Method Article

Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

DOI:

10.3791/62251

⸱

June 12th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics of Fluids group, Department of Science and Technology, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 2BIOS Lab-on-a-Chip group, Max Planck Center Twente for Complex Fluid Dynamics, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 3Department of Biotechnology and Nanomedicine, SINTEF Industry, 4Department of Circulation and Medical Imaging, Norwegian University of Science and Technology, 5Department of Health Research, SINTEF Digital, 6Cancer Clinic, St. Olav’s Hospital, 7Department of Physics, Norwegian University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzykowe środki kontrastowe są bardzo obiecujące w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków za pomocą ultradźwięków. Kapsułkowanie leków w nanocząstkach zmniejsza toksyczność ogólnoustrojową i wydłuża czas krążenia leków. W nowatorskim podejściu do dostarczania leków wspomaganego mikropęcherzykami, nanocząstki są wbudowane w otoczki mikropęcherzyków lub na nich, umożliwiając lokalne i wyzwalane uwalnianie ładunku nanocząstek za pomocą ultradźwięków. Dokładne zrozumienie mechanizmów uwalniania w rozległej przestrzeni parametrów ultradźwiękowych ma kluczowe znaczenie dla wydajnego i kontrolowanego uwalniania. Ten zestaw przedstawionych protokołów ma zastosowanie do mikropęcherzyków z otoczką zawierającą znacznik fluorescencyjny. W tym przypadku nacisk kładziony jest na mikropęcherzyki wypełnione nanocząstkami polimerowymi z poli(2-etylo-butylocyjanoakrylanu), domieszkowanymi zmodyfikowanym barwnikiem czerwieni nilowej. Cząstki są utrwalone w zdenaturowanej otoczce kazeinowej. Mikropęcherzyki są wytwarzane przez energiczne mieszanie, tworząc dyspersję gazowego perfluoropropanu w fazie ciekłej zawierającej kazeinę i nanocząstki, po czym powłoka mikropęcherzyków samoczynnie się organizuje. Do scharakteryzowania mikropęcherzyków stabilizowanych nanocząstkami we wszystkich istotnych skalach czasowych procesu uwalniania nanocząstek potrzebne są różne techniki mikroskopowe. Fluorescencja nanocząstek umożliwia obrazowanie konfokalne pojedynczych mikropęcherzyków, ujawniając rozkład cząstek w otoczce. Ultraszybkie obrazowanie in vitro z wykorzystaniem mikroskopii jasnego pola z szybkością 10 milionów klatek na sekundę zapewnia wgląd w dynamikę pęcherzyków w odpowiedzi na insonację ultradźwiękową. Wreszcie, uwalnianie nanocząstek z otoczki pęcherzykowej najlepiej zobrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, wykonywanej z prędkością 500 000 klatek na sekundę. Aby scharakteryzować dostarczanie leków in vivo, wyzwalane uwalnianie nanocząstek w obrębie naczyń krwionośnych i ich wynaczynienie poza warstwę śródbłonka jest badane za pomocą mikroskopii przyżyciowej w guzach zagnieżdżonych w komorach okiennych grzbietowego fałdu skórnego, w skali czasowej kilku minut. Połączenie tych uzupełniających się technik charakterystyki zapewnia unikalny wgląd w zachowanie mikropęcherzyków i ich uwalnianie ładunku użytecznego w różnych skalach czasowych i długości, zarówno in vitro, jak i in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultrasonografia jest najczęściej używaną techniką obrazowania medycznego. Jest nieinwazyjny, szybki, bezpieczny, ekonomiczny i przenośny1,2,3. Jednak krew jest słabym rozpraszaczem ultradźwięków, a kontrast puli krwi może być zwiększony przez dożylne wstrzyknięcie ultradźwięków środków kontrastowych3. Ten zwiększony kontrast puli krwi umożliwia ilościowe określenie perfuzji narządów do celów diagnostycznych, np. w wykrywaniu choroby wieńcowej4 i przerzutowej choroby wątroby5. Rzeczywiście, udowodniono, że unaczynienie guza jest ważnym czynnikiem prognostycznym6. Duży wysiłek badawczy jest obecnie skierowany na wspomagane mikropęcherzykami, celowane obrazowanie molekularne i dostosowanie środków kontrastowych do zastosowań terapeutycznych.

Dostępne na rynku ultradźwiękowe środki kontrastowe zazwyczaj składają się z zawiesiny powlekanych mikropęcherzyków7,8 o średnicach od 1 μm do 10 μm9. Ponieważ mikropęcherzyki ultradźwiękowego środka kontrastowego są nieco mniejsze niż czerwone krwinki7, mikropęcherzyki mogą bezpiecznie dotrzeć nawet do najmniejszych naczyń włosowatych bez tworzenia okluzji3. Mikropęcherzyki mają znacznie zwiększony współczynnik rozpraszania wstecznego ultradźwięków w porównaniu do tissue10, ze względu na ich ściśliwy rdzeń gazowy11. Ponadto echo mikropęcherzykowe jest wysoce nieliniowe, tzn. jego widmo zawiera harmoniczne i podharmoniczne częstotliwości sterującej. Ponadto siła echa jest silnie zależna od odpowiedzi rezonansowej bąbelka12. Podczas gdy tkanka rozprasza się tylko liniowo, niewielka liczba mikropęcherzyków jest wystarczająca, aby osiągnąć wysoką czułość wykrywania w obrazowaniu harmonicznym13,14. To nieliniowe generowanie kontrastu może być nawet wystarczająco silne, aby śledzić pojedyncze bąbelki w body15.

Powłoka ultradźwiękowego środka kontrastowego stabilizuje pęcherzyki przed rozpuszczeniem i koalescencją, wydłużając tym samym czas ich krążenia w puli krwi16. Otoczka może składać się z lipidów, polimerów lub zdenaturowanych białek3,8. Zmniejsza napięcie międzyfazowe, ograniczając w ten sposób efekt rozpuszczania pod ciśnieniem Laplace'a17 i tworzy barierę rezystancyjną przed dyfuzją gazów18. Aby jeszcze bardziej zwiększyć stabilność, kontrastowe mikropęcherzyki są zwykle wypełnione gazem o dużej masie cząsteczkowej o niskiej rozpuszczalności we krwi11. Otoczka mikropęcherzykowa radykalnie zmienia reakcję mikropęcherzyków na insonację ultradźwiękową11. Niepowlekane pęcherzyki gazu mają charakterystyczną częstotliwość rezonansową, która jest odwrotnie proporcjonalna do ich wielkości, a dodanie powłoki lipidowej zwiększa częstotliwość rezonansową w stosunku do niepowlekanego pęcherzyka ze względu na wewnętrzną sztywność powłoki3. Ponadto powłoka rozprasza energię poprzez lepkość dylatacyjną, która stanowi dominujące źródło tłumienia dla powlekanych pęcherzyków3. Powłoka stabilizująca ma tę dodatkową zaletę, że może być funkcjonalizowana np. poprzez wiązanie ligandów celujących z powierzchnią mikropęcherzyków. To ukierunkowanie umożliwia wiele zastosowań dla tych pęcherzyków, a w szczególności obrazowanie molekularne za pomocą ultradźwięków14,19.

Mikropęcherzykowe środki kontrastowe są bardzo obiecujące w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków za pomocą ultradźwięków. Mikropęcherzyki oscylujące w zamknięciu naczynia krwionośnego mogą powodować mikrostrumienie, a także miejscowe naprężenia normalne i ścinające na ścianie naczynia włosowatego3. Przy wysokich ciśnieniach akustycznych oscylacje o dużej amplitudzie mogą prowadzić do zapadania się mikropęcherzyków w gwałtownym procesie zwanym kawitacją bezwładnościową, co z kolei może prowadzić do pęknięcia lub uszkodzenia naczynia krwionośnego20. Te gwałtowne zjawiska mogą wywoływać efekty biologiczne, takie jak sonopermeation21, zwiększając wynaczynienie leków terapeutycznych do śródmiąższu przez ścianę śródbłonka, zarówno parakomórkowo, jak i transkomórkowo. Może również poprawić przenikanie środków terapeutycznych przez macierz zewnątrzkomórkową guzów bogatych w zręb21,22 i biofilms23,24, chociaż ten mechanizm jest nadal słabo poznany26.

Dostarczanie leków za pośrednictwem ultradźwięków wykazało obiecujące wyniki zarówno przedklinicznie27,28, jak i w badaniach klinicznych22. Co więcej, w przypadku stosowania z ultradźwiękami o stosunkowo niskiej częstotliwości (~1 MHz), doniesiono, że mikropęcherzyki lokalnie i przejściowo zwiększają przepuszczalność bariery krew-mózg, umożliwiając w ten sposób lekom przedostanie się do miąższu mózgu, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych29,30,31,32,33,34.

Generalnie istnieją dwa podejścia do dostarczania leków za pośrednictwem ultradźwięków: materiał terapeutyczny może być podawany jednocześnie z bąbelkami, lub może być dołączony lub załadowany do powłoki bąbelkowej28,35,36. Wykazano, że drugie podejście jest bardziej efektywne pod względem dostarczania leków37. Mikropęcherzyki mogą być wypełnione lekami lub materiałem genetycznym zamkniętym w nanocząstkach (liposomach lub nanokonstrukcjach polimerowych) przymocowanych do otoczki lub włączonych bezpośrednio do otoczki mikropęcherzykowej35,36. Mikropęcherzyki załadowane nanocząstkami mogą być aktywowane przez (zogniskowane) ultradźwięki, aby lokalnie uwolnić ładunek nanocząstek28,33,38,39,40. Jeśli taki mikropęcherzyk jest w bezpośrednim kontakcie z komórką, wykazano in vitro, że ładunek może nawet zostać osadzony na błonie cytoplazmatycznej komórki w procesie zwanym sonoprinting34,35.

Przestrzeń parametrów ultradźwiękowych dla insonacji mikropęcherzyków jest obszerna, a warunki biologiczne in vivo dodatkowo komplikują sprawę. W związku z tym połączenie skoncentrowanych ultradźwięków i mikropęcherzyków naładowanych nanocząstkami stanowi wyzwanie w dziedzinie terapii celowanych.

Celem tej pracy jest dostarczenie protokołów, które mogą być wykorzystane do szczegółowego zobrazowania reakcji mikropęcherzyków w funkcji parametrów ultradźwiękowych oraz do zbadania mechanizmów prowadzących do pęknięcia powłoki i późniejszego uwolnienia materiału znakowanego fluorescencyjnie. Ten zestaw protokołów ma zastosowanie do mikropęcherzyków z otoczkami zawierającymi barwnik fluorescencyjny. Rysunek 1 przedstawia schematyczne przedstawienie mikropęcherzyków stabilizowanych polimerowo-nanocząstkami i-białkami opracowanych w SINTEF (Trondheim, Norwegia). Pęcherzyki te są wypełnione gazem perfluoropropan (C3F8), a nanocząstki stabilizujące otoczkę zawierają NR668, który jest lipofilową pochodną barwnika fluorescencyjnego czerwieni Nilowej38,43. Nanocząstki składają się z cyjanoakrylanu poli(2-etylobutylu) (PEBCA) i są PEGylowane. Funkcjonalizacja glikolem polietylenowym (PEG) zmniejsza opsonizację i fagocytozę przez jednojądrzasty układ fagocytów, wydłużając w ten sposób czas krążenia14,44. W rezultacie, PEGylacja zwiększa ilość nanocząsteczek docierających do miejsca docelowego, poprawiając tym samym skuteczność zabiegu16. Rysunek 2 ilustruje, w jaki sposób zastosowanie czterech metod mikroskopowych pozwala badaczom objąć wszystkie istotne skale czasu i długości. Należy zauważyć, że rozdzielczość przestrzenna osiągalna w mikroskopii optycznej jest określana przez granicę dyfrakcji, która zależy od długości fali światła i apertury numerycznej (NA) obiektywu oraz źródła oświetlenia obiektu45. W przypadku omawianych systemów limit rozdzielczości optycznej wynosi zwykle 200 nm. Dodatkowo, mikroskopia przyżyciowa może być wykorzystana do obrazowania na poziomie subkomórkowym46. W przypadku mikropęcherzyków stabilizowanych nanocząstkami i białkami w tej pracy, minimalna skala długości istotna dla mikroskopii przyżyciowej to wielkość małych naczyń włosowatych (≥10 μm). Eksperymenty z szybkim obrazowaniem optycznym in vitro (10 milionów klatek na sekundę) i szybkim obrazowaniem fluorescencyjnym (500 000 klatek na sekundę) opisano dla pojedynczych mikropęcherzyków. Szybkie obrazowanie w jasnym polu w nanosekundowych skalach czasowych jest odpowiednie do badania rozdzielczej w czasie dynamiki radialnej wibrujących pęcherzyków. Natomiast szybka mikroskopia fluorescencyjna pozwala na bezpośrednią wizualizację uwalniania nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie. Ponadto strukturę otoczki mikropęcherzykowej można badać za pomocą trójwymiarowej (3D) mikroskopii konfokalnej Z-stack oraz skaningowej mikroskopii elektronowej (protokół dla tej ostatniej nie jest uwzględniony w obecnych pracach). Mikroskopia przyżyciowa polega na wykorzystaniu mikroskopii wielofotonowej do obrazowania guzów rosnących w komorach okna grzbietowego w celu dostarczenia w czasie rzeczywistym informacji o lokalnym przepływie krwi i losie znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek in vivo47. Połączenie tych metod mikroskopowych ostatecznie zapewnia szczegółowy wgląd w zachowanie terapeutycznych środków mikropęcherzykowych w odpowiedzi na ultradźwięki, zarówno in vitro, jak i in vivo.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Norweskie Władze ds. Badań na Zwierzętach. Szczegóły dotyczące materiałów, które zostały wykorzystane w protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Produkcja mikropęcherzyków

UWAGA: W tej pracy interesujące mikropęcherzyki to mikropęcherzyki stabilizowane białkiem i nanocząstkami, dla których protokół produkcji został opisany wcześniej28,33,48. Dlatego protokół produkcyjny został tutaj krótko podsumowany.

  1. Najpierw, za pomocą pipety, wymieszaj ultraczystą wodę z 0,5% wag. kazeiny w buforowanym fosforaną soli fizjologicznej (PBS) i 1% wag. nanocząstek znakowanych 0,21% wag. barwnika fluorescencyjnego NR668 (modyfikowana czerwień nilowa) w sterylnej szklanej fiolce z zaciskaną nakrętką (10 ml, średnica 2 cm). Nanocząstki polimerowe są przygotowywane przy użyciu metody polimeryzacji mini-emulsyjnej, opisanej przez Mørch i wsp. 38.
    UWAGA: W tym przypadku barwnik pełni funkcję leku modelowego, aby umożliwić wizualizację uwalniania nanocząstek. Podczas pracy z roztworem nanocząstek należy nosić fartuch laboratoryjny, okulary i rękawice. Wszelkie rozlane płyny roztworu nanocząstek należy natychmiast zetrzeć 100% acetonem.
  2. Zakręć fiolkę gumową nakrętką, lekko wymieszaj i umieść fiolkę w kąpieli ultradźwiękowej na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wyeliminowania ewentualnych agregatów. Umieścić narzędzie do dyspersji końcówką mieszadła w odległości ~0.5 cm od dna szklanej fiolki. Za pomocą szklanej pipety podłączonej do pojemnika z gazem dodać perfluoropropan do przestrzeni nad głową fiolki zawierającej roztwór, aż roztwór zacznie lekko bulgotać.
    UWAGA: Owiń folię samouszczelniającą wokół podstawy narzędzia do dyspersji, aby zapobiec ślizganiu się szklanej fiolki podczas mieszania.
  3. Mieszać roztwór energicznie w temperaturze 1935 × g (24 000 obr./min przy promieniu obrotu 3 mm) przez 4 minuty za pomocą narzędzia dyspersyjnego. Zamknąć fiolkę gumową nakrętką i zapieczętować fiolkę do dalszego użycia.
    UWAGA: Mieszanie zatrzymuje gaz w cieczy. Powłoka mikropęcherzykowa następnie składa się samoczynnie bez konieczności wykonywania żadnego aktywnego kroku.
  4. Nadmiar kazeiny i roztworu nanocząstek należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a narzędzie dyspersyjne czyścić 100% acetonem.

