Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikrokropelki z powłoką dimetylodioktadecyloamoniową ze zmianą fazową jako obiecujący system dostarczania leków: wyniki dotyczące sferoid 3D komórek nowotworowych ssaków

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62255

⸱

14 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Sciences and Technologies, University of Rome Tor Vergata, 2Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Mikrokropelki dekafluoropentanu opracowane z otoczką bromku dimetylodioctamidomoniowego wykazywały wyjątkową stabilność koloidalną i aktywny biointerfejs. DDAB-MD okazały się skutecznymi rezerwuarami leków charakteryzującymi się wysokim powinowactwem do błon plazmatycznych wraz ze zwiększonym wychwytem i aktywnością przeciwnowotworową doksorubicyny przeciwko ludzkiemu potrójnie ujemnemu modelowi 3D raka piersi (MDA-MB-231).

Streszczenie

Znacząca poprawa mikrokropel perfluorowęglowodoru zmiennofazowych (MDs) w rozległym scenariuszu teranostycznym przebiega poprzez optymalizację składu MDs pod względem wydajności syntezy, stabilności i zdolności dostarczania leków. W tym celu zaprojektowano dekafluoropentan (DFP) MD stabilizowany powłoką kationowego środka powierzchniowo czynnego bromku dimetylodioktadiamoniowego (DDAB). Wysokie stężenie DDAB-MD można było łatwo uzyskać w ciągu kilku sekund za pomocą pulsacyjnej insonacji o dużej mocy, co skutkowało kroplami o niskiej polidyspersji o wielkości 1 μm. Wysoce dodatni potencjał ζ, wraz z długimi, nasyconymi łańcuchami węglowodorowymi powłoki DDAB, są kluczowymi czynnikami stabilizującymi kroplę i znajdujący się w niej ładunek leku. Wysokie powinowactwo powłoki DDAB do błony komórkowej plazmatyki pozwala na miejscowe dostarczanie chemioterapeutyków poprzez zwiększenie stężenia leku na granicy komórek nowotworowych i zwiększenie wychwytu. To przekształciłoby DDAB-MD w odpowiednie narzędzie dostarczania leków wykazujące wysoką aktywność przeciwnowotworową przy bardzo niskich dawkach leków.

W tej pracy wykazano, że skuteczność takiego podejścia znacznie poprawia działanie doksorubicyny przeciwko sferoidom 3D komórek nowotworowych ssaków, MDA-MB-231. Zastosowanie trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych opracowanych w postaci wielokomórkowych sferoid nowotworowych (tj. gęsto upakowanych komórek w kulistym kształcie) ma wiele zalet w porównaniu z hodowlami komórkowymi 2D: oprócz tego, że ma potencjał wypełnienia luki między konwencjonalnymi badaniami in vitro a testami na zwierzętach, poprawi zdolność do wykonywania bardziej predykcyjnych badań in vitro Testy przesiewowe na potrzeby przedklinicznego opracowywania leków lub oceny potencjału leków off-label i nowych strategii współukierunkowania.

Wprowadzenie

Wektory dostarczania leków, które są w stanie zapewnić wysoką skuteczność przeciwnowotworową i zmniejszyć skutki uboczne, są głównymi celami, pozostając jednocześnie poważnym wyzwaniem chemiczno-farmaceutycznym1,2. Do tej pory ich postęp jest początkowo ograniczony przez kontrast między niewystarczającym uwalnianiem leku in situ a krytycznym poziomem toksyczności nieswoistej3,4,5. W ostatnich latach wdrożono kilka systemów dostarczania leków w celu usprawnienia podawania środków przeciwnowotworowych, w tym liposomów, miceli polimerowych, polimeromów6,7,8,9,10. Systemy te wykazują potencjał w wydłużaniu czasu krążenia i selektywności leków, przy jednoczesnym zmniejszaniu dystrybucji i akumulacji w zdrowych narządach i tkankach. W każdym razie, kapsułkowane preparaty przeciwnowotworowych leków stosowanych w chemioterapii, takich jak antracykliny, doprowadziły do znacznego zmniejszenia skuteczności internalizacji leków. Ostatnio reagujące na bodźce nośniki mikronowe i submikronowe, takie jak mikropęcherzyki11, mikrokropelki, hybrydowe nanocząstki złota12, nanohydrożele13, rusztowania PLGA i platformy mezoporowate14, zyskują zainteresowanie farmakologiczne ze względu na ich dużą wszechstronność w celowaniu i wywieraniu efektów hamujących nowotwór za pomocą doksorubicyny (Dox) i docetakselu. Pionierskie eksperymenty mające na celu przekształcenie tych nosicieli w skutecznych żołnierzy przeciwnowotworowych do zadań multimodalnych (tj. chemioterapii, fototermii i synergii genów) oraz obrazowania molekularnego15 utorowały drogę do spersonalizowanej nanomedycyny teranostycznej.

