Artykuł metodologiczny

Mikrokropelki z powłoką dimetylodioktadecyloamoniową ze zmianą fazową jako obiecujący system dostarczania leków: wyniki dotyczące sferoid 3D komórek nowotworowych ssaków

DOI:

10.3791/62255

⸱

14 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Sciences and Technologies, University of Rome Tor Vergata, 2Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrokropelki dekafluoropentanu opracowane z otoczką bromku dimetylodioctamidomoniowego wykazywały wyjątkową stabilność koloidalną i aktywny biointerfejs. DDAB-MD okazały się skutecznymi rezerwuarami leków charakteryzującymi się wysokim powinowactwem do błon plazmatycznych wraz ze zwiększonym wychwytem i aktywnością przeciwnowotworową doksorubicyny przeciwko ludzkiemu potrójnie ujemnemu modelowi 3D raka piersi (MDA-MB-231).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znacząca poprawa mikrokropel perfluorowęglowodoru zmiennofazowych (MDs) w rozległym scenariuszu teranostycznym przebiega poprzez optymalizację składu MDs pod względem wydajności syntezy, stabilności i zdolności dostarczania leków. W tym celu zaprojektowano dekafluoropentan (DFP) MD stabilizowany powłoką kationowego środka powierzchniowo czynnego bromku dimetylodioktadiamoniowego (DDAB). Wysokie stężenie DDAB-MD można było łatwo uzyskać w ciągu kilku sekund za pomocą pulsacyjnej insonacji o dużej mocy, co skutkowało kroplami o niskiej polidyspersji o wielkości 1 μm. Wysoce dodatni potencjał ζ, wraz z długimi, nasyconymi łańcuchami węglowodorowymi powłoki DDAB, są kluczowymi czynnikami stabilizującymi kroplę i znajdujący się w niej ładunek leku. Wysokie powinowactwo powłoki DDAB do błony komórkowej plazmatyki pozwala na miejscowe dostarczanie chemioterapeutyków poprzez zwiększenie stężenia leku na granicy komórek nowotworowych i zwiększenie wychwytu. To przekształciłoby DDAB-MD w odpowiednie narzędzie dostarczania leków wykazujące wysoką aktywność przeciwnowotworową przy bardzo niskich dawkach leków.

W tej pracy wykazano, że skuteczność takiego podejścia znacznie poprawia działanie doksorubicyny przeciwko sferoidom 3D komórek nowotworowych ssaków, MDA-MB-231. Zastosowanie trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych opracowanych w postaci wielokomórkowych sferoid nowotworowych (tj. gęsto upakowanych komórek w kulistym kształcie) ma wiele zalet w porównaniu z hodowlami komórkowymi 2D: oprócz tego, że ma potencjał wypełnienia luki między konwencjonalnymi badaniami in vitro a testami na zwierzętach, poprawi zdolność do wykonywania bardziej predykcyjnych badań in vitro Testy przesiewowe na potrzeby przedklinicznego opracowywania leków lub oceny potencjału leków off-label i nowych strategii współukierunkowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory dostarczania leków, które są w stanie zapewnić wysoką skuteczność przeciwnowotworową i zmniejszyć skutki uboczne, są głównymi celami, pozostając jednocześnie poważnym wyzwaniem chemiczno-farmaceutycznym1,2. Do tej pory ich postęp jest początkowo ograniczony przez kontrast między niewystarczającym uwalnianiem leku in situ a krytycznym poziomem toksyczności nieswoistej3,4,5. W ostatnich latach wdrożono kilka systemów dostarczania leków w celu usprawnienia podawania środków przeciwnowotworowych, w tym liposomów, miceli polimerowych, polimeromów6,7,8,9,10. Systemy te wykazują potencjał w wydłużaniu czasu krążenia i selektywności leków, przy jednoczesnym zmniejszaniu dystrybucji i akumulacji w zdrowych narządach i tkankach. W każdym razie, kapsułkowane preparaty przeciwnowotworowych leków stosowanych w chemioterapii, takich jak antracykliny, doprowadziły do znacznego zmniejszenia skuteczności internalizacji leków. Ostatnio reagujące na bodźce nośniki mikronowe i submikronowe, takie jak mikropęcherzyki11, mikrokropelki, hybrydowe nanocząstki złota12, nanohydrożele13, rusztowania PLGA i platformy mezoporowate14, zyskują zainteresowanie farmakologiczne ze względu na ich dużą wszechstronność w celowaniu i wywieraniu efektów hamujących nowotwór za pomocą doksorubicyny (Dox) i docetakselu. Pionierskie eksperymenty mające na celu przekształcenie tych nosicieli w skutecznych żołnierzy przeciwnowotworowych do zadań multimodalnych (tj. chemioterapii, fototermii i synergii genów) oraz obrazowania molekularnego15 utorowały drogę do spersonalizowanej nanomedycyny teranostycznej.

