Artykuł metodologiczny

Wykrywanie akumulacji β amyloidu za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego w mysim modelu choroby Alzheimera

DOI:

10.3791/62254

⸱

19 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesiology, Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application Technology and NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Narcotic and Psychotropic Drugs, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W neuropatologii choroby Alzheimera, jedną z najważniejszych cech jest odkładanie β amyloidu. W tym protokole opisujemy metodę barwienia immunofluorescencyjnego u transgenicznej myszy 5×FAD w celu wykrycia akumulacji β amyloidu w blaszkach miażdżycowych. Proces perfuzji, kriosekcji, barwienia i kwantyfikacji zostanie szczegółowo opisany.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD) jest chorobą neurodegeneracyjną, która przyczynia się do 60-70% demencji na całym świecie. Jedną z cech charakterystycznych choroby Alzheimera jest niewątpliwie akumulacja β amyloidu (Aβ) w mózgu. Aβ jest wytwarzany w wyniku proteolitycznego rozszczepienia białka prekursorowego beta-amyloidu (APP) przez β-sekretazę i γ-sekretazę. W warunkach patologicznych zwiększone rozszczepienie β APP prowadzi do nadprodukcji Aβ, który agreguje się w blaszki Aβ. Ponieważ blaszki Aβ są charakterystyczne dla patologii AD, wykrywanie ilości Aβ jest bardzo ważne w badaniach nad AD. W tym protokole wprowadzamy metodę barwienia immunofluorescencyjnego w celu wizualizacji osadzania Aβ. Mysi model używany w naszych eksperymentach to 5×FAD, który niesie ze sobą pięć mutacji znalezionych w ludzkiej rodzinnej chorobie Alzheimera. Deficyty neuropatologiczne i behawioralne myszy 5xFAD są dobrze udokumentowane, co czyni go dobrym modelem zwierzęcym do badania patologii Aβ. Wprowadzimy procedurę obejmującą perfuzję przezsercową, kriosekcję, barwienie immunofluorescencyjne i kwantyfikację w celu wykrycia akumulacji Aβ u myszy 5×FAD. Dzięki temu protokołowi naukowcy mogą badać patologię Aβ w mysim modelu AD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD) jest chorobą neurodegeneracyjną, która powoduje 60%-70% demencji na całym świecie i kosztuje dużo zasobów społecznych1. Powszechnie wiadomo, że akumulacja β amyloidu (Aβ) jest patologiczną cechą charakterystyczną choroby Alzheimera. Białko prekursorowe amyloidu (APP) jest integralnym białkiem błonowym, które występuje w wielu tkankach. Peptyd Aβ, składający się z 36-42 aminokwasów2, jest wytwarzany przez późniejsze rozszczepienie β- i γ-sekretazy w APP3,4. Zmiany w rozszczepieniu APP i mutacje w genie APP prowadzą do nadprodukcji ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Xuzhou oraz zgodnie z wytycznymi chińskich przepisów rządowych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Perfuzja myszy

UWAGA: Więcej szczegółów na temat procedury perfuzji można znaleźć w filmie z laboratorium Wiliama Shaina 11.

  1. Znieczulenie transgenicznych myszy 5×FAD (C57BL/6J) 1% pentobarbitalem sodu (50 mg/kg masy ciała) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe12,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy wyżej opisanych procedur barwienia immunofluorescencyjnego, aby zbadać depozycję akumulacji Aβ u myszy 5×FAD w różnym wieku. Rysunek 3 przedstawia typowe wyniki i nieoptymalne wyniki przy użyciu naszego protokołu. Wycinki mózgu 5-miesięcznych i 8-miesięcznych heterozygotycznych myszy transgenicznych 5×FAD oraz 4 do 6-miesięcznej grupy kontrolnej typu dzikiego wybarwiono przeciwciałem 6E10 i wykryto pod mikroskopem fluorescencyjnym. Rysunek 3A pokazuje akumulację .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała 6E10 może specyficznie wykryć akumulację Aβ w mózgu, co można łatwo określić ilościowo za pomocą obrazu J. Warto zauważyć, że kilka kluczowych kroków w tym protokole może mieć wpływ na wyniki.