W tym scenariuszu, mikrokropelki perfluorowęglowodoru zmiennofazowe (MDs) zostały ocenione pod kątem kluczowej możliwości, jaką oferują do koniugacji wysokiego obciążenia ładunkiem leku, chemicznej wszechstronności powłoki MDs adresującej bariery biologiczne, stabilności koloidalnej i wydajności syntezy11,12. Dodatkowym atutem jest echogeniczność MD promowana przez akustyczne lub optyczne odparowanie rdzenia perfluorowęglowodorowego (PFC), co pozwala na uzyskanie obrazowania in situ i obiecującej skuteczności terapeutycznej. Co więcej, parowanie rdzenia MD uzyskane przez uwolnienie energii wiązek cząstek jonizujących może być wykorzystane do śledzenia wiązki i dozymetrii promieniowania.

Niniejsze badanie ma na celu opracowanie mikrokropelek dekafluoropentanu (DFP) stabilizowanych przez wielokrotną użyteczną powłokę kationowego środka powierzchniowo czynnego bromku dimetylodioktadiamoniowego (DDAB). DDAB shelled-MD spełniają zarówno oczekiwania fizykochemiczne, jak i biologiczne. Wykazano, że mikrokropelki na bazie DFP są cennymi środkami kontrastowymi zmiennofazowymi w celu uzyskania biokompatybilnego i stabilnego perfluorowęglowodoru MDs16. Żel krystaliczny DDAB nasyca długie łańcuchy w temperaturze fizjologicznej, głęboko wnikając w rdzeń hydrofobowy, stabilizując kroplę i znajdujący się w niej ładunek leku. Co więcej, wysoki dodatni potencjał ζ na granicy faz wody zwiększa stabilność koloidalną MD. Atrakcyjność biologiczna powierzchni powłoki DDAB polega na zdolności do powodowania śmierci bakterii i grzybów w stężeniach, które prawie nie wpływają na komórki ssaków, oraz do wiązania błon plazmatycznych, ujemnie naładowanych białek antygenowych, nukleotydów, DNA lub nanocząstek. Wyżej wymienione cechy mogą być wykorzystane do wygenerowania niezwykłego immunoadiuwanta, terapii genowej i działania przeciwnowotworowego w komórkach ssaków17.

DDAB-MD (Dox@DDAB-MDs) z ładunkiem Dox, opisane tutaj, promują uwalnianie leku przeciwko wysoce agresywnym, inwazyjnym i słabo zróżnicowanym potrójnie ujemnym komórkom raka piersi. Poniżej opisano prosty i szybki protokół oparty na insonacji sondy o dużej mocy w celu uzyskania stabilnych DDAB-MD o dużej gęstości i wąskim rozkładzie wielkości z wysoką wydajnością ładowania Dox w jednoetapowej formule. Takie cechy są konkurencyjne nawet dla innych metod przygotowania, takich jak urządzenia mikroprzepływowe i homogenizatory o wysokim ścinaniu16.

Innym poważnym problemem ograniczającym w projektowaniu efektywnych wektorów dostarczania leków jest to, że aktywność leku jest funkcją różnych parametrów (np. absorpcji, dystrybucji, stężeń) możliwych do uzyskania w rzeczywistym celu biologicznym, które nie mogą być brane pod uwagę przez jednowarstwowe modele komórek18. Z tego powodu historia rozwoju nowych preparatów przeciwnowotworowych jest usiana badaniami in vitro, które niestety okazały się nieskuteczne już na poziomie modeli przedklinicznych na zwierzętach19.

Szczególnie, potrzeba przejścia od hodowli komórkowych do bardziej złożonego i niezawodnego systemu niż badania in vivo i ex vivo jest związana z nieodłącznymi ograniczeniami badań farmakologicznych na hodowlach 2D. W tym kontekście uwzględniono systemy 3D in vitro, takie jak sferoidy, organoidy, narządy na chipie, które symulują morfologię, aktywność i reakcję fizjologiczną bardziej złożonych struktur niż monowarstwy 2D20. W ujęciu przedklinicznym modele komórek 3D naśladujące mikrośrodowisko komórkowe dają możliwość lepszego zrozumienia złożonej biologii w fizjologicznie bardziej odpowiednim kontekście, w którym tradycyjne kultury jednowarstwowe nie są skuteczne21,22.