W tym scenariuszu, mikrokropelki perfluorowęglowodoru zmiennofazowe (MDs) zostały ocenione pod kątem kluczowej możliwości, jaką oferują do koniugacji wysokiego obciążenia ładunkiem leku, chemicznej wszechstronności powłoki MDs adresującej bariery biologiczne, stabilności koloidalnej i wydajności syntezy11,12. Dodatkowym atutem jest echogeniczność MD promowana przez akustyczne lub optyczne odparowanie rdzenia perfluorowęglowodorowego (PFC), co pozwala na uzyskanie obrazowania in situ i obiecującej skuteczności terapeutycznej. Co więcej, parowanie rdzenia MD uzyskane przez uwolnienie energii wiązek cząstek jonizujących może być wykorzystane do śledzenia wiązki i dozymetrii promieniowania.

Niniejsze badanie ma na celu opracowanie mikrokropelek dekafluoropentanu (DFP) stabilizowanych przez wielokrotną użyteczną powłokę kationowego środka powierzchniowo czynnego bromku dimetylodioktadiamoniowego (DDAB). DDAB shelled-MD spełniają zarówno oczekiwania fizykochemiczne, jak i biologiczne. Wykazano, że mikrokropelki na bazie DFP są cennymi środkami kontrastowymi zmiennofazowymi w celu uzyskania biokompatybilnego i stabilnego perfluorowęglowodoru MDs16. Żel krystaliczny DDAB nasyca długie łańcuchy w temperaturze fizjologicznej, głęboko wnikając w rdzeń hydrofobowy, stabilizując kroplę i znajdujący się w niej ładunek leku. Co więcej, wysoki dodatni potencjał ζ na granicy faz wody zwiększa stabilność koloidalną MD. Atrakcyjność biologiczna powierzchni powłoki DDAB polega na zdolności do powodowania śmierci bakterii i grzybów w stężeniach, które prawie nie wpływają na komórki ssaków, oraz do wiązania błon plazmatycznych, ujemnie naładowanych białek antygenowych, nukleotydów, DNA lub nanocząstek. Wyżej wymienione cechy mogą być wykorzystane do wygenerowania niezwykłego immunoadiuwanta, terapii genowej i działania przeciwnowotworowego w komórkach ssaków17.

DDAB-MD (Dox@DDAB-MDs) z ładunkiem Dox, opisane tutaj, promują uwalnianie leku przeciwko wysoce agresywnym, inwazyjnym i słabo zróżnicowanym potrójnie ujemnym komórkom raka piersi. Poniżej opisano prosty i szybki protokół oparty na insonacji sondy o dużej mocy w celu uzyskania stabilnych DDAB-MD o dużej gęstości i wąskim rozkładzie wielkości z wysoką wydajnością ładowania Dox w jednoetapowej formule. Takie cechy są konkurencyjne nawet dla innych metod przygotowania, takich jak urządzenia mikroprzepływowe i homogenizatory o wysokim ścinaniu16.

Innym poważnym problemem ograniczającym w projektowaniu efektywnych wektorów dostarczania leków jest to, że aktywność leku jest funkcją różnych parametrów (np. absorpcji, dystrybucji, stężeń) możliwych do uzyskania w rzeczywistym celu biologicznym, które nie mogą być brane pod uwagę przez jednowarstwowe modele komórek18. Z tego powodu historia rozwoju nowych preparatów przeciwnowotworowych jest usiana badaniami in vitro, które niestety okazały się nieskuteczne już na poziomie modeli przedklinicznych na zwierzętach19.

Szczególnie, potrzeba przejścia od hodowli komórkowych do bardziej złożonego i niezawodnego systemu niż badania in vivo i ex vivo jest związana z nieodłącznymi ograniczeniami badań farmakologicznych na hodowlach 2D. W tym kontekście uwzględniono systemy 3D in vitro, takie jak sferoidy, organoidy, narządy na chipie, które symulują morfologię, aktywność i reakcję fizjologiczną bardziej złożonych struktur niż monowarstwy 2D20. W ujęciu przedklinicznym modele komórek 3D naśladujące mikrośrodowisko komórkowe dają możliwość lepszego zrozumienia złożonej biologii w fizjologicznie bardziej odpowiednim kontekście, w którym tradycyjne kultury jednowarstwowe nie są skuteczne21,22.

Po udowodnieniu, że DDAB-MDs mogą oddziaływać z błoną komórkową ludzkich komórek raka piersi, sprzyjając internalizacji leku i śmierci komórek przy bardzo niskim (nanomolowym) stężeniu Dox, skuteczność takiej metodologii przeciwko sferoidom 3D komórek nowotworowych ssaków, MDA-MB-231, została przetestowana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie odczynniki i instrumenty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wytwarzanie i charakterystyka mikrokropelek

  1. Przygotowanie DDAB-MD ładowanych przez Dox
    1. Rozpuścić proszek DDAB w etanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM i końcową objętość 1 ml. Przygotować 1 ml roztworu podstawowego Dox, rozpuszczając 2 mg proszku Dox w etanolu.
      UWAGA: Wiadomo, że Dox ma ostrą toksyczność pokarmową kategorii 4 i rakotwórczość kategorii 1B. Stosować tylko pod wyciągiem w rękawiczkach i masce zdrowotnej.
    2. Dodać 250 μl DFP do 300 μl roztworu DDAB (faza olejowa) w 15 ml plastikowej wyskalowanej probówce wirówkowej.
      UWAGA: Czystość DFP wynosi 60% (GC), gęstość 1,6 g/ml (20 °C), temperatura wrzenia 55 °C. Czystość Dox wynosi 98, 0-102, 0% (HPLC). Czystość DDAB wynosi ≥98% (TLC). Czystość etanolu wynosi 97%.
    3. Delikatnie dodaj 2,15 ml wody dejonizowanej do fazy olejowej, tworząc dwufazową mieszaninę wody i oleju. Delikatnie wstrzyknąć 10 μl roztworu Dox bezpośrednio do fazy olejowej bezpośrednio przed insonacją, aby uniknąć podziału znacznej ilości Dox na fazę wodną.
    4. Emulgować dwufazową mieszaninę przez insonację sondy (z mikrokońcówką stożkową 1/8 cala) przy użyciu ultradźwiękowego procesora cieczy o wysokiej intensywności w trybie impulsowym (0,7 s włączonego i 0,3 s wyłączonego) przy 20 kHz, 100 W przez 10 s. Natychmiast rozcieńczyć świeżo przygotowane MD ultrafiltrowaną, dejonizowaną wodą (np. MilliQ) o współczynnik 1,8,
      UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia jest orientacyjny, wybrany empirycznie. Roztwór MDs można rozcieńczyć bardziej, o ile z kolejnych wirowań uzyska się wystarczającą ilość osadów.
    5. Weź 1 ml otrzymanej zawiesiny i odwiruj 3x, ponownie zawieszając w ultrafiltrowanej, dejonizowanej wodzie (np. MilliQ) w celu usunięcia nadmiaru Dox i etanolu. Przeprowadzić pierwsze odwirowanie w temperaturze 25 °C, 360 x g przez 3 minuty, a drugie i trzecie odwirowanie w temperaturze 280 x g w tej samej temperaturze i czasie.
    6. Po ostatnim przemyciu usunąć wodę sklarowaną nad osadem i pobrać 5 μl granulek i rozdzielić je na 2 ml pożywki do obróbki komórek, uzyskując równoważne stężenie Dox 10 nM.Kroki protokołu syntezy Dox@DDAB-MDs są pokazane w Rysunek 1.
      UWAGA: Równoważne stężenie Dox definiuje się jako ilość wolnego Dox zawartego w tej samej objętości zawiesiny Dox@DDAB-MDs.
  2. Charakterystyka DDAB-MD obciążonych Dox
