Artykuł metodologiczny

Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy")

DOI:

10.3791/62245

⸱

31 marca 2021

 ,  ,  , 
1LBMC, Laboratoire de Biologie et Modélisation de la Cellule Univ Lyon, ENS de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, UMR 5239, INSERM, U1210, Lyon, 69007, France, 2CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie Univ Lyon, Inserm, U1111, Université Claude Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, ENS de Lyon, F-69007, Lyon, France

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy prosty i tani protokół ładowania kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) w cząsteczkach wirusopodobnych. Cząstki te, zwane "nanoostrzami", umożliwiają skuteczne dostarczanie kompleksu Cas9/sgRNA w komórkach unieśmiertelnionych i pierwotnych, a także in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas zdemokratyzował edycję genomu w komórkach eukariotycznych i doprowadził do rozwoju wielu innowacyjnych zastosowań. Jednak dostarczenie białka Cas9 i jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) do komórek docelowych może być wyzwaniem technicznym. Klasyczne wektory wirusowe, takie jak te pochodzące z lentiwirusów (LV) lub wirusów związanych z adenowirusami (AAV), pozwalają na skuteczne dostarczanie transgenów kodujących białko Cas9 i związane z nim sgRNA w wielu komórkach pierwotnych i in vivo. Niemniej jednak wektory te mogą mieć wady, takie jak integracja transgenu w genomie komórki docelowej, ograniczona pojemność ładunkowa oraz długotrwała ekspresja białka Cas9 i przewodnika RNA w komórkach docelowych.

Aby przezwyciężyć niektóre z tych problemów, opracowano wektor dostarczania oparty na wirusie mysiej białaczki (MLV), który pakuje białko Cas9 i związane z nim przewodnikowe RNA w przypadku braku jakiegokolwiek kodującego transgenu. Poprzez fuzję białka Cas9 z C-końcem białka strukturalnego Gag z MLV, powstały cząsteczki wirusopodobne (VLP) załadowane białkiem Cas9 i sgRNA (nazwane "Nanoostrza"). Nanoostrza można pobrać z pożywki hodowlanej komórek produkcyjnych, oczyścić, określić ilościowo i wykorzystać do transdukcji komórek docelowych i dostarczenia aktywnego kompleksu Cas9 / sgRNA. Nanoostrza dostarczają ładunek rybonukleoprotein (RNP) przejściowo i szybko do szerokiej gamy komórek pierwotnych i nieśmiertelnych, i mogą być programowane do innych zastosowań, takich jak przejściowa aktywacja transkrypcji docelowych genów przy użyciu zmodyfikowanych białek Cas9. Nanoostrza są zdolne do edycji genomu in vivo w wątrobie dorosłych myszy, którym wstrzyknięto implanty, oraz w oocytach w celu wytworzenia zwierząt transgenicznych. Wreszcie, mogą być skompleksowane z DNA dawcy w celu "wolnej od transfekcji" naprawy ukierunkowanej na homologię. Przygotowanie nanoostrzy jest proste, stosunkowo tanie i można je łatwo przeprowadzić w każdym laboratorium biologii komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu do innych programowalnych nukleaz, system CRISPR-Cas radykalnie uprościł i zdemokratyzował procedurę celowania i dzielenia genomu w komórkach eukariotycznych na podstawie sekwencji. Dzięki prostemu wyrażeniu sgRNA, użytkownicy mogą zaprogramować białko Cas9 (lub zoptymalizowane warianty) dla prawie każdego locus1. W tym scenariuszu dostarczanie białka Cas9 i sgRNA staje się głównym ograniczeniem podczas przeprowadzania mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. W unieśmiertelnionych komórkach sgRNA i białko Cas mogą być łatwo wyrażane z transfekowanych plazmidów, aby osiągnąć skuteczne celowanie w genom w większości komórek. Jednak konstytutywna ekspresja kompleksu Cas9 / sgRNA może zwiększyć aktywność białka Cas9 poza celem i wprowadzić niepożądane zmiany w niespecyficznych loci2. W komórkach pierwotnych transfekcja DNA może być technicznie trudna do osiągnięcia i prowadzić do słabej ekspresji lub niewielkiego odsetka transfekowanych komórek. Alternatywa dla klasycznej transfekcji DNA polega na wykorzystaniu wektorów wirusowych, które dostarczają transgen kodujący Cas9 i sgRNA lub elektroporacja rekombinowanego białka Cas9 sprzężonego z syntetycznym sgRNA. Jednak podejścia te mogą prowadzić do integracji transgenu w genomie gospodarza komórki (jak ma to miejsce w przypadku klasycznych wektorów ekspresyjnych retrowirusowych i lentiwirusowych), ograniczenia przez czynniki komórkowe i prowadzić do konstytutywnej ekspresji białka Cas9 i sgRNA.

Elektroporacja kompleksu RNP Cas9/sgRNA może przezwyciężyć większość tych problemów i doprowadzić do efektywnego i przejściowego dostarczania w komórkach pierwotnych i in vivo, a także umożliwić odpowiedź zależną od dawki. Niemniej jednak zwykle opiera się na drogim sprzęcie i odczynnikach, a także jest trudny do przeskalowania, jeśli trzeba poddać obróbce dużą liczbę komórek. Jako alternatywę dla wyżej wymienionych technik, autorzy ci opracowali "Nanoblades" - retrowirusowy wektor dostarczania białka Cas9 i sgRNA3, który jest koncepcyjnie podobny do innych systemów dostarczania białek kapsydu pochodzących z wirusa4,5,6,7,8. Nanoostrza wykorzystują naturalną zdolność poliproteiny Gag z retrowirusów do wytwarzania, gdy ulegają ekspresji samodzielnie w hodowanych komórkach, VLP, które są uwalniane w podłożu zewnątrzkomórkowym9. Poprzez fuzję białka Cas9 z C-końcowym końcem poliproteiny Gag wirusa białaczki mysiej (MLV) i koekspresję sgRNA i glikoprotein otoczki wirusa, białko Cas9 może być zamknięte w uwolnionych VLP lub Nanoostrzach. Po oczyszczeniu Nanoostrza mogą być inkubowane z komórkami docelowymi lub wstrzykiwane in vivo, aby pośredniczyć w szybkim, przejściowym i zależnym od dawki dostarczaniu kompleksu Cas9 / sgRNA RNP 3.

Nanoostrza mogą być zaprogramowane za pomocą wielu sgRNA do jednoczesnej edycji w różnych loci lub za pomocą wariantów Cas9 do wykonywania innych zastosowań, takich jak aktywacja lub represja transkrypcji specyficznej dla celu3. W przeciwieństwie do elektroporacji białek, która opiera się na ekspresji rekombinowanej, nowo opisane warianty Cas z literatury można łatwo sklonować do wektora ekspresji fuzji Gag, co czyni go wszechstronną platformą. Nanoostrza mogą być dodatkowo skompleksowane lub załadowane jednoniciowymi i dwuniciowymi oligodeoksynukleotydami (ssODN) w celu przeprowadzenia naprawy ukierunkowanej na homologię3. Produkcja nanoostrzy jest stosunkowo prosta i tania. Co więcej, Nanoblades mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez wiele dni lub w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania. Zazwyczaj nanoostrza pośredniczą w wydajnej, wolnej od transgenów edycji genomu w większości unieśmiertelnionych i pierwotnych hodowanych komórek. Jednak niektóre komórki pierwotne mogą być wrażliwe na obecność cząstek wirusa, co powoduje zwiększoną śmiertelność. Komórki wrodzonego układu odpornościowego mogą również reagować na obecność nanoostrzy (ze względu na ich wirusowe pochodzenie) i ulegać aktywacji. W takich przypadkach protokół transdukcji musi zostać zoptymalizowany, aby ograniczyć czas ekspozycji na Nanoblades i zminimalizować efekty niespecyficzne. Nanoostrza stanowią realną i łatwą do wdrożenia alternatywę dla innych dostępnych metod dostarczania CRISPR.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i klonowanie sgRNA

UWAGA: Wytyczne dotyczące projektowania sgRNA można uzyskać z wielu źródeł, takich jak https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing lub od Hanna i Doench10.