Po udowodnieniu, że DDAB-MDs mogą oddziaływać z błoną komórkową ludzkich komórek raka piersi, sprzyjając internalizacji leku i śmierci komórek przy bardzo niskim (nanomolowym) stężeniu Dox, skuteczność takiej metodologii przeciwko sferoidom 3D komórek nowotworowych ssaków, MDA-MB-231, została przetestowana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie odczynniki i instrumenty są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Wytwarzanie i charakterystyka mikrokropel

  1. Przygotowanie MDs z DDAB obciążonych Dox
    1. Rozpuścić proszek DDAB w etanolu, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM i objętość końcową 1 mL. Przygotować 1 mL roztworu zapasowego Dox, rozpuszczając 2 mg proszku Dox w etanolu.
      UWAGA: Dox wykazuje ostrą toksyczność doustną (kategoria 4) oraz rakotwórczość (kategoria 1B). Stosować wyłącznie pod wyciągiem z użyciem rękawiczek i maseczki ochronnej.
    2. Dodać 250 µL DFP do 300 µL roztworu DDAB (faza olejowa) w plastikowej konicznej probówce wirówkowej o pojemności 15 mL.
      UWAGA: Czystość DFP wynosi 60% (GC), gęstość 1,6 g/mL (20 °C), temperatura wrzenia wynosi 55 °C. Czystość Dox wynosi 98,0-102,0% (HPLC). Czystość DDAB wynosi ≥98% (TLC). Czystość etanolu wynosi 97%.
    3. Ostrożnie dodać 2,15 mL wody dejonizowanej do fazy olejowej, tworząc dwufazową mieszaninę woda/olej. Tuż przed sonikacją wstrzyknąć ostrożnie 10 µL roztworu Dox bezpośrednio do fazy olejowej, aby uniknąć przejścia znacznej ilości Dox do fazy wodnej.
    4. Zemulgować mieszaninę dwufazową za pomocą sonikacji sondą (z tytanową mikrokońcówką stożkową 1/8 cala), używając wysokointensywnego procesora ultradźwiękowego do cieczy w trybie impulsowym (0,7 s włączony i 0,3 s wyłączony) przy 20 kHz, 100 W przez 10 s. Bezzwłocznie rozcieńczyć świeżo przygotowane MDs ultrafiltrowaną wodą dejonizowaną (np. MilliQ) w stopniu 1,8.
      UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia ma charakter orientacyjny i został dobrany empirycznie. Roztwór MDs można rozcieńczyć bardziej, o ile z kolejnych wirowań uda się uzyskać wystarczającą ilość osadu.
    5. Pobrać 1 mL otrzymanej zawiesiny i wirować 3 razy, resuspendując w ultrafiltrowanej wodzie dejonizowanej (np. MilliQ), aby usunąć nadmiar Dox i etanolu. Pierwsze wirowanie przeprowadzić przy 25 °C, 360 xg przez 3 min, a drugie i trzecie przy 280 x g w tej samej temperaturze i czasie.
    6. Po ostatnim przemyciu usunąć nadsącz i pobrać 5 µL osadu, a następnie zdyspergować go w 2 mL medium do traktowania komórek, uzyskując równoważne stężenie Dox wynoszące 10 nM. Kroki procedury syntezy Dox@DDAB-MDs przedstawiono na Rysunku 1.
      UWAGA: Równoważne stężenie Dox definiuje się jako ilość wolnego Dox zawartą w tej samej objętości zawiesiny Dox@DDAB-MDs.
  2. Charakterystyka MDs z DDAB obciążonych Dox