    1. Zmierz rozkład wielkości za pomocą fotometru do dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i przeanalizuj uzyskane korelogramy za pomocą algorytmu CONTIN w celu ekstrapolacji powiązanych czasów zaniku. Następnie użyj czasów rozpadu, aby określić rozkład współczynników dyfuzji cząstek (D) i przelicz je w rozkładzie średnic hydrodynamicznych (2RH) za pomocą zależności Stokesa-Einsteina RH = kBT/6πηD, gdzie kBT jest energią cieplną układu, a η lepkości rozpuszczalnika.
    2. Sprawdź rozmiar i rozkład wielkości również za pomocą mikroskopii jasnego pola z oprogramowaniem do analizy obrazu (np. Obraz J), mierząc wielkość co najmniej 100 kropel na klatkę (dla 3 lub 4 klatek), uzyskując wartość średnią i odchylenie standardowe.
      UWAGA: W przypadku pomiarów DLS rozcieńczyć roztwór MDs w ultrafiltrowanej, dejonizowanej wodzie (np. MilliQ), PBS i w pożywce do hodowli komórkowych, aby uniknąć rozpraszania wstecznego do ustalonego stężenia 1,5 x 108 MDs / ml. Dla ultrafiltrowanej, dejonizowanej wody i PBS w pożywce do hodowli komórkowych uzyskaliśmy średnie wartości wielkości odpowiednio 1,1 ± 0,1 μm, 1,1 ± 0,25 μm i 1,2 ± 0,2 μm. MD odzyskane z granulek, po odwirowaniu, nie wykazują żadnych zmian wielkości w obrębie błędów.
    3. Użyj szkiełka do zliczania komórek do mikroskopii, aby ocenić stężenie MDs. Komora składa się z dwóch różnych obszarów zliczania o grubości 0,10 mm. Umieścić 10 μl zawiesiny MDs nad komorą. Policz MD wewnątrz kwadratu komory o wymiarach 0,25 x 0,25nm2 za pomocą mikroskopu optycznego z obiektywem dalekiego zasięgu 40x i przeanalizuj za pomocą darmowego oprogramowania do analizy obrazu.
    4. Obliczyć stężenie MDs, wyrażone jako liczba MDs/ml, zgodnie z równaniem:
      figure-protocol-1
    5. Sprawdź zinternalizowane obrazy Dox za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) wykorzystujące autofluorescencję Dox przy 590 nm. Zmierzyć zawartość Dox za pomocą testu fluorymetrycznego, dyspergując cząstki w ultrafiltrowanej, dejonizowanej wodzie lub PBS, odwirowując je w temperaturze 25 °C, 360 x g przez 3 minuty, a następnie określając ilość wolnego leku, oceniając fluorescencję supernatantu przy 590 nm z krzywą kalibracyjną (zakres liniowości dla stężenia Dox: 2-20 μmol/ml, R2 = 0,99).
      UWAGA: Odejmij uzyskaną wartość od całkowitego stężenia Dox, aby uzyskać zakapsułkowaną ilość Dox. Wykonaj eksperyment w trzech egzemplarzach. Skuteczność enkapsulacji Dox wynosi 28% ± 2%, obliczona poprzez podzielenie ilości leku Dox w MD przez całkowitą zawartość wdrożonego Dox.
    6. Przeprowadzić eksperymenty uwalniania Dox w czasie, odwirowując i powtarzając procedurę zgodnie z krokiem 1.2.3, aby uzyskać procent Dox uwolniony w supernatancie do liczby zamkniętych w kapsułkach. Po pierwszym oznaczeniu powtórzyć procedurę, zmniejszając prędkość wirowania do 280 x g, aby uniknąć pękania MD. Wykreśl krzywą zwolnienia w czasie. Sprawdzić, czy stężenie Dox uwolnionego w ciągu 24 godzin w supernatance osiąga maksymalnie 20%.
    7. Zmierzyć potencjał ζ w temperaturze 37 °C za pomocą dedykowanej aparatury (np. NanoZetaSizer) i sprawdzić, czy uzyskane wartości wynoszą około 90-100 mV.