2. Obrazowanie pojedynczych pęcherzyków

  1. Mikroskopia konfokalna
    1. Przygotowanie próbki
      1. Rozcieńczyć roztwór pęcherzyków, aby zobrazować pojedyncze mikropęcherzyki w następujący sposób. Umieścić igłę odpowietrzającą (19 G-21 G) w szklanej fiolce z zaciskaną nakrętką, zawierającej mikropęcherzyki wytworzone zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 1. Obrócić fiolkę do góry dnem, aby duże pęcherzyki mogły odsunąć się od uszczelki fiolki.
      2. Włożyć kolejną końcówkę igły (19 g) małej (~1 ml) strzykawki do fiolki, gdy fiolka jest nadal odwrócona do góry dnem. Usunąć niewielką ilość zawiesiny pęcherzykowej i przenieść zawartość strzykawki do małej probówki, aby ułatwić pipetowanie w następnym kroku.
        UWAGA: Objętość zawiesiny do ekstrakcji zależy bezpośrednio od rodzaju i stężenia zawiesiny pęcherzykowej. W tym przypadku wyekstrahowano 0,2 ml.
      3. Za pomocą pipety rozcieńczyć zawiesinę mikropęcherzyków (z sekcji 1) w przefiltrowanym PBS do uzyskania stężenia około 2 × 105 do 6 × 105 mikropęcherzyków/ml, aby umożliwić obrazowanie pojedynczych pęcherzyków.
        UWAGA: W zależności od rodzaju pęcherzyków zaleca się umycie zawiesiny bąbelkowej w celu usunięcia wolnego barwnika fluorescencyjnego. Jest to szczególnie ważne w przypadku pęcherzyków, w przypadku których barwnik fluorescencyjny jest wprowadzany do skorupy. Aby przepłukać pęcherzyki, rozcieńczyć zawiesinę bąbelkową (np. pobierając 100 μl roztworu pęcherzyków w 10 ml PBS) i odwirować ją (zwykle z prędkościami rzędu 100 × g). Na koniec usunąć supernatant zawierający mikropęcherzyki za pomocą pipety do dalszej analizy. Pozostały roztwór zawiera wolne cząstki fluorescencyjne i można go wyrzucić. W razie potrzeby etap prania należy powtórzyć.
      4. Dodaj glicerol do mieszaniny, aby zwiększyć lepkość podłoża i wyeliminować ruch wywołany ruchami Browna, który w przeciwnym razie zakłócałby raczej powolne obrazowanie konfokalne Z-stack.
        UWAGA: Ilość glicerolu zależy od rodzaju pęcherzyka, który jest obrazowany (tutaj ~50%). W przypadku niektórych rodzajów pęcherzyków glicerol może mieć niekorzystny wpływ na stabilność49. Nie zaobserwowano jednak żadnej zauważalnej zmiany w pęcherzykach w ciągu około 30 minut w obrazowaniu konfokalnym. Ponadto glicerol może zmieniać odpowiedź akustyczną mikropęcherzyków i dlatego może być stosowany tylko w metodach obrazowania, w których mikropęcherzyki nie są insonizowane.
      5. Umieść zawiesinę mikropęcherzyków w komorze o cienkich ściankach w celu optymalnego obrazowania, takiej jak szkiełko kanałowe.
    2. Protokół obrazowania
      1. Włącz mikroskop konfokalny i wybierz odpowiedni obiektyw oraz żądany laser i skaner do użycia podczas mikroskopii konfokalnej.
        UWAGA: Tutaj użyj obiektywu 60-krotnego zanurzenia w wodzie o rozdzielczości 0,08 μm/piksel i w zależności od rozmiaru bąbelka wyobraz sobie obszar o wymiarach 256 x 256 pikseli lub 128 x 128 pikseli. W tych konkretnych eksperymentach użyj lasera 488 nm i skanera Galvano. Długość fali emisji zależy od barwnika fluorescencyjnego i jest zazwyczaj szerokopasmowa.
      2. Znajdź mikropęcherzyk w jasnym polu i przełącz się na mikroskopię konfokalną. Ustaw żądaną górną i dolną płaszczyznę, pomiędzy którymi mikroskop konfokalny będzie skanował. Zdobądź stos Z, aby obserwować strukturę 3D; użyć kroku o wielkości 100 nm w kierunku Z.
  2. Mikroskopia w jasnym polu
    1. Montaż układu optycznego
      UWAGA: Schematyczne przedstawienie zestawu mikroskopii jasnego pola jest pokazane na Rysunek 3A. Aby zapewnić niezakłóconą propagację ultradźwięków, łaźnia wodna zawiera dwa otwory: jeden dla źródła światła, a drugi dla przetwornika ultradźwiękowego. Układ optyczny składa się z (modułowego) mikroskopu, szybkiej kamery i dopasowanej optyki. Ponieważ okres oscylacji mikropęcherzyków jest zwykle rzędu 1 μs (przy użyciu ultradźwięków 1 MHz), kamera powinna być ustawiona na nagrywanie z szybkością co najmniej 5 milionów klatek na sekundę. W tym przypadku kamera ma być ustawiona na nagrywanie z prędkością 10 milionów klatek na sekundę (256 x 400 pikseli) przez 256 klatek (25,6 μs), aby uchwycić wszystkie szczegóły dynamiki pęcherzyków, w tym wyższe harmoniczne.
      1. Przymocuj do mikroskopu obiektyw zanurzeniowy w wodzie o odpowiednim powiększeniu, odległości roboczej i NA.
        UWAGA: Zastosowano obiektyw zanurzający w wodzie, aby zapewnić stabilną odległość roboczą pomimo stopniowego parowania wody. W tym przypadku wybrano obiektyw zanurzeniowy w wodzie o powiększeniu 60x, odległości roboczej 2 mm i NA 1.
      2. Do oświetlenia należy użyć światła stroboskopowego o szczytowej mocy wyjściowej co najmniej 1 kW oraz soczewki tubusu między mikroskopem a kamerą, aby zapewnić, że jak najmniej światła otoczenia dociera do matrycy szybkiej kamery.
      3. Użyj ściemnialnego halogenowego źródła światła, aby ustawić ostrość na pojedynczych mikropęcherzykach i wyrównać układ optyczny i akustyczny w celu obrazowania w czasie rzeczywistym.
    2. Montaż systemu akustycznego
      1. Użyj programowalnego generatora przebiegów arbitralnych i wzmacniacza mocy (wzmocnienie 56 dB), aby sterować przetwornikiem z gładką obwiednią i kształtem fali. Podłącz oscyloskop do generatora przebiegów arbitralnych, aby sprawdzić sygnał. Podłącz komputer osobisty do generatora przebiegów arbitralnych, aby zaprogramować przychodzącą falę ciśnienia akustycznego za pomocą skryptu napisanego we własnym zakresie.
      2. Użyj generatora impulsów/opóźnienia jako głównego wyzwalacza do synchronizacji systemów optycznych i akustycznych. Ustaw opóźnienia wyzwalania w generatorze impulsów/opóźnień i oprogramowaniu kamery tak, aby nagrywanie rozpoczynało się 16 μs po transmisji ultradźwiękowej, aby fala ultradźwiękowa mogła dotrzeć do pęcherzyków. Uruchom źródło światła na 1,5 μs przed rozpoczęciem nagrywania, aby zapewnić odpowiednie oświetlenie podczas oscylacji pęcherzyków (patrz Rysunek 3B dla wykresu czasowego).
      3. Wybierz odpowiedni przetwornik o odpowiedniej częstotliwości środkowej. Umieścić go w otworze łaźni wodnej tak, aby był ustawiony pod kątem w stosunku do osi optycznej, aby zminimalizować odbicia od membran uchwytu próbki i zmniejszyć tworzenie się fali stojącej.
        UWAGA: W tym przypadku jednoelementowy przetwornik zanurzeniowy z ogniskowaniem o częstotliwości środkowej 2,25 MHz, odległości ogniskowej 1" i średnicy elementu 0,75" został umieszczony pod kątem 35° w stosunku do osi optycznej. Kalibracja funkcji przenoszenia musi być wykonana przy użyciu tego samego wzmacniacza, który jest używany w systemie akustycznym. Skalibruj funkcję przenoszenia z amplitudy napięcia na amplitudę ciśnienia przetwornika za pomocą hydrofonu światłowodowego w funkcji częstotliwości transmisji ultradźwięków.
    3. Wybór uchwytu na próbkę
      1. Należy użyć uchwytu na próbkę z optycznie i akustycznie przezroczystymi membranami i objętością wystarczająco dużą, aby umożliwić obrazowanie kilku pojedynczych mikropęcherzyków w tej samej próbce.
        UWAGA: W tym przypadku zastosowano kasetę z hodowlą komórkową o objętości 10 ml, powierzchniach błony 25cm2 i grubości błony 175 μm. Ze względu na odbicia akustyczne na dolnej membranie i zakłócenia od fal odbitych przez obiektyw mikroskopu i górną membranę, ciśnienie akustyczne in situ może różnić się od zaprogramowanego w generatorze przebiegów arbitralnych. Umieszczenie przetwornika pod kątem w stosunku do membran uchwytu próbki zmniejsza tworzenie się fali stojącej, ale może zwiększyć odbicia od membran.
      2. Upewnij się, że próbka może być całkowicie zanurzona i znalazła się w ogniskowej zarówno przetwornika, jak i obiektywu mikroskopu. Użyj aluminiowego wspornika przymocowanego do stolika do mikropozycjonowania 3D, aby niezależnie przesunąć uchwyt próbki.
    4. Wyrównanie układów optycznych i akustycznych
      1. Aby translacja 3D wyrównała konfigurację, przymocuj kąpiel wodną do stolika translacji XY i przymocuj stolik do stołu optycznego, aby upewnić się, że nie porusza się podczas eksperymentów. Następnie napełnij łaźnię wodną wodą i włącz ściemnialne halogenowe źródło światła. Podczas wyrównywania przesuń obiektyw mikroskopu na bok, aby zapobiec odbiciom ultradźwiękowym.
      2. Przymocuj hydrofon igłowy (0,2 mm) do ramienia uchwytu próbki i umieść hydrofon igłowy w łaźni wodnej, tak aby końcówka znajdowała się w polu view obiektywu. Włącz wzmacniacz i generator przebiegów arbitralnych; stosować pojedyncze impulsy po 5 do 10 cykli ultradźwiękowych i częstotliwość powtarzania impulsów 15 Hz. Upewnij się, że końcówka hydrofonu jest wyśrodkowana i wyostrzona na obrazie mikroskopowym. Przesuwaj zbiornik w kierunku XY, a igłę w kierunku Z, aż do osiągnięcia maksymalnej amplitudy ciśnienia.
