 2,5 ml roztworu utrwalającego Carnoya, stukając, aby poluzować granulkę.
    5. Przygotuj spready do kariotypowania, upuszczając zawiesinę komórek na czyste szkiełka podstawowe.
    6. Potraktuj szkiełka 0,15% trypsyny przez 1 minutę i umyj raz PBS. Następnie bejcuj roztworem Giemsy przez 4 minuty i zakończ płukaniem wodą destylowaną. Nabywaj i przetwarzaj za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  2. Demonstracja statusu wolnego od transgenu
    1. Izolacja genomowego DNA
      1. Pobrać pipetą 20 μl proteazy na dno probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      2. Dodać 200 μl TSiPSC zawieszonych w PBS do probówki mikrowirówkowej.
      3. Dodać 200 μl buforu AL do próbki i mieszać przez 15 s przez pulsacyjne wirteksowanie.
      4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 56 °C.
      5. Krótko odwiruj probówkę do mikrowirówki, aby usunąć krople z wnętrza pokrywki.
      6. Dodać 200 μl etanolu (96-100%) do próbki i ponownie mieszać przez 15 sekund przez pulsacyjne wirteksowanie. Po wymieszaniu krótko odwiruj probówkę, aby usunąć krople z wnętrza pokrywki.
      7. Ostrożnie nałóż mieszaninę z poprzedniego kroku na mini kolumnę wirującą (w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml) bez zwilżania obręczy. Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6000 x g przez 1 min. Wyrzucić probówkę zawierającą filtrat i umieścić mini kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
      8. Ostrożnie otwórz mini kolumnę wirującą i nie zwilżając obręczy, dodaj 500 μl buforu AW1. Zamknij nakrętkę i odwiruj przy 6000 x g przez 1 min. Umieść mini kolumnę wirową w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzuć probówkę zbiorczą zawierającą filtrat.
      9. Ostrożnie otwórz mini kolumnę wirującą i dodaj 500 μl buforu AW2 bez zwilżania obręczy. Zamknij nakrętkę i odwiruj z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty.
      10. Umieść mini kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzuć starą probówkę zbiorczą wraz z filtratem. Wirować z pełną prędkością przez 1 minutę, aby wyeliminować możliwość ewentualnego przeniesienia buforu AW2.
      11. Umieść mini kolumnę wirową w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wyrzuć probówkę zbiorczą zawierającą filtrat. Ostrożnie otwórz mini kolumnę wirową i dodaj 200 μl buforu AE lub wody destylowanej. Inkubować w temperaturze pokojowej (15-25 °C) przez 5 minut, a następnie wirować przy 6000 x g przez 1 minutę.
    2. Status wolny od transgenu PCR (przy użyciu zestawu KAPA HiFi PCR KR0368)
      1. Upewnij się, że wszystkie odczynniki są odpowiednio rozmrożone i wymieszane.
      2. Przygotować główną mieszaninę PCR zawierającą odpowiednią objętość wszystkich składników reakcji w oparciu o tabelę 2 (ustawić reakcje na lodzie).
      3. Przenieś odpowiednie objętości głównej mieszanki PCR, matrycy i startera do poszczególnych probówek PCR.
      4. Zakryj poszczególne reakcje, wymieszaj i krótko odwiruj.
      5. Przeprowadzić PCR zgodnie z tabelą 3.
  3. Identyfikacja biomarkerów pluripotencji
    1. Barwienie fosfatazą alkaliczną (AP)
      1. Przygotuj 1x AP roztwór do barwienia na żywo, rozcieńczając 3 μl 500x roztworu podstawowego w 1,5 ml DMEM/F-12 na każde 10cm2 obszaru hodowli.
      2. Usunąć pożywkę z naczynia do hodowli iPSC. Umyj kulturę za pomocą DMEM/F-12 raz. Dodaj 1x roztwór żywej plamy AP na iPSC. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
      3. Usuń plamę AP i umyj dwukrotnie DMEM/F-12. Dodaj świeży DMEM/F-12 i zobrazuj pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą standardowego filtra FITC w ciągu 30-90 minut od barwienia.
    2. Barwienie immunologiczne biomarkerów pluripotencji
      1. Utrwalić zlewające się kultury iPSC za pomocą 4% paraformaldehydu przez noc w temperaturze 4 °C. Umyć trzykrotnie PBS Tween 20 (PBST), każde pranie przez 5 minut.
      2. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,3% Triton X-100 w PBST przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyć trzykrotnie PBST.
        UWAGA: Permeabilizację należy wykonywać tylko dla antygenów wewnątrzkomórkowych.
      3. Blokować komórki z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wybarwić komórki przeciwciałami pierwszorzędowymi (rozcieńczonymi w stosunku 1:1000 w 1% BSA) przez noc. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć trzykrotnie PBST.
      4. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym (rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w 1% BSA) przez 5 godzin w temperaturze pokojowej. Umyć trzykrotnie PBST.
      5. Oznaczyć jądra 0,5 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) przez 1 minutę. Umyj komórki raz za pomocą PBST.
      6. Rób obrazy pod mikroskopem fluorescencyjnym.

6. Testy różnicowania in vitro

  1. Różnicowanie ciała zarodka (EB)
    1. Pokrój kolonie iPSC na małe kawałki, zbierz i ułóż na płytkach Petriego o niskim mocowaniu w pożywce dla ciała zarodka. Hoduj komórki przez 15 dni, wymieniając pożywkę co 3 dni.
      UWAGA: EB z dnia 15 można wykorzystać bezpośrednio do wykrywania trzech biomarkerów listka zarodkowego. Alternatywnie, określone linie komórkowe mogą być indukowane za pomocą czynników wzrostu, a następnie wykrywanie biomarkerów.
  2. Różnicowanie endodermy (hepatocytów)
    1. Hoduj iPSC w kulturach jednowarstwowych w pożywce pluripotencji.
    2. Po zlaniu się przejdź na pożywkę RPMI 1640 z 1x seleninem transferyny insuliny i 100 ng/ml aktywiny A przez 2 dni, a następnie wzrost w pożywce RPMI 1640 z 30 ng/ml bFGF i 20 ng/ml BMP4 przez 9 dni. Wymieniaj podłoże co 2 dni.
    3. Począwszy od 10 dnia, należy uzupełniać pożywkę 0,1 μM deksametazonem. Zakończ eksperyment w 20 dniu.
  3. Różnicowanie mezodermy (kardiomiocytów)
    1. Dzień płytki 8 EB na 0,5% płytkach pokrytych Matrigelem w pożywce z ciała zarodka. Zezwól na dołączanie i zwijanie elementów EB.
    2. Uzupełnij pożywkę 20 ng/ml BMP4 i hoduj przez 20 dni. Wymieniaj podłoże co 2-3 dni. Zakończ eksperyment w 20 dniu.
  4. Różnicowanie ektodermiczne (neuronalne)
    1. Dzień płytki 4 EB na 2 μg/cm2 płytkach pokrytych kolagenem typu IV w pożywce dla ciała zarodka. Zezwól na dołączanie i zwijanie elementów EB.
    2. Następnego dnia zmień pożywkę na DMEM F-12 z 2 mg / ml glukozy, 1x seleninem transferyny insuliny i 2,5 μg / ml fibronektyny. Zakończ eksperyment w 15 dniu.
  5. Powstawanie organoidów mózgowych
    1. Hoduj TSiPSC w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm na MEF-ach do 70-80% zlewania się. Pokrój kolonie i zbierz je do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 225 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    2. Umyj kawałki kolonii przez ponowne zawieszenie w 2 ml PBS i odwiruj w celu usunięcia supernatantu.
    3. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny i postukaj w probówkę, aby usunąć komórki. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 3-4 minuty w celu dysocjacji fragmentów kolonii na zawiesinę pojedynczej komórki.
    4. Zneutralizuj trypsynę przez rozcieńczenie 4 ml pożywki pluripotencji zawierającej 10 μg/ml inhibitora kinazy białkowej (ROCK) inhibitora dichlorowodorku Y-27632 (ROCKi), aby zapobiec śmierci komórki wywołanej dysocjacją.
    5. Odwirować w celu uzyskania osadu. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki dla ciała zarodka zawierającej 10 μg/ml ROCKi.
    6. Usunąć 10 μl zawiesiny komórek w celu zliczenia komórek. Dodaj 10 μl błękitu trypanowego, aby wykryć martwe komórki. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    7. Dodać odpowiednią objętość pożywki z ciałem zarodka z ROCKi do zawiesiny komórek, aby uzyskać 9 000 żywych komórek na 150 μl.
    8. Umieścić 150 μl w każdym dołku na 96-dołkowej płytce o niskim stopniu przyłączenia i inkubować w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach sprawdzić płytki pod kątem agregacji. W dniu 2 delikatnie usunąć pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką embrionoidalną bez ROCKi.
    9. W dniu 6 przenieś EB do studzienek z 24-dołkową płytką o niskim przyłączeniu zawierającą 500 μl pożywki do indukcji neuronalnej składającej się z DMEM-F12 z 1% suplementem N2, 2 mM suplementu GlutaMAX i 1 mM aminokwasów endogennych i 1 μg / ml heparyny. Zmieniaj podłoże co 2 dni.
    10. Po 5 dniach w pożywce do indukcji neuronów osadź agregaty neuroepitelialne w Matrigel, nakładając warstwę kwadratu parafilmu o wymiarach 2 cm x 2 cm na pustą tackę z końcówkami o pojemności 200 μl. Dociśnij parafilm palcami w rękawiczkach do każdego otworu w tacce na końcówki, aby zrobić małe wgniecenia. Czysty parafilm z 70% etanolem do sterylizacji.
    11. Przenieś kwadrat parafilmu do naczynia o średnicy 60 mm. Użyj przyciętych końcówek o pojemności 200 μl, aby przenieść agregaty neuronabłonkowe na wgniecenia w parafilmie. Usunąć nadmiar pożywki za pomocą pipetowania.
    12. Dodać 30 μl rozmrożonego Matrigelu na agregaty neuroepitlialne i umieścić agregat do środka Matrigelu za pomocą końcówki pipety. Umieścić szalkę o średnicy 60 mm na 20-30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby Matrigel uległ polimeryzacji.
    13. Dodać 5 ml pożywki do różnicowania organoidów mózgowych składającej się z 1:1 DMEM-F12: pożywka neurobazalna, 0,5% suplementu N2, 2,5 μg/ml insuliny, 2 mM suplementu GlutaMAX, 0,5 mM NEAA, 1% suplementu B27 i 2,5 ml penicyliny-streptomycyny.
    14. Za pomocą sterylnych kleszczy odwróć arkusz parafilmu i mieszaj naczynie, aż agregaty osadzone w Matrigel spadną z arkusza do podłoża. Osadzone agregaty hodować w nawilżonym inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 4 dni, zmieniając pożywkę co drugi dzień.
    15. Po 4 dniach hodowli statycznej umieścić szalki o średnicy 60 mm na wytrząsarce orbitalnej zainstalowanej wewnątrz inkubatora, wytrząsającej z prędkością 50 obr./min. Hoduj organoidy przez 3 miesiące, uzyskując całkowite zmiany w pożywce z mózgową pożywką różnicującą organoidy co 3 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowanie wolnych od integracji iPSC z płodu po samoistnym poronieniu z kariotypem 45XO
Wyizolowano fibroblasty z FCV z kariotypem 45XO charakterystycznym dla zespołu Turnera (TS) i poddano je nukleofekcji episomalnymi plazmidami reprogramującymi w celu wygenerowania TSiPSC, które mogą być wykorzystane do dalszego modelowania zespołu, a w szczególności związanych z nim deficytów neurologicznych (Rycina 1a&b). Do eksperymentów z transfekcją wykorzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie stabilnych modeli komórkowych cytogenetycznie nieprawidłowej tkanki płodu jest niezbędne do utrwalenia wadliwego fenotypu. Droga iPSC jest najskuteczniejszą metodą przygotowania komórek do wiecznej konserwacji wadliwych właściwości20.

Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) wykazują właściwości samoodnawiania i różnicowania się w wyspecjalizowane komórki, przypominające zarodki o wczesnym rozszczepieniu21. W związku z tym PSC mogą ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie finansowe dla powyższych badań zostało zapewnione przez Manipal Academy of Higher Education. Charakterystykę linii przeprowadzono częściowo w laboratorium M. M. Panickera z NCBS. Dziękujemy Laboratorium Diagnostycznemu Anand za pomoc w kariotypowaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,15% trypsynaThermo Fisher Scientific27250018G Banding
2-merkaptoetanolThermo Fisher Scientific21985023Pluripotencja i pożywka dla embrionów
4', 6 diamidino-2-fenyloindolSigma AldrichD8417Immunocytochemia
Aktywina ASigma AldrichSRP3003Testy
różnicowaniaFosfataza alkaliczna Live StainThermo Fisher ScientificA14353Barwienie AP
AMAXA Nucleofector II
AmnioMAX II kompletne podłożaThermo Fisher Scientific, Gibco11269016Podłoże specyficzne dla hodowli komórek kosmków kosmówkowych płodu
AmpicylinaHiMediaTC021Oczyszczanie plazmidu
Anty mysie IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059Immunocytochemia
Anty królik IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11034Immunocytochemia
Anty królik IgG (H+L) Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunocytochemia
Antybiotyk-Antybiotyk GrzybiczeThermo Fisher Scientific, Gibco15240096Kontrola zanieczyszczeń
Anty-E-KadherynaBD Nauki biologiczne610181Immunocytochemia
Anty-NanogBD Biosciences560109Immunocytochemia
Anty-OCT3/4BD Nauki biologiczne611202Immunocytochemia
Anty-SOX17BD Biosciences561590Immunocytochemia
Anty-SOX2BD Biosciences561469Immunocytochemia
Anty-SSEA4BD Nauki biologiczne560073Immunocytochemia
Anty-TRA 1-81MiliporeMAB4381Immunocytochemia
podstawowa Czynnik wzrostu fibroblastów [FGF2]Sigma AldrichF0291Pożywka pluripotencji
Czynnik morfogenetyczny kości 4Sigma AldrichSRP3016Testy różnicujące
Bydło Albumina surowicySigma AldrichA3059Kolagen blokujący
Ludzki typ IVBD Biosciences354245Testy różnicowania
Mieszanka kolagenazySigma AldrichC8051Trawienie kosmków kosmówkowych płodu
DeksametazonSigma AldrichD4902Testy różnicujące
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033Testy różnicowania
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274Trawienie restrykcyjne
FibronektynaSigma AldrichF2518Testy różnicujące
Giemsa StainHiMediaS011G Pasaż
Lodowaty kwas octowyHiMediaAS001Utrwalacz do kariotypowania
GlukozaSigma AldrichG7528Testy różnicowania
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Pluripotencja i pożywka dla embrionów
Heparyna sodowaSigma AldrichH3149Testy różnicowania
Roztwór insuliny ludzkiejSigma AldrichI9278Testy różnicowania
Insulina Transferyna SelenitSigma AldrichI1884Testy różnicujące
Zestaw KAPA HiFi PCRKapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX ColcemidThermo Fisher Scientific15210040Zatrzymanie mitotyczne do kariotypowania
Nokaut DMEMThermo Fisher Scientific10829018Pluripotencja i zarodek
podłoże KnockOut Wymiana surowicyThermo Fisher Scientific10828028Pożywka dla pluripotencji i zarodków
Luria Bertani agarHiMediaM1151FOczyszczanie plazmidu
MatrigelBD Biosciences356234Testy różnicowania
MEM Aminokwasy endogenneThermo Fisher Scientific11140035Pluripotencja i pożywka dla embrionów
MetanolHiMedia MB113Utrwalacz do kariotypowania
Miozyna komorowy łańcuch ciężki &alfa;/βMilliporeMAB1552Immunocytochemia
NHDF Zestaw nukleofektorówLonzaVAPD-1001Nucleofekcja
Paraformaldehyd (PFA)Sigma AldrichP6148Mocowanie komórek
pCXLE-hOCT3/ 4-SHP53-FAddgene27077Przeprogramowanie epizodyczne Plazmid
pCXLE-hSKAddgene27078Plazmid przeprogramowania epizodycznego
pCXLE-hULAddgene27080Przeprogramowanie episomalne Penicylina plazmidowa
Streptomycyna  Thermo Fisher Naukowy,  15070063Pluripotencja i pożywka dla embrionów
Phalloidyna- Tetrametylorodamina B izotiocyjanianSigma AldrichP1951Immunocytochemia
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma AldrichP44171 X PBS 1 tabletka PBS rozpuszczona w 200 ml wody dejonizowanej i wysterylizowana w autoklawie
Przechowywanie: Temperatura pokojowa.
PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS.
Przechowywanie: Temperatura pokojowa.
Zestaw do oczyszczania plazmidu - Midi prepQIAGEN12143Oczyszczanie plazmidu
Roztwór chlorku potasuHiMediaMB043Hipotoniczny roztwór do kariotypowania
QIAamp DNA Zestaw krwiQiagen51104Izolacja genomowego DNA
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Pożywka do różnicowania hepatocytów
Cytrynian soduHiMediaRM255Hipotoniczny roztwór do kariotypowania
Triton X-100HiMediaMB031Permeabilizacja
Trypsyna-EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Subkultura   fibroblasty kosmków kosmówkowych płodu
Tween 20HiMediaMB067Przygotowanie PBST&
beta; III tubulinaSigma AldrichT8578Immunocytochemia
Y-27632 dichlorowodorekSigma AldrichY0503Testy różnicujące
Lonza-Nucleofection ciała

Bibliografia

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
  3. Biancotti, J. -C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
  4. Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
  5. Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
  6. Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022(2015).
  7. Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
  8. Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
  9. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  10. Soldner, F., et al. Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
  11. Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
  12. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  13. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  14. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
  15. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  16. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  17. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
  20. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  21. Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aneuploidia chromosomowagenerowanie iPSCreprogramowanie episomalneizolacja fibroblastówmarkery pluripotencjitworzenie ciał embrioidalnychróżnicowanie warstw zarodkowychdeficyty neuropoznawcze
Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.