2. Wytwarzanie sferoid w mikroformowanych podłożach nieprzylepnych

  1. Mikroformy odlewnicze
    1. Umieść małe foremki 3D i 1 g czystego proszku agarozowego w pojemnikach odpowiednich do sterylizacji. Autoklawować je w autoklawie przez 30 minut w suchym cyklu (121 °C).
    2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 50 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej (NaCl) do szklanej butelki zawierającej wysterylizowaną agarozę i umieść ją w kuchence mikrofalowej, aby zagotować i rozpuścić proszek. Pozostawić stopioną agarozę do ostygnięcia do temperatury 60 °C i dodać 500 μl do każdej mikroformy, unikając tworzenia się pęcherzyków podczas pipetowania.
      UWAGA: Stopiona agaroza może powodować poważne oparzenia skóry. Potrzebne jest odpowiednie środki ochrony osobistej.
    3. Usuń zżelowaną agarozę, ostrożnie zginając formę i usuwając nowo powstałe podłoże. Umieść substraty na 12-dołkowej płytce i dodaj 2 ml świeżej pożywki hodowlanej do dołka. Inkubować przez co najmniej 15 minut, aby zrównoważyć każdy substrat.
      UWAGA: Przygotuj wcześniej pożywkę hodowlaną i przepuść ją przez filtr 0,22 μm, aby usunąć ewentualne cząstki lub zanieczyszczenia.
  2. Wysiewanie komórek
    1. Hodowla komórek MDA-MB 231 z kompletną pożywką (DMEM uzupełnioną 1% Pen/Strep, 10% FBS i 1% L-Glu) w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji w kolbie T75, wyrzuć pożywkę, przepłucz 4 ml DPBS i dodaj 3 ml trypsyny/EDTA. Umieścić kolbę w inkubatorze i poczekać, aż komórki się odłączą. Sprawdzaj oderwanie pod mikroskopem odwróconym (przy 20x) co 5 minut.
    2. Zebrać oderwane komórki z 3 ml DPBS z 10% FBS w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 235 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant zawierający zarówno DPBS, jak i trypsynę/EDTA i ponownie zawiesić komórki w 3 ml świeżej pożywki. Odpipetować 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl trypanblue i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera.
      UWAGA: Podczas zbierania komórek należy zneutralizować trypsynę/EDTA za pomocą DPBS zawierającego 10% FBS, aby zapobiec uszkodzeniu komórek przez trypsynę podczas etapu wirowania.
    3. Aby uzyskać nominalną średnicę sferoidy 50 μm (~15 komórek/sferoidę), należy rozcieńczyć zawiesinę komórek do końcowego stężenia 3,840 komórek/190 μl, co daje 256 sferoid w małej formie. Alternatywnie, dla średnicy sferoidy 200 μm (~1,000 komórek/sferoidę) rozcieńczyć do końcowego stężenia 81,000 komórek/190 μl, co daje 81 sferoid w dużej formie, zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Wyjmij pożywkę hodowlaną z płytki 12-dołkowej i przechyl podłoża, aby ostrożnie usunąć pożywkę z komory wysiewu komórek. Dodać 190 μl zawiesiny komórkowej do każdego substratu (kroplami) i poczekać, aż komórki osiądną przez 10 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    5. Dodać 2 ml otaczającego podłoża do dołka i umieścić wielostudzienkowy z powrotem w inkubatorze. Sprawdzaj, czy nie tworzy się sferoida co 24 godziny. W razie potrzeby wymień na świeże podłoże.
  3. Zbiór i przetwarzanie sferoid
    1. Umieścić w inkubatorze szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 2 ml świeżej pożywki, aby zapewnić równowagę przez 10-15 minut.
    2. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych otaczającą substrat. Za pomocą sterylnej pęsety usuń substrat ze studzienki i odwróć go na szalce Petriego. Delikatnie postukaj w spód podłoża, aby sferoidy opadły grawitacyjnie.
    3. Umieścić szalkę Petriego zawierającą sferoidy z powrotem w inkubatorze w celu dalszego przetwarzania. Kroki protokołu do produkcji sferoid są pokazane w Rysunek 2.

3. Leczenie sferoidów

  1. Usunąć supernatant z formy i zastąpić go 200 μl dyspersji Dox@DDAB-MDs, przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 1.1.6.
  2. Po 5 minutach dodać 2 ml / studzienkę otaczającego podłoża w celu zrównoważenia. Po upływie żądanego czasu zabiegu postępuj zgodnie z krokiem 2.1.

4. Charakterystyka wielkości i morfologii sferoidów

  1. Sprawdź rozmiar sferoidy po pożądanym czasie inkubacji za pomocą obiektywu 40x w połączeniu z oprogramowaniem do przetwarzania obrazu mikroskopu.
  2. Zmierz rozmiar co najmniej 10 sferoid, aby zebrać wystarczającą ilość danych do odpowiednich statystyk i przeanalizować ich objętość zgodnie z opisem w kroku 7.

5. Test proliferacji/żywotności: mikroskopia fluorescencyjna z barwieniem żywych komórek

UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi wytwarzania sferoidów aż do kroku 2.2.5.

  1. Usunąć supernatant z formy i zastąpić go 200 μl 4 μM kalceiny-AM w PBS i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. W ciągu ostatnich 20 minut inkubacji dodać 10 μg/ml jodku propidyny, aby wybarwić martwe komórki.
  2. Zebrać sferoidy, odwracając podłoże na płytkę Petriego zgodnie z krokiem 2.3.2.
  3. Zobrazuj sferoidy w roztworze barwiącym za pomocą CLSM z obiektywami 40x/60x i laserem Ar+, ustawiając wzmocnienie i otwór w odpowiedni sposób, aby uzyskać ostre obrazy.