      3. Dostosuj ostrość mikroskopu, aby ponownie ustawić ostrość na końcówce hydrofonu.
        UWAGA: Ten protokół zapewnia wyrównanie między ostrością mikroskopu a ostrością przetwornika. Nie zmieniaj położenia mikroskopu i przetwornika po wyrównaniu.
    5. Przygotowanie próbki
      1. Powtórzyć kroki od 2.1.1.1 do 2.1.1.3 w celu przygotowania roztworu próbki. Rozcieńczyć roztwór pęcherzyków, aby umożliwić obrazowanie pojedynczego pęcherzyka i wykluczyć oddziaływania akustyczne sąsiednich pęcherzyków.
      2. Otworzyć wylot uchwytu na próbkę. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć roztwór próbki do drugiego otworu uchwytu próbki, aż do jego całkowitego napełnienia. Upewnij się, że wewnątrz uchwytu na próbkę nie ma pęcherzyków powietrza, aby zapobiec niepożądanym interakcjom z polem ultradźwiękowym.
      3. Zamknąć oba zawory uchwytu próbki i umieścić uchwyt próbki prostopadle do osi optycznej.
        UWAGA: Utrzymuj napełniony uchwyt próbki poziomo, aby zapobiec przesuwaniu się pęcherzyków na jedną stronę uchwytu próbki podczas ruchu.
    6. Protokół obrazowania
      1. Zaprogramuj żądaną częstotliwość sterowania ultradźwiękami i ciśnienie akustyczne w generatorze przebiegów arbitralnych za pomocą wspomnianego wcześniej własnego skryptu.
        UWAGA: W tym przypadku akustyczna fala ciśnienia była pojedynczym wybuchem 40 cykli, z 8-cyklowym impulsem stożkowym Gaussa. Częstotliwości ultradźwięków stosowane w tych eksperymentach wynosiły 1 MHz, 2 MHz lub 3 MHz, a amplitudy ciśnienia akustycznego wahały się od 81 kPa do 1200 kPa.
      2. Przesunąć uchwyt na próbkę zawierającą roztwór próbki za pomocą stolika XYZ, aby zlokalizować pojedyncze mikropęcherzyki w ognisku mikroskopu. Zacznij od pola widzenia w rogu uchwytu próbki i upewnij się, że krawędź mikropęcherzyków jest wyraźnie widoczna i ostra (patrz Rysunek 3C, aby uzyskać idealny widok z kamery).
      3. Podłącz koniec światłowodu, który był wcześniej podłączony do światła halogenowego, do światła stroboskopowego, tak aby drugi koniec był nadal podłączony do łaźni wodnej. Uruchom nagrywanie.
      4. Powtórzyć kroki od 2.2.6.2 do 2.2.6.3 tyle razy, ile jest to pożądane dla każdego ustawienia ultradźwięków (częstotliwość i ciśnienie akustyczne), przesuwając kasetę hodowli komórkowej zawierającą mikropęcherzyki o co najmniej 2 mm (w płaszczyźnie ogniskowej) od poprzedniego miejsca, aby upewnić się, że mikropęcherzyki w polu widzenia nie są insonizowane w poprzednich doświadczeniach.
        UWAGA: Tutaj każdy eksperyment został powtórzony ~20 razy. Gdy cały uchwyt próbki zostanie poddany insonizacji, opróżnij uchwyt na próbkę i napełnij go świeżym roztworem próbki do kolejnych eksperymentów.
    7. analiza danych
      1. Zastosuj środowisko programistyczne, aby przeprowadzić analizę danych zgodnie z pytaniem badawczym i przeprowadzić wykrywanie krawędzi po przetworzeniu obrazów. Korzystając z funkcji, która mierzy właściwości obszarów obrazu, znajdź środek ciężkości pęcherzyka i pochodną profilu intensywności wokół każdego pęcherzyka, aby wykryć kontur pęcherzyka (a tym samym promień pęcherzyka R). Wyodrębnij odpowiednie parametry z promienia w czasie dla pojedynczych mikropęcherzyków.
        UWAGA: W niniejszym badaniu do przetwarzania obrazu wykorzystano środowisko programistyczne w celu binaryzacji i filtrowania nagrań pojedynczych mikropęcherzyków. Wewnętrzny skrypt został wykorzystany do znalezienia pochodnej profilu intensywności wokół każdego bąbelka.
  3. Mikroskopia fluorescencyjna
    1. Montaż układu optycznego
      1. Zbuduj zestaw do mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 4A), z tą samą bazą, która jest używana w mikroskopii jasnego pola opisanej w sekcji 2.2.
        UWAGA: Konfigurację opisaną w sekcji 2.3 można połączyć z konfiguracją opisaną dla mikroskopii w jasnym polu w sekcji 2.2. Połączenie mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii jasnego pola umożliwia wizualizację rdzenia gazowego z mikropęcherzykami podczas obrazowania uwalniania nanocząstek.
      2. Ustaw szybką kamerę tak, aby nagrywała z szybkością 500 000 klatek na sekundę (400 x 250 pikseli) przez 128 klatek (256 μs).
        UWAGA: Czas obrazowania jest dłuższy niż w eksperymentach w jasnym polu, ponieważ natężenie światła jest ograniczone we fluorescencji, a także dlatego, że skala czasowa, w której następuje dostarczanie cząstek, jest dłuższa niż dynamika pęcherzyków.
      3. Wybierz laser o mocy wystarczająco wysokiej, aby dostarczyć wystarczającą ilość światła i który ma odpowiednią długość fali wzbudzenia, i upewnij się, że jest sprzężony z modulatorem akustyczno-optycznym, aby uniknąć bielenia próbki.
        UWAGA: W tym badaniu do wzbudzenia fluorescencji nanocząstek użyto lasera o fali ciągłej o mocy 5 W i długości fali wzbudzenia 532 nm.
      4. Umieść rozdzielacz wiązki, zwierciadło dichroiczne i filtr wycinający między laserem a obiektywem mikroskopu, aby skierować światło wzbudzenia w kierunku próbki, jednocześnie umożliwiając emisję fluorescencji dotarcie do kamery.
    2. Montaż systemu akustycznego
      1. Do insonizacji mikropęcherzyków należy użyć tego samego układu akustycznego, co w sekcji 2.2.2. Zmień przetwornik w tych konkretnych eksperymentach na jednoelementowy, skoncentrowany przetwornik zanurzeniowy o częstotliwości środkowej 2,25 MHz, odległości ogniskowej 1,88" i średnicy elementu 1". Umieść go pod kątem 35° w stosunku do osi optycznej, aby zminimalizować odbicia od membran uchwytu próbki i zmniejszyć tworzenie się fali stojącej.
    3. Wyrównanie układów optycznych i akustycznych
      1. Powtórzyć czynności opisane w ppkt 2.2.4.
    4. Przygotowanie próbki
      1. Przygotować roztwór próbki zgodnie z opisem w sekcji 2.2.5.
    5. Protokół obrazowania
      1. Ustaw żądaną częstotliwość sterowania ultradźwiękami i amplitudę ciśnienia akustycznego w generatorze przebiegów arbitralnych za pomocą wspomnianego wcześniej własnego skryptu.
        UWAGA: W tym przypadku akustyczna fala ciśnienia została zaprogramowana tak, aby była pojedynczym wybuchem ultradźwięków o długości 140 cykli, z 10-cyklowym impulsem stożkowym Gaussa. Dłuższe czasy trwania impulsów są na ogół wymagane do wywołania efektów biologicznych w porównaniu z tymi, które są wymagane do badania dynamiki pęcherzyków. Częstotliwości ultradźwięków stosowane w tych eksperymentach wynosiły 1 MHz, 2 MHz lub 3 MHz, a amplitudy ciśnienia akustycznego wahały się od 81 kPa do 1200 kPa.
      2. W generatorze impulsów/opóźnień ustaw opóźnienie wyzwalania lasera dla fluorescencyjnego wzbudzenia nanocząstek z mikropęcherzyków podczas nagrywania.
        UWAGA: W przypadku tych konkretnych eksperymentów opóźnienie wyzwalania wynosiło od 20 μs do 170 μs przez łączny czas trwania 150 μs. Diagram taktowania jest pokazany w Rysunek 4B.
      3. Przesunąć uchwyt na próbkę zawierającą roztwór próbki za pomocą stolika XYZ, aby zlokalizować pojedyncze mikropęcherzyki w ognisku mikroskopu. Rozpocząć od pola widzenia narożnika uchwytu na próbki; zobacz Rysunek 4C, aby uzyskać idealny widok z kamery, w którym interfejs mikropęcherzyków jest wyraźnie widoczny i ostry. Uruchom nagrywanie.
      4. Powtórzyć krok 2.3.5.3 tyle razy, ile jest to pożądane dla każdego ustawienia ultradźwięków (częstotliwość i ciśnienie akustyczne), przesuwając kasetę z hodowlą komórkową zawierającą mikropęcherzyki o co najmniej 2 mm (w płaszczyźnie optycznej) od poprzedniego miejsca, aby upewnić się, że mikropęcherzyki w polu widzenia nie są sonikowane w poprzednich doświadczeniach.
        UWAGA: W tym badaniu każdy eksperyment powtórzono ~10-20x. Gdy cały uchwyt próbki zostanie poddany insonizacji, opróżnij uchwyt na próbkę i napełnij go świeżym roztworem próbki do kolejnych eksperymentów. Odległość, na jaką należy przesunąć uchwyt próbki między eksperymentami, zależy od wielkości wiązki akustycznej.
    6. analiza danych
      1. Przeanalizuj zapisy z mikroskopii fluorescencyjnej zgodnie z pytaniem badawczym. Dla każdej mikropęcherzyki określ wizualnie, czy doszło do dostarczenia nanocząstek w eksperymentach mikroskopii fluorescencyjnej. Jeśli dla pojedynczego mikropęcherzyka obserwuje się odrywanie i osadzanie się nanocząstek z rdzenia gazowego na membranie uchwytu próbki, należy ręcznie wprowadzić informację, że dostarczenie nastąpiło w środowisku programowania.

3. Mikroskopia przyżyciowa

  1. Chirurgia komory okiennej grzbietowego fałdu skórnego (opisana wcześniej26,47,50)
    1. Zaaklimatyzuj zwierzęta przez tydzień przed umieszczeniem komór okiennych. Chociaż można używać zarówno samic, jak i samców myszy, a wiek nie ma znaczenia, upewnij się, że waga myszy wynosi co najmniej 22-24 g, aby skóra była wystarczająco elastyczna.
    2. Operację należy wykonać w znieczuleniu ogólnym z śródoperacyjnym i pooperacyjnym leczeniem przeciwbólowym. Znieczulić zwierzę przez podskórne wstrzyknięcie fentanylu (0,05 mg/kg)/medetomidyny (0,5 mg/kg)/midazolamu (5 mg/kg)/wody (2:1:2:5) w dawce 0,1 ml na 10 g masy. Użyj poduszki grzewczej lub lampy grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia.
    3. Delikatnie pociągnąć za podwójną warstwę skóry na grzbiecie zwierzęcia tak, aby skóra znalazła się między dwiema symetrycznymi ramami z polioksymetylenu komory okiennej. Zamocuj komorę, umieszczając dwie wystające przez podwójną warstwę skóry i zszywając wzdłuż górnej krawędzi komory.
    4. Usuń skórę w okrągłej ramie komory po jednej stronie fałdu skórnego. Umieść szkło nakrywkowe o średnicy 11,8 mm w ramce, z której usuwa się skórę, aby utworzyć okienko do tkanki.
    5. Należy podać podskórnie atipemazol (2,5 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) i wodę (1:1:8) w dawce 0,1 ml na 10 g jako antidotum w celu zakończenia znieczulenia. Umieść zwierzę na noc w podgrzewanym stojaku do odzyskiwania. Uzupełnij wodę dla zwierząt o 25 mg/ml enrofloksacyny, aby zapobiec zakażeniu w miejscu operacji.
  2. Tworzenie modelu guza
    1. Utrzymuj komórki rakowe w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 w odpowiedniej pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
      UWAGA: W tym protokole wykorzystano linię komórkową ludzkiego kostniakomięsaka (OHS), ale można również użyć innych linii komórkowych.
    2. Następnego dnia po kroku 3.1.5 znieczulij zwierzę izofluranem (5% podczas indukcji i 1-2% podczas konserwacji) przez kilka minut. Zdejmij szkło nakrywkowe, nałóż 5 × 106 komórek rakowych w 30 μl pożywki do hodowli komórkowych i załóż szkło nakrywkowe.
    3. Pozwól guzom rosnąć przez 2 tygodnie przed obrazowaniem i monitoruj wagę i stan zdrowia zwierząt co najmniej 3 razy w tygodniu w tym okresie.
  3. Montaż układu optycznego
    1. Wykonaj obrazowanie przyżyciowe podczas leczenia ultrasonograficznego (jak opisano w poprzedniej pracy26) za pomocą odpowiedniego mikroskopu i obiektywu, w zależności od pytania badawczego, które jest w trakcie. Zobacz Rysunek 5A dla schematycznego przedstawienia konfiguracji eksperymentalnej.
      UWAGA: W tym konkretnym eksperymencie użyto mikroskopu wielofotonowego, wyposażonego w 20-krotny obiektyw zanurzający w wodzie (NA 1,0 i odległość robocza 2 mm) oraz laser impulsowy. Obrazy zostały pozyskane w trybie skanowania rezonansowego przy 31 klatkach na sekundę (512 x 512 pikseli) przy polu widzenia 400 x 400μm2. Długość fali wzbudzenia wynosiła 790 nm. Filtry przed dwoma detektorami fosforku arsenku galu były długoprzepustowe 590 nm i pasmowo-przepustowe 525/50 nm do wykrywania fluorescencji.
  4. Montaż systemu akustycznego
    1. Zamontuj odpowiedni przetwornik ultradźwiękowy w falowodzie (wykonanym na zamówienie) umieszczonym poniżej obiektywu pod kątem 45° w stosunku do osi optycznej, aby zminimalizować odbicia od szkła nakrywkowego komory okiennej grzbietowego fałdu skórnego i zmniejszyć tworzenie się fali stojącej. Napełnij falowód wodą destylowaną i odgazowaną. Nałóż ultradźwiękowy żel sprzęgający na wierzch falowodu.
  5. Wyrównanie układów optycznych i akustycznych
    1. Wyrównaj oś optyczną z ogniskiem ultradźwięków. Umieść hydrofon światłowodowy w ognisku obiektywu. Następnie włącz wzmacniacz i generator przebiegów arbitralnych, aby wzbudzić przetwornik krótkimi impulsami (5-10 cykli) z częstotliwością powtarzania impulsów 100 Hz i przesuń przetwornik ultradźwiękowy do pozycji, w której wykryte jest najwyższe ciśnienie sygnałem hydrofonu na oscyloskopie.
      UWAGA: Nie zmieniaj położenia przetwornika po wyrównaniu.
  6. Protokół obrazowania
    1. Umieść podgrzewany uchwyt na zwierzę (specjalnie zaprojektowany) podłączony do stolika pozycjonującego XY między falowodem a obiektywem i dodaj więcej żelu sprzęgającego. Znieczulij zwierzę i umieść cewnik do żyły ogonowej. Umieść mysz w podgrzewanym uchwycie i zamocuj komorę okienną w uchwycie. Dodaj kroplę wody na wierzch szkiełka nakrywkowego w komorze okiennej i przesuń obiektyw w miejsce, aby zobrazować tkankę nowotworową.
    2. Rysunek 5B pokazuje diagram czasowy eksperymentów przedstawiający kolejność zdarzeń. Wstrzyknąć dożylnie znakowany fluorescencyjnie dekstran 2 MDa (30 μl, 4 mg/ml rozcieńczony w soli fizjologicznej), aby uwidocznić układ naczyniowy, i poruszać myszą za pomocą etapu translacji XY, aby znaleźć pozycję z odpowiednimi naczyniami krwionośnymi. Zapisz obrazy wyjściowe przed zabiegiem ultradźwięków. Dostosuj liczbę klatek na sekundę, pole widzenia i długość nagrania w zależności od pytania badawczego oraz specyfiki mikroskopu i barwników, które mają być obrazowane.
      UWAGA: W tych eksperymentach zarejestrowano 31 klatek na sekundę przy polu widzenia 400 x 400μm2, a obrazowanie wykonywano w sposób ciągły przez 5 minut.
    3. Ustaw żądaną częstotliwość sterowania ultradźwiękami, długość impulsu i amplitudę ciśnienia akustycznego w generatorze przebiegów arbitralnych.
      UWAGA: W tych eksperymentach użyto częstotliwości 1 MHz o długości impulsu 10 ms i szczytowych amplitudach podciśnienia od 0,2 MPa do 0,8 MPa. Zastosowano częstotliwość powtarzania impulsów 0,5 Hz lub 0,1 Hz, aby umożliwić ponowne przenikanie nowych mikropęcherzyków do leczonego obszaru między impulsami ultradźwiękowymi.
    4. Wstrzyknąć dożylnie 50 μl mikropęcherzyków (2 × 108 do 5 × 108 mikropęcherzyków/ml) i zastosować ultradźwięki podczas obrazowania, zgodnie z opisem w26.
  7. analiza danych
    1. W zależności od pytania badawczego, analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów (open source) i środowiska programistycznego, zgodnie z opisem w26, w celu określenia parametrów naczyń krwionośnych (średnica, rozgałęzienie, prędkość i kierunek przepływu), akumulacji nanocząstek w naczyniach oraz kinetyki i głębokości penetracji wynaczynienia dekstranu i nanocząstek do tkanki nowotworowej.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki, wytworzone zgodnie z opisem w protokole, były analizowane przy użyciu różnych metod mikroskopowych i w różnych skalach czasowych.

Fluorescencja nanocząstek w mikroskopii konfokalnej (Rysunek 6A) wskazuje, że powłoka ma niejednorodny rozkład cząstek. Do charakteryzacji pęcherzyków można zastosować inne metody mikroskopowe. Na przykład, Rysunek 6B pokazuje ogólną strukturę mikropęcherzyka za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, jak przedstawiono w poprzedniej pracy34.

Dynamika radialna i fenomenologiczne zachowanie pęcherzyków mogą być badane za pomocą opisanej metody mikroskopii jasnego pola in vitro, w której mikropęcherzyki były obrazowane z prędkością 10 milionów klatek na sekundę. Promień pojedynczych mikropęcherzyków został z czasem wyodrębniony za pomocą skryptu napisanego we własnym zakresie. Przykład takiej odpowiedzi radialnej pokazano na Rysunek 7.