    1. Zmierzyć rozkład wielkości za pomocą fotometru do dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i przeanalizować uzyskane korelogramy algorytmem CONTIN w celu ekstrapolacji powiązanych czasów zaniku. Następnie wykorzystać czasy zaniku do wyznaczenia rozkładu współczynników dyfuzji cząstek (D) i przeliczyć je na rozkład średnic hydrodynamicznych (2RH) korzystając z relacji Stokesa-Einsteina RH = kBT/6πηD, gdzie kBT to energia termiczna układu, a η to lepkość rozpuszczalnika.
    2. Zweryfikować wielkość i rozkład wielkości również za pomocą mikroskopii w jasnym polu z użyciem oprogramowania do analizy obrazu (np. Image J), mierząc wielkość co najmniej 100 kropli na klatkę (dla 3 lub 4 klatek) w celu uzyskania wartości średniej i odchylenia standardowego.
      UWAGA: Do pomiarów DLS rozcieńczyć roztwór MDs w ultrafiltrowanej wodzie dejonizowanej (np. MilliQ), PBS i w medium do hodowli komórkowej do stałego stężenia 1,5 x 108 MDs/mL, aby uniknąć rozpraszania wstecznego. Dla ultrafiltrowanej wody dejonizowanej, PBS i medium do hodowli komórkowej uzyskano średnie wartości wielkości odpowiednio 1,1 ± 0,1 µm, 1,1 ± 0,25 µm i 1,2 ± 0,2 µm. MDs odzyskane z osadów po wirowaniu nie wykazują żadnych zmian wielkości w granicach błędu.
    3. Użyć szkiełka z komorą do liczenia komórek w mikroskopii w celu oceny stężenia MDs. Komora składa się z dwóch różnych obszarów liczenia o grubości 0,10 mm. Nanieść 10 µL zawiesiny MDs na komorę. Policzyć MDs wewnątrz kwadratu o wymiarach 0,25 x 0,25 nm2 komory za pomocą mikroskopu optycznego z obiektywem dalekosiężnym 40x i przeanalizować wynik za pomocą darmowego oprogramowania do analizy obrazu.
    4. Obliczyć stężenie MDs, wyrażone jako liczba MDs/mL, zgodnie z równaniem:
      Wzór na stężenie kropli, MDs/mL, dla mikroskopii; licznik: policzone krople x 1000.
    5. Zweryfikować internalizację Dox za pomocą obrazowania konfokalnym mikroskopem skaningowym (CLSM), wykorzystując autofluorescencję Dox przy 590 nm. Zmierzyć zawartość Dox za pomocą testu fluorymetrycznego, dyspergując cząstki w ultrafiltrowanej wodzie dejonizowanej lub PBS, wirując je przy 25 °C, 360 x g przez 3 min, a następnie określając ilość wolnego leku poprzez ocenę fluorescencji nadsączu przy 590 nm z wykorzystaniem krzywej kalibracyjnej (zakres liniowości dla stężenia Dox: 2-20 µmol/mL, R2 = 0,99).
      UWAGA: Odjąć uzyskaną wartość od całkowitego stężenia Dox, aby otrzymać ilość enkapsulowanego Dox. Doświadczenie przeprowadzić w trzech powtórzeniach. Efektywność enkapsulacji Dox wynosi 28% ± 2%, obliczona poprzez podzielenie ilości leku Dox w MDs przez całkowitą ilość wprowadzonego Dox.
    6. Przeprowadzić doświadczenia dotyczące uwalniania Dox w czasie, wirując i powtarzając procedurę zgodnie z krokiem 1.2.3, aby uzyskać procent Dox uwolnionego do nadsączu w stosunku do liczby enkapsulowanych cząsteczek. Po pierwszym oznaczeniu powtórzyć procedurę, zmniejszając prędkość wirowania do 280 x g, aby uniknąć rozpadu MDs. Wykreślić krzywą uwalniania w czasie. Sprawdzić, czy stężenie Dox uwolnione do nadsączu w ciągu 24 h osiąga maksimum 20%.
    7. Zmierzyć potencjał ζ przy 37 °C za pomocą dedykowanego urządzenia (np. NanoZetaSizer) i zweryfikować, czy uzyskane wartości wynoszą około 90-100 mV.