6. Analiza i akwizycja obrazu

  1. Transmisyjne i konfokalne obrazy 2D
    1. Otwórz oprogramowanie konfokalne (plik uzupełniający A) i wybierz obiektyw (60x, 40x itd.). Na prawym panelu kliknij na Trans, aby wybrać kanał transmisji.
    2. Kliknij na Na żywo, aby wyświetlić obraz i wyszukać zoptymalizowaną ostrość. Kliknij Pojedynczy, aby zatrzymać pobieranie.
    3. Aby uzyskać obrazy konfokalne, kliknij czerwony lub zielony kanał laserowy w zależności od użytego barwnika fluorescencyjnego. W sekcji otworkowej wybierz Przysłona S z menu rozwijanego i ustaw sekcję wzmocnienia na 6.00 B.
    4. Kliknij na żywo i ustaw przysłonę otworkową i wzmocnienie w celu optymalizacji kontrastu. Kliknij Pojedynczy, aby zatrzymać pobieranie i zapisać obraz. Nałóż na siebie obraz transmisyjny i konfokalny, wybierając odpowiedni kanał na górnym pasku narzędzi.
  2. Konfokalne obrazy 3D
    1. Kliknij Z na prawym panelu (Plik uzupełniający B). Kliknij czerwony przycisk, aby zresetować ustawienia.
    2. Wybierz sekcję Ref, kliknij opcję Na żywo i przeszukaj plan mediany wewnątrz obiektu przesuwającego fokus. Zaznacz górną sekcję i przesuwaj fokus w górę, aż obiekt stanie się nieostry i zniknie.
    3. Powtórz krok 6.2.2 dla dolnej sekcji, przesuwając ostrość w dół.
    4. Ustaw rozmiar kroku na 0,75 μm. Kliknij Z-stack, a następnie Single, aby rozpocząć skanowanie. Zapisz obrazy w .ics formacie.
  3. Obrazy i analizy optyczne
    1. Otwórz oprogramowanie mikroskopu optycznego, uchwyć obraz z 40-krotnym długim ogniskowym lub 20-krotnym obiektywem, naciskając przycisk Odtwórz na górnym pasku narzędzi. Naciśnij przycisk Stop i zapisz obraz.
    2. Na górnym pasku narzędzi kliknij Widok, Kontrolka analizy, Adnotacje i Pomiary, otwierając panel z różnymi opcjami (Plik uzupełniający C). W panelu Adnotacje i pomiary wybierz opcję Półoś i kliknij opcję Elipsa.
    3. W wyszukiwaniu obrazów wyszukaj oś, która lepiej pasuje do kształtu obiektu i naciśnij Enter na klawiaturze, aby przenieść uzyskaną wartość na tabelę po prawej stronie.
    4. Powtórz krok 6.3.3 dla co najmniej 10 obiektów, aby uzyskać wystarczającą ilość danych. Kliknij Eksportuj do arkusza danych Excela, aby wyeksportować dane i zapisać je.
  4. Wizualizacja obrazu 3D Z-Stack i obliczenia numeryczne objętości
    1. Otwórz obraz 3D przechwycony za pomocą mikroskopii konfokalnej w oprogramowaniu mikroskopu optycznego (plik uzupełniający D).
    2. Aby zobaczyć rekonstrukcję 3D, kliknij Pokaż widok głośności na pasku narzędzi obrazu; obiekt można obrócić w dowolnym kierunku, klikając lewym przyciskiem myszy. Aby zaznaczyć część woluminu, naciskaj ctrl + lewy myszy (plik uzupełniający E).
    3. Naciśnij przycisk x na klawiaturze, aby zrobić migawkę obrazu 3D i go zapisać.
    4. Aby obliczyć objętość obiektu, kliknij Zmierz, Pomiary obiektów 3D otwierające panel (Plik uzupełniający, Obraz F). Kliknij na pasku narzędzi panelu Zdefiniuj próg 3D i ustaw zoptymalizowany próg, korzystając również z gładkich i czystych filtrów (Plik uzupełniający, Obraz G). Kliknij przycisk OK, aby uzyskać w panelu pomiary obiektów 3D różne parametry, w tym objętość.
    5. Kliknij Eksportuj do Excela, aby wyeksportować dane i zapisać je.