Sekwencja obrazu typowego udanego dostarczania nanocząstek, opisana w sekcji 2.3.6, jest pokazana w Rysunek 8A. Można zauważyć, że nanocząstki osadzone w powłoce mikropęcherzyków świecą się w wyniku fluorescencji, gdy światło lasera dociera do pęcherzyka. Napędzane insonacją ultradźwiękową nanocząstki fluorescencyjne odrywają się od rdzenia gazowego mikropęcherzyków i osadzają się na membranie uchwytu próbki. Na koniec laser jest wyłączany, a fluorescencyjne nanocząstki nie są już wzbudzane. Nieudane dostarczenie znakowanego fluorescencyjnie ładunku mikropęcherzyków zazwyczaj wygląda jak sekwencja obrazu pokazana na Rysunek 8B, gdzie fluorescencyjne nanocząstki świecą na powłoce mikropęcherzyka, która pozostaje nienaruszona podczas ekspozycji na ultradźwięki.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym podczas ultradźwięków została wykorzystana do zbadania wpływu ultradźwięków i mikropęcherzyków na zachowanie nanocząsteczek we krwi, zwiększenie przepuszczalności naczyń krwionośnych guza i poprawę dostarczania nanocząstek. Można scharakteryzować zakres i kinetykę penetracji do macierzy zewnątrzkomórkowej w funkcji ciśnienia akustycznego, częstotliwości i długości impulsów. Efekt leczenia ultradźwiękami może się różnić w zależności od wielkości i morfologii naczyń oraz wynikającego z tego zamknięcia pęcherzyka. Można określić, w jaki sposób leczenie ultradźwiękami wpływa na przepływ i kierunek krwi. Przykładowy eksperyment pokazujący wynaczynienie nanocząstek w czasie jest pokazany na Rysunek 9 przy indeksie mechanicznym (MI) 0,826. Wyniki przyżyciowej mikroskopii wielofotonowej wyjaśniają przestrzenne i czasowe wynaczynienie nanocząstek podczas ekspozycji na ultradźwięki, co jest bardzo korzystne dla pełnego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw dostarczania nanocząstek za pośrednictwem ultradźwięków i optymalizacji takich technologii26.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie mikropęcherzyka z powłoką z fluorescencyjnie znakowanych nanocząstek polimerowych w denaturowanej kazeinie. Mikropęcherzyki mają zwykle średnicę od 1 μm do 10 μm. Nanocząstki mają średnicę głównie od 100 nm do 200 nm38. Skrót: C3F8 = perfluoropropan gaz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat przedstawiający odpowiednie skale czasu i długości dla mikroskopii jasnego pola, fluorescencji, konfokalnej i przyżyciowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie eksperymentów z mikroskopią jasnego pola. (A) konfiguracja eksperymentalna, (B) schemat czasowy, oraz (C) typowa nagrana klatka. Podziałka w (C) = 10 μm. Skrót: fps = klatki na sekundę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie eksperymentów z mikroskopią fluorescencyjną. (A) konfiguracja eksperymentalna, (B) schemat taktowania, oraz (C) typowa nagrana klatka. Podziałka w (C) = 10 μm. Skrót: fps = klatki na sekundę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Schematyczne przedstawienie eksperymentów mikroskopowych w trybie przyżyciowym. (A) Konfiguracja eksperymentalna, (B) schemat czasowy, oraz (C) typowa zarejestrowana klatka. Podziałka w (C) = 50 μm. Kolor zielony odpowiada dektranowi-FITC, a czerwony nanocząstkom. Skrót: GaAsP = fosforek arsenku galu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Struktura 3D pojedynczej mikropęcherzyki stabilizowanej nanocząstkami i białkiem. (A) Użycie mikroskopii konfokalnej do pokazania nanocząstek, oraz (B) Użycie skaningowego mikroskopu elektronowego do pokazania struktury 3D. (B) został powielony za zgodą 34. podziałka w (A) = 5 μm; podziałka w (B) = 2 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Typowe sferyczne oscylacje mikropęcherzyków o promieniu 2,89 μm stabilizowanych nanocząstkami i białkami sonizowanych przy częstotliwości ultradźwiękowej 1 MHz i amplitudzie ciśnienia akustycznego 142 kPa. (A-D) Obrazy z szybkiego zapisu i odpowiadająca im krzywa promienia pęcherzyka w czasie (na dole). Podziałka = 5 μm, a czerwona linia wskazuje promień początkowy. Profil oświetlenia (dowolne jednostki) jest oznaczony kolorem żółtym. Powiększenie wynosi 120x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Sekwencja obrazów z szybkiej mikroskopii fluorescencyjnej. (A) Pomyślne dostarczenie znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek mikropęcherzyka stabilizowanego nanocząstkami i białkiem, insonizowanego przy częstotliwości ultradźwięków 2 MHz i amplitudzie ciśnienia akustycznego 600 kPa. (B) Nieudane dostarczenie znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek mikropęcherzyka stabilizowanego nanocząstkami i białkiem, insonizowanego przy częstotliwości ultradźwięków 2 MHz i amplitudzie ciśnienia akustycznego 210 kPa. Podziałka = 10 μm. Powiększenie wynosi 120x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Mikroskopia przyżyciowa po insonacji mikropęcherzyków stabilizowanych nanocząstkami i białkami przy częstotliwości ultradźwięków 1 MHz i amplitudzie ciśnienia akustycznego 800 kPa. (A) Nanocząstki w naczyniu, oraz (B) sekwencja obrazu obszaru wskazanego przez biały przerywany kwadrat w (A) przedstawiający wynaczynienie dekstranu (kolor zielony) i nanocząstek (kolor czerwony). Podziałka = 50 μm. Powiększenie wynosi 20x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączono różne metody mikroskopii optycznej, aby uzyskać informacje na temat różnych etapów dostarczania nanocząstek z powierzchni mikropęcherzyków do otaczającego ośrodka. Wykonano obrazowanie oscylacji pęcherzyków, a także obrazowanie uwalniania nanocząstek z otoczki pęcherzyka, wynaczynienia i penetracji przez macierz zewnątrzkomórkową guzów in vivo. Obrazowanie in vitro umożliwia badanie przesiewowe wielu parametrów ultrasonograficznych w porównaniu z bardziej złożonymi konfiguracjami in vivo . Korzyścią płynącą z połączenia tego zakresu metod obrazowania są uzupełniające się informacje, które można uzyskać w różnych skalach czasowych - cecha, która ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania i optymalizacji mikropęcherzyków w celu pomyślnego dostarczenia i uzyskania skuteczności terapeutycznej. Takie podejście jest przydatne do zrozumienia mechanizmów dostarczania wszystkich mikropęcherzyków, w tym konstruktów z nanocząstkami znakowanymi fluorescencyjnie i leków.

Najbardziej krytyczne etapy w metodach mikroskopowych stosowanych do badania pojedynczych mikropęcherzyków są następujące. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej nanocząstki powinny być znakowane fluorescencyjnie, aby umożliwić wizualizację uwalniania cząstek. Ponadto roztwór próbki powinien być wystarczająco rozcieńczony, aby wyizolować pojedyncze mikropęcherzyki do analizy w metodach mikroskopii konfokalnej, jasnego pola i fluorescencji. Ponadto ważne jest, aby wybrać częstotliwość sterowania ultradźwiękami i ciśnienie akustyczne, aby jak najskuteczniej wzbudzić pęcherzyki, a mianowicie w ich rezonansie. W przypadku, gdy pytanie badawcze dotyczy dostarczenia ładunku nanocząstek, odpowiednie parametry ultradźwiękowe powinny być częścią badania. Oprócz rezonansu, pęcherzyki te powinny być również napędzane do lub powyżej progu uwalniania nanocząstek, zwykle przy stosunkowo wysokich amplitudach ciśnienia akustycznego (MI > 0,3)51. W przypadku obrazowania mikroskopowego w jasnym polu bardzo ważne jest, aby wybrać szybką kamerę o wystarczająco dużej liczbie klatek na sekundę, aby zminimalizować rozmycie ruchu i uniknąć aliasingu.

Mikroskopia w jasnym polu jest ograniczona głównie przez liczbę klatek na sekundę i intensywność dostępnych źródeł światła, ponieważ wyższa liczba klatek na sekundę dałaby bardziej szczegółowy wgląd w dynamikę pęcherzyków w rozdzielczości czasowej, ale wymaga intensywniejszego oświetlenia ze względu na krótsze czasy naświetlania. Aby bardziej szczegółowo zbadać uwalnianie cząstek, liczbę klatek na sekundę dla obrazowania fluorescencyjnego można w zasadzie zwiększyć poprzez zwiększenie intensywności światła laserowego. Jednak absorpcja światła laserowego o dużej intensywności przez znakowane fluorescencyjnie mikropęcherzyki generuje ciepło, nawet w przypadku barwników o wysokiej wydajności kwantowej. Ciepło to może zakłócać przeprowadzane eksperymenty, a w skrajnych przypadkach indukować kawitację fototermiczną52. Tak więc w praktyce istnieje ograniczenie zastosowanej płynności lasera. Jednak intensywne oświetlenie laserowe może być również celowo wykorzystywane do indukowania uwalniania cząstek z liposomów53. Temperatura wpływa na dynamikę pęcherzyków i reakcję ultradźwiękową, w zależności od typu pęcherzyka54. W związku z tym, aby obiektywnie porównać metody in vitro i przyżyciowe, metody in vitro omówione w protokole powinny być wykonywane w temperaturze 37 °C. Innym ograniczeniem metod in vitro omówionych w niniejszej pracy jest to, że pęcherzyki nie znajdują się w środowisku swobodnego pola, ponieważ mikropęcherzyki będą unosić się pod membraną uchwytu próbki. Ponadto podczas obrazowania pojedynczych mikropęcherzyków występuje błąd selekcji. Jednak przeprowadzanie powtarzających się eksperymentów na pojedynczych pęcherzykach pozwala na zbadanie wpływu wielkości i usunięcie czynnika zakłócającego - rozkładu wielkości. Jeśli odpowiedź pęcherzyków jako funkcję wielkości może być zrozumiana, podczas gdy stężenie nie jest zbyt wysokie, aby zapobiec interakcjom pęcherzyka-pęcherzyk, można obliczyć reakcję dowolnej populacji pęcherzyków. Wreszcie, zarówno metody mikroskopii jasnego pola, jak i mikroskopii fluorescencyjnej zapewniają wgląd w mikropęcherzyki splątane na dwuwymiarowym (2D) obrazie. Jeśli pytanie badawcze wymaga więcej niż obrazowania 2D, zachowanie pęcherzyków w 3D można rozwiązać, łącząc konfigurację opisaną w protokole z konfiguracją widoku bocznego dla obrazowania wielopłaszczyznowego55.