2. Wytwarzanie sferoidów w mikrowytłaczanych podłożach nieprzylepnych

  1. Odlewanie mikrokamieni
    1. Umieścić małe formy 3D oraz 1 g czystego proszku agarozy w pojemnikach nadających się do sterylizacji. Sterylizować w autoklawie przez 30 min w cyklu suchym (121 °C).
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 50 mL 0,9% roztworu soli fizjologicznej (NaCl) do szklanej butelki zawierającej wysterylizowaną agarozę, a następnie umieścić ją w kuchence mikrofalowej, aby zagotować i rozpuścić proszek. Pozostawić stopioną agarozę do ostygnięcia do 60 °C i dodać 500 µL do każdej mikroformy, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
      OSTRZEŻENIE: Stopiona agaroza może spowodować poważne oparzenia skóry. Wymagane jest zastosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej.
    3. Usunąć zgielaty agar, ostrożnie wyginając formę i wyjmując nowo powstały substrat. Umieścić substraty na płytce 12-dołkowej i dodać 2 mL świeżej pożywki hodowlanej do każdego dołka. Inkubować przez co najmniej 15 min w celu równoważenia każdego substratu.
      UWAGA: Pożywkę hodowlaną należy przygotować wcześniej i przefiltrować przez filtr 0,22 µm, aby usunąć ewentualne cząsteczki lub zanieczyszczenia.
  2. Wysiewanie komórek
    1. Hodować komórki MDA-MB 231 w pożywce kompletnej (DMEM uzupełnionej o 1% Pen/Strep, 10% FBS i 1% L-Glu) w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji w kolbie T75, odpipekować pożywkę, przepłukać 4 mL DPBS i dodać 3 mL trypsyny/EDTA. Umieścić kolbę w inkubatorze i odczekać do odklejenia się komórek. Kontrolować proces odklejania pod mikroskopem odwróconym (przy powiększeniu 20x) co 5 min.
    2. Zebrać odklejone komórki za pomocą 3 mL DPBS z 10% FBS do probówki 15 mL i wirować przy 235 x g przez 10 min. Odpipekować nadsącz zawierający DPBS i trypsynę/EDTA, a osad komórkowy resuspender w 3 mL świeżej pożywki. Odpipekować 10 µL zawiesiny komórkowej wraz z 10 µL błękitu trypanu i policzyć komórki przy użyciu komory Neubauera.
      UWAGA: Podczas zbierania komórek należy zneutralizować trypsynę/EDTA za pomocą DPBS zawierającego 10% FBS, aby zapobiec uszkodzeniu komórek przez trypsynę podczas etapu wirowania.
    3. Aby uzyskać nominalną średnicę sferoidów 50 µm (~15 komórek/sferoid), rozcieńczyć zawiesinę komórkową do końcowego stężenia 3 840 komórek/190 µL, co pozwoli na uzyskanie 256 sferoidów w małej formie. Alternatywnie, dla średnicy sferoidów 200 µm (~1 000 komórek/sferoid), rozcieńczyć do końcowego stężenia 81 000 komórek/190 µL, co pozwoli na uzyskanie 81 sferoidów w dużej formie, zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 12-dołkowej i przechylić substraty, aby ostrożnie usunąć pożywkę z komory wysiewu komórek. Dodać 190 µL zawiesiny komórkowej do każdego substratu (kroplami) i odczekać 10 min w inkubatorze do hodowli tkanek, aż komórki osiądą.
    5. Dodać 2 mL pożywki otaczającej do każdego dołka i umieścić płytkę wielodołkową z powrotem w inkubatorze. Kontrolować powstawanie sferoidów co 24 h. W razie potrzeby wymienić pożywkę na świeżą.
  3. Zbiór i przetwarzanie sferoidów
    1. Umieścić szalkę Petriego 35 mm zawierającą 2 mL świeżej pożywki w inkubatorze w celu równoważenia przez 10-15 min.
    2. Usunąć pożywkę hodowlaną otaczającą substrat. Za pomocą sterylnej pęsety wyjąć substrat z dołka i odwrócić go nad szalką Petriego. Delikatnie stuknąć w dno substratu, aby sferoidy opadły pod wpływem grawitacji.
    3. Umieścić szalkę Petriego zawierającą sferoidy z powrotem w inkubatorze w celu dalszego przetwarzania. Kroki protokołu wytwarzania sferoidów przedstawiono na Rysunku 2.

3. Traktowanie sferoidów

  1. Usunąć nadsącz z formy i zastąpić go 200 µL dyspersji Dox@DDAB-MDs, przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 1.1.6.
  2. Po 5 min dodać 2 mL/studzienkę pożywki otaczającej w celu równoważenia. Po pożądanym czasie traktowania postępować zgodnie z krokiem 2.1.

4. Charakterystyka wielkości i morfologii sferoidów

  1. Po pożądanym czasie inkubacji sprawdź rozmiar sferoidów, używając obiektywu 40x oraz oprogramowania do przetwarzania obrazów mikroskopowych.
  2. Zmierz rozmiar co najmniej 10 sferoidów, aby zebrać wystarczającą ilość danych do przeprowadzenia odpowiednich analiz statystycznych, a następnie przeanalizuj ich objętości zgodnie z opisem w kroku 7.

5. Test proliferacji/żywotności: mikroskopia fluorescencyjna z barwieniem żywych komórek

UWAGA: Należy postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi wytwarzania sferoidów aż do kroku 2.2.5.

  1. Usunąć nadsącz z formy i zastąpić go 200 µL 4 µM calcein-AM w PBS, a następnie inkubować przez 3 h w temperaturze pokojowej w ciemności. W ciągu ostatnich 20 min inkubacji dodać 10 µg/mL jodku propidyny w celu zabarwienia martwych komórek.
  2. Zebrać sferoidy poprzez odwrócenie podłoża do szalki Petriego zgodnie z krokiem 2.3.2.
  3. Wykonać obrazowanie sferoidów w roztworze barwiącym przy użyciu CLSM z obiektywami 40x/60x i laserem Ar+, ustawiając wzmocnienie oraz otwór pinhole w odpowiedni sposób, aby uzyskać ostre obrazy.

6. Analiza i akwizycja obrazów

  1. Obrazowanie 2D w transmisji i konfokalne
    1. Otwórz oprogramowanie konfokalne (Supplementary File A) i wybierz obiektyw (60x, 40x itp.). Na prawym panelu kliknij Trans, aby wybrać kanał transmisyjny.
    2. Kliknij Live, aby zwizualizować obraz i znaleźć optymalną ostrość. Kliknij Single, aby zatrzymać akwizycję.
    3. W przypadku obrazów konfokalnych kliknij kanały laserowe Red lub Green, w zależności od zastosowanego barwnika fluorescencyjnego. W sekcji pinhole wybierz S-aperture z menu rozwijanego i ustaw wartość w sekcji gain na 6.00 B.
    4. Kliknij Live i ustaw aperturę pinhole oraz gain w celu optymalizacji kontrastu. Kliknij Single, aby zatrzymać akwizycję i zapisać obraz. Nałóż obraz transmisyjny na konfokalny, wybierając odpowiedni kanał na górnym pasku narzędzi.
  2. Obrazowanie konfokalne 3D
    1. Kliknij Z na prawym panelu (Supplementary File B). Kliknij czerwony przycisk, aby zresetować ustawienia.
    2. Wybierz sekcję Ref, kliknij Live i przemieszczając ostrość, wyszukaj płaszczyznę środkową wewnątrz obiektu. Wybierz sekcję Top i przesuń ostrość w górę, aż obiekt zostanie rozmyty i zniknie.
    3. Powtórz krok 6.2.2 dla sekcji dolnej, przesuwając ostrość w dół.
    4. Ustaw wielkość kroku na 0.75 µm. Kliknij Z-stack, a następnie Single, aby rozpocząć skanowanie. Zapisz obrazy w formacie .ics.
  3. Obrazowanie optyczne i analiza
    1. Otwórz oprogramowanie mikroskopu optycznego, wykonaj zdjęcie przy użyciu obiektywu 40x z długą ogniskową lub 20x, naciskając Play na górnym pasku narzędzi. Naciśnij Stop i zapisz obraz.
    2. Na górnym pasku narzędzi kliknij View, Analysis Control, Annotations and Measurements, co otworzy panel z różnymi opcjami (Supplementary file C). W panelu Annotation and Measurements wybierz Semiaxis i kliknij Ellipse.
    3. W oknie Image Search wyszukaj oś, która najlepiej pasuje do kształtu obiektu, i naciśnij Enter na klawiaturze, aby przenieść uzyskaną wartość do tabeli w prawym panelu.
    4. Powtórz krok 6.3.3 dla co najmniej 10 obiektów, aby uzyskać wystarczającą ilość danych. Kliknij Export to Excel Data Sheet, aby wyeksportować dane i je zapisać.
  4. Wizualizacja obrazów 3D Z-Stack i numeryczne obliczanie objętości
    1. Otwórz obraz 3D wykonany mikroskopią konfokalną w oprogramowaniu mikroskopu optycznego (Supplementary file D).
    2. Aby zobaczyć rekonstrukcję 3D, kliknij Show Volume View na pasku narzędzi obrazu; obiekt można obracać w dowolnym kierunku, klikając lewym przyciskiem myszy. Aby wybrać fragment objętości, przytrzymaj klawisz ctrl + lewy przycisk myszy (Supplementary File E).
    3. Naciśnij przycisk x na klawiaturze, aby zrobić migawkę obrazu 3D i ją zapisać.
    4. Aby obliczyć objętość obiektu, kliknij Measure, 3D object measurements, co otworzy panel (Supplementary File, Image F). Kliknij na pasku narzędzi panelu Define 3D threshold i ustaw zoptymalizowany próg, korzystając również z filtrów smooth i clean (Supplementary File, Image G). Kliknij OK, aby w panelu pomiarów obiektów 3D uzyskać różne parametry, w tym objętość.
    5. Kliknij Export to Excel, aby wyeksportować dane i je zapisać.

7. Analiza danych sferoidów

  1. W celu obliczenia objętości sferoidów należy przyjąć przybliżenie struktury 3D jako elipsoidy wydłużonej, szacując oś większą i mniejszą na podstawie projekcji 2D, jak pokazano na wstawce do Rysunku 3.
  2. Należy zweryfikować przybliżenie za pomocą elipsoidy wydłużonej poprzez porównanie objętości obliczonej numerycznie, zgodnie z krokiem 6.4, z wzorem na objętość elipsoidy Równanie objętości elipsoidy \(V=\frac{4}{3}\pi abc\); ilustracja wzoru matematycznego. przy założeniu b>a=c, gdzie a, b i c stanowią osie elipsoidy).
  3. Należy obliczyć średnią objętość dla co najmniej 10 sferoidów oraz odpowiadające im odchylenia standardowe. Jeśli rozkład objętości sferoidów jest normalny, należy zastosować test Dixona w celu zidentyfikowania i odrzucenia wartości odstających. Następnie należy obliczyć stosunek objętości między próbkami traktowanymi a kontrolnymi wraz z propagacją błędu, zgodnie z Rysunkiem 6A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dox@DDAB-MDs opracowano zgodnie z protokołem (Sekcja 1), zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1. Otrzymane MDs składają się z monowarstwy DDAB kapsułkującej rdzeń DFP (Rysunek 1A). Kationowy ładunek DDAB oraz procedura sonikacji zapobiegają tworzeniu się wielowarstwowych struktur DDAB osadzonych na granicy faz DFP i wody23.

Mikrografia CLSM (Rycina 1B) pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby poprawić skuteczność antracyklin jako leków przeciwnowotworowych, w pracy przedstawiono tworzenie kropelek PFC w skorupie DDAB otaczających lek chemioterapeutyczny doksorubicynę (Dox) oraz wpływ takiego preparatu na oddziaływanie z wysoce agresywnymi potrójnie ujemnymi komórkami raka piersi, MDA-MB-231.

Budowa DOX@DDAB-MD
MD ładowane Dox zostały opracowane metodą insonacji z niezwykle szybkim, dobrze odtwarzalnym, przyjaznym dla użytkownika i wydajnym protokołem. Meto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Konflikt interesów: Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Prawa człowieka/zwierząt: Ten artykuł nie zawiera żadnych badań z udziałem ludzi lub zwierząt przeprowadzonych przez któregokolwiek z autorów.

Podziękowania

Ta praca otrzymała dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant AMPHORA (766456).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&mikro-szalka PetriegoIbidi8115635mm wysokości, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-DekafluoropentanSigma-Aldrich138495-42-8b.p. 55° C
12-dołkowa płytkahodowlana Corning
15 ml probówka wirówkowaFalcon89039-664
Szalki 3D-Petriego 12:256Mikrotkanki (Sigma-Aldrich)Z764000-6EAMałe
szalki 3D-Petriego 12:81Mikrotkanki (Sigma-Aldrich)Z764019-6EADuży
inkubator do hodowli 5% CO2, 37° CThermo ScienificHERAcell 150i
50 ml probówka wirówkowaFalcon352070
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, II poziom
CalceinSigma-Aldrich
Calcein-AMSigma-Aldrich148504-34-1 4mMroztwór podstawowy w DMSO
cam sCMOS Andor Zyla 4.2Andor Instruments
Wirówka Hettich Universal 320RHettich Lab. Technologia
DAPISIgma-Aldrich
Bromek dimetylodioktadianoamimoniowy w proszkuSigma-Aldrich3700-67-2
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning15-013-CV
Chlorowodorek doksorubicynySigma-Aldrich25316-40-9
DPBS (zmodyfikowany PBS firmy Dulbecco)Corning21-030-CVpH 7,4
Etanol 70%Sigma-Aldrich
EZ-C1 cyfrowy ecliplseNikon InstrumentsSrebrna wersja 3.91
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Goniometr Corning35-079-CV
BI-200SMBrookhaven Instruments Corporations
Laser Ar+ Spectra Physics
Laser He-NeMelles-Griot
L-GlutammineCorning25-005-CI
Mcroskop Nikon Eclipse TiNikon Instruments
MDA-MB 231 linia komórkowaATCC
Microsoft ExcelMicrosoft
Microplates czytnik SparkTecan grupa
NanoZetaSizer ZSMalvern Instruments LTD
Neubauer ulepszona komora718605
Oprogramowanie NIS ElementsNikon InstrumentsAR 4.30
Pen/StreptoCorning30-002-CI
Fotokorelator BI-9000 ATBrookhaven Instruments Corporations62927-1
Fotometr HC120Brookhaven Instruments CorporationsN° 1275
Pipety i końcówki, różne rozmiaryGilson
Propidium Jodek
, różne rozmiaryCorning
Laser na ciele stałymSuwtech LaserN° 22368
T25 KolbySarstedt83.3910.002
Kolby T75Sarstedt83.3911.002
Trypsyna/EDTA 0,05%EuroCloneECB3052D
Vibra-Cell VCX-400Sonics & Materiały, w tym
Łaźnia37° Z
Pipety serologiczne Propidium wodna

Bibliografia

  1. Aryal, S., Park, H., Leary, J. F., Key, J. Top-down fabrication-based nano/microparticles for molecular imaging and drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 14, 6631-6644 (2019).
  2. Peng, Y., et al. Research and development of drug delivery systems based on drug transporter and nano-formulation. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 15, 220-236 (2020).
  3. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: Where they stand. Cell Death and Disease. 3, 411(2012).
  4. Raj, S., Franco, V. I., Lipshultz, S. E. Anthracycline-induced cardiotoxicity: A review of pathophysiology, diagnosis, and treatment. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16, 315(2014).
  5. Iyer, A. K., Singh, A., Ganta, S., Amiji, M. M. Role of integrated cancer nanomedicine in overcoming drug resistance. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 1784-1802 (2013).
  6. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33, 941-951 (2015).
  7. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: An emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7, 771-782 (2008).
  8. Lammers, T., Hennink, W. E., Storm, G. Tumour-targeted nanomedicines: Principles and practice. British Journal of Cancer. 99, 392-397 (2008).
  9. Couvreur, P., et al. Polycyanoacrylate nanocapsules as potential lysosomotropic carriers: preparation, morphological and sorptive properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 31, 331-332 (1979).
  10. Yordanov, G. G., Dushkin, C. D. Preparation of poly(butylcyanoacrylate) drug carriers by nanoprecipitation using a pre-synthesized polymer and different colloidal stabilizers. Colloid and Polymer Science. 288, 1019-1026 (2010).
  11. Kooiman, K., Vos, H. J., Versluis, M., De Jong, N. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 28-48 (2014).
  12. Fasolato, C., et al. Antifolate SERS-active nanovectors: Quantitative drug nanostructuring and selective cell targeting for effective theranostics. Nanoscale. 11, 15224-15233 (2019).
  13. Cerroni, B., et al. Temperature-tunable nanoparticles for selective biointerface. Biomacromolecules. 16, 1753-1760 (2015).
  14. Chronopoulou, L., et al. PLGA based particles as "drug reservoir" for antitumor drug delivery: characterization and cytotoxicity studies. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 180, 495-502 (2019).
  15. Calderó, G., Paradossi, G. Ultrasound/radiation-responsive emulsions. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 49, 118-132 (2020).
  16. Capece, S., et al. Complex interfaces in 'phase-change' contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 18, 8378-8388 (2016).
  17. Mielczarek, L., et al. In the triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell line, sulforaphane enhances the intracellular accumulation and anticancer action of doxorubicin encapsulated in liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 558, 311-318 (2019).
  18. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230, 16-26 (2015).
  19. Heinonen, T. Better science with human cell-based organ and tissue models. Alternatives to Laboratory Animals. 43, 29-38 (2015).
  20. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  21. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 1-18 (2014).
  22. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  23. Feitosa, E., Karlsson, G., Edwards, K. Unilamellar vesicles obtained by simply mixing dioctadecyldimethylammonium chloride and bromide with water. Chemistry and Physics of Lipids. 140, 66-74 (2006).
  24. Cancerrxgene. Doxorubicin IC50. Genomics of drug sensitivity in cancer. , Available from: https://www.cancerrxgene.org/compound/Doxorubicin/133/overview/ic50 (2020).
  25. Boo, L., et al. Phenotypic and microRNA transcriptomic profiling of the MDA-MB-231 spheroid-enriched CSCs with comparison of MCF- 7 microRNA profiling dataset. PeerJ. 2017, 1-27 (2017).
  26. Domenici, F., Castellano, C., Dell'unto, F., Congiu, A. Temperature-dependent structural changes on DDAB surfactant assemblies evidenced by energy dispersive X-ray diffraction and dynamic light scattering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 95, 170-177 (2012).
  27. Choosakoonkriang, S., et al. Infrared spectroscopic characterization of the interaction of cationic lipids with plasmid DNA. Journal of Biological Chemistry. 276, 8037-8043 (2001).
  28. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  29. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and evaluation of doxorubicin-containing microbubbles for ultrasound-triggered doxorubicin delivery: Cytotoxicity and mechanisms involved. Molecular Therapy. 18, 101-108 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrokrople zmiany fazowejotoczka z dimetyldioctadecylammoniumumikrokrople perfluorow glowetr jwymiarowe sferoidy nowotworowedostarczanie doksorubicynywielokom rkowe sferoidy nowotworowesurfaktant kationowyprzedkliniczny rozw j lek w

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.