  1. Po zaprojektowaniu 20 sekwencji nukleotydowych sgRNA zamów następujące jednoniciowe oligonukleotydy DNA:
    1. Do przodu: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N odpowiada docelowemu locus bez sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM))
    2. Rewers: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N odpowiada odwrotnemu uzupełnieniu docelowego locus bez sekwencji PAM)
      UWAGA: Przy zamawianiu oligonukleotydów nie są wymagane żadne specjalne modyfikacje (nie ma wymogu stosowania fosforanu 5').
  2. Zhybrydyzować dwa oligonukleotydy DNA w probówce o pojemności 0,2 ml w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), mieszając 5 μl buforu do wyżarzania (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 w 25 °C), 1 μl każdego oligonukleotydu DNA (100 μM roztworu podstawowego w wodzie) i 42 μL wody.
  3. Na bloku PCR inkubować próbki w temperaturze 95 °C przez 15 sekund, a następnie zmniejszyć temperaturę do 20 °C z krokiem 0,5 °C/s. Przechowywać w temperaturze pokojowej lub przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Trawić 10 μg plazmidów ekspresyjnych sgRNA BLADE lub SUPERBLADE z 10 jednostkami enzymu restrykcyjnego BsmBI-v2 przez 3 godziny w temperaturze 55 °C w całkowitej objętości reakcji 50 μL.
    UWAGA: Strawiony wektor powinien uwolnić wstawkę DNA o wielkości ~1,9 kb i drugi fragment DNA o wielkości ~3,3 kb.
  5. Załadować reakcję restrykcyjną na 1% żel agarozowy barwiony 5 μg/ml bromku etydyny (lub bezpieczniejszym alternatywnym barwnikiem w żelu DNA).
    UWAGA: Podczas manipulowania bromkiem etydyny, który podejrzewa się o powodowanie wad genetycznych, należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny.
    1. Na stole ultrafioletowym (UV) ustawionym na długość fali 312 nm (aby uniknąć uszkodzenia DNA) wyciąć fragment DNA o wielkości 3,3 kb z żelu i umieścić go w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Nosić odpowiedni sprzęt ochronny (rękawice i okulary chroniące przed promieniowaniem UV) podczas manipulowania bromkiem etydyny i pracy na stole UV.
    2. Ekstrahować DNA z pokrojonego żelu zawierającego 3,3 kb fragmentu DNA za pomocą dedykowanego zestawu do ekstrakcji żelu DNA (patrz tabela materiałów). Określić ilościowo ilość oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  6. Zliguj zhybrydyzowane oligonukleotydy DNA do przodu i do tyłu z kroku 1.2 do trawionego przez BsmB1, oczyszczonego żelem wektora BLADES lub SUPERBLADE z kroku 1.5.2. W tym celu dodać 2 μl buforu ligazy DNA T4, 50 ng wektora oczyszczonego żelem (z kroku 1.5.2), 1 μl zhybrydyzowanych oligonukleotydów DNA (z kroku 1.2), wodę w celu uzupełnienia objętości do 19 μl i 1 μl ligazy DNA T4. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
    1. Przekształcić produkt ligacji w kompetentne bakterie (patrz tabela materiałów) zgodnie z opisem wpunkcie 11. Przekształcone bakterie umieścić na płytce z agarem ampicyliny Luria Bertani i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Wybrać kilka izolowanych kolonii na płytce agarowej, aby przeprowadzić minipreparację DNA11 (patrz Tabela Materiałów) i przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera przy użyciu startera U6 do przodu (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') w celu sprawdzenia poprawności ligacji sekwencji zmiennej sgRNA.
      UWAGA: Inne plazmidy ekspresyjne sgRNA mogą być używane, jeśli nie kodują białka Cas9, co może zakłócać produkcję Nanoblade.

2. Przygotowanie plazmidu

  1. Przeprowadzić maxipreparation (patrz Tabela Materiałów) wszystkich wymaganych plazmidów i przygotować 10 μg porcji w stężeniu 1 μg/ml do przechowywania w temperaturze -20 °C. Unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania plazmidów; użyć podwielokrotności dwukrotnie przed ich wyrzuceniem.

3. Przygotowanie nanoostrzy

  1. W dniu 1 wysiewaj od 3,5 do 4 × 106 HEK293T komórek (patrz tabela materiałów) w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego wysoką glukozę, pirogronian sodu, L-glutaminę, 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i penicylinę/streptomycynę w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Delikatnie przesuń płytkę o średnicy 10 cm do tyłu i do przodu, a następnie od prawej do lewej (powtórz tę sekwencję 5x), aby równomiernie rozprowadzić komórki na szalce hodowlanej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym z 5% CO2,
    UWAGA: Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się z hodowanymi komórkami i nanoostrzami powinny być wykonywane pod kapturem z przepływem laminarnym do hodowli komórkowych, aby uniknąć ich zanieczyszczenia.
  2. Dzień 2: Transfekcja plazmidu
    1. Komórki powinny być zlewane w 70-80% 24 godziny po posiewie ( Rysunek 1A). Zastąp pożywkę 10 ml świeżego DMEM zawierającego wysoki poziom glukozy, pirogronian sodu, L-glutaminę, 10% FBS (penicylinę i streptomycynę można pominąć, chociaż nie jest to obowiązkowe) przed transfekcją.
      UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby komórki nie zlewały się. W przeciwnym razie wydajność transfekcji, a także produkcja cząstek mogą zostać zmniejszone.
    2. Na każdą 10 cm płytkę przygotuj następujące ilości plazmidów w probówce o pojemności 1,5 ml: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg plazmidu BLADES lub SUPERBLADES kodującego sklonowane sgRNA (lub 2,2 μg każdy, jeśli używasz dwóch sgRNA).
    3. Dodać 500 μl buforu do transfekcji (patrz tabela materiałów), wirować przez 10 s, a następnie wirować przez 1 s. Dodać 20 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów), wirować probówkę przez 1 s, a następnie wirować przez 1 s.
    4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dodawać cały roztwór kroplami do komórek w pożywce DMEM za pomocą pipetora P1000. Delikatnie przesuwaj płytkę o średnicy 10 cm do tyłu i do przodu, a następnie od prawej do lewej (powtórz tę sekwencję 5x), aby równomiernie rozprowadzić odczynnik do transfekcji na komórkach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 40 godzin w inkubatorze komórkowym z 5% CO2,
      UWAGA: W razie potrzeby podłoże można zmienić 4 godziny po transfekcji.
  3. W dniu 3 sprawdź morfologię transfekowanych komórek pod mikroskopem.
    UWAGA: Komórki producenta zaczną się łączyć. Jest to normalne zjawisko ze względu na ekspresję fuzogennych otoczek wirusowych (Rysunek 1B, C).
  4. Dzień 4: Zbiór Nanoostrzy
    UWAGA: Co najmniej 40 godzin po transfekcji komórki połączyłyby się ze sobą z powodu ekspresji fuzogennych otoczek wirusowych, a czasami komórki są całkowicie oderwane od podpory płytki (Rysunek 1D).
    1. Zebrać 9 ml supernatantu pożywki za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
      UWAGA: Nanoostrza to VLP zdolne do dostarczania białka Cas9 i związanego z nim sgRNA do komórek pierwotnych i in vivo. Chociaż nie są uważane za organizmy modyfikowane genetycznie, ponieważ są pozbawione materiału genetycznego, mogą wywoływać zmiany genetyczne. Dlatego należy z nimi manipulować ostrożnie, aby uniknąć kontaktu z użytkownikami (zwłaszcza jeśli są zaprogramowane do celowania w geny supresorowe nowotworu). Użytkownikom zaleca się przestrzeganie lokalnych wytycznych bezpieczeństwa dotyczących manipulacji wektorami retrowirusowymi i pracę w laboratorium na poziomie BSL-2 podczas przygotowywania VLP i przeprowadzania eksperymentów transdukcji. Nanoostrza można inaktywować 70% etanolem lub 0,5% podchlorynem sodu. Zaleca się również traktowanie wszystkich odpadów z tworzyw sztucznych (końcówki pipet, płytki do hodowli tkankowych, probówki wirówkowe) 0,5% podchlorynem sodu przez co najmniej 10 minut w celu dezaktywacji nanoostrzy.
    2. Odwirować zebrany supernatant o stężeniu 500 × g przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórkowych i odzyskania supernatantu bez naruszania osadu komórkowego.
      UWAGA: Jeśli nanoostrza mają być używane na ogniwach pierwotnych, przefiltruj supernatant za pomocą filtra 0,45 μm lub 0,8 μm. Należy pamiętać, że ten krok drastycznie zmniejsza miano Nanoblade, ponieważ znaczna frakcja zostanie zablokowana w membranie filtra.
    3. Nanoostrza należy granulować przez noc (12-16 godzin) w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 4 300 × g lub o masie 209 490 × g w ultrawirówce przez 75 minut w temperaturze 4 °C (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Jeśli komórki docelowe mogą rosnąć w DMEM, możliwe jest ich inkubowanie bezpośrednio z supernatantem otrzymanym po kroku 3.4.2 bez koncentracji nanoostrzy.
  5. Dzień 5: Ponowne zawieszenie i przechowywanie Nanoostrzy
    1. Po odwirowaniu powoli zassać pożywkę i ponownie zawiesić biały osad ze 100 μl zimnej soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS). Przykryj probówkę parafilmem i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając, a następnie ponownie zawiesić osad przez pipetowanie w górę i w dół.
      UWAGA: Po ponownym zaparciu może pojawić się biały, lepki materiał; Jest to normalne i nie wpływa znacząco na wydajność transdukcji.
    2. Przechowuj Nanoblades w temperaturze 4 °C, jeśli planujesz użyć ich w ciągu czterech tygodni. W przeciwnym razie należy zamrozić nanoostrza w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Podczas manipulowania ciekłym azotem należy nosić okulary ochronne i rękawice kriogeniczne. Szybkie zamrażanie i przechowywanie w temperaturze -80 °C prowadzi do znacznego spadku wydajności Nanoblade. Co więcej, rozmrożonych nanoostrzy nie należy ponownie zamrażać. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Koncentracja nanoostrzy na poduszce z sacharozy

UWAGA: Jako alternatywa dla nocnego wirowania lub ultrawirowania (krok 3.4.3), Nanoostrza mogą być skoncentrowane na poduszce sacharozy. W ten sposób uzyskuje się czystszą frakcję nanoostrzy, chociaż całkowita odzyskana ilość będzie niższa.

  1. Przygotować 10% roztwór sacharozy (od wagowych do objętościowych) w 1x PBS i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm (patrz Tabela Materiałów).
  2. Rozpocznij proces koncentracji nanoostrzy na poduszce sacharozy.
    1. Umieścić 9 ml próbki zawierającej VLP (z kroku 3.4.3) w probówce do ultrawirówki (patrz tabela materiałów). Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i kaniuli powoli ułóż 2,5 ml 10% sacharozy pod próbką, starając się nie mieszać próbki zawierającej VLP z roztworem sacharozy.
    2. Alternatywnie umieść 2,5 ml 10% sacharozy w probówce ultrawirówkowej (patrz Tabela materiałów). Przechylić probówkę i powoli dodać 9 ml próbki zawierającej VLP (z kroku 3.4.3) za pomocą pipetora wolnoobrotowego. Podczas tej operacji stopniowo podnoś rurkę do pozycji pionowej.
  3. Odwirować próbki o masie 209,490 × g w ultrawirówce przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Technika ta może być przystosowana do wirowania z niską prędkością (4 300 × g) przez noc, zgodnie z opisem w 12.
  4. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant i umieścić probówkę do góry nogami na bibułce, aby usunąć pozostały płyn. Po upływie 1 minuty dodać 100 μl 1x PBS i umieścić probówkę w temperaturze 4 °C z osłoną parafilmową w uchwycie probówki na stole mieszadlanym na 1 godzinę (patrz Tabela Materiałów) przed ponownym podwieszeniem granulki przez pipetowanie w górę i w dół.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

5. Monitorowanie ładowania Cas9 w Nanoblades za pomocą kropki

  1. Przygotować bufor rozcieńczający, dodając 1 objętość buforu do lizy zawierającego niejonowy środek powierzchniowo czynny (patrz tabela materiałów) w 4 objętościach po 1 PBS. Rozcieńczyć 2 μl skoncentrowanych nanoostrzy w 50 μl buforu rozcieńczającego, krótko przemieszać i przenieść 25 μl tej mieszaniny do nowej probówki zawierającej 25 μl buforu rozcieńczającego. Powtórz tę operację, aby uzyskać 4 probówki z rozcieńczeniami Nanoblade (2-krotne kroki rozcieńczania).
  2. Dla wzorcowych prób kontrolnych rozcieńczyć 2 μl rekombinowanej nukleazy Cas9 (patrz Tabela materiałów) w 50 μl buforu rozcieńczającego, krótko odwirować i przystąpić do wykonania ośmiu seryjnych rozcieńczeń (2-krotne rozcieńczenie na każdy etap).
  3. Ostrożnie narysuj 2,5 μl każdego rozcieńczenia VLP i 2,5 μl każdego wzorca na membranie nitrocelulozowej za pomocą wielokanałowej pipety (większa objętość może spowodować nakładanie się miejsc).
    UWAGA: Można również zastosować membranę z polifluorku winylu nasączoną metanolem.
  4. Gdy cząstki zostaną wchłonięte przez membranę, zablokuj membranę 1x solą fizjologiczną buforowaną Tris zawierającą niejonowy środek powierzchniowo czynny (TBS-T) uzupełniony beztłuszczowym mlekiem w proszku (5% w/v) przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać protokół, a membranę przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x TBS-T.
  5. Odrzucić 1x TBST uzupełniony beztłuszczowym mlekiem w proszku i inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem przeciwko peroksydazie chrzanowej Cas9 (rozcieńczenie 1/1000 w 1x TBST, 5% mleka). Umyj membranę 3x za pomocą TBS-T i zwizualizuj sygnał za pomocą ulepszonego zestawu substratów chemiluminescencyjnych.
  6. Określ ilościowo intensywność punktów dla nanoostrzy i rekombinowanych rozcieńczeń wzorca Cas9 za pomocą zastrzeżonego oprogramowania dostarczonego ze stacją obrazowania żelowego lub imageJ13. Zdefiniuj krzywą liniową łączącą intensywność punktu punktowego ze stężeniem Cas9. Korzystając z funkcji otrzymanej krzywej, ekstrapoluj zawartość Cas9 w każdym preparacie.
    UWAGA: Ilość rekombinowanego białka kontrolnego Cas9 może nasycić odczyt dla najbardziej skoncentrowanych próbek standardowego zestawu rozcieńczeń (Rysunek 2). W związku z tym zaleca się, aby przy definiowaniu krzywej liniowej usunąć odczyt z nierozcieńczonych próbek (a czasami odczyt z pierwszych etapów rozcieńczania), jeśli nie mieszczą się one w zakresie liniowym w odniesieniu do znanego stężenia Cas9, które zostało wykryte. Podobnie, ekstrapolując ilość Cas9 w próbkach Nanoblade, należy używać tylko odczytów, które mieszczą się w zakresie liniowym krzywej standardowej.

6. Transdukcja komórek docelowych za pomocą Nanoostrzy (procedura transdukcji w płytce 12-dołkowej)

  1. Na 12-dołkowej płytce wysiewaj 100 000-200 000 komórek (pierwotnych lub unieśmiertelnionych komórek przylegających) na dołek w 1 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych. Pozwól komórkom przylegać do powierzchni płytki przed transdukcją.
  2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 5-20 μl skoncentrowanych nanoostrzy (z kroku 3.5.1 lub 4.4) do 500 μl pożywki do hodowli komórkowych i wymieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą pipetora P1000. Usuń pożywkę z komórek i zastąp ją 500 μl tej mieszaniny Nanoblade.
    UWAGA: Transdukcja musi być zoptymalizowana dla każdego typu komórki. Ważne jest, aby używać jak najmniejszej objętości pożywki (unikając jednocześnie wysuszenia komórek docelowych), aby nanoostrza pozostały wysoce skoncentrowane. Przylegające komórki muszą być transdukowane bezpośrednio po przymocowaniu do płytki (nie należy transdukować w zawiesinie, ponieważ znacznie zmniejszy to wydajność transdukcji). Niektóre komórki tolerują długotrwałą ekspozycję na Nanoostrza (24-48 godzin), podczas gdy inne są bardzo wrażliwe i mogą tworzyć małe syncytia. W takim przypadku nanoostrza należy inkubować z komórkami tylko przez 4-6 godzin przed wymianą pożywki. Spinoculation14 może również poprawić transdukcję komórek hodowanych w zawiesinie. Adiuwanty, takie jak polimery kationowe (patrz tabela materiałów), mogą również poprawić wydajność transdukcji w niektórych typach komórek.
  3. Po 4-6 godzinach inkubacji komórek w małej objętości pożywki zawierającej nanoostrza, zwiększ objętość pożywki do normalnej ilości (1 ml w przypadku pracy z płytką 12-dołkową) lub zastąp ją świeżą pożywką, jeśli komórki są wrażliwe na VLPs.
    UWAGA: Pożywkę komórkową zawierającą Nanoblades należy inaktywować 0,5% podchlorynem sodu przez 10 minut przed wyrzuceniem. Używaj rękawic i okularów ochronnych podczas manipulowania podchlorynem sodu. Jeśli nanoostrza wywołują śmierć komórki, dostosuj ilość i całkowity czas ekspozycji, aby zmniejszyć śmiertelność komórek.

7. Pomiar skuteczności CRISPR w docelowym locus za pomocą testu endonukleazy T7

  1. Zaprojektuj startery PCR, aby wzmocnić region 400-700 par zasad (bp) obejmujący miejsce rozszczepienia CRISPR.
    UWAGA: Miejsce rozszczepienia powinno być oddalone od krawędzi amplikonu o co najmniej 200 pz i powinno być nieznacznie przesunięte od środka amplikonu, tak aby po rozszczepieniu endonukleazy T7 uwolniły się 2 fragmenty o różnych rozmiarach.
  2. Wyodrębnij genomowe DNA z komórek poddanych działaniu nanoostrzy ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania oraz z komórek kontrolnych potraktowanych nanoostrzami zaprogramowanymi kontrolnym sgRNA (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  3. Używając 150 ng genomowego DNA jako matrycy, zaprogramuj reakcję PCR o objętości 30 μl (objętość końcowa), postępując zgodnie z protokołem producenta. Sprawdź, czy amplifikacja PCR daje pojedynczy amplikon o oczekiwanej wielkości, uruchamiając 2% żel agarozowy wybarwiony 5 μg/ml bromku etydyny (lub bezpieczniejszym alternatywnym barwnikiem w żelu DNA).
    UWAGA: Podczas manipulowania bromkiem etydyny, który podejrzewa się o powodowanie wad genetycznych, należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Wytwarzanie i trawienie heterodupleksów
    1. W probówce PCR o pojemności 0,2 ml dodaj 5 μl buforu enzymatycznego (dostarczonego z endonukleazą T7 I), 20 μl wody i 24 μl produktu PCR z kroku 7.3. Umożliwić tworzenie heterodupleksu poprzez podgrzanie próbek do 94 °C w ciągu 3 minut, a następnie poprzez obniżenie temperatury (2 °C na minutę) do osiągnięcia 40 °C.
    2. Dodać 0,5 μl endonukleazy T7 I w temperaturze pokojowej do każdej probówki heterodupleksowej, łącznie z kontrolą. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Załaduj wynikową reakcję w 2,5% (wagowo/objętościowo) żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. Po migracji zobrazuj żel na transiluminatorze UV.
      UWAGA: Podczas manipulowania bromkiem etydyny, który podejrzewa się o powodowanie wad genetycznych, należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny. Używaj okularów chroniących przed promieniowaniem UV podczas korzystania z transilluminatora UV.
    3. Zmierz wydajność rozszczepienia, analizując obraz wynikający z reakcji trawienia w celu ilościowego określenia intensywności każdego pasma za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów).

8. Pomiar skuteczności CRISPR w docelowym locus za pomocą sekwencjonowania Sangera i analizy TIDE

UWAGA: Jako alternatywa dla testu endonukleazy T7, wydajność CRISPR może być monitorowana poprzez analizę i dekonwolucję śladów sekwencjonowania Sangera w oparciu o protokół TIDE15.

  1. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera amplikonów PCR z kroku 7.3 (w tym warunek kontrolny odpowiadający komórkom niepoddanym działaniu środka) przy użyciu startera PCR do przodu lub do tyłu.
  2. Przeanalizuj ślady sekwencjonowania Sangera w warunkach kontrolnych (komórki niepoddane działaniu substancji Nanoblade) i próbki poddane działaniu nanoostrzy przy użyciu serwera TIDE (https://tide.nki.nl) i postępując zgodnie z ich wytycznymi dotyczącymi analizy.

9. Tworzenie kompleksu nanoostrzy z donorami ssODN do naprawy kierowanej homologią (procedura transdukcji w płytce 12-dołkowej)

UWAGA: Wytyczne dotyczące projektowania ssODN do efektywnej edycji za pośrednictwem naprawy ukierunkowanej na homologię zostały opisane wcześniej16.

  1. Na płytce 12-dołkowej wysiewaj 100 000-200 000 komórek na studzienkę w 1 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych. Pozwól komórkom przylegać do powierzchni płytki przed transdukcją.
  2. Przygotować 100 μl roztworu polimeru kationowego (patrz tabela materiałów) o stężeniu 8 μg/ml w 1x PBS.
    1. Zmieszać 19 μl kationowego roztworu polimeru ze 100 pmol matrycy ssODN. Dodać 20 μl skoncentrowanych nanoostrzy (z kroku 3.5.1 lub 4.4) i inkubować przez 15 minut na lodzie.
    2. Usunąć skompleksowane nanoostrza/ssODN z lodu i dodać 500 μl pożywki do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C). Usunąć pożywkę z komórek docelowych (z kroku 9.1) i dodać 500 μl pożywki zawierającej skompleksowane Nanoblades/ssODN. Pozwól komórkom namnażać się przez 48 godzin przed genotypowaniem.
  3. Wyodrębnij genomowe DNA z frakcji populacji komórek za pomocą dedykowanego zestawu do ekstrakcji (patrz tabela materiałów).
    1. Zaprojektuj startery PCR, aby amplifikować obszar 400-700 pz obejmujący miejsce knock-in.
      UWAGA: Startery PCR nie powinny pokrywać się z ramionami homologicznymi ssODN, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich wynikających z amplifikacji PCR wszelkich pozostałości ssODN nadal obecnych w komórkach docelowych.
    2. Używając 150 ng genomowego DNA z komórek kontrolnych (niepoddanych działaniu substancji lub komórek traktowanych nanoostrzami jako matrycy), zaprogramuj reakcję PCR o pojemności 30 μl zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: ślady ssODN mogą być obecne w pożywce komórkowej kilka dni po transdukcji z kompleksem. Ten ssODN może służyć jako częściowy szablon dla testów PCR próbujących przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem prawidłowej integracji. Dlatego zaleca się przejście komórek co najmniej dwa razy po transdukcji, aby uniknąć ewentualnych testów fałszywie dodatnich.
    3. Załadować 5 μl reakcji kontrolnej i PCR poddanej działaniu nanoostrzy w 1% (wagowo/objętościowo) żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. Po migracji zobrazuj żel na transilluminatorze UV.
      UWAGA: Jeżeli rekombinacja homologiczna powiedzie się i odpowiada wprowadzeniu więcej niż 1 pz materiału genetycznego, powinna istnieć różnica w masie cząsteczkowej amplikonów PCR między próbką kontrolną a próbką poddaną działaniu nanoostrzy. Ponieważ skuteczność HDR nie osiąga 100%, w próbce poddanej działaniu nanoostrzy powinny być widoczne dwa prążki (jedno o podobnej wielkości do kontrolnego amplikonu PCR odpowiadającego nieedytowanemu allelowi i jedno o wyższej masie cząsteczkowej odpowiadające allelowi knock-in, patrz środkowy panel na rysunku 3B).
  4. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera kontrolnych i amplikonów PCR poddanych działaniu Nanoblade.
  5. Określ ilościowo wydajność knock-in za pomocą protokołu TIDER17.

10. Dostarczanie nanoostrzy in vivo

  1. Dostarcz do 25 μl skoncentrowanych nanoostrzy od kroku 3.5.1 poprzez wstrzyknięcie retroorbitalne lub do 100 μl przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, zgodnie z opisem w18, jeśli pracujesz z myszami.
    UWAGA: Wszystkie procedury związane z eksperymentami na zwierzętach (w tym wstrzyknięcia Nanoblade w celu edycji genomu) wymagają zatwierdzonego protokołu od lokalnej komisji etycznej.
  2. W celu wytworzenia myszy transgenicznych użyj mikrowstrzykiwacza, aby dostarczyć od 1 do 10 pL skoncentrowanych nanoostrzy z kroku 4.4 do przestrzeni okołowitelowej oocytów myszy, jak opisano wcześniej18.
    UWAGA: W przypadku iniekcji periviteliny konieczne jest oczyszczenie i skoncentrowanie nanoostrzy na poduszce sacharozy, aby uniknąć zatkania mikrowtryskiwacza.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przygotowania Nanoblade jest dość prosty i wymaga prostego sprzętu laboratoryjnego, oprócz dostępu do kaptura do hodowli tkanek, inkubatora CO2 i wahadłowej wirówki kubełkowej lub ultrawirówki. Jednak niektóre etapy wymagają szczególnej uwagi, takie jak źródło i postępowanie z komórkami produkcyjnymi, a także warunki transdukcji. Jak pokazano w Rysunek 1A, ważne jest, aby wysiewać komórki tak, aby były jednorodnie rozmieszczone na płytce i osiągnęły ~70-80% konfluencji w dniu transfekcji (unikaj tworzenia się skupisk komórek). Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji (Rysunek 1B, C), komórki produkcyjne utworzą syncytię, prowadząc do komórek o większych rozmiarach z wieloma jądrami. Czterdzieści godzin po transfekcji (Rysunek 1D), większość komórek na płytce utworzy syncytię i zacznie odłączać się od płytki.

To jest całkowicie normalne i jest spowodowane ekspresją glikoproteiny otoczki, która indukuje fuzję między sąsiednimi komórkami. Po zagęszczeniu przez odwirowanie (lub nawet bezpośrednio z supernatantu komórek produkcyjnych), ilość Cas9 załadowanego w nanoostrzach może być określona ilościowo w sposób bezwzględny za pomocą kropki na membranie nitrocelulozowej przy użyciu rekombinowanego Cas9 jako odniesienia (Rysunek 2). Ten krok jest ważny, aby określić prawidłową ilość nanoostrzy do użycia do transdukcji komórek docelowych. Podczas wykonywania testu kropkowego ważne jest, aby wziąć pod uwagę tylko odczyty, które mieszczą się w liniowym zakresie krzywej wzorcowej. Jednak niezależnie od ilości Cas9 obecnego w Nanoblades, konieczne jest przetestowanie skuteczności edycji genomu bezpośrednio na komórkach docelowych za pomocą testu endonukleazy T7 (Rysunek 3) lub sekwencjonowania Sangera.

Jak pokazano na Rysunek 3, wydajność Nanoostrzy może się różnić w zależności od partii, chociaż zwykle jest skorelowana z ilością Cas9. W przykładzie pokazanym w Rysunek 3, partia z linii 1 prowadzi do 20% ogólnej wydajności edycji, podczas gdy partia z linii 3 prowadzi do 60% wydajności. W takim przypadku możliwe jest zwiększenie objętości używanych Nanoostrzy z partii 1, aby osiągnąć wydajność edycji podobną do tej z partii 3. Rysunek 4 pokazuje maksymalną wydajność edycji uzyskaną przy użyciu Nanoostrzy w różnych typach komórek pierwotnych. Ważne jest, aby pamiętać, że wydajność może się różnić w zależności od sekwencji użytego sgRNA i docelowej dostępności.

figure-results-1
Rysunek 1: Morfologia komórek produkcyjnych podczas produkcji Nanoblade. (A) HEK293T komórek przy 70-80% zbieżności 24 godziny po posiewze. (B i C) HEK293T morfologia komórek 24 godziny po transfekcji. (D) HEK293T morfologia komórek 40 godzin po transfekcji. Podziałka = 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Kwantyfikacja obciążenia Cas9 w Nanoostrzach za pomocą kropki. (A) Rekombinowany Cas9 lub 100-krotnie skoncentrowane (przez ultrawirowanie) próbki nanoostrzy (#1, #2 i #3) są rozcieńczane sekwencyjnie 2-krotnie i nakrapiane na membranie nitrocelulozowej przed inkubacją z przeciwciałami sprzężonymi z HRP anty-Cas9. Sygnał ujawnia się poprzez zwiększoną chemiluminescencję. (B) Sygnał chemiluminescencji jest pozyskiwany i oznaczany ilościowo dla rekombinowanych rozcieńczeń Cas9 i intensywności sygnału wykreślanej w stosunku do znanej ilości Cas9 nakrapianego na membranie nitrocelulozowej. Krzywą regresji oblicza się dla rozcieńczeń, które mieszczą się w zakresie liniowym (patrz niebieskie krzyżyki), z wyłączeniem wszystkich stężeń, które znajdują się poza zakresem liniowym (patrz czerwone krzyżyki). (C) Stężenie Cas9 (nM) w każdym preparacie Nanoblade ekstrapolowano przy użyciu równania z regresji liniowej uzyskanej w (B). W tym celu ważne jest, aby używać wyłącznie ilościowego sygnału z rozcieńczeń Nanoblade, które mieszczą się w liniowym zakresie krzywej regresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Monitorowanie efektywności edycji po transdukcji. (A) Test endonukleazy T7 mierzący efektywność cięcia w komórkach traktowanych Nanoostrzami. Komórki transdukowane za pomocą nanoostrzy ukierunkowanych na gen EMX1 analizowano za pomocą testu endonukleazy T7. Tor 1: Partia przygotowawcza Nanoblade #1 (20% wydajności łupliwości); Tor 2: Komórki kontrolne; Tor 3: Partia przygotowawcza Nanoblade #2 (60% wydajności łupliwości). (B) Wbicie sekwencji znaczników flagi w otwartej ramce odczytu DDX3. Skoncentrowane nanoostrza zaprogramowane za pomocą sgRNA ukierunkowanego na locus DDX3 wyprodukowano z różnych klonów HEK293T (#1, #2) i skompleksowano zwiększającymi dawkami matrycy ssODN Flag-DDX3 i otrzymanych kompleksów wykorzystywanych do transdukcji HEK293T komórek docelowych. Po transdukcji komórki hodowano przez trzy dni przed ich pobraniem w celu ekstrakcji genomowego DNA i białek całkowitych. Białka Flag-DDX3 poddano immunoprecypitacji za pomocą kulek agarozy anty-Flag, a następnie analizie western-blot odzyskanych białek przy użyciu przeciwciała anty-Flag (górny panel). Ukierunkowana na miejsce insercja znacznika Flaga w locus Ddx3 została również przetestowana za pomocą PCR przy użyciu starterów flankujących miejsce wprowadzenia (środkowy panel) lub przy użyciu startera do przodu, który rozpoznaje sekwencję znacznika Flaga i odwrotnego startera specyficznego dla locus Ddx3 poniżej miejsca wprowadzenia flagi (dolny panel). Skróty: EMX1 = Puste przetchlinki Homeobox 1; DDX3 = helikaza RNA DEAD-box 3; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; ODN = oligodeoksynukleotyd; ssODN = jednoniciowy ODN; sgRNA = RNA z pojedynczym przewodnikiem; IP = immunoprecypitacja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wydajność edycji osiągnięta w różnych typach komórek pierwotnych za pomocą Nanoostrzy. Skróty: PBL = limfocyty krwi obwodowej; IL = interleukina; CD = klaster zróżnicowania; iPSC = indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanoostrza pozwalają na szybkie i zależne od dawki dostarczanie kompleksu Cas9/sgRNA RNP do linii komórkowych i komórek pierwotnych. W przeciwieństwie do klasycznej transfekcji i innych wektorów dostarczania wirusa, ale podobnie jak elektroporacja białek, Nanoblades mają tę zaletę, że przejściowo dostarczają Cas9 / sgRNA RNP w sposób wolny od transgenu. Nanoostrza oferują bardzo wszechstronną, prostą i niedrogą platformę do dostarczania białka, którą można łatwo i szybko dostosować do stale powiększającej się rodziny wariantów CRISPR. Nanoostrza mogą być wytwarzane w linii komórkowej HEK293T lub jej pochodnych. HEK293T zastosowane tutaj linie komórkowe zostały opracowane w celu maksymalizacji produkcji cząstek retrowirusowych i lentiwirusowych (patrz tabela materiałów). Jednakże, chociaż inne źródła komórek HEK293T mogą być odpowiednie, użytkownicy muszą testować i porównywać HEK293T komórek z różnych źródeł, ponieważ zaobserwowano duże różnice w produkcji cząstek w zależności od źródła HEK293T komórek. Komórki muszą być również często sprawdzane pod kątem zanieczyszczenia Mycoplasma i pasażowane co trzy dni (klasycznie rozcieńczenie 1/8), aby uniknąć nadmiernej konfluencji, która ma negatywny wpływ na produkcję cząstek.

Komórki nie powinny być utrzymywane przez więcej niż 20 pasaży. Do hodowli komórkowych zastosowano DMEM uzupełniony glukozą, penicyliną/streptomycyną, glutaminą i 10% zdekomplementowaną płodową surowicą bydlęcą. Ze względu na to, że pochodzenie surowicy może mieć wpływ na jakość preparatu Nanoblade, przed rozpoczęciem produkcji na dużą skalę należy przebadać różne partie surowicy. Nanoostrza mogą być efektywnie wytwarzane w innych mediach, takich jak RPMI lub modyfikacje minimalnej niezbędnej pożywki bez surowicy, które mogą zastąpić DMEM następnego dnia po transfekcji. Jak wskazano poniżej, chociaż zastąpienie pożywki po transfekcji niektórymi odczynnikami do transfekcji DNA jest opcjonalne, korzystna może być modyfikacja pożywki, do której uwalniane są VLP, zwłaszcza w celu ograniczenia śladów surowicy w preparacie cząstek. Jednakże hodowla komórek w pożywce o zmniejszonej surowicy w dniu poprzedzającym transfekcję nie została jeszcze podjęta.

