Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) to bezradiacyjny transfer energii od wzbudzonego donora do cząsteczki akceptora i zależy od odległości i orientacji molekuł, jak również od stopnia nakładania się widm emisji donorowej i absorpcji akceptora. FRET pozwala badać interakcje białek w żywej komórce w czasie i w różnych przedziałach subkomórkowych. W literaturze opisano różne algorytmy oparte na intensywności do pomiaru FRET za pomocą mikroskopii. W tym miejscu zapewniony jest protokół i algorytm do ilościowego określenia wydajności FRET w oparciu o pomiar zarówno uczulonej emisji akceptora, jak i wygaszania cząsteczki donora. Kwantyfikacja ratiometrycznego FRET w żywej komórce wymaga nie tylko określenia przesłuchu (spektralnego rozlewania się lub krwawienia) białek fluorescencyjnych, ale także skuteczności wykrywania układu mikroskopowego. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje, jak ocenić te krytyczne parametry.
Wprowadzenie
Analiza rezonansu Förstera (FRET) oparta na mikroskopii pozwala na ocenę interakcji między białkami w żywych komórkach. Dostarcza informacji przestrzennych i czasowych, w tym informacji o tym, gdzie w komórce i w którym przedziale subkomórkowym zachodzi interakcja i czy ta interakcja zmienia się w czasie.
Theodor Förster położył teoretyczne podstawy FRET w 1948 roku1. FRET to bezpromieniowy transfer energii od wzbudzonego donora do cząsteczki akceptora i zależy od odległości cząsteczek i względnej orientacji ich dipoli przejściowych, a także nakładania się widm emisji donorowej i absorpcji akceptora. Szybkość transferu energii jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości donor-akceptor. Dzięki temu FRET może być używany do pomiaru bliskości molekularnej w zakresie 1-10 nm.
FRET konkuruje z innymi procesami de-wzbudzenia cząsteczki donorowej i powoduje tzw. wygaszanie donorów i uwrażliwianie emisji akceptora. Wygaszanie donorów to zmniejszenie liczby emitowanych fotonów donorowych, podczas gdy emisja uwrażliwiona to wzrost emitowanych fotonów akceptorowych. Wiele mikroskopowych analiz FRET wykorzystuje pomiary intensywności fluorescencji, w tym fotowybielanie akceptorowe2, fotowybielanie przez dawcę2 lub fotowybielanie uwrażliwione na FRET dla acceptor3.
Tutaj przedstawiono krok po kroku eksperymentalny protokół i algorytm matematyczny do ilościowego oznaczania FRET za pomocą hartowania donorów i emisji uwrażliwionej na akceptor4,5, metoda często określana jako ratiometryczny FRET. Opublikowano wiele protokołów dotyczących przybliżania emisji uczulonej, ale niewiele z nich określiło ilościowo bezwzględną wydajność FRET6,7,8,9. Kwantyfikacja wydajności FRET w żywej komórce wymaga określenia (i) przesłuchu (rozlanie spektralne lub krwawienie) białek fluorescencyjnych, a także (ii) skuteczności wykrywania układu mikroskopowego. Podczas gdy przesłuchy można ocenić poprzez obrazowanie komórek wyrażających tylko jeden z fluoroforów, ocena względnej skuteczności wykrywania fluorescencji dawcy i akceptora jest bardziej skomplikowana. Wymaga to znajomości co najmniej stosunku liczby cząsteczek donorowych i akceptorowych powodujących powstanie mierzonych sygnałów. Liczba fluoroforów ulegających ekspresji w żywych komórkach różni się jednak w zależności od komórki i jest nieznana. Tak zwany czynnik α charakteryzuje względną siłę sygnału z pojedynczej wzbudzonej cząsteczki donora i akceptora. Znajomość tego czynnika jest warunkiem wstępnym ilościowych pomiarów ratiometrycznych FRET w próbkach o zmiennym stosunku cząsteczek akceptorowych do donorowych, jakie występują podczas obrazowania żywych komórek za pomocą białek fluorescencyjnych. Użycie białka fuzyjnego 1 do 1 donor-akceptor jako sondy kalibracyjnej pozwala na określenie czynnika α, a także służy jako kontrola pozytywna. Ta genetycznie sprzężona sonda ulega ekspresji przez komórki w nieznanych ilościach całkowitych, ale w stałej i znanej względnej ilości jeden do jednego. Poniższy protokół określa, jak skonstruować sondę 1 do 1 i jak jej używać do ilościowego określania wydajności FRET. Arkusz kalkulacyjny, który zawiera wszystkie formuły, znajduje się w suplemencie i może być używany przez czytelników do wprowadzania własnych pomiarów w odpowiednich kolumnach, jak opisano poniżej.
Podczas gdy protokół wykorzystuje parę dawca/akceptor GFP-Cherry, przedstawione podejście można wykonać z dowolną inną parą FRET. Plik uzupełniający 1 zawiera szczegółowe informacje na temat par niebieskozielo-żółtych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Konstrukcja plazmidu
- W celu wygenerowania sondy fuzyjnej eGFP-mCherry1 należy użyć wektora ekspresyjnego dla komórek ssaków N1 (patrz Tabela materiałów) z wstawionym mCherry110 przy użyciu miejsc restrykcyjnych AgeI oraz BsrGI.
- Do amplifikacji eGFP11 bez kodonu stop jako fragmentu SalI-BamHI należy użyć następujących oligonukleotydów: starter N-końcowy 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' oraz starter C-końcowy 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
- Wstaw ten fragment SalI-BamHI do miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora N1, aby wprowadzić linker RNPPV (pięcioaminokwasowy) pomiędzy zielone a czerwone białko fluorescencyjne.
UWAGA: Linker ten zapewnia średnią wydajność FRET dla pary donor-akceptor GFP-Cherry na poziomie około 0,25 - 0,3 (Rysunek 1A). Wybór linkerów sztywnych12 i helikalnych13 o różnej długości w celu skalowania zmierzonych wydajności FRET był omawiany w innych publikacjach, lecz nie jest on wymagany dla naszych celów dotyczących białka fuzyjnego. W dalszej części, dla uproszczenia, będziemy nazywać białka fluorescencyjne „GFP” i „Cherry”.
2. Hodowla komórkowa i transfekcja
- Do eksperymentów FRET w pożywkach, np. pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle's media), bez czerwieni fenolowej w celu zmniejszenia fluorescencji tła, można użyć dowolnej linii komórkowej, np. komórek NRK. Z tego samego powodu zaleca się stosowanie trypsyny wolnej od czerwieni fenolowej.
- Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, należy je odczepić za pomocą 1 mL 0,05% trypsyny-EDTA, policzyć komórki w zawiesinie przy użyciu komory Neubauera i zasiać około 10 000 komórek na każdą studnię 8-studiennego szkiełka nakrywkowego z komorami; alternatywnie, z konfluentnej hodowli komórkowej w kolbie T25 można użyć 1 kropli zawiesiny komórkowej z pipety 2 mL lub 3 kropli z 5-mL zawiesiny komórkowej z konfluentnej hodowli w kolbie T12,5.
- Komórki należy hodować w 8-studiennych komorach (0,8 cm2/studnia) ze szkiełkiem nakrywkowym nr 1.0 do fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37°C i 5% CO2).
- 24 h po wysiewaniu należy przeprowadzić transfekcję komórek, używając odpowiedniego, dostępnego komercyjnie medium do transfekcji (patrz Tabela materiałów), z GFP, Cherry, mieszaniną GFP/Cherry (mieszanina 1:1, tj. 0,8 μg i 0,8 μg plazmidowego DNA GFP i Cherry) oraz chimerą GFP-Cherry.
- Do transfekcji należy użyć 5 μL odczynnika do transfekcji w 45 μL DMEM oraz 1,6 μg plazmidowego DNA. Wymieszać, delikatnie stukując probówkę do mikrowirowania.
- Po 15 min inkubacji mieszaniny w temperaturze pokojowej, należy dodać 1-2 μL mieszaniny odczynnika do transfekcji do każdej studni 8-studiennego szkiełka z komorami. Szkiełko z komorami należy przenieść z powrotem do inkubatora.
- Przed obrazowaniem żywych komórek należy odczekać 20 h od momentu transfekcji, aby umożliwić prawidłową ekspresję, zwijanie i dojrzewanie białek fluorescencyjnych, zwłaszcza fluoroforu czerwonego.
3. Obrazowanie FRET
- Obrazuj transfected cells w nawilżonej i podgrzewanej komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C. Aby zbuforować medium hodowlane do fizjologicznego pH, zastosuj gaz CO2 przy przepływie 5% lub dodaj 20 mM HEPES, aby uczynić medium niezależnym od CO2.
- Użyj konfokalnego mikroskopu laserowego. Ustaw wzbudzenie i emisję w następujący sposób, aby zoptymalizować sygnał i zminimalizować przesłuch (cross-talk).
- Do wzbudzenia GFP użyj linii 488-nm lasera argonowego, a do wzbudzenia Cherry lasera diodowego w stanie stałym 561-nm (lub lasera helowo-neonowego 543-nm, w zależności od dostępnych linii laserowych).
- W oprogramowaniu komercyjnego mikroskopu konfokalnego ustaw następujące parametry. Ustaw Lustro dichroiczne na 488/ 561, wybierając odpowiednią opcję z menu rozwijanego. Zbieraj fluorescencję, wykorzystując światło lasera 488-nm do wzbudzenia w kanale 1 poprzez pasmo emisji 505 - 530 nm (lub 505 - 550 nm), a w kanale 2 z filtrem długoprzepustowym >585 nm; do wzbudzenia w kanale 3 użyj światła lasera 561-nm z filtrem długoprzepustowym > 585 nm (wprowadź długości fal). Można również zastosować filtry pasmowe, np. 590 - 650 nm lub podobne, które mają zaletę wykluczania rozpraszania Ramanowskiego.
- Wzbudzaj sekwencyjnie oboma laserami i ustaw tryb obrazowania na Switch after each line (przełączanie po każdej linii), aby wzbudzenie obrazu o wymiarach 512 x 512 pikseli następowało naprzemiennie po każdej linii (a nie po każdej klatce, co uniemożliwiłoby wykrycie FRET ze względu na dyfuzję znakowanych białek podczas rejestracji obrazów z różnymi wzbudzeniami; kliknij odpowiedni przycisk).
- Za pomocą kliknięć przycisków ustaw krótką serię czasową trzech obrazów, aby sprawdzić, czy występuje istotny fotobleaching, a w razie potrzeby zmniejsz moc lasera. Optymalne jest fotobleaching poniżej 1%. Wysoka intensywność lasera może również prowadzić do nasycenia absorpcji, co zmniejsza pozorną wydajność FRET14. Bezpiecznie jest stosować moc lasera do 10-20 μW mierzona na soczewce obiektywu.
- W pierwszej kolejności obrazuj komórki wykazujące ekspresję konstruktu fuzyjnego GFP-Cherry. Ustaw parametry definiujące zintegrowaną w czasie intensywność lasera na piksel w obrazie konfokalnym, t.j. czas przebywania piksela (pixel dwell time) w mikrosekundach, transmisję akustooptycznego filtra strojonego (AOTF) w procentach oraz zoom.
- Obrazuj komórki, używając obiektywu olejowego 63x i ustawiając Zoom na 3x. Zapewnia to wystarczające powiększenie i rozdzielczość do obrazowania komórek w całości. Dąż do uzyskania rozmiaru piksela 70-80 nm.
- Ustaw Pixel dwell time na 2-4 μs oraz transmisję AOTF dla laserów 488-nm i 561-nm w taki sposób, aby obrazy miały dobry stosunek sygnału do szumu, bez fotobleachingu i bez pikseli wykazujących nasycenie intensywności fluorescencji. Wskazane jest dostrojenie mocy laserów 488 i 561 tak, aby poziomy sygnału w kanale 1 i kanale 3 były zbliżone.
- Ustaw Wzmocnienie fotopowielacza (tryb uśredniania) na 600-800.
- Przy tych ustawieniach obrazuj 15-20 komórek wykazujących ekspresję białka fuzyjnego GFP-Cherry. 15-20 komórek zapewnia dobrą statystykę, ograniczając jednocześnie całkowity czas sesji pomiarowej FRET do kilku godzin, co pomaga zapewnić stabilność ustawień mikroskopowych.
- Z tymi samymi ustawieniami obrazuj komórki wykazujące ekspresję GFP, Cherry, GFP i Cherry oraz komórki nietransfekowane. Szukaj komórek wykazujących ekspresję odpowiednio w kanale zielonym lub czerwonym.
- Następnie obrazuj 15-20 komórek koekspresujących białka zainteresowania sprzężone odpowiednio z GFP i Cherry. Podczas poszukiwania komórek wykazujących ekspresję unikaj długiej ekspozycji, aby nie doprowadzić do fotobleachingu białek fluorescencyjnych. Cherry wykazuje niższą fotostabilność niż GFP, a fotobleaching Cherry (akceptora) utrudnia analizę FRET.
UWAGA: Widma absorpcji i emisji GFP i Cherry przedstawiono na Supplementary Figure 1. Po pomiarach trwających 5-6 h zaleca się ponowne obrazowanie kilku komórek wykazujących ekspresję chimery GFP-Cherry na koniec sesji, aby udokumentować, że ustawienia pozostały stabilne, a wykryte wydajności FRET białka fuzyjnego GFP-Cherry nie zmieniły się znacząco w trakcie sesji obrazowania.
4. Analiza obrazu w celu wykrycia bezwzględnych wydajności FRET z wykorzystaniem gaszenia donora i emisji indukowanej
UWAGA: Poniżej przedstawiono praktyczny przewodnik krok po kroku, dotyczący sposobu wyznaczania wydajności FRET z wykorzystaniem dołączonego arkusza kalkulacyjnego (Supplementary File 2). Teorię oraz wyprowadzenie przedstawionych równań można znaleźć szczegółowo w poprzednich publikacjach4,15,16,17. Przy opisanych ustawieniach zbierane są następujące intensywności fluorescencji.
- Zmierz sygnał donora I1 w kanale 1 (kanale donora), przy wzbudzeniu 488 nm i pasmie emisji 505-530 nm.
gdzie ID to nieugaszony sygnał donora w kanale 1, który zostałby zmierzony w obecności akceptora, średnia wydajność FRET oraz B1 to średni sygnał tła w kanale 1. - Zmierz sygnał akceptora I3 w kanale 3 (kanale akceptora), przy wzbudzeniu 561 nm i emisji >585 nm.
gdzie IA to sygnał akceptora, a B3 to tło w kanale 3. - Zmierz sygnał FRET w kanale 2 (kanale transferu), przy wzbudzeniu 488 nm i emisji >585 nm.
Sygnał w kanale 2 jest sumą czterech różnych komponentów: (i) ID(1 - E)S1 to prześwit widmowy (spectral spill over) z ugaszonego sygnału donora do kanału detekcji >585 (z współczynnikiem przenikania S1), (ii) IAS2 to sygnał akceptora wynikający z bezpośredniego wzbudzenia światłem 488 nm (z współczynnikiem przenikania S2), (iii) IDEα to emisja sensybilizowana akceptora przez FRET z wzbudzonej cząsteczki donora (α zostanie szczegółowo omówione w sekcjach 4.8. - 4.10.), oraz (iv) B2 to sygnał tła. - Zmierz średnie intensywności tła w kanałach 1, 2, 3 w komórkach nietransfekowanych lub poddanych transfekcji pozornej (mock); oba warianty są dopuszczalne przy pomijalnej różnicy. Dla wszystkich pomiarów komórkowych użyj narzędzia do rysowania ręcznego, aby wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI) i unikać pęcherzyków perynuklearnych o zwiększonej autofluorescencji. Ważne jest uniknięcie znacznej autofluorescencji pochodzącej z tych pęcherzyków perynuklearnych.
- Wprowadź pomiary do kolumn X, Y i Z dostarczonego arkusza kalkulacyjnego. Średnie intensywności tła w 3 kanałach wpisz do komórek A2, B2 i C2 arkusza excel (Plik uzupełniający 2).
- Zmierz średnie intensywności w kanałach 1, 2, 3 komórek eksponujących wyłącznie GFP lub Cherry i wprowadź pomiary do kolumn C, D, E oraz N, O, P. Odpowiednie intensywności tła należy odjąć (w kolumnach F, G, H oraz Q, R, S).
- Aby obliczyć wydajność FRET E, wyznacz współczynniki przenikania S1 i S2. Widmowy współczynnik przenikania S1 oblicza się z komórek eksponujących tylko GFP
w kolumnie I. Wprowadź średnią wartość dla S1 do komórki D2 w arkuszu excel. - Oblicz widmowy współczynnik przenikania S2 z komórek eksponujących tylko Cherry
w kolumnie T. Wprowadź średnią wartość dla S2 do komórki E2 w arkuszu excel. - Upewnij się, że czynnik α wiąże sygnał z dowolnej liczby wzbudzonych cząsteczek GFP w kanale 1 z sygnałem równej liczby wzbudzonych cząsteczek Cherry w kanale 2 i jest definiowany jako
gdzie QA i QD to kwantowe wydajności fluorescencji Cherry i GFP; ηA oraz ηD to wydajności detekcji fluorescencji akceptora i donora odpowiednio w kanałach 2 i 1.
UWAGA: Czynnik α można by wyznaczyć z dwóch próbek eksponujących znane bezwzględne ilości GFP i Cherry. Niemożliwe jest jednak poznanie dokładnej ilości GFP i Cherry eksponowanych w pojedynczej komórce. Dlatego obliczyliśmy ten czynnik, wykorzystując komórki eksponujące białko fuzyjne GFP-Cherry. W tym przypadku, mimo że bezwzględna ilość nadal jest nieznana, wiadomo, że stosunek cząsteczek donora do akceptora wynosi jeden. - Zmierz średnie intensywności w kanałach 1, 2, 3 komórek eksponujących białko fuzyjne GFP-Cherry i wprowadź pomiary do kolumn AE, AF, AG. Intensywności tła należy odjąć (w kolumnach AH, AI, AJ).
- Oblicz czynnik α (kolumna AJ) z intensywności fluorescencji w kanałach 1, 2 i 3 białka fuzyjnego GFP-Cherry w następujący sposób:
- Skorygowane o tło intensywności zmierzone odpowiednio w kanale 1 (I1 - B1), 2 (I2 - B2) i 3 (I3 - B3) są mierzone z użyciem chimery GFP-Cherry. Widmowy współczynnik przenikania S1 został wyznaczony przy użyciu komórek eksponujących tylko GFP (patrz pkt 4.7.). εD i εA to współczynniki ekstynkcji GFP (donora) i Cherry (akceptora) przy 488 nm, które można wyznaczyć z literatury (εGFP = 53 000 M-1cm-1)18 oraz z krzywej absorpcji Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm1). Stosunek
został wpisany do komórki G2 arkusza excel. Wprowadź średnią wartość dla czynnika α do komórki J2. - Użyj wyznaczonego czynnika α do obliczenia wydajności FRET, E, w następujący sposób (kolumna AK):
- Alternatywnie wyznacz wydajność FRET, E, dla kontroli negatywnych, t.j. koekspresji GFP i Cherry oraz ekspresji samego GFP, dodając pomiary kanałów 1, 2 i 3 do arkusza excel w kolumnach AD, AE i AF pod pomiarami białka fuzyjnego GFP-Cherry. W ten sam sposób wyznacz wydajności FRET pomiędzy białkami o zainteresowaniu znakowanymi GFP i Cherry.
- Wyznacz nieugaszoną intensywność donora, ID, jako (I1 - B1)/(1 - E), a intensywność akceptora jako IA = I3 - B3; wartości te są proporcjonalne do poziomów ekspresji białek z markerami.
- Wyznacz skorygowany stosunek intensywności akceptora do donora (Q) białka fuzyjnego GFP-Cherry w następujący sposób (kolumna AL):
- Dla pozostałych komórek kotransfekowanych oblicz molekularny stosunek akceptora do donora NA/ND w następujący sposób:
UWAGA: Uzasadnienie dla wyznaczenia stosunku NA/ND i wykreślenia średniej komórkowej wydajności FRET E w funkcji NA/ND wynika z tego, że jedna cząsteczka donora może przekazać energię wielu akceptorom, podczas gdy cząsteczka akceptora może przyjąć energię tylko od jednego donora w danej chwili. Nawet jeśli ze względu na stechiometrię oddziaływania tylko jeden akceptor może oddziaływać z donorem, oczekuje się, że zwiększenie stężenia akceptora zwiększy frakcję donorów w kompleksie z akceptorem zgodnie z prawem działania mas. Zatem przy stałej (lub w wąskim zakresie) ekspresji donora, wydajność FRET powinna rosnąć wraz ze wzrostem NA/ND. Jednak przy wykreślaniu wydajności FRET E w funkcji NA/ND dla koekspresji GFP i Cherry, t.j. dla sondy negatywnej, wzrost NA/ND nie powinien skutkować wzrostem wydajności FRET (przynajmniej przy wystarczająco niskich stężeniach akceptora, gdzie nie występuje losowy FRET wynikający z bliskości barwników akceptorowych i donorskich).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia odpowiednio obrazy uzyskane w kanale donora, kanale 1 (488, 505-530 nm), kanale transferu, kanale 2 (488, >585 nm) oraz kanale akceptora, kanale 3 (561, >585 nm). Reprezentatywne obrazy komórek wykazujących ekspresję wyłącznie GFP, wyłącznie Cherry, koekspresję GFP i Cherry oraz ekspresję białka fuzyjnego GFP-Cherry. Średnie komórkowe wydajności FRET obliczone dla komórek NRK wykazujących ekspresję białka fuzyjnego GFP-Cherry (kontr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony protokół szczegółowo opisuje zastosowanie genetycznie sprzężonej sondy kalibracyjnej białka fluorescencyjnego jeden do jednego do jednego do ilościowego oznaczania FRET przy użyciu wykrywania uczulonej emisji akceptora i wygaszania cząsteczki donorowej za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może być stosowana do oceny interakcji białek w kontekście fizjologicznym żywej komórki w różnych przedziałach subkomórkowych. Rozdzielczość przestrzenną można dodatkowo poprawić, stosując przedstawiony algorytm do...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Neuroscience Imaging Service w Stanford University School of Medicine za dostarczenie sprzętu i miejsca dla tego projektu. Badania te były wspierane przez finansowanie stacjonarne Instytutu Raka Stanforda i Oddziału Ginekologii Onkologicznej w Stanford, a także GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 z Narodowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji na Węgrzech.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% Trypsyna-EDTA bez czerwieni fenolowej (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 wektor | Addgene | 3553 | |
| DMEM bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-dołkowe komory #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
Bibliografia
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
- Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
- van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
- Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413(2013).
- Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
- Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194(2020).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).
- Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
- Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
- Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
- Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
- Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
- Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
- McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
- Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270(2015).
- Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
- King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