Aby zapobiec odklejaniu się lub pękaniu plastrów pokazanych na rysunku 3C, należy zwrócić uwagę na kilka kluczowych punktów. Perfuzja powinna przebiegać szybko po wykonaniu nacięcia na przeponie ze względu na nieodwrac.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez ogólny projekt Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (numer grantu: 81974157) od Chińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych, profesurę specjalną Jiangsu (dla C.L.) z Departamentu Edukacji Jiangsu, Program Zespołu Innowacyjnego i Przedsiębiorczego w prowincji Jiangsu (dla H.Z., A. L., W.W., C.L. i Y.S.), grant startowy dla doskonałych talentów (D2019025) oraz Program Szkolenia w zakresie Innowacji i Przedsiębiorczości (201910313038Z do Z.S., Y.X., M.Z. i J.D.) z Uniwersytetu Medycznego Xuzhou. Badania te były również wspierane przez National Demonstration Center for Experimental Basic Medical Science Education (Uniwersytet Medyczny Xuzhou).....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anesthetia
Strzykawka iniekcyjnaKLMEDICAL1 ml
Pentobarbitual soduSigma-AldrichP37611% w soli fizjologicznej do iniekcji i.p
. Torakotomia:
IRIS-Fine Nożyczki do prostej tęczówki (~11,5 cm)RWDS12010-11
Ostre zakrzywione nożyczki chirurgiczne(11,5 cm)RWDS14016-11
Kleszcze preparacyjne proste (~10,5 cm)RWDF12010-10
perfuzja
Rurka odśrodkowa (5 mL)iniekcyjna Biosharp
KLMEDICAL20 ml
ParaformaldehydVicmed VIH100
PBS 0,01M (PH7,2-7,4) proszekVicmedVC2001PDodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać roztwór
< mocny>Utrwalanie, odwadnianie i kriosekcję
adhezyjne szkiełka mikroskopoweCITOTEST18810576,2 mm i razy; 25,4 mm
Kriostat mikrotomowyLEICACM1950
Związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)Sakura Finetek4583
SacharozaVETECV900116
Barwienie immunofluorescencyjne
Mikroskop fluorescencyjnyOLYMPUSIX-81
Kozioł anty-mysi IgG (H+L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11005200X
Image-Pro Plus 7.0CMedia CybernetykaNaukowe oprogramowanie do tworzenia wykresów i analizy danych
Immunohistochemiczne mokre pudełko (czarne)SinylabDostosowane300 mm i czasy; 100 mm & razy; 38 mm, głębokość rowka 27 mm, może zawierać 10 standardowych prowadnic
PipetThermo Scientific
Końcówkido pipetDobrze oferuje
plastikowe pudełko do barwieniaSinylabDostosowane30 ml, może zawierać 5 standardowych szkiełek
Podstawowy bufor do rozcieńczania przeciwciałwykonany w naszym laboratorium1% BSA 1g, 0,3% Triton X-100 300ul, 0,01% azydek sodu 10 mg w 100 ml PBS
Oczyszczony anty beta-amyloid, przeciwciało 1-16 (6E10)BiolegendSIG-39320500X
Szybki roztwór do odzyskiwania antygenu do zamrażania SekcjeKeyGEN BioTECHKGIHC0055X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1GraphpadOprogramowanie do mapowania medycznego
Obraz J Fidżi 2.0.0Narodowy Instytut ZdrowiaNaukowe oprogramowanie do tworzenia wykresów i analizy danych
Strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burns, A., Iliffe, S. Alzheimer's disease. BMJ. 338, 158(2009).
  2. Leong, Y. Q., Ng, K. Y., Chye, S. M., Ling, A. P. K., Koh, R. Y. Mechanisms of action of amyloid-beta and its precursor protein in neuronal cell death. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 11-30 (2020).
  3. Tiwari,....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

beta amyloidblaszki amyloidowebia ko prekursorowe beta amyloidumyszy 5xFADperfuzja przezsercowakriosekcjonowanieilo ciowe oznaczanie blaszek
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły