Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Podsumowanie

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Streszczenie

Mikroskopia krioelektronowa stała się jednym z najważniejszych narzędzi w badaniach biologicznych, pozwalającym na ujawnienie informacji strukturalnych makromolekuł w rozdzielczości zbliżonej do atomowej. W analizie pojedynczej cząstki zeszklona próbka jest obrazowana za pomocą wiązki elektronów, a detektory na końcu kolumny mikroskopowej wytwarzają filmy tej próbki. Filmy te zawierają tysiące obrazów identycznych cząstek w losowych orientacjach. Dane muszą przejść przez proces przetwarzania obrazu składający się z wielu kroków, aby uzyskać ostateczną objętość zrekonstruowaną w 3D. Celem procesu przetwarzania obrazu jest zidentyfikowanie parametrów akwizycji, aby móc zrekonstruować badaną próbkę. Scipion zapewnia wszystkie narzędzia do stworzenia tego przepływu pracy przy użyciu kilku pakietów przetwarzania obrazów w zintegrowanej strukturze, umożliwiając również śledzenie wyników. W tym artykule przedstawiono i omówiono cały proces przetwarzania obrazu w Scipion z danymi pochodzącymi z rzeczywistego przypadku testowego, podając wszystkie szczegóły niezbędne do przejścia od filmów uzyskanych przez mikroskop do końcowej rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości. Omówiono również moc stosowania narzędzi konsensusu, które umożliwiają łączenie metod i potwierdzanie wyników na każdym etapie przepływu pracy, poprawiając dokładność uzyskanych wyników.

Wprowadzenie

W mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), analiza pojedynczych cząstek (SPA) zeszklonych próbek mrożono-uwodnionych jest jednym z najczęściej stosowanych i udanych wariantów obrazowania makrocząsteczek biologicznych, ponieważ pozwala zrozumieć interakcje molekularne i funkcję zespołów biologicznych¹. Dzieje się tak dzięki niedawnym postępom w tej technice obrazowania, które dały początek "rewolucji rozdzielczości"² i umożliwiły pomyślne określenie biologicznych struktur 3D z rozdzielczością bliską atomowi. Obecnie najwyższa rozdzielczość osiągnięta w SPA cryo-EM wyniosła 1,15 A dla apoferrytyny³ (wpis EMDB: 11668). Na te osiągnięcia technologiczne składają się ulepszenia w przygotowaniu próbek⁴, akwizycji obrazu⁵ oraz metodach przetwarzania obrazu⁶. Ten artykuł skupia się na tym ostatnim punkcie.

Krótko mówiąc, celem metod przetwarzania obrazu jest zidentyfikowanie wszystkich parametrów akwizycji, aby odwrócić proces obrazowania mikroskopu i odzyskać strukturę 3D badanej próbki biologicznej. Parametry te to wzmocnienie kamery, ruch wywołany wiązką, aberracje mikroskopu (głównie rozogniskowanie), orientacja kątowa 3D i translacja każdej cząstki oraz stan konformacyjny w przypadku posiadania próbki ze zmianami konformacyjnymi. Jednak liczba parametrów jest bardzo wysoka, a cryo-EM wymaga stosowania obrazów o niskiej dawce, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, co znacznie zmniejsza stosunek sygnału do szumu (SNR) pozyskiwanych obrazów. W związku z tym problemu nie można jednoznacznie rozwiązać, a wszystkie parametry, które mają zostać obliczone, mogą być jedynie szacunkami. W całym procesie przetwarzania obrazu należy zidentyfikować prawidłowe parametry, odrzucając pozostałe, aby ostatecznie uzyskać rekonstrukcję 3D w wysokiej rozdzielczości.

Dane generowane przez mikroskop są zebrane w ramkach. Upraszczając, ramka zawiera liczbę elektronów, które dotarły do określonej pozycji (piksela) na obrazie, za każdym razem, gdy używane są detektory zliczające elektrony. W określonym polu widzenia zbieranych jest kilka klatek i nazywa się to filmem. Ponieważ niskie dawki elektronów są stosowane w celu uniknięcia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, które mogłyby zniszczyć próbkę, SNR jest bardzo niski, a klatki odpowiadające temu samemu filmowi muszą zostać uśrednione, aby uzyskać obraz ujawniający informacje strukturalne o próbce. Jednak nie tylko prosta średnia jest stosowana, próbka może ulegać przesunięciom i innym rodzajom ruchów w czasie obrazowania z powodu ruchu wywołanego wiązką, który należy skompensować. Klatki z kompensacją przesunięcia i uśrednione tworzą mikrofotografię.

Po uzyskaniu mikrofotografii, musimy oszacować aberracje wprowadzone przez mikroskop dla każdej z nich, zwane Funkcją Transferu Kontrastu (CTF), która reprezentuje zmiany kontrastu mikrofotografii w funkcji częstotliwości. Następnie cząstki można wybrać i wyekstrahować, co nazywa się wybieraniem cząstek. Każda cząstka powinna być małym obrazem zawierającym tylko jedną kopię badanej próbki. Istnieją trzy rodziny algorytmów wybierania cząstek: 1) te, które wykorzystują tylko podstawową parametryzację wyglądu cząstki, aby znaleźć je w całym zestawie mikrofotografii (np. rozmiar cząstek), 2) te, które uczą się, jak wyglądają cząstki od użytkownika lub wstępnie wytrenowanego zestawu, oraz 3) te, które używają szablonów obrazów. Każda rodzina ma inne właściwości, które zostaną pokazane później.

Wyodrębniony zestaw cząstek znalezionych na mikrofotografiach zostanie wykorzystany w procesie klasyfikacji 2D, który ma dwa cele: 1) oczyszczenie zestawu cząstek poprzez odrzucenie podzbioru zawierającego obrazy czystego szumu, nakładające się na siebie cząstki lub inne artefakty, oraz 2) uśrednione cząstki reprezentujące każdą klasę mogą być użyte jako początkowe informacje do obliczenia początkowej objętości 3D.

Początkowe obliczenie objętości 3D to kolejny kluczowy krok. Problem uzyskania struktury 3D może być postrzegany jako problem optymalizacyjny w wielowymiarowym krajobrazie rozwiązań, gdzie globalnym minimum jest najlepsza objętość 3D, która reprezentuje oryginalną strukturę, ale można znaleźć kilka lokalnych minimów reprezentujących nieoptymalne rozwiązania i gdzie bardzo łatwo jest wpaść w pułapkę. Początkowy wolumen stanowi punkt wyjścia dla procesu wyszukiwania, więc złe oszacowanie początkowego wolumenu może uniemożliwić nam znalezienie globalnego minimum. Począwszy od początkowej objętości, etap klasyfikacji 3D pomoże odkryć różne stany konformacyjne i ponownie oczyścić zestaw cząstek; Celem jest uzyskanie strukturalnie jednorodnej populacji cząstek. Następnie etap udoskonalania 3D będzie odpowiedzialny za dopracowanie parametrów kątowych i translacyjnych dla każdej cząstki, aby uzyskać najlepszą możliwą objętość 3D.

Na koniec, w ostatnich krokach, uzyskana rekonstrukcja 3D może zostać wyostrzona i wypolerowana. Ostrzenie to proces wzmacniania wysokich częstotliwości zrekonstruowanej objętości, a polerowanie jest krokiem w kierunku dalszego dopracowania niektórych parametrów, takich jak CTF lub kompensacja ruchu wywołanego wiązką, na poziomie cząstek. Ponadto niektóre procedury walidacji mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia osiągniętej rozdzielczości na końcu przepływu pracy.

Po wszystkich tych krokach, procesy śledzenia i dokowania⁷ pomogą nadać biologiczne znaczenie uzyskanej rekonstrukcji 3D, budując modele atomowe de novo lub dopasowując istniejące modele. Jeśli osiągniemy wysoką rozdzielczość, procesy te powiedzą nam o położeniu struktur biologicznych, a nawet różnych atomów, w naszej strukturze.

Scipion⁸ pozwala na stworzenie całego przepływu pracy, łącząc najważniejsze pakiety przetwarzania obrazów w sposób integracyjny. Xmipp⁹, Relion¹⁰, CryoSPARC¹¹, Eman¹², Spider¹³, Cryolo¹⁴, Ctffind¹⁵, CCP4¹⁶, Phenix¹⁷ i wiele innych pakietów można dołączyć do Scipion. Zawiera również wszystkie niezbędne narzędzia, które zapewniają integrację, interoperacyjność, identyfikowalność i odtwarzalność, aby w pełni śledzić cały przepływ pracy przetwarzania obrazu⁸.

Jednym z najpotężniejszych narzędzi, które Scipion pozwala nam używać, jest konsensus, który oznacza porównywanie wyników uzyskanych za pomocą kilku metod w jednym kroku przetwarzania, tworząc kombinację informacji przekazywanych różnymi metodami w celu wygenerowania dokładniejszego wyniku. Może to przyczynić się do zwiększenia wydajności i poprawy osiągniętej jakości w szacowanych parametrach. Należy pamiętać, że prostszy przepływ pracy można zbudować bez użycia metod konsensusu; Widzieliśmy jednak moc tego narzędzia^22,25, a przepływ pracy przedstawiony w tym manuskrypcie będzie z niego korzystał w kilku krokach.

Wszystkie kroki, które zostały podsumowane w poprzednich akapitach, zostaną szczegółowo wyjaśnione w następnej sekcji i połączone w kompletny przepływ pracy za pomocą Scipion. Pokazane zostanie również, w jaki sposób korzystać z narzędzi konsensusu, aby osiągnąć wyższą zgodność w generowanych produktach. W tym celu wybrano przykładowy zbiór danych rybosomu Plasmodium falciparum 80S (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660). Zestaw danych składa się z 600 filmów składających się z 16 klatek o rozmiarze 4096x4096 pikseli o rozmiarze piksela 1,34Å wykonanych przy użyciu FEI POLARA 300 za pomocą kamery FEI FALCON II, o rozdzielczości zgłoszonej w EMDB to 3,2Ź⁸ .

Protokół

1. Tworzenie projektu w Scipion i importowanie danych

1. Otwórz Scipion i kliknij Utwórz projekt, określ nazwę projektu i miejsce, w którym zostanie on zapisany (Rysunek uzupełniający 1). Scipion otworzy okno projektu pokazujące płótno z panelem z listą dostępnych metod, każda z nich reprezentuje jedno narzędzie do przetwarzania obrazu, które można wykorzystać do zarządzania danymi.
   UWAGA: Ctrl+F może być użyty do znalezienia metody, jeśli nie pojawia się ona na liście.
2. Aby zaimportować filmy wykonane przez mikroskop, wybierz pwem - importuj filmy na lewym panelu (lub wpisz go naciskając Ctrl+F).
3. Otworzy się nowe okno (rysunek uzupełniający 2). Tam uwzględnij ścieżkę do danych i parametry pozyskiwania. W tym przykładzie użyj następującej konfiguracji: Napięcie mikroskopu 300 kV, Aberracja sferyczna 2,0 mm, Kontrast amplitudy 0,1, Współczynnik powiększenia 50000, Tryb częstotliwości próbkowania do Z obrazu i Rozmiar piksela 1,34 A. Po wypełnieniu wszystkich parametrów w formularzu kliknij przycisk Wykonaj.
   UWAGA: Po uruchomieniu metody na płótnie pojawia się pole w kolorze żółtym oznaczone jako uruchomione. Po zakończeniu metody pole zmieni kolor na zielony, a etykieta zmieni się na zakończoną. W przypadku wystąpienia błędu podczas wykonywania metody, pole pojawi się na czerwono, oznaczone jako niepowodzenie. W takim przypadku sprawdź dolną część płótna, w zakładce Dziennik wyjściowy pojawi się wyjaśnienie błędu.
4. Po zakończeniu metody sprawdź wyniki w dolnej części płótna na karcie Podsumowanie. W tym miejscu prezentowane są dane wyjściowe wygenerowane przez metodę, w tym przypadku zestaw filmów. Kliknij przycisk Analizuj wyniki, a pojawi się nowe okno z listą filmów.

2. Wyrównanie filmu: od filmów do mikrofotografii

1. Użyj metody xmipp3 - wyrównanie optyczne, która implementuje Optical flow¹⁹. Aby wypełnić formularz, należy użyć następujących parametrów (Rysunek uzupełniający 3): filmy wejściowe to filmy uzyskane w kroku 1, zakres w polu Klatki do wyrównania wynosi od 2 do 13, pozostałe opcje pozostają przy wartościach domyślnych. Uruchom program.
   UWAGA: Parametry pogrubione w formularzu muszą być zawsze wypełnione. Pozostałe będą miały wartość domyślną lub nie będą obowiązkowo wymagane. W górnej części okna formularza znajdują się pola, w których rozmieszczone są zasoby obliczeniowe, takie jak wątki, interfejsy MPI lub procesory GPU.
2. Kliknij na Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane mikrofotografie i trajektorię szacowanych przesunięć (Rysunek 1). Dla każdego widzianego mikrografu: spójrz na gęstość widmową mocy (PSD), trajektorie uzyskane w celu wyrównania filmu (jeden punkt na klatkę) we współrzędnych kartezjańskich i biegunowych oraz nazwę pliku uzyskanej mikrofotografii (klikając na nią, mikrografię można sprawdzić). Zauważ, że cząstki próbki są znacznie bardziej widoczne na mikrofotografii w porównaniu z pojedynczą klatką filmu.

3. Szacowanie CTF: obliczanie aberracji mikroskopu

1. Najpierw użyj metody grigoriefflab - ctffind¹⁵. Konfiguracja jest następująca: mikrografy wejściowe są danymi wyjściowymi kroku 2, współczynnik ręcznego zmniejszania próbkowania CTF jest ustawiony na 1,5, a zakres rozdzielczości wynosi od 0,06 do 0,42. Ponadto w Opcjach zaawansowanych (które można znaleźć, wybierając tę opcję na Poziomie Eksperta formularza) ustaw Rozmiar okna na 256. Pozostałe parametry pozostają z wartościami domyślnymi (rysunek uzupełniający 4).
   UWAGA: W większości metod w Scipion opcja Advanced pokazuje więcej parametrów konfiguracyjnych. Z tych opcji należy korzystać ostrożnie, gdy program, który ma zostać uruchomiony, jest całkowicie znany, a znaczenie parametrów jest zrozumiałe. Niektóre parametry mogą być trudne do wypełnienia bez patrzenia na dane; w takim przypadku Scipion pokazuje magiczną różdżkę po prawej stronie, która pokaże okno kreatora (Rysunek uzupełniający 5). Na przykład w polu Rozdzielczość tego formularza jest to szczególnie przydatne, ponieważ wartości te powinny być wybrane tak, aby w przybliżeniu pokrywały obszar od pierwszego zera do ostatniego zauważalnego pierścienia PSD.
2. Kliknij Execute (Wykonaj) i Analizuj wyniki (Rysunek 2) po zakończeniu metody. Sprawdź, czy szacowany CTF jest zgodny z eksperymentalnym. W tym celu spójrz na PSD i porównaj szacowane pierścienie w rogu z tymi pochodzącymi z danych. Sprawdź również uzyskane wartości rozmycia, aby znaleźć nieoczekiwane wartości, a odpowiednie mikrofotografie można odrzucić lub ponownie przeliczyć. W tym przykładzie można użyć całego zestawu mikrofotografii.
   UWAGA: Użyj przycisków w dolnej części okna, aby utworzyć podzbiór mikrofotografii (z czerwonym przyciskiem Mikrografie) i przeliczyć CTF (z czerwonym przyciskiem Przelicz CTF), jeśli zajdzie taka potrzeba.
3. Aby doprecyzować poprzednie oszacowanie, użyj xmipp3 - ctf estimation²⁰. Wybierz jako Mikrografie wejściowe dane wyjściowe kroku 2, wybierz opcję Użyj defoci z poprzedniego oszacowania CTF, jako Poprzednie oszacowanie CTF wybierz dane wyjściowe grigoriefflab - ctffind, a na poziomie zaawansowanym zmień rozmiar okna na 256 (Rysunek uzupełniający 6). Uruchom to.
4. Kliknij Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane CTF-y. W przypadku tej metody więcej danych jest szacowanych i reprezentowanych w kilku dodatkowych kolumnach. Ponieważ żaden z nich nie pokazuje nieprawidłowych wartości szacunkowych, wszystkie mikrofotografie zostaną wykorzystane w kolejnych krokach.

4. Wybieranie cząstek: znajdowanie cząstek na mikrofotografiach

1. Przed przystąpieniem do kompletacji należy przeprowadzić wstępny proces mikrofotografii. Otwórz xmipp3 - wstępnie przetwarzaj mikrofotografie, ustaw jako mikrografie wejściowe te uzyskane w kroku 2 i wybierz opcje Usuń uszkodzone piksele? z wielokrotnością standardowej wartości 5 i Mikrografie w dół? ze współczynnikiem próbkowania w dół równym 2 (Rysunek uzupełniający 7). Kliknij Wykonaj i sprawdź, czy rozmiar powstałych mikrofotografii został zmniejszony.
2. Do pobierania użyj xmipp3 - ręczne pobieranie (krok 1) i xmipp3 - automatyczne pobieranie (krok 2)²¹. Ręczne pobieranie pozwala na ręczne przygotowanie zestawu cząstek, z którymi krok automatycznego pobierania nauczy się i wygeneruje kompletny zestaw cząstek. Najpierw uruchom xmipp3 - ręczne pobieranie (krok 1) z mikrografiami wejściowymi jako mikrografiami uzyskanymi w poprzednim procesie wstępnym. Kliknij na Execute (Wykonaj), a pojawi się nowe interaktywne okno (Rysunek 3).
3. W tym oknie prezentowana jest lista mikrofotografii (Rysunek 3a) oraz innych opcji. Zmień rozmiar (px) na 150, będzie to rozmiar pudełka zawierającego każdą cząstkę. Wybrana mikrofotografia pojawi się w większym oknie. Wybierz region i wybierz wszystkie widoczne w nim cząstki (Rysunek 3b). Następnie kliknij Aktywuj szkolenie, aby rozpocząć naukę. Pozostałe obszary mikrofotografii są wybierane automatycznie (Rysunek 3c). Sprawdź wybrane cząstki i dołącz więcej, klikając na nie, lub usuń niewłaściwe za pomocą shift+kliknięcie, jeśli to konieczne.
4. Wybierz następną mikrofotografię w pierwszym oknie. Mikrofotografia zostanie automatycznie pobrana. Sprawdź ponownie, aby w razie potrzeby uwzględnić lub usunąć niektóre cząstki. Powtórz ten krok z około 5 mikrofotografiami, aby stworzyć reprezentatywny zestaw treningowy.
5. Gdy to zrobisz, kliknij Współrzędne w oknie głównym, aby zapisać współrzędne wszystkich wybranych cząstek. Zestaw uczący cząstek jest gotowy do przejścia do automatycznego wybierania w celu zakończenia procesu dla wszystkich mikrofotografii.
6. Otwórz xmipp3 - automatyczne pobieranie (krok 2) wskazujące, że w Xmipp pobieranie cząstek uruchamia poprzednie pobieranie ręczne, a mikrografy wybierają jako takie same jak nadzorowane. Kliknij Wykonaj. Ta metoda wygeneruje jako dane wyjściowe zestaw około 100000 współrzędnych.
7. Zastosuj podejście oparte na konsensusie, więc przeprowadź drugą metodę wybierania, aby wybrać cząstki, w których obie metody są zgodne. Open sphire - cryolo picking¹⁴ i wybierz wstępnie przetworzone mikrofotografie jako mikrofotografie wejściowe, Użyj modelu ogólnego? do Tak, z progiem ufności 0,3 i rozmiarem pudełka 150 (rysunek uzupełniający 8). Uruchom to. Metoda ta powinna również wygenerować około 100000 współrzędnych.
8. Uruchom xmipp3 - deep consensus picking²². Ponieważ współrzędne wejściowe obejmują dane wyjściowe sphire — wybieranie kriolologiczne (krok 4.7) i xmipp3 — automatyczne wybieranie (krok 4.6), ustaw opcję Wybierz typ modelu na wstępnie wytrenowany i pomiń trenowanie i oceń bezpośrednio za pomocą wstępnie wytrenowanego modelu? na Tak (rysunek uzupełniający 9). Uruchom to.
9. Kliknij Analizuj wyniki i w nowym oknie kliknij ikonę oka obok opcji Wybierz cząstki/współrzędne z wysokimi wartościami "zScoreDeepLearning1". Otworzy się nowe okno z listą wszystkich cząstek (Rysunek 4). Wartości zScore w kolumnie dają wgląd w jakość cząstki, niskie wartości oznaczają złą jakość.
   1. Kliknij etykietę_xmipp_zScoreDeepLearning aby uporządkować cząstki od najwyższego do najniższego zScore. Wybierz cząstki o wskaźniku zScore wyższym niż 0,75 i kliknij Współrzędne, aby utworzyć nowy podzbiór. Powinno to utworzyć podzbiór o około 50000 współrzędnych.
10. Otwórz xmipp3 - głębokie czyszczenie mikrografów. Jako współrzędne wejściowe wybierz podzbiór uzyskany w poprzednim kroku, źródło mikrografów jest takie samo jak współrzędne i utrzymuj wartość Threshold na poziomie 0,75. Uruchom to. Sprawdź na karcie Podsumowanie, czy liczba współrzędnych została zmniejszona, chociaż w tym przypadku usunięto tylko kilka współrzędnych.
    UWAGA: Ten krok jest w stanie dodatkowo wyczyścić zestaw współrzędnych i może być bardzo przydatny w czyszczeniu innych zestawów danych z większą liczbą artefaktów filmowych, takich jak strefy węglowe lub duże zanieczyszczenia.
11. Uruchom xmipp3 - wyodrębnij cząstki (rysunek uzupełniający 10). Jako współrzędne wejściowe wskaż współrzędne uzyskane po poprzednim kroku, źródło mikrografów jako inne, mikrografy wejściowe jako dane wyjściowe kroku 2, oszacowanie CTF jako dane wyjściowe oszacowania xmipp3 - ctf, współczynnik próbkowania w dół do 3 i rozmiar pudełka na cząstki do 100. Na karcie Przetwarzanie wstępne formularza wybierz opcję Tak dla wszystkich. Uruchom to.
12. Sprawdź, czy dane wyjściowe powinny zawierać cząstki o zmniejszonym rozmiarze 100x100 pikseli i rozmiarze piksela 4,02 piksela/px.
13. Uruchom ponownie xmipp3 - wyodrębnij cząstki, zmieniając następujące parametry: zmniejszenie współczynnika próbkowania do 1 i rozmiar pudełka na cząstki do 300. Sprawdź, czy dane wyjściowe są tym samym zestawem cząstek, ale teraz w pełnej rozdzielczości.

5. Klasyfikacja 2D: grupowanie podobnych cząstek razem

1. Otwórz metodę cryosparc2 - 2d classification¹¹ z cząstkami wejściowymi, takimi jak te uzyskane w kroku 4.11, a w zakładce Klasyfikacja 2D Liczba klas na 128 zachowaj wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi. Uruchom to.
2. Kliknij na Analizuj wyniki, a następnie na ikonę oka obok opcji Wyświetl klasy cząstek za pomocą Scipion (Rysunek 5). Ta klasyfikacja pomoże oczyścić zestaw cząstek, ponieważ kilka klas będzie wydawać się hałaśliwych lub z artefaktami. Wybierz klasy zawierające dobre widoki. Kliknij Cząstki (czerwony przycisk w dolnej części okna), aby utworzyć podzbiór czyszczący.
3. Teraz otwórz xmipp3 - cl2d²³ i ustaw jako obrazy wejściowe obrazy uzyskane w poprzednim kroku i liczbę klas na 128. Kliknij na Execute.
   UWAGA: Ta druga klasyfikacja jest stosowana jako dodatkowy etap czyszczenia zestawu cząstek. Zwykle warto usunąć jak najwięcej hałaśliwych cząstek. Jeśli jednak wymagany jest prostszy przepływ pracy, można użyć tylko jednej metody klasyfikacji 2D.
4. Po zakończeniu metody sprawdź 128 wygenerowanych klas, klikając Analizuj wyniki i Co pokazać: klasy. Większość wygenerowanych klas pokazuje rzut makrocząsteczki z pewnym poziomem szczegółowości. Jednak niektóre z nich wydają się głośne (w tym przykładzie około 10 klas). Wybierz wszystkie dobre klasy i kliknij przycisk Klasy, aby wygenerować nowy podzbiór zawierający tylko dobre. Ten podzbiór będzie używany jako dane wejściowe dla jednej z metod generowania woluminu początkowego. Mając te same wybrane klasy, kliknij na Cząsteczki, aby utworzyć czystszy podzbiór po usunięciu tych należących do złych klas.
5. Otwórz pwem - podzbiór z pełnym zestawem elementów jako wyjściem 4.13 (wszystkie cząstki w pełnym rozmiarze), Utwórz losowy podzbiór na Nie, Inny zestaw jako podzbiór cząstek utworzonych w poprzednim kroku i Ustaw operację jako przecięcie. Spowoduje to wyodrębnienie poprzedniego podzbioru z cząstek w pełnej rozdzielczości.

6. Początkowe oszacowanie objętości: budowanie pierwszego przypuszczenia objętości 3D

1. W tym kroku oszacuj dwie początkowe objętości za pomocą różnych metod, a następnie użyj narzędzia konsensusu, aby wygenerować ostateczną szacowaną objętość 3D. Otwórz xmipp3 - zrekonstruuj metodę significant²⁴ z klasami wejściowymi jak te uzyskane po kroku 5, grupą symetrii jako c1 i zachowaj pozostałe parametry z ich wartościami domyślnymi (rysunek uzupełniający 11). Wykonaj to.
2. Kliknij Analizuj wyniki. Sprawdź, czy uzyskano wolumin o niskiej rozdzielczości o wymiarach 100x100x100 pikseli i rozmiarze piksela 4,02 μ/px.
3. Otwórz xmipp3 - przytnij/zmień rozmiar woluminów (Rysunek uzupełniający 12) używając jako woluminów wejściowych tych uzyskanych w poprzednim kroku, Zmienić rozmiar woluminów? na Tak, opcję Zmień rozmiar na Częstotliwość próbkowania i Zmień rozmiar częstotliwości próbkowania na 1,34 A/px. Uruchom to. Sprawdź na karcie Podsumowanie, czy wolumin wyjściowy ma prawidłowy rozmiar.
4. Teraz utwórz drugi wolumin początkowy. Otwórz relion - 3D initial model¹⁰, ponieważ cząstki wejściowe używają dobrych cząstek w pełnej rozdzielczości (wyjście 5,5) i ustawiają średnicę maski cząstek na 402A, zachowaj pozostałe parametry z wartościami domyślnymi. Uruchom to.
5. Kliknij Analizuj wyniki, a następnie w Wyświetlaj głośność z: plasterkami. Sprawdź, czy uzyskano objętość o niskiej rozdzielczości, ale z głównym kształtem struktury (rysunek uzupełniający 13).
6. Teraz otwórz pwem - join sets, aby połączyć dwa wygenerowane woluminy początkowe w celu utworzenia danych wejściowych do metody konsensusu. Po prostu wskaż Woluminy jako Typ wejścia i wybierz dwa początkowe woluminy w zestawie Wejść. Uruchom to. Dane wyjściowe powinny być zestawem zawierającym dwa elementy z obydwoma woluminami.
7. Narzędziem konsensusu jest to, które znajduje się w xmipp3 - swarm consensus²⁵. Otwórz to. Użyj jako pełnowymiarowych obrazów dobrych cząstek w pełnej rozdzielczości (wyjście 5,5), jako początkowych objętości zestawu z dwoma elementami wygenerowanymi w poprzednim kroku i upewnij się, że grupa symetrii to c1. Kliknij Wykonaj.
8. Kliknij Analizuj wyniki. Sprawdź, czy uzyskano bardziej szczegółową wolumin wyjściowy (Rysunek 6). Chociaż wokół struktury jest więcej szumu, aby mieć więcej szczegółów na mapie struktury, pomocne będą następujące kroki uściślające, aby uniknąć lokalnych minimów.
   UWAGA: Jeśli UCSF Chimera²⁶ jest dostępny, użyj ostatniej ikony w górnej części okna, aby wykonać wizualizację 3D uzyskanej objętości.
9. Otwórz i wykonaj relion - 3D auto-refine¹⁰, aby dokonać pierwszego kątowego przypisania cząstek w 3D. Jako Cząstki wejściowe wybierz wyjście 5.5 i ustaw średnicę maski cząstek na 402A. W zakładce Referencyjna mapa 3D wybierz jako Objętość wejściową tę uzyskaną w poprzednim kroku, Symetria jako c1 i Początkowy filtr dolnoprzepustowy do 30A (Rysunek uzupełniający 14).
10. Kliknij Analizuj wyniki. W nowym oknie wybierz final jako Volume do wizualizacji i kliknij Display volume with: slices, aby zobaczyć uzyskaną objętość. Sprawdź również korelację powłoki Fouriera (FSC), klikając na Wyświetl wykresy rozdzielczości w oknie wyników oraz pokrycie kątowe w Wyświetl rozkład kątowy: wykres 2D (Rysunek 7). Zrekonstruowana woluta zawiera znacznie więcej szczegółów (prawdopodobnie z niewielkimi rozmytymi obszarami w zewnętrznej części konstrukcji), a FSC przekracza próg 0,143 w okolicach 4,5A. Pokrycie kątowe obejmuje całą sferę 3D.

7. 3D klasyfikacja: odkrywanie stanów konformacyjnych

1. Stosując podejście oparte na konsensusie, można odkryć, czy w danych występują różne stany konformacyjne. Otwórz relion - klasyfikacja 3D¹⁰ (Rysunek uzupełniający 15). Jako cząstki wejściowe użyj tych właśnie uzyskanych w 6.10 i ustaw średnicę maski cząstek na 402A. Na karcie Referencyjna mapa 3D użyj jako objętości wejściowej objętości uzyskanej po kroku 6.10, ustaw Symetria na c1 i Początkowy filtr dolnoprzepustowy na 15A. Na koniec w zakładce Optymalizacja ustaw liczbę zajęć na 3. Uruchom to.
2. Sprawdź wyniki, klikając Analizuj wyniki, wybierz Pokaż klasyfikację w Scipion. Pokazane są trzy wygenerowane klasy i kilka interesujących miar. Pierwsze dwie klasy powinny mieć podobną liczbę przypisanych obrazów (kolumna rozmiaru) i wyglądać bardzo podobnie, podczas gdy trzecia ma mniej obrazów i bardziej rozmyty wygląd. Ponadto rlnAccuracyRotations i rlnAccuracyTranslations powinny być wyraźnie lepsze dla pierwszych dwóch klas. Wybierz dwie najlepsze klasy i kliknij przycisk Klasy, aby wygenerować podzbiór je zawierający.
3. Powtórz kroki 7.1 i 7.2, aby wygenerować drugą grupę dobrych klas. Oba te elementy będą stanowić dane wejściowe narzędzia konsensusu.
4. Otwórz i uruchom xmipp3 - consensus classes 3D i wybierz jako Input Classes dwa podzbiory wygenerowane w poprzednich krokach.
5. Kliknij Analizuj wyniki. Przedstawiona jest liczba zbieżnych cząstek między klasami: pierwsza wartość to liczba pokrywających się cząstek w pierwszej klasie podzbioru 1 i pierwszej klasie podzbioru 2, druga wartość to liczba pokrywających się cząstek w pierwszej klasie podzbioru 1 i drugiej klasie podzbioru 2 itd. Sprawdź, czy cząstki są losowo przypisane do klasy pierwszej lub drugiej, co oznacza, że metoda klasyfikacji 3D nie jest w stanie znaleźć zmian konformacyjnych. Biorąc pod uwagę ten wynik, cały zestaw cząstek zostanie wykorzystany do dalszego przetwarzania.

8. 3D uściślenie: udoskonalanie kątowych przypisań jednorodnej populacji

1. Również w tym kroku zastosuj podejście oparte na konsensusie. Najpierw otwórz i uruchom pwem - subset z pełnym zestawem elementów jako wyjściem 6.9, Utwórz losowy podzbiór na Tak i Liczba elementów na 5000. Dzięki temu tworzony jest podzbiór obrazów z poprzednim wyrównaniem w celu wytrenowania metody używanej w następnym kroku.
2. Otwórz xmipp3 - głębokie wyrównanie, ustaw obrazy wejściowe jako dane wyjściowe dobrych cząstek uzyskanych w 5.5, Objętość jako tę uzyskaną po 6.10, Trening wejściowy ustawiony jako ten utworzony w poprzednim kroku, Rozdzielczość docelową na 10A, a pozostałe parametry zachowaj z wartościami domyślnymi (Rysunek uzupełniający 16). Kliknij Wykonaj.
3. Kliknij Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskany rozkład kątowy, w którym nie ma brakujących kierunków, a pokrycie kątowe nieznacznie się poprawia w porównaniu do 6.10 (Rysunek 8).
4. Otwórz i wykonaj xmipp3 - porównaj kąty i wybierz jako Cząstki wejściowe 1 wyjście 6.9 i Cząstki wejściowe 2 wyjście 8.2, upewnij się, że grupa Symetria to c1. Ta metoda oblicza zgodność między xmipp3 - głębokie wyrównanie i relion - automatyczne uściślanie 3D.
5. Kliknij Analizuj wyniki, zostanie wyświetlona lista cząstek z uzyskanymi różnicami w przesunięciach i kątach. Kliknij na ikonę paska w górnej części okna, otworzy się kolejne okno, które umożliwia tworzenie wykresów obliczonych zmiennych. Wybierz _xmipp_angleDiff i kliknij Wykres, aby zobaczyć reprezentację różnic kątowych na cząstkę. Zrób to samo z _xmipp_shiftDiff. Na tych rysunkach, w przybliżeniu w połowie cząstek, obie metody są zgodne (Rysunek 9). Zaznacz cząstki o różnicach kątowych mniejszych niż 10º i utwórz nowy podzbiór.
6. Teraz otwórz xmipp3 - highres²⁷, aby dokonać lokalnego doprecyzowania przypisanych kątów. Najpierw wybierz jako Obrazy pełnowymiarowe obrazy uzyskane w poprzednim kroku, a jako Początkowe woluminy dane wyjściowe 6.9 ustaw Promień cząstki na 150 pikseli, a grupę Symetria na c1. Na karcie Przypisanie kątowe ustaw Wyrównanie obrazu na Lokalne, Liczba iteracji na 1 i Maksymalne. Rozdzielczość docelowa jako 5A/px (rysunek uzupełniający 17). Uruchom to.
7. Na karcie Podsumowanie sprawdź, czy wolumin wyjściowy jest mniejszy niż 300x300x300 pikseli i ma nieco większy rozmiar piksela.
8. Kliknij Analizuj wyniki, aby zobaczyć uzyskane wyniki. Kliknij na Wykresy rozdzielczości wyświetlacza, aby zobaczyć FSC, a na Objętość wyświetlacza: Zrekonstruowana, aby zobaczyć uzyskaną objętość (Rysunek uzupełniający 18). Uzyskuje się dobrą rozdzielczość głośności bliską 4-3,5A.
9. Kliknij Wyświetl cząstki wyjściowe i w oknie z listą cząstek kliknij ikonę paska. W nowym oknie wybierz opcję Wpisz jako histogram, ze 100 pojemnikami, wybierz etykietę _xmipp_cost, a na koniec naciśnij przycisk Drukuj (rysunek uzupełniający 19). W ten sposób prezentowany jest histogram etykiety kosztowej, który zawiera korelację cząstki z wybranym dla niej kierunkiem rzutowania. W tym przypadku uzyskuje się jednomodalną funkcję gęstości, która jest oznaką braku różnych populacji w zbiorze cząstek. W ten sposób wszystkie z nich zostaną wykorzystane do kontynuacji udoskonalenia
   UWAGA: W przypadku zobaczenia funkcji gęstości multimodalnej, zestaw cząstek należących do wyższego maksimum powinien być wybrany tak, aby kontynuować przepływ pracy tylko z nimi.
10. Otwórz i wykonaj ponownie xmipp3 - highres za pomocą opcji Kontynuuj z poprzedniego przebiegu? na Tak, ustaw jako Obrazy pełnowymiarowe te uzyskane po wersji 8.5, a następnie wybierz poprzedni przebieg z poprzednim wykonaniem Xmipp Highres. Na karcie Przypisanie kątowe ustaw Wyrównanie obrazu na Lokalne, z 1 iteracją i 2,6 A/px jako rozdzielczością docelową (pełna rozdzielczość).
11. Teraz dane wyjściowe powinny zawierać wolumin w pełnej rozdzielczości (rozmiar 300x300x300 pikseli). Kliknij na Analizuj wyniki, aby ponownie sprawdzić uzyskany wolumin i FSC, który teraz powinien być woluminem o wysokiej rozdzielczości około 3A (Rysunek 10).

9. Ocena i przetwarzanie końcowe

1. Otwórz xmipp3 - lokalna klasa MonoRes28. Ta metoda obliczy rozdzielczość lokalnie. Ustaw jako Głośność wejściową tę uzyskaną po 8.10, ustaw Czy chcesz używać połowy głośności? na Tak i Zakres rozdzielczości od 1 do 10A. Uruchom to.
2. Kliknij Analizuj wyniki i wybierz Pokaż histogram rozdzielczości i Pokaż kolorowe plasterki (Rysunek 11). Pokazana jest rozdzielczość w różnych częściach woluminu. Większość wokseli centralnej części struktury powinna prezentować rozdzielczości w okolicach 3A, podczas gdy najgorsze rozdzielczości osiąga się w częściach zewnętrznych. Również histogram rozdzielczości na woksel jest pokazany ze szczytem około (nawet poniżej) 3A.
3. Otwórz i uruchom xmipp3 - localdeblur sharpening²⁹, aby zastosować wyostrzanie. Jako Input Map wybierz ten uzyskany w 8.10, a jako Resolution Map ten uzyskany w poprzednim kroku za pomocą MonoRes.
4. Kliknij Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane woluminy. Otwórz ostatnią, odpowiadającą ostatniej iteracji algorytmu. Zaleca się otwarcie woluminu za pomocą innych narzędzi, takich jak UCSF Chimera²⁶, aby lepiej zobaczyć cechy woluminu w 3D (Rysunek 12).
5. Na koniec otwórz narzędzie walidacyjne zawarte w xmipp3 - validate overfitting³⁰, które pokaże, jak rozdzielczość zmienia się wraz z liczbą cząstek. Otwórz go i dołącz jako cząstki wejściowe cząstki uzyskane w kroku 8.5, ustaw Oblicz szum ograniczony dla rozdzielczości? na Tak, z początkową objętością referencyjną 3D jako wyjściem 8.10. W Opcjach zaawansowanych ustaw liczbę cząstekna "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (Rysunek uzupełniający 20). Uruchom to.
6. Kliknij Analizuj wyniki. Pojawią się dwa wykresy (Rysunek 13) wraz z ewolucją rozdzielczości, w zielonej linii, wraz ze wzrostem liczby cząstek użytych w rekonstrukcji. Czerwona linia reprezentuje rozdzielczość osiągniętą przy rekonstrukcji wyrównanego szumu Gaussa. Rozdzielczość poprawia się wraz z liczbą cząstek i obserwuje się dużą różnicę w rekonstrukcji z cząstek w porównaniu do tej z szumu, co jest wskaźnikiem posiadania cząstek z dobrą informacją strukturalną.
7. Na podstawie dotychczasowych wyników można by przeprowadzić dopasowanie modelu do objętości post-processingu, co pozwoliłoby na odkrycie struktur biologicznych makrocząsteczki.

Wyniki

Użyliśmy zestawu danych rybosomu Plasmodium falciparum 80S (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660) do przeprowadzenia testu i, dzięki protokołowi Scipion przedstawionemu w poprzedniej sekcji, uzyskaliśmy zrekonstruowaną objętość makrocząsteczki w 3D w wysokiej rozdzielczości, zaczynając od informacji zebranych przez mikroskop, które składają się z bardzo zaszumionych obrazów zawierających projekcje 2D w dowolnej orientacji próbki.

Główne wyniki uzyskane po uruchomieniu całego protokołu są przedstawione w Rysunek 10, Rysunek 11, oraz Rysunek 12. Rysunek 10 przedstawia uzyskaną objętość 3D przed obróbką końcową. Na Rysunek 10a, FSC wynosi 3 A, co oznacza, że jest bardzo blisko limitu Nyquista (przy danych o rozmiarze piksela 1,34 A, limit Nyquista wynosi 2,6 A). Rysunek 10b pokazuje niektóre wycinki zrekonstruowanej objętości 3D z wysokim poziomem szczegółów i dobrze zdefiniowanymi strukturami. W Rysunek 11 prezentowane są wyniki po lokalnej analizie rozdzielczości uzyskanej objętości 3D. Można zauważyć, że większość wokseli w strukturze osiąga rozdzielczość poniżej 3 A, głównie te znajdujące się w centralnej części konstrukcji. Jednak zewnętrzna część wykazuje gorsze rozdzielczości, co jest zgodne z rozmyciem pojawiającym się w tych obszarach w wycinkach Rysunek 10b. Rysunek 12 pokazuje tę samą mapę 3D po post-processingu, która jest w stanie podkreślić wyższe częstotliwości objętości, odsłaniając więcej szczegółów i poprawiając odwzorowanie, co widać zwłaszcza w prezentacji 3D w Rysunek 12c.

W Rysunek 14, Chimera²⁶ został użyty do wyświetlenia reprezentacji 3D uzyskanej objętości (Rysunek 14a), przetworzonej po przetworzeniu (Rysunek 14b) oraz mapy rozdzielczości (Rysunek 14c), pokolorowanej kodem kolorystycznym rozdzielczości lokalnych. Może to dać jeszcze więcej informacji na temat uzyskanej struktury. To narzędzie jest bardzo przydatne do uzyskania wglądu w jakość uzyskanej objętości, ponieważ można zobaczyć bardzo małe szczegóły w całym kontekście 3D konstrukcji. Gdy osiągnięta rozdzielczość jest wystarczająca, można znaleźć nawet niektóre biochemiczne części struktury (np. alfa-helisy w Rysunek 14d. Na tym rysunku należy podkreślić wysoką rozdzielczość osiągniętą we wszystkich centralnych częściach struktury 3D, które można zobaczyć jako ciemnoniebieskie obszary w Rysunek 14c.

Wszystkie poprzednie wyniki zostały osiągnięte dzięki dobrej wydajności całego protokołu, ale może to nie być prawdą. Istnieje kilka sposobów na zidentyfikowanie złego zachowania. W najogólniejszym przypadku dzieje się tak, gdy uzyskana struktura ma niską rozdzielczość i nie jest w stanie ewoluować do lepszej. Jeden z przykładów jest przedstawiony w Rysunek 15. Niewyraźna objętość (Rysunek 15c) skutkuje niskim wskaźnikiem FSC, który można zobaczyć na krzywej FSC (Rysunek 15a) oraz na histogramie oszacowania lokalnego (Rysunek 15b). Ten przykład został wygenerowany przy użyciu metody uściślania 3D z nieprawidłowymi danymi wejściowymi, ponieważ oczekiwano pewnych określonych właściwości w wejściowym zestawie cząstek, których nie spełniają. Jak widać, zawsze bardzo ważne jest, aby wiedzieć, w jaki sposób różne metody spodziewają się otrzymać dane i odpowiednio je przygotować. Ogólnie rzecz biorąc, po uzyskaniu danych wyjściowych, takich jak te w Rysunek 15, może to oznaczać problem z przepływem pracy przetwarzania lub danymi źródłowymi.

Istnieje kilka punktów kontrolnych w przepływie pracy, które można przeanalizować, aby dowiedzieć się, czy protokół rozwija się prawidłowo, czy nie. Na przykład, zaraz po pobraniu, kilka z omówionych wcześniej metod może uszeregować cząstki i dać wynik dla każdej z nich. W przypadku posiadania złych cząstek, metody te pozwalają na ich identyfikację i usunięcie. Ponadto klasyfikacja 2D może być dobrym wskaźnikiem posiadania złego zestawu cząstek. Rysunek 16 pokazuje przykład takiego złego zestawu. Na Rysunek 16a, pokazane są dobre klasy zawierające pewne szczegóły struktury, podczas gdy Rysunek 16b pokazuje złe klasy, które są hałaśliwe lub niewyśrodkowane, w tym ostatnim przypadku można zauważyć, że wybór był nieprawidłowy i dwie cząstki wydają się pojawiać razem. Kolejnym punktem kontrolnym jest początkowe oszacowanie objętości, Rysunek 17 pokazuje przykład dobrych (Rysunek 17a) i złych (Rysunek 17b). Złe oszacowanie zostało utworzone przy użyciu nieprawidłowej konfiguracji metody. Należy wziąć pod uwagę, że wszystkie ustawienia powinny być wykonane ostrożnie, dobierając odpowiednio każdy parametr zgodnie z analizowanymi danymi. W przypadku braku mapy z minimalną ilością informacji strukturalnych, poniższe udoskonalenie nie będzie w stanie uzyskać dobrej rekonstrukcji.

Gdy problemem jest złe przejęcie, w którym filmy nie zachowują informacji strukturalnych, niemożliwe będzie wydobycie z nich dobrych cząsteczek i uzyskanie udanego przetwarzania. W takim przypadku należy zebrać więcej filmów, aby uzyskać rekonstrukcję 3D w wysokiej rozdzielczości. Jeśli jednak tak nie jest, istnieje kilka sposobów radzenia sobie z problemami w całym przepływie pracy. Jeśli zbieranie nie jest wystarczająco dobre, istnieje kilka sposobów, aby spróbować to naprawić, np. powtórzenie zbierania, użycie różnych metod lub próba ręcznego pobrania większej liczby cząstek, aby pomóc metodom uczyć się na ich podstawie. Podczas klasyfikacji 2D, jeśli tylko kilka klas jest dobrych, rozważ również powtórzenie procesu kompletacji. Przy początkowym szacowaniu objętości spróbuj użyć kilku metod, jeśli niektóre z nich dały niedokładne wyniki. To samo dotyczy udoskonalenia 3D. Idąc tym tokiem rozumowania, w niniejszym manuskrypcie przedstawiono kilka narzędzi konsensusu, które mogą być bardzo przydatne w celu uniknięcia problemów i kontynuowania przetwarzania z dokładnymi danymi. Dzięki zastosowaniu konsensusu między kilkoma metodami, możemy odrzucić dane, które są trudne do wybrania, sklasyfikowania, wyrównania itp., co prawdopodobnie jest wskaźnikiem słabych danych. Jeśli jednak kilka metod jest w stanie zgodzić się w wygenerowanych danych wyjściowych, prawdopodobnie dane te zawierają cenne informacje, z którymi można kontynuować przetwarzanie.

Zachęcamy czytelnika do pobrania większej ilości zestawów danych i próby ich przetworzenia zgodnie z zaleceniami przedstawionymi w tym manuskrypcie oraz do stworzenia podobnego przepływu pracy łączącego pakiety przetwarzania za pomocą Scipion. Próba przetworzenia zbioru danych jest najlepszym sposobem, aby poznać moc narzędzi przetwarzania dostępnych w najnowocześniejszym oprogramowaniu Cryo-EM, poznać najlepsze zasady przezwyciężenia ewentualnych wad pojawiających się podczas przetwarzania oraz zwiększyć wydajność dostępnych metod w każdym konkretnym przypadku testowym.

Rysunek 1. Wynik wyrównania filmu. a) Główne okno wyników, z listą wszystkich wygenerowanych mikrofotografii i dodatkowymi informacjami: gęstością widmową mocy, trajektorią szacowanego wyrównania we współrzędnych biegunowych, to samo we współrzędnych kartezjańskich, nazwą pliku wygenerowanego mikrografu. (b) Trajektoria wyrównania reprezentowana we współrzędnych kartezjańskich. (c) Wygenerowana mikrofotografia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Estymacja CTF z wynikiem Ctffind. Główne okno z wynikami zawiera rysunek z szacowanym PSD (w rogu) wraz z PSD pochodzącym z danych oraz kilka parametrów rozmycia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Okna ręcznej kompletacji z Xmipp. (a) Główne okno z listą mikrofotografii do przetworzenia i kilkoma innymi parametrami. (b) Ręczne wybieranie cząstek znajdujących się w obszarze mikrofotografii. (c) i (d) Automatycznie wybrane cząstki, które mają być nadzorowane w celu stworzenia zestawu cząstek treningowych dla metody automatycznego wybierania Xmipp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Głęboka kompletacja konsensusu z wynikiem Xmipp. Parametr zScoreDeepLearning nadaje wagę dobroci cząstki i jest kluczem do wykrywania złych cząstek. (a) Najniższe wartości zScores są powiązane z artefaktami. (b) Najwyższe wyniki zScore są związane z cząstkami zawierającymi makrocząsteczkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Klasyfikacja 2D z wynikiem Cryosparc. Pokazane są wygenerowane klasy (średnie podzbiorów cząstek pochodzących z tej samej orientacji). Kilka dobrych klas zaznaczonych na czerwono (z pewnym poziomem szczegółowości) i kilka złych klas niewybranych (hałaśliwe i niewyśrodkowane klasy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Początkowa objętość 3D z wynikiem konsensusu roju. Widok początkowej objętości 3D uzyskanej po uruchomieniu narzędzia konsensusu xmipp3 - konsensus roju, przy użyciu poprzednich początkowych oszacowań objętości 3D Xmipp i Relion. (a) Objętość jest reprezentowana przez plasterki. b) Wizualizacja 3D objętości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Udoskonalenie początkowej objętości 3D za pomocą wyniku Relion. a) uzyskana krzywa FSC, przekraczająca próg przy około 4,5A. (b) Pokrycie kątowe pokazane jako górny widok sfery 3D. W tym przypadku, ponieważ nie ma symetrii, przypisane cząstki powinny pokrywać całą sferę. c) Objętość rafinowana reprezentowana przez plasterki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Wyrównanie 3D w oparciu o głębokie uczenie z wynikiem Xmipp. Wyniki wygenerowane przez xmipp3 - metoda głębokiego wyrównania dla wyrównania 3D. (a) Przypisanie kątowe dla każdej cząstki w postaci macierzy transformacji. b) Pokrycie kątowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Wynik konsensusu wyrównania 3D. (a) Wykaz cząstek z uzyskanymi różnicami w parametrach przesunięcia i kąta. (b) Wykres różnic kątowych na cząstkę. (c) Wykres różnicy przesunięć na cząstkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10. Końcowa iteracja wyniku udoskonalania 3D. a) Krzywa FSC. b) Uzyskana objętość w pełnej rozdzielczości w warstwach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11. Lokalna analiza rozdzielczości z wynikiem Xmipp. Wyniki metody xmipp3 - local MonoRes. (a) Niektóre reprezentatywne wycinki pokolorowane wartością rozdzielczości na woksel, jak wskazano w kodzie koloru. (b) Histogram rozdzielczości lokalnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12. Wyostrzanie z wynikiem Xmipp. Wyniki xmipp3 - metoda wyostrzania localdeblur. a) Wykaz uzyskanych objętości na iterację. (b) objętość 3D uzyskana po ostatniej iteracji reprezentowana przez warstwy. (c) Reprezentacja 3D ostatniego tomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13. Sprawdź poprawność narzędzia do nadmiarowego dopasowania w wyniku Xmipp. Wyniki xmipp3 - walidacja overfittingu. Zielona linia odpowiada rekonstrukcji na podstawie danych, a czerwona linii szumowi. (a) Odwrotność rozdzielczości podniesionej do kwadratu z logarytmem liczby cząstek. (b) Rozdzielczość wraz z liczbą cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 14. Kilka reprezentacji 3D uzyskanej objętości. a) Objętość wstępnie przetworzona. b) Objętość po przetworzeniu końcowym. (c) Rozdzielczość lokalna, ciemnoniebieskie woksele to woksele o wyższej rozdzielczości (2,75A), a ciemnoczerwone woksele to te o niższej rozdzielczości (10,05A). (d) Powiększ objętość po obróbce, w której widać alfa-helisę (czerwony owal). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 15. Przykład złej rekonstrukcji 3D. a) Krzywa FSC z ostrym spadkiem i przekroczeniem progu w niskiej rozdzielczości. (b) Histogram rozdzielczości lokalnej. c) objętość 3D w plasterkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 16. Przykład klas 2D. (a) Dobre klasy wykazujące pewien poziom szczegółowości. (b) Złe klasy zawierające szumy i artefakty (górna część uzyskana za pomocą Xmipp, dolna za pomocą CryoSparc). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 17. Przykład objętości początkowej 3D o różnych właściwościach. a) Dobra objętość początkowa, w której można zaobserwować kształt makrocząsteczki. (b) Zła objętość początkowa, w której uzyskany kształt jest całkowicie odmienny od oczekiwanego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Tworzenie projektu Scipion. Okno wyświetlane przez Scipion, w którym można wybrać stary projekt lub utworzyć nowy, podając nazwę i lokalizację tego projektu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2. Metoda importu filmów. Okno wyświetlane przez Scipion, gdy otwarte jest pwem - import filmów. W tym miejscu należy uwzględnić główne parametry akwizycji, aby filmy mogły być przetwarzane w Scipion. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3. Metoda wyrównywania filmu. Okno wyświetlane przez Scipion, gdy używane jest xmipp3 - wyrównanie optyczne. Filmy wejściowe, zakres klatek branych pod uwagę przy wyrównywaniu i kilka innych parametrów do przetwarzania filmów powinny być wypełnione. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4. Metoda szacowania CTF za pomocą Ctffind. Formularz w Scipion ze wszystkimi niezbędnymi polami do uruchomienia programu Ctffind. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5. Czarodziej w Scipion. Kreator pomagający użytkownikowi w wypełnianiu niektórych parametrów w formularzu. W takim przypadku kreator ma uzupełnić pole resolution w metodzie grigoriefflab - ctffind. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6. Metoda uściślania CTF za pomocą Xmipp. Forma xmipp3 - estymacja ctf ze wszystkimi parametrami, aby dokonać udoskonalenia wcześniej oszacowanego CTF. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7. Metoda mikrofotografii przed procesem. Forma xmipp3 - wstępne przetwarzanie mikrofotografii, które pozwala na przeprowadzenie na nich pewnych operacji. W tym przykładzie przydatne są polecenia Usuń uszkodzone piksele i Mikrografie w dół. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8. Metoda kompletacji z Cryolo. Formularz do uruchamiania metody pobierania Cryolo przy użyciu wstępnie przeszkolonej sieci. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 9. Metoda wyboru opartego na konsensusie z Xmipp. Forma xmipp3 - głęboka kompletacja konsensusu oparta na głębokim uczeniu się w celu obliczenia konsensusu współrzędnych, przy użyciu wstępnie wytrenowanej sieci na kilku zestawach współrzędnych uzyskanych różnymi metodami wybierania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 10. Metoda ekstrakcji cząstek. Zakładki wprowadzania i przetwarzania wstępnego xmipp3 - wyodrębnianie cząstek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 11. 3D początkowej metody objętości z Xmipp. Forma metody xmipp3 - rekonstrukcja znacząca w celu uzyskania wstępnej mapy 3D. Zostaną wyświetlone karty Dane wejściowe i Kryteria. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 12. Metoda zmiany rozmiaru woluminu. Formularz do przycinania lub zmiany rozmiaru woluminu. W tym przykładzie ta metoda jest używana do generowania woluminu o pełnym rozmiarze po xmipp3 - rekonstruuj znaczące. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 13. 3D początkowy tom z wynikiem Relion. Widok uzyskanej objętości początkowej 3D z relionem - metoda początkowego modelu 3D według plasterków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 14. Udoskonalenie początkowego tomu za pomocą Relion. Forma relacji metody - automatyczne uściślanie 3D. W tym przykładzie został on użyty do uściślenia początkowego wolumenu oszacowanego po osiągnięciu konsensusu. Zostaną wyświetlone karty Wejściowa i Referencyjna mapa 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 15. 3D metoda klasyfikacji. Forma relacji - klasyfikacja 3D. Wyświetlane są zakładki Wejście, Mapa referencyjna 3D i Optymalizacja. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 16. 3D wyrównanie oparte na metodzie głębokiego uczenia. Formularz otwarty dla metody xmipp3 - deep align. W tym miejscu konieczne jest wytrenowanie sieci za pomocą zbioru uczącego, wtedy sieć ta będzie przewidywać przypisanie kątowe na cząstkę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 17. 3D metoda udoskonalania. Forma metody xmipp3 - highres. Wyświetlane są zakładki Wprowadzanie i Przypisanie kątowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 18. Pierwsza iteracja wyniku udoskonalania 3D. a) Krzywa FSC. (b) Uzyskany wolumin (o rozmiarze mniejszym niż pełna rozdzielczość) przedstawiony jako plasterki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 19. Pierwsza iteracja analizy korelacji udoskonalenia 3D. Pojawi się nowe okno po kliknięciu na ikonę paska w górnej części okna z listą cząstek. W oknie Wykres kolumn można utworzyć histogram żądanego parametru estymacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 20. Narzędzie do walidacji nadmiernego dopasowania. Forma xmipp3 - walidacja metody overfittingu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obecnie cryo-EM jest kluczowym narzędziem do ujawniania struktury 3D próbek biologicznych. Gdy za pomocą mikroskopu zbierzemy dobre dane, dostępne narzędzia przetwarzania pozwolą nam uzyskać rekonstrukcję 3D badanej makrocząsteczki. Przetwarzanie danych Cryo-EM jest w stanie osiągnąć rozdzielczość bliską atomowi, co jest kluczem do zrozumienia funkcjonalnego zachowania makrocząsteczki, a także ma kluczowe znaczenie w odkrywaniu leków.

Scipion to oprogramowanie, które umożliwia tworzenie całego przepływu pracy łączącego najważniejsze pakiety przetwarzania obrazu w sposób zintegrowany, co pomaga w śledzeniu i odtwarzalności całego przepływu pracy przetwarzania obrazu. Scipion zapewnia bardzo kompletny zestaw narzędzi do przeprowadzenia przetwarzania; Jednak uzyskanie rekonstrukcji w wysokiej rozdzielczości zależy całkowicie od jakości pozyskanych danych i sposobu ich przetwarzania.

Aby uzyskać rekonstrukcję 3D w wysokiej rozdzielczości, pierwszym wymogiem jest uzyskanie dobrych filmów z mikroskopu, które zachowują informacje strukturalne w wysokiej rozdzielczości. Jeśli tak nie jest, przepływ pracy nie będzie w stanie wyodrębnić z danych informacji w wysokiej rozdzielczości. Następnie, pomyślny proces przetwarzania powinien być w stanie wyodrębnić cząstki, które naprawdę odpowiadają strukturze i znaleźć orientacje tych cząstek w przestrzeni 3D. Jeśli którykolwiek z kroków przepływu pracy zakończy się niepowodzeniem, jakość zrekonstruowanego woluminu ulegnie pogorszeniu. Scipion pozwala na użycie różnych pakietów w każdym z etapów przetwarzania, co pomaga znaleźć najbardziej odpowiednie podejście do przetwarzania danych. Ponadto, dzięki dostępności wielu pakietów, można stosować narzędzia konsensusu, które zwiększają dokładność poprzez znalezienie zgodności w szacowanych wynikach różnych metod. Ponadto szczegółowo omówiono w sekcji Reprezentatywne wyniki kilka narzędzi walidacji oraz sposób identyfikowania dokładnych i niedokładnych wyników na każdym etapie przepływu pracy, wykrywania potencjalnych problemów i sposobów ich rozwiązywania. Wzdłuż protokołu znajduje się kilka punktów kontrolnych, które mogą pomóc w uświadomieniu sobie, czy protokół działa poprawnie, czy nie. Niektóre z najistotniejszych to: kompletacja, klasyfikacja 2D, początkowe szacowanie objętości i wyrównanie 3D. Sprawdzanie danych wejściowych, powtarzanie kroku inną metodą lub korzystanie z konsensusu to opcje dostępne w Scipion, których użytkownik może użyć, aby znaleźć rozwiązania, gdy pojawią się problemy.

Jeśli chodzi o poprzednie podejścia do integracji pakietów w dziedzinie Cryo-EM, Appion³¹ jest jedynym, który pozwala na rzeczywistą integrację różnych pakietów oprogramowania. Jednak Appion jest ściśle powiązany z Leginon³², systemem do automatycznego zbierania obrazów z mikroskopów elektronowych. Główna różnica w stosunku do Scipion polega na tym, że model danych i pamięć masowa są mniej sprzężone. W ten sposób, aby stworzyć nowy protokół w Scipion, wystarczy opracować skrypt w Pythonie. Jednak w Appion programista musi napisać skrypt i zmienić bazową bazę danych. Podsumowując, Scipion został opracowany w celu uproszczenia konserwacji i rozbudowy.

W tym manuskrypcie przedstawiliśmy kompletny przebieg procesu przetwarzania Cryo-EM, wykorzystując rzeczywisty zestaw danych przypadków rybosomu Plasmodium falciparum 80S (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660). Omówione i omówione tutaj kroki można podsumować jako wyrównanie filmu, estymacja CTF, wybieranie cząstek, klasyfikacja 2D, wstępna estymacja mapy, klasyfikacja 3D, udoskonalanie 3D, ocena i przetwarzanie końcowe. W kilku z tych etapów wykorzystano różne pakiety, a narzędzia konsensusu zostały zastosowane. Ostateczna objętość zrekonstruowana w 3D osiągnęła rozdzielczość 3 A, a w objętości przetworzonej można wyróżnić niektóre struktury drugorzędowe, takie jak alfa-helisy, co pomaga opisać, jak atomy są ułożone w przestrzeni.

Przepływ pracy przedstawiony w tym manuskrypcie pokazuje, w jaki sposób Scipion może być używany do łączenia różnych pakietów Cryo-EM w prosty i zintegrowany sposób, aby uprościć przetwarzanie i jednocześnie uzyskać bardziej wiarygodne wyniki.

W przyszłości rozwój nowych metod i pakietów będzie się rozwijał, a oprogramowanie takie jak Scipion, które pozwoli na łatwą integrację wszystkich z nich, będzie jeszcze ważniejsze dla badaczy. Podejścia oparte na konsensusie będą bardziej odpowiednie nawet wtedy, gdy dostępnych będzie wiele metod o różnych podstawach, co pomoże uzyskać dokładniejsze oszacowania wszystkich parametrów zaangażowanych w proces rekonstrukcji w Cryo-EM. Śledzenie i odtwarzalność są kluczowe w procesie badawczym i łatwiejsze do osiągnięcia w przypadku Scipion dzięki wspólnej strukturze do wykonywania kompletnych przepływów pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
w tym artykule nie wykorzystano żadnego materiału	-	-	-