Jak wspomniano, nanoostrza są wytwarzane w wyniku nadekspresji mieszaniny plazmidów w komórkach produkcyjnych. Wydaje się, że nadekspresja jest wymagana dla optymalnej produkcji. Rzeczywiście, laboratorium to opracowało linię komórkową producenta, w której konstrukt wyrażający Gag-Pol został ustabilizowany przez selekcję antybiotyków; jednak system ten nie był w stanie wyprodukować znacznych ilości Nanoostrzy. Podobną obserwację poczyniono, gdy konstrukt kodujący sgRNA został stabilnie zintegrowany z genomem komórek produkcyjnych. Jak opisano w przypadku innych systemów produkcji cząstek, przydatna może być stabilna linia komórkowa wyrażająca przynajmniej niektóre konstrukty zaangażowane w produkcję nanoostrzy; Wymagałoby to jednak z pewnością przetwarzania dużych ilości supernatantu i odpowiedniej techniki oczyszczania cząstek. Powyższy protokół przedstawia preferowaną procedurę produkcji nanoostrzy, która wykorzystuje określone odczynniki do transfekcji (patrz tabela materiałów).

Chociaż odczynniki do transfekcji innych producentów również zostały przetestowane z sukcesem, zdecydowana większość wyników tej grupy z Nanoblades jest zgodna z procedurą opisaną w niniejszym dokumencie. Tanie transfekcja może być osiągnięta przy użyciu odczynników fosforanu wapnia i zapewnia dobrą wydajność produkcji; Jednak metoda ta bezwzględnie wymaga wymiany pożywki transfekcyjnej następnego dnia po transfekcji i może pozostawić pozostałości fosforanu wapnia w preparacie osadzonych cząstek. Z koniecznością wysokiego poziomu ekspresji składników Nanoblade w komórkach produkcyjnych spójna jest obserwacja, że ilość sgRNA związanych z białkiem Cas9 może być czynnikiem ograniczającym efektywną edycję genomu. Aby poprawić ładowanie sgRNA, niezależne grupy opracowały ostatnio dwa podejścia techniczne wykorzystujące wektory dostarczania białek podobne do Nanoblades. Polegają one na wykorzystaniu zależnej od polimerazy T7 cytoplazmatycznej ekspresji sgRNA6 lub poprzez dodanie retrowirusowego sygnału enkapsydacji do sekwencji sgRNA w celu pośredniczenia w wiązaniu z poliproteiną Gag6. Podejścia te mogą rzeczywiście poprawić ładowanie sgRNA w nanoostrzach, chociaż nie zostały jeszcze przetestowane.

Transdukcja komórek docelowych jest kluczowym etapem procedury. W większości unieśmiertelnionych linii komórkowych transdukcja za pomocą nanoostrzy ma niewielki lub żaden efekt cytopatyczny lub nie ma go wcale. Jednak w komórkach pierwotnych toksyczność może stanowić problem. Dlatego transdukcja musi być zoptymalizowana dla każdego typu komórki. W szczególności czas ekspozycji na nanoostrza jest ważnym czynnikiem, który należy zmodyfikować podczas optymalizacji protokołu transdukcji. W przypadku wrażliwych komórek, takich jak neurony pierwotne lub komórki szpiku kostnego, 4-6 godzin inkubacji z nanoostrzami przed wymianą pożywki pozwala na efektywne dostarczanie białka Cas9 przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności komórek. Ponadto adiuwanty, takie jak między innymi polimery kationowe, mogą znacznie poprawić wydajność transdukcji w niektórych komórkach (patrz tabela materiałów). Ważne jest, aby pamiętać, że Nanoostrza są VLP i mogą indukować odpowiedź immunogenną. Może to stanowić ograniczenie w przypadku pracy z niektórymi typami komórek pierwotnych, takimi jak makrofagi lub komórki dendrytyczne, w których inkubacja z nanoostrzami może wywołać ważne zmiany w ekspresji genów i fenotypie komórek. Jeśli makrofagi i komórki dendrytyczne pochodzą z prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych (takich jak komórki szpiku kostnego myszy), lepiej jest transdukować komórki za pomocą nanoostrzy, zanim zostaną w pełni zróżnicowane, aby uniknąć wywoływania odpowiedzi komórkowej przeciwko nanoostrzy. W przeciwnym razie elektroporacja białka Cas9 może stanowić realną alternatywę podczas pracy ze zróżnicowanymi komórkami odpornościowymi.