7. Analiza danych sferoidalnych

  1. W przypadku obliczeń objętości sferoid przybliż strukturę 3D za pomocą elipsoidy płaskiej, szacując oś główną i mniejszą za pomocą rzutu 2D, jak pokazano na wstawce Rysunek 3.
  2. Sprawdź poprawność przybliżenia elipsoidy prolate, porównując objętość obliczoną numerycznie, jak pokazano w kroku 6.4, ze wzorem na objętość elipsoidy prolate figure-protocol-2 z b>a=c, gdzie a, b i c są osią elipsoidy).
  3. Obliczyć średnią objętość co najmniej 10 sferoid i odpowiednie odchylenia standardowe. Jeśli rozkład objętości sferoidy jest normalny, zastosuj test Dixona, aby zidentyfikować i odrzucić wartość odstającą. Następnie oblicz stosunek objętości między próbkami poddanymi działaniu substancji a próbkami wraz z propagacją błędu, jak podano w Rysunek 6A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dox@DDAB-MDs zostały opracowane zgodnie z protokołem (Sekcja 1), jak schematycznie opisano w Rysunek 1. Otrzymane MD wykonane są z monowarstwy DDAB otaczającej rdzeń DFP (Rysunek 1A). Ładunek kationowy DDAB i procedura sonikacji pozwalają uniknąć tworzenia się warstw wielopłytkowych DDAB ułożonych na granicy DFP i wody23.

Mikrografia CLSM (Rysunek 1B) pokazuje produkcję skonce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby poprawić skuteczność antracyklin jako leków przeciwnowotworowych, w pracy przedstawiono tworzenie kropelek PFC w skorupie DDAB otaczających lek chemioterapeutyczny doksorubicynę (Dox) oraz wpływ takiego preparatu na oddziaływanie z wysoce agresywnymi potrójnie ujemnymi komórkami raka piersi, MDA-MB-231.