Alternatywną metodą badania mikropęcherzyków jest charakterystyka akustyczna56. Jednak pomiar echa pojedynczego mikropęcherzyka wymaga zlokalizowania i wyizolowania pojedynczego mikropęcherzyka w wiązce ultradźwiękowej56, co stanowi wyzwanie, z którym zwykle radzi sobie przy użyciu wąskiej rurki lub pęsety optycznej lub akustycznej57,58. Aby akustycznie zwymiarować pęcherzyki, mikropęcherzyki mogą być insonizowane w reżimie rozpraszania geometrycznego przy częstotliwościach znacznie wyższych niż ich częstotliwość rezonansowa, co nie wywołuje wolumetrycznych oscylacji mikropęcherzyków59. Zastosowanie "kamery akustycznej" jest taką metodą obrazowania dynamiki radialnej pojedynczych mikropęcherzyków w odpowiedzi na ultradźwięki, przy czym sonda ultradźwiękowa o wysokiej częstotliwości jest używana do określenia radialnej odpowiedzi pęcherzyka na falę napędową o niskiej częstotliwości60. Wadą tej metody jest to, że można jej użyć tylko do określenia względnej zmiany promienia mikropęcherzyków; W związku z tym potrzebna jest inna metoda wyznaczania bezwzględnego promienia pęcherzyka, np. poprzez obrazowanie optyczne61,62. Wadą metod, w których mikropęcherzyki są wystawione na działanie ultradźwięków o częstotliwościach wyższych niż ich częstotliwość rezonansowa, jest to, że przy tak wysokich częstotliwościach głębokość penetracji jest zmniejszona59, co ogranicza użyteczność w zastosowaniach in vivo. Inne formy mikroskopii mogą być również wykorzystywane do badania mikropęcherzyków, takie jak skaningowa mikroskopia elektronowa, mikroskopia sił atomowych i transmisyjna mikroskopia elektronowa63. Osiągalna rozdzielczość czasoprzestrzenna tych alternatywnych technik mikroskopowych jest jednak na ogół bardziej ograniczona, a techniki te mają tę wadę, że obrazowanie jest wykonywane przed lub po ekspozycji na ultradźwięki za pomocą analizy off-line i zazwyczaj charakteryzują się niską przepustowością63. Inną alternatywą jest zastosowanie metody rozpraszania światła, która może być wykorzystana do badania dynamiki radialnej pojedynczych mikropęcherzyków w czasie rzeczywistym, ale ma niski stosunek sygnału do szumu w porównaniu z metodami rozpraszania akustycznego64.

Mikroskopia przyżyciowa w czasie rzeczywistym podczas ekspozycji na ultradźwięki jest potężną metodą uzyskiwania nowych informacji na temat układu naczyniowego, zachowania mikropęcherzyków, nanocząstek lub innych cząsteczek (takich jak w tym przypadku dekstran) podczas ekspozycji na ultradźwięki. Ogólnym ograniczeniem podczas wykonywania mikroskopii przyżyciowej w czasie rzeczywistym jest to, że obrazowany jest tylko niewielki obszar tkanki, a głębokość przenikania światła do tkanki jest ograniczona. Jeśli zobrazowane naczynia zawierają bardzo mało mikropęcherzyków i/lub nanocząstek w polu widzenia, można uzyskać niewiele lub nie uzyskać żadnych informacji na temat zachowania i wynaczynienia nanocząstek. Ponadto, ze względu na ograniczone pole widzenia, kluczowe znaczenie ma odpowiednie ustawienie między ścieżkami światła i ultradźwięków. Jeśli ciśnienie ultradźwiękowe jest wystarczająco wysokie, aby wywołać zniszczenie pęcherzyków, ważne jest również, aby wybrać częstotliwość powtarzania impulsów, która umożliwia świeże pęcherzyki reperperperację w polu widzenia między impulsami ultradźwiękowymi. Ponadto, ponieważ ultradźwięki będą odbijać się od szkła nakrywkowego w komorze okiennej i obiektywu, ważne jest ustawienie przetwornika pod kątem, aby zmniejszyć odbicia, aby zapobiec tworzeniu się fal stojących, które zniekształcają skalibrowane pole ciśnienia. Inną praktyczną kwestią jest to, że zestaw musi mieć wystarczająco dużo miejsca, aby zamontować przetwornik ultradźwiękowy i falowód powyżej lub poniżej obiektywu w konfiguracji mikroskopu. Guzy w komorze okna grzbietowego będą miały ograniczoną grubość ze względu na komorę ograniczającą i szkiełko nakrywkowe; Jednak w razie potrzeby można użyć innych modeli. Przykładami są guzy fałdów skórnych, na przykład w poduszeczce tłuszczowej sutka65 lub obrazowanie przyżyciowe guzów w jamie brzusznej różnych narządów66. Takie guzy mogą być hodowane ortotopowo w odpowiednim mikrośrodowisku i jako takie stanowią bardziej istotny klinicznie przypadek.

Metody opisane w tej pracy rzucają światło na potencjał znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków do badania podstaw zastosowań dostarczania leków przy użyciu pęcherzyków i ultradźwięków. Ta kombinacja metod mikroskopowych dostarcza cennych informacji na temat reakcji mikropęcherzyków na insonację ultradźwiękową i związanej z nią przestrzeni parametrów akustycznych, a także przedstawia jasny obraz zachowania mikropęcherzyków i ładunku w odpowiednim zakresie skal czasowych i długości.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 MS/s Dwukanałowy generator przebiegów arbitralnych model 8026Tabor ElectronicsGenerator przebiegów arbitralnych (programowalny)
ENI2100 L, używany w konfiguracji komory okiennej
2 MDa dekstranSigma-Aldrich
33522 AAgilent TechnologiesGenerator arbitralnych kształtów fal, używany w konfiguracji
A1RNikon Instrumenty Mikroskopkonfokalny
ACE ISCHOTTŚciemnialne halogenowe źródło światła AC
AtipemazolOrion PharmaAntidotum na obudzenie zwierzęcia
BaytrilBayerEnrofloksacyna
BD Neoflon 24 GBecton Dickinson & FirmaCewnik do żył ogonowych
BNC model 575Berkely Nucleonics CorporationGenerator impulsów/opóźnień
Myjka ultradźwiękowa Branson 2510BransonKąpiel ultradźwiękowa
Suwak kanałowyIbidi
CLINIcell 25Laboratoires Mabio InternationalKaseta do hodowli komórkowych (objętość 10 mL, powierzchnia błony 25 cm2, grubość membrany 175 &mikro; m)
LightlineCohlibri(5 W, długość fali wzbudzenia 532 nm)
DP03014 Cyfrowy oscyloskop fosforowyOscyloskopTektronix
FentanylActavis Group HFZnieczulenie myszy
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichSuplement do pożywki do hodowli komórkowych
Hydrofon światłowodowyPrecyzja AkustykaSłuży do wyrównywania
FlumanezilFresenius KabiAntidotum na obudzenie zwierzęcia
Podgrzewany uchwyt na zwierzęNiestandardowy projektStalowy uchwyt, w którym mysz jest umieszczona na boku we wnęce wielkości myszy, z komorą okienną leżącą płasko i unieruchomioną z każdej strony. Pod komorą znajduje się otwór w uchwycie zapewniający kontakt akustyczny między przetwornikiem a skórą. Uchwyt jest podgrzewany do maksymalnej temperatury 37° C, a temperatura jest kontrolowana przez sprzężenie zwrotne z sondy temperatury doodbytniczej w myszy. Uchwyt jest zamontowany na stoliku pozycjonującym XY, dzięki czemu zwierzę może być poruszane niezależnie, aby obrazować różne obszary komory okiennej
Hyper Vision HPV-X2ShimadzuSzybka
kamera ImageJNational Institutes of Health  oraz Laboratorium Oprzyrządowania Optycznego i Obliczeniowego, programprzetwarzania obrazów open source
In vivo SliceScopeScientificaMikroskop wielofotonowy
IsofluraneBaxter
ISOTONBeckman CoulterFiltrowany, buforowany fosforanem roztwór soli
fizjologicznej LUMPLFLN60XWOlympusObiektyw do zanurzenia w wodzie (powiększenie 60x, odległość robocza 2 mm)
MaiTai DeepSeeSpectra-PhysicsLaser pulsacyjny
MATLABMathworksŚrodowisko programistyczne
MedetomidineOrion PharmaZnieczulenie myszy
MidazolamAccord Healthcare LimitedZnieczulenie myszy
Milli-QMerckWoda ultraczysta
MVS 7010 Stroboskop ksenonowy o wysokiej intensywnościPerkinElmerŚwiatło stroboskopowe
Panametrics-NDT C305OlympusJednoelementowy przetwornik zanurzeniowy z ostrością (częstotliwość środkowa 2,25 MHz, odległość ogniskowa 1", średnica 1")
Panametrics-NDT V304OlympusJednoelementowy przetwornik zanurzeniowy z ogniskowaniem (częstotliwość środkowa 2,25 MHz, odległość ogniskowa 1,88 ", średnica 1,25")
PenicylinaSigma-AldrichDodatek do pożywki do hodowli komórkowych przed implantacją guza u zwierząt
Gaz perfluoropropanF2 Chemikalia
Roswell Park Memorial Institute 1640Gibco Thermo-FisherPożywka do hodowli komórkowych
Safe-Lock rurkaEppendorf
StreptomycinSigma-AldrichDodatek do pożywki do hodowli komórkowych przed implantacją guza u zwierząt
T 25 basic ULTRA-TURRAXIKA technologiaNarzędzie dyspersyjne
TDS 210Oscyloskop Tektronix, używany w konfiguracji komory okiennej
PrzetwornikPrecision Acoustics Ltdużywany w konfiguracji komory okiennej
U-TLUOlympusSoczewka tubusu
VBA100-200WzmacniaczVectawave
Komory okienneWykonanena zamówienie Używany w konfiguracji komory okiennej
XLUMPLFLN20 XWOlympus20x Stopień zanurzenia w wodzie
XY(Z)Thorlabs
Wzmacniacz komory okiennejLaser Uniwersytetu Wisconsin laboratoryjna

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Szabo, T. L. Diagnostic ultrasound imaging: inside out. , Academic Press. (2004).
  2. Paefgen, V., Doleschel, D., Kiessling, F. Evolution of contrast agents for ultrasound imaging and ultrasound-mediated drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 197(2015).
  3. Versluis, M., Stride, E., Lajoinie, G., Dollet, B., Segers, T. Ultrasound contrast agents modeling. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (9), 2117-2144 (2020).
  4. Coelho-Filho, O. R., Rickers, C., Kwong, R. Y., Jerosch-Herold, M. MR myocardial perfusion imaging. Radiology. 266 (3), 701-715 (2013).
  5. Pandharipande, P. V., Krinsky, G. A., Rusinek, H., Lee, V. S. Perfusion imaging of the liver: current challenges and future goals. Radiology. 234 (3), 661-673 (2005).
  6. Weidner, N., Carroll, P. R., Flax, J., Blumenfeld, W., Folkman, J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. The American Journal of Pathology. 143 (2), 401-409 (1993).
  7. Quaia, E. Classification and safety of microbubble-based contrast agents. Contrast Media in Ultrasonography. Medical Radiology (Diagnostic Imaging). Quaia, E. , Springer. Berlin, Heidelberg. 3-14 (2005).
  8. Unger, E. C., Porter, T., Culp, W., Labell, R., Matsunaga, T., Zutshi, R. Therapeutic applications of lipid-coated microbubbles. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (9), 1291-1314 (2004).
  9. Blomley, M. J. K., Cooke, J. C., Unger, E. C., Monaghan, M. J., Cosgrove, D. O. Microbubble contrast agents: a new era in ultrasound. BMJ. 322 (7296), 1222-1225 (2001).
  10. Faez, T., et al. 20 years of ultrasound contrast agent modeling. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency control. 60 (1), 7-20 (2012).
  11. De Jong, N., Emmer, M., Van Wamel, A., Versluis, M. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Medical & Biological Engineering & Computing. 47 (8), 861-873 (2009).
  12. De Jong, N. Acoustic properties of ultrasound contrast agents. , (1993).
  13. Schneider, M. Characteristics of sonovueTM. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
  14. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  15. Averkiou, M. A., Powers, J., Skyba, D., Bruce, M., Jensen, S. Ultrasound contrast imaging research. Ultrasound Quarterly. 19 (1), 27-37 (2003).
  16. Snipstad, S., et al. Contact-mediated intracellular delivery of hydrophobic drugs from polymeric nanoparticles. Cancer Nanotechnology. 5 (1), 8(2014).
  17. Epstein, P. S., Plesset, M. S. On the stability of gas bubbles in liquid-gas solutions. The Journal of Chemical Physics. 18 (11), 1505-1509 (1950).
  18. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  19. Deshpande, N., Needles, A., Willmann, J. K. Molecular ultrasound imaging: current status and future directions. Clinical Radiology. 65 (7), 567-581 (2010).
  20. Miller, M. W., Miller, D. L., Brayman, A. A. A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective. Ultrasound in Medicine & Biology. 22 (9), 1131-1154 (1996).
  21. Snipstad, S., et al. Sonopermeation to improve drug delivery to tumors: from fundamental understanding to clinical translation. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (12), 1249-1261 (2018).
  22. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  23. May, J. -N., et al. Multimodal and multiscale optical imaging of nanomedicine delivery across the blood-brain barrier upon sonopermeation. Theranostics. 10 (4), 1948-1959 (2020).
  24. Carmen, J. C., et al. Ultrasonic-enhanced gentamicin transport through colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Journal of Infection and Chemotherapy. 10 (4), 193-199 (2004).
  25. Runyan, C. M., et al. Low-frequency ultrasound increases outer membrane permeability of Pseudomonas aeruginosa. The Journal of General and Applied Microbiology. 52 (5), 295-301 (2006).
  26. Yemane, P. T., et al. Effect of ultrasound on the vasculature and extravasation of nanoscale particles imaged in real time. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (11), 3028-3041 (2019).
  27. van Wamel, A., et al. Acoustic Cluster Therapy (ACT) enhances the therapeutic efficacy of paclitaxel and Abraxane® for treatment of human prostate adenocarcinoma in mice. Journal of Controlled Release. 236, 15-21 (2016).
  28. Snipstad, S., et al. Ultrasound improves the delivery and therapeutic effect of nanoparticle-stabilized microbubbles in breast cancer xenografts. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  29. Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30 (7), 979-989 (2004).
  30. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  31. Aslund, A. K. O., et al. Nanoparticle delivery to the brain-By focused ultrasound and self-assembled nanoparticle-stabilized microbubbles. Journal of Controlled Release. 220, 287-294 (2015).
  32. Downs, M. E., Buch, A., Karakatsani, M., Konofagou, E. E., Ferrera, V. P. Blood-brain barrier opening in behaving non-human primates via focused ultrasound with systemically administered microbubbles. Scientific Reports. 5, 15076(2015).
  33. Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102(2018).
  34. Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103(2019).
  35. Lentacker, I., et al. Lipoplex-loaded microbubbles for gene delivery: a Trojan Horse controlled by ultrasound. Advanced Functional Materials. 17 (12), 1910-1916 (2007).
  36. De Temmerman, M., et al. mRNA-Lipoplex loaded microbubble contrast agents for ultrasound-assisted transfection of dendritic cells. Biomaterials. 32 (34), 9128-9135 (2011).
  37. Burke, C. W., Alexander, E., Timbie, K., Kilbanov, A. L., Price, R. J. Ultrasound-activated agents comprised of 5FU-bearing nanoparticles bonded to microbubbles inhibit solid tumor growth and improve survival. Molecular Therapy. 22 (2), 321-328 (2014).
  38. Mørch, Ý, et al. Nanoparticle-stabilized microbubbles for multimodal imaging and drug delivery. Contrast Media & Molecular Imaging. 10 (5), 356-366 (2015).
  39. Jamburidze, A., et al. Nanoparticle-coated microbubbles for combined ultrasound imaging and drug delivery. Langmuir. 35 (31), 10087-10096 (2019).
  40. Snipstad, S., et al. Sonopermeation enhances uptake and therapeutic effect of free and encapsulated cabazitaxel. Ultrasound in Medicine and Biology. , (2021).
  41. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  42. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250(2019).
  43. Klymchenko, A. S., et al. Highly lipophilic fluorescent dyes in nano-emulsions: towards bright non-leaking nano-droplets. RSC Advances. 2 (31), 11876(2012).
  44. Aslund, A. K. O., et al. Quantification and qualitative effects of different PEGylations on Poly (butyl cyanoacrylate) Nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 14 (8), 2560-2569 (2017).
  45. Born, M., Wolf, E. Principles of optics: electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge; New York. (1999).
  46. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  47. Hak, S., Reitan, N. K., Haraldseth, O., de Lange Davies, C. Intravital microscopy in window chambers: a unique tool to study tumor angiogenesis and delivery of nanoparticles. Angiogenesis. 13 (2), 113-130 (2010).
  48. Fusser, M., et al. Cabazitaxel-loaded Poly (2-ethylbutyl cyanoacrylate) nanoparticles improve treatment efficacy in a patient derived breast cancer xenograft. Journal of Controlled Release. 293, 183-192 (2019).
  49. Abou-Saleh, R. H., et al. Molecular effects of glycerol on lipid monolayers at the gas-liquid interface: impact on microbubble physical and mechanical properties. Langmuir. 35 (31), 10097-10105 (2019).
  50. Seynhaeve, A. L. B., ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e55115(2018).
  51. Luan, Y., et al. Lipid shedding from single oscillating microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (8), 1834-1846 (2014).
  52. Lajoinie, G., et al. Ultrafast vapourization dynamics of laser-activated polymeric microcapsules. Nature Communications. 5 (1), 1-8 (2014).
  53. Mathiyazhakan, M., et al. Non-invasive controlled release from gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes through pulse laser induced microbubble cavitation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 126, 569-574 (2015).
  54. Vos, H. J., Emmer, M., de Jong, N. Oscillation of single microbubbles at room versus body temperature. 2008 IEEE Ultrasonics Symposium. , 982-984 (2008).
  55. Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall-a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
  56. Sijl, J., et al. Acoustic characterization of single ultrasound contrast agent microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (6), 4091-4097 (2008).
  57. Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90 (11), 114103(2007).
  58. Baresch, D., Garbin, V. Acoustic trapping of microbubbles in complex environments and controlled payload release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15490-15496 (2020).
  59. Maresca, D., et al. Acoustic sizing of an ultrasound contrast agent. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (10), 1713-1721 (2010).
  60. Renaud, G., Bosch, J. G., vander Steen, A. F. W., de Jong, N. An "acoustical camera" for in vitro characterization of contrast agent microbubble vibrations. Applied Physics Letters. 100 (10), 101911(2012).
  61. Renaud, G., Bosch, J. G., Van Der Steen, A. F. W., De Jong, N. Low-amplitude non-linear volume vibrations of single microbubbles measured with an "acoustical camera.". Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (6), 1282-1295 (2014).
  62. Luan, Y., et al. Combined optical sizing and acoustical characterization of single freely-floating microbubbles. Applied Physics Letters. 109 (23), (2016).
  63. Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: Fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10 (1), 011501(2016).
  64. Guan, J., Matula, T. J. Using light scattering to measure the response of individual ultrasound contrast microbubbles subjected to pulsed ultrasound in vitro. The Journal of the Acoustical Society of America. 116 (5), 2832-2842 (2004).
  65. Sofias, A. M., Åslund, A. K. O., Hagen, N., Grendstad, K., Hak, S. Simple and robust intravital microscopy procedures in hybrid TIE2GFP-BALB/c transgenic mice. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 486-493 (2020).
  66. Ritsma, L., Steller, E. J. A., Ellenbroek, S. I. J., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. M., van Rheenen, J. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbubble Drug DeliveryUltrasound Triggered ReleaseFluorescent MicrobubblesNanoparticle ReleaseConfocal MicroscopyIntravital MicroscopyBrightfield MicroscopyPolymeric NanoparticlesCasein Shell MicrobubblesTumor Vasculature Imaging

Related Articles