Nanoostrza mogą być używane in vivo do transdukcji mysich zygot lub embrionów w celu wytworzenia transgenicznych zwierząt. Podobnie jak klasyczne wektory retrowirusowe lub lentiwirusowe, mogą być również wstrzykiwane bezpośrednio do tkanek pochodzących od dorosłych zwierząt. Jednak nanoostrza (podobne do wektorów retrowirusowych i lentiwirusowych) mogą być inaktywowane przez odpowiedź immunologiczną zwierzęcia gospodarza; W związku z tym dawka do wstrzyknięcia musi być zoptymalizowana dla każdego zastosowania. Ta odpowiedź immunologiczna może również ograniczać dystrybucję funkcjonalnych VLP do tkanek w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Wreszcie, w przeciwieństwie do wektorów lentiwirusowych, nanoostrza są wolne od transgenów i dostarczają Cas9 w ograniczonym czasie. W związku z tym nie można ich używać do wykonywania funkcjonalnych badań przesiewowych całego genomu, które wymagają wysokoprzepustowego sekwencjonowania sgRNA po selekcji komórek. Nanoostrza są przydatne, gdy wymagana jest szybka, zależna od dawki i wolna od transgenów edycja genomu20. Ponadto, podobnie jak w przypadku elektroporacji białek, nanoostrza prowadzą do mniejszej liczby efektów poza celem niż przedłużona ekspresja Cas9 / sgRNA poprzez transfekcję DNA lub klasyczne wektory wirusowe3. Przyszły rozwój nanoostrzy koncentruje się na wykorzystaniu wariantów Cas9 do różnych zastosowań technologicznych, takich jak edycja zasad i celowanie w RNA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Philippe E. Mangeot i Emiliano P. Ricci są wymienieni jako wynalazcy patentu dotyczącego technologii Nanoblades (zgłaszający patenty: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; numer wniosku: WO 2017/068077 Al; status patentu: data publikacji: 27 kwietnia 2017 r.; Wszystkie aspekty manuskryptu są objęte zgłoszeniem patentowym. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) z Université de Lyon, w ramach programu Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) prowadzonego przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) oraz przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-StG-LS6-805500 do E.P.R.) w ramach programów Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13,2 mL, cienkościenne probówki polipropylenowe, 14 x 89 mm - 50 szt.Beckman Coulter Life Sciences331372Ultrawirówki do oczyszczania Nanoostrzy
Membrany do bibułki Amersham Protran Premium Premium, nitrocelulozaMembrana nitrocelulozowa Merck GE10600004 do ilościowego oznaczania poziomów Cas9 w oczyszczonych nanoostrzach
BIC-Gag-CAS9Addgene119942Koduje fuzję GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Umożliwia wytwarzanie cząstek podobnych do wirusa GAG-CAS9 z komórek produkcyjnych w połączeniu z nadekspresją gRNA i odpowiednimi otoczkami
BICstim-Gag-dCAS9-VPRAddgene120922koduje fuzję GAG-dCAS9-VPR w celu ukierunkowanej aktywacji transkrypcyjnej
BLADEAddgene134912Pusty szkielet do klonowania sekwencji sgRNA do użycia w systemie Nanoblades
BsmBI-v2New England BiolabsR0739SEnzym restrykcyjny do trawienia wektorów BLADE i SUPERBLADES do klonowania sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) Mysie mAb (koniugat HRP) #97982Technologia sygnalizacji komórkowejPrzeciwciało anty-Cas9 97982Sdo oznaczania ilościowego Cas9 za pomocą
nukleazy Cas9 dot-blot, S. pyogenesNew England BiolabsM0386TRekombinowane białko Cas9 do wykorzystania jako odniesienie do bezwzględnej kwantyfikacji ilości Cas9 załadowanego w Nanoblades
Roztwór bromku etydyny (10 mg / ml w H2O)Sigma-AldrichE1510-10MLDo barwienia żeli agarozowych i wizualizacji DNA
Wytrząsarki Fisherbrand Wave MotionFisher Scientific88-861-028Stół mieszający do ponownego zawieszenia nanoostrzy po odwirowaniu
żeluAnalyzerhttp://www.gelanalyzer.com; ilościowe określanie intensywności pasma po trawieniu
Gesicle Producer 293TProducent Takara632617Nanoblades linia komórkowa
Gibco DMEM, wysoka glukoza, pirogronianThermoFisher Scientific41966052Pożywka do hodowli komórkowych dla Gesicle Cell Producer Komórki 293T
GoTaq G2 Polimeraza DNAPromegaM7848Polimeraza Taq do amplifikacji genomowego DNA przed testami endonukleazy
T7 jetPRIME Zestaw odczynników transfekcyjnych do DNA i DNA/ siRNAPolyplusPOL114-15Odczynnik do transfekcji do produkcji Nanoostrzy w komórkach Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 µ m, filtr strzykawkowyMilliporeSLAA033SSFiltr strzykawkowy do usuwania zanieczyszczeń komórkowych przed zagęszczeniem Nanoostrzy
Millex-GS, 0,22 i mikro; m, filtr strzykawkowyMilliporeSLGS033SSFiltr strzykawkowy do sterylizacji roztworu poduszki sacharozowej
Millex-HP, 0,45 µ m, polieterosulfon, filtr strzykawkowyMilliporeSLHP033RSFiltr strzykawkowy do usuwania zanieczyszczeń komórkowych przed koncentracją Nanoostrzy
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA Monarch NewEngland BiolabsT1020Ldo ekstrakcji żelu DNA do oczyszczania fragmentu plazmidu pBLADES lub pSUPERBLADES po trawieniu za pomocą BsmBI
NEB Stabilny kompetentny E. coli (wysoka wydajność)New England BiolabsC3040IKompetentne bakterie do transformacji i amplifikacji plazmidu
Zestaw NucleoBond Xtra Midi do transfekcji plazmidowego DNAMacherey-Nagel740410.50Zestaw Maxipreparation do oczyszczania plazmidowego DNA z hodowanych bakterii
Zestaw do ekstrakcji gDNA nukleospinyMacherey-Nagel740952.50Ekstrakcja genomowego DNA z transdukowanych komórek
NucleoSpin Plasmid, Mini zestaw do plazmidowego DNAMacherey-Nagel740588.50Minizestaw do przygotowania do oczyszczania plazmidowego DNA z hodowanych bakterii
NucleoSpin Tissue, Mini zestaw do DNA z komórek i tkanekMacherey-Nagel740952.5Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA
Optima XE-90Beckman Coulter Life SciencesA94471Ultrawirówka
pBaEVRlessEls Verhoeyen (Inserm U1111)Prośby osobiste należy przesyłać na adres: els.verhoyen@ens-lyon.frEndogenny retrowirus pawiana Rless glikoproteina opisana w Girard-Gagnepain, A. i wsp. Pseudotypowane LV otoczki pawiana przewyższają VSV-G-LV pod względem transferu genów do wcześnie stymulowanych cytokinami i spoczynkowych HSC. Krew 124, 1221– 1231 (2014)
pBS-CMV-gagpolAddgene35614Enocdes wirusa białaczki mysiej geny gag i pol
pCMV-VSV-GAddgene8454Białko otoczki do produkcji retrowirusowych cząstek lentiwirusowych i MuLV
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)ThermoFisher Scientific1420009110X PBS do rozcieńczania w miliporowej wodzie
Odczynnikdo transfekcji polibrenuMillipore SigmaTR-1003-GPolimer kationowy, który zwiększa efektywność transdukcji retrowirusowej w określonych komórkach ssaków. Może również umożliwić zależne od wirusa wejście oligodeoksynukleotydu (ODN) do naprawy ukierunkowanej na homologię
sacharozy, dla biologii molekularnej, ≥ 99,5% (GC)Sigma-AldrichS0389-5KGSacharoza do przygotowania poduszki do oczyszczania Nanoblade poprzez ultrawirowanie
SUPERBLADE5Addgene134913Pusta sieć szkieletowa do klonowania sekwencji sgRNA do wykorzystania w systemie nanoostrzy (zoptymalizowana pod kątem zwiększenia wydajności edycji genomu przez Chen B i in., 2013)
Substrat SuperSignal West Dura o przedłużonym czasie trwaniaThermoFisher Scientific34076Ulepszony substrat HRP do chemiluminescencji (ECL) do kropek Cas9
SW 41 Ti Rotor z łyżką wahadłowąBeckman Coulter Life Sciences331362Rotor do ultrawirowania
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAThermoFisherScientific S33102Alternatywa dla bromku etydyny do barwienia żeli agarozowych i wizualizacji DNA
T4 Ligaza DNANew England BiolabsM0202SLigaza DNA do ligacji wektorów BLADE lub SUPERBLADES z dupleksowanymi oligonukleotydami DNA odpowiadającymi zmiennemu regionowi
endonukleazy sgRNA T7 INew England BiolabsM0302ST7 I rozpoznaje i rozszczepia nieidealnie dopasowane DNA. Pozwala monitorować zakres edycji genomu w określonym locus
Bufor do lizy zawierający trytonPromegaE291Aw celu rozbicia Nanoblades i umożliwienia kwantyfikacji Cas9
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416Do przygotowania TBST
Bufor do lizy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).
  3. Mangeot, P. E., et al. Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature Communications. 10 (1), 45(2019).
  4. Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases. eLife. 3, 01911(2014).
  5. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).
  6. Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications. 11, 1334(2020).
  7. Indikova, I., Indik, S. Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts. Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).
  8. Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (17), 99(2019).
  9. Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell. 59 (1), 103-112 (1989).
  10. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
  11. Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. Third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
  12. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875(2015).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  14. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
  15. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  16. Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing. Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).
  17. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
  18. Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders. Journal of Visualized Experiments. (140), e57609(2018).
  19. Montagna, C., et al. VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).
  20. Marnef, A., et al. A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair. Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9edycja genomu CRISPRprzygotowanie nanobladestransdukcja kom rek pierwotnychkom rki unie miertelnioneanaliza dot blottest endonukleazy T7naprawa kierowana homologiWestern blot

Powiązane artykuły