Budowa DOX@DDAB-MD
MD ładowane Dox zostały opracowane metodą insonacji z niezwykle szybkim, dobrze odtwarzalnym, przyjaznym dla użytkownika i wydajnym protokołem. Meto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konflikt interesów: Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Prawa człowieka/zwierząt: Ten artykuł nie zawiera żadnych badań z udziałem ludzi lub zwierząt przeprowadzonych przez któregokolwiek z autorów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca otrzymała dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant AMPHORA (766456).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&mikro-szalka PetriegoIbidi8115635mm wysokości, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-DekafluoropentanSigma-Aldrich138495-42-8b.p. 55° C
12-dołkowa płytkahodowlana Corning
15 ml probówka wirówkowaFalcon89039-664
Szalki 3D-Petriego 12:256Mikrotkanki (Sigma-Aldrich)Z764000-6EAMałe
szalki 3D-Petriego 12:81Mikrotkanki (Sigma-Aldrich)Z764019-6EADuży
inkubator do hodowli 5% CO2, 37° CThermo ScienificHERAcell 150i
50 ml probówka wirówkowaFalcon352070
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, II poziom
CalceinSigma-Aldrich
Calcein-AMSigma-Aldrich148504-34-1 4mMroztwór podstawowy w DMSO
cam sCMOS Andor Zyla 4.2Andor Instruments
Wirówka Hettich Universal 320RHettich Lab. Technologia
DAPISIgma-Aldrich
Bromek dimetylodioktadianoamimoniowy w proszkuSigma-Aldrich3700-67-2
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning15-013-CV
Chlorowodorek doksorubicynySigma-Aldrich25316-40-9
DPBS (zmodyfikowany PBS firmy Dulbecco)Corning21-030-CVpH 7,4
Etanol 70%Sigma-Aldrich
EZ-C1 cyfrowy ecliplseNikon InstrumentsSrebrna wersja 3.91
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Goniometr Corning35-079-CV
BI-200SMBrookhaven Instruments Corporations
Laser Ar+ Spectra Physics
Laser He-NeMelles-Griot
L-GlutammineCorning25-005-CI
Mcroskop Nikon Eclipse TiNikon Instruments
MDA-MB 231 linia komórkowaATCC
Microsoft ExcelMicrosoft
Microplates czytnik SparkTecan grupa
NanoZetaSizer ZSMalvern Instruments LTD
Neubauer ulepszona komora718605
Oprogramowanie NIS ElementsNikon InstrumentsAR 4.30
Pen/StreptoCorning30-002-CI
Fotokorelator BI-9000 ATBrookhaven Instruments Corporations62927-1
Fotometr HC120Brookhaven Instruments CorporationsN° 1275
Pipety i końcówki, różne rozmiaryGilson
Propidium Jodek
, różne rozmiaryCorning
Laser na ciele stałymSuwtech LaserN° 22368
T25 KolbySarstedt83.3910.002
Kolby T75Sarstedt83.3911.002
Trypsyna/EDTA 0,05%EuroCloneECB3052D
Vibra-Cell VCX-400Sonics & Materiały, w tym
Łaźnia37° Z
Pipety serologiczne Propidium wodna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aryal, S., Park, H., Leary, J. F., Key, J. Top-down fabrication-based nano/microparticles for molecular imaging and drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 14, 6631-6644 (2019).
  2. Peng, Y., et al. Research and development of drug delivery systems based on drug transporter and nano-formulation. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 15, 220-236 (2020).
  3. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: Where they stand. Cell Death and Disease. 3, 411(2012).
  4. Raj, S., Franco, V. I., Lipshultz, S. E. Anthracycline-induced cardiotoxicity: A review of pathophysiology, diagnosis, and treatment. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16, 315(2014).
  5. Iyer, A. K., Singh, A., Ganta, S., Amiji, M. M. Role of integrated cancer nanomedicine in overcoming drug resistance. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 1784-1802 (2013).
  6. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33, 941-951 (2015).
  7. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: An emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7, 771-782 (2008).
  8. Lammers, T., Hennink, W. E., Storm, G. Tumour-targeted nanomedicines: Principles and practice. British Journal of Cancer. 99, 392-397 (2008).
  9. Couvreur, P., et al. Polycyanoacrylate nanocapsules as potential lysosomotropic carriers: preparation, morphological and sorptive properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 31, 331-332 (1979).
  10. Yordanov, G. G., Dushkin, C. D. Preparation of poly(butylcyanoacrylate) drug carriers by nanoprecipitation using a pre-synthesized polymer and different colloidal stabilizers. Colloid and Polymer Science. 288, 1019-1026 (2010).
  11. Kooiman, K., Vos, H. J., Versluis, M., De Jong, N. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 28-48 (2014).
  12. Fasolato, C., et al. Antifolate SERS-active nanovectors: Quantitative drug nanostructuring and selective cell targeting for effective theranostics. Nanoscale. 11, 15224-15233 (2019).
  13. Cerroni, B., et al. Temperature-tunable nanoparticles for selective biointerface. Biomacromolecules. 16, 1753-1760 (2015).
  14. Chronopoulou, L., et al. PLGA based particles as "drug reservoir" for antitumor drug delivery: characterization and cytotoxicity studies. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 180, 495-502 (2019).
  15. Calderó, G., Paradossi, G. Ultrasound/radiation-responsive emulsions. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 49, 118-132 (2020).
  16. Capece, S., et al. Complex interfaces in 'phase-change' contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 18, 8378-8388 (2016).
  17. Mielczarek, L., et al. In the triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell line, sulforaphane enhances the intracellular accumulation and anticancer action of doxorubicin encapsulated in liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 558, 311-318 (2019).
  18. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230, 16-26 (2015).
  19. Heinonen, T. Better science with human cell-based organ and tissue models. Alternatives to Laboratory Animals. 43, 29-38 (2015).
  20. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  21. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 1-18 (2014).
  22. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  23. Feitosa, E., Karlsson, G., Edwards, K. Unilamellar vesicles obtained by simply mixing dioctadecyldimethylammonium chloride and bromide with water. Chemistry and Physics of Lipids. 140, 66-74 (2006).
  24. Cancerrxgene. Doxorubicin IC50. Genomics of drug sensitivity in cancer. , Available from: https://www.cancerrxgene.org/compound/Doxorubicin/133/overview/ic50 (2020).
  25. Boo, L., et al. Phenotypic and microRNA transcriptomic profiling of the MDA-MB-231 spheroid-enriched CSCs with comparison of MCF- 7 microRNA profiling dataset. PeerJ. 2017, 1-27 (2017).
  26. Domenici, F., Castellano, C., Dell'unto, F., Congiu, A. Temperature-dependent structural changes on DDAB surfactant assemblies evidenced by energy dispersive X-ray diffraction and dynamic light scattering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 95, 170-177 (2012).
  27. Choosakoonkriang, S., et al. Infrared spectroscopic characterization of the interaction of cationic lipids with plasmid DNA. Journal of Biological Chemistry. 276, 8037-8043 (2001).
  28. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  29. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and evaluation of doxorubicin-containing microbubbles for ultrasound-triggered doxorubicin delivery: Cytotoxicity and mechanisms involved. Molecular Therapy. 18, 101-108 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrokrople zmiany fazowejotoczka z dimetyldioctadecylammoniumumikrokrople perfluorow glowetr jwymiarowe sferoidy nowotworowedostarczanie doksorubicynywielokom rkowe sferoidy nowotworowesurfaktant kationowyprzedkliniczny rozw j lek w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły