Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Podsumowanie

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Streszczenie

Mikroskopia krioelektronowa stała się jednym z najważniejszych narzędzi w badaniach biologicznych, pozwalającym na ujawnienie informacji strukturalnych makromolekuł w rozdzielczości zbliżonej do atomowej. W analizie pojedynczej cząstki zeszklona próbka jest obrazowana za pomocą wiązki elektronów, a detektory na końcu kolumny mikroskopowej wytwarzają filmy tej próbki. Filmy te zawierają tysiące obrazów identycznych cząstek w losowych orientacjach. Dane muszą przejść przez proces przetwarzania obrazu składający się z wielu kroków, aby uzyskać ostateczną objętość zrekonstruowaną w 3D. Celem procesu przetwarzania obrazu jest zidentyfikowanie parametrów akwizycji, aby móc zrekonstruować badaną próbkę. Scipion zapewnia wszystkie narzędzia do stworzenia tego przepływu pracy przy użyciu kilku pakietów przetwarzania obrazów w zintegrowanej strukturze, umożliwiając również śledzenie wyników. W tym artykule przedstawiono i omówiono cały proces przetwarzania obrazu w Scipion z danymi pochodzącymi z rzeczywistego przypadku testowego, podając wszystkie szczegóły niezbędne do przejścia od filmów uzyskanych przez mikroskop do końcowej rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości. Omówiono również moc stosowania narzędzi konsensusu, które umożliwiają łączenie metod i potwierdzanie wyników na każdym etapie przepływu pracy, poprawiając dokładność uzyskanych wyników.

Wprowadzenie

W mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), analiza pojedynczych cząstek (SPA) zeszklonych próbek mrożono-uwodnionych jest jednym z najczęściej stosowanych i udanych wariantów obrazowania makrocząsteczek biologicznych, ponieważ pozwala zrozumieć interakcje molekularne i funkcję zespołów biologicznych¹. Dzieje się tak dzięki niedawnym postępom w tej technice obrazowania, które dały początek "rewolucji rozdzielczości"² i umożliwiły pomyślne określenie biologicznych struktur 3D z rozdzielczością bliską atomowi. Obecnie najwyższa rozdzielczość osiągnięta w SPA cryo-EM wyniosła 1,15 A dla apoferrytyny³ (wpis EMDB: 11668). Na te osiągnięcia technologiczne składają się ulepszenia w przygotowaniu próbek⁴, akwizycji obrazu⁵ oraz metodach przetwarzania obrazu⁶. Ten artykuł skupia się na tym ostatnim punkcie.

Krótko mówiąc, celem metod przetwarzania obrazu jest zidentyfikowanie wszystkich parametrów akwizycji, aby odwrócić proces obrazowania mikroskopu i odzyskać strukturę 3D badanej próbki biologicznej. Parametry te to wzmocnienie kamery, ruch wywołany wiązką, aberracje mikroskopu (głównie rozogniskowanie), orientacja kątowa 3D i translacja każdej cząstki oraz stan konformacyjny w przypadku posiadania próbki ze zmianami konformacyjnymi. Jednak liczba parametrów jest bardzo wysoka, a cryo-EM wymaga stosowania obrazów o niskiej dawce, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, co znacznie zmniejsza stosunek sygnału do szumu (SNR) pozyskiwanych obrazów. W związku z tym problemu nie można jednoznacznie rozwiązać, a wszystkie parametry, które mają zostać obliczone, mogą być jedynie szacunkami. W całym procesie przetwarzania obrazu należy zidentyfikować prawidłowe parametry, odrzucając pozostałe, aby ostatecznie uzyskać rekonstrukcję 3D w wysokiej rozdzielczości.

Dane generowane przez mikroskop są zebrane w ramkach. Upraszczając, ramka zawiera liczbę elektronów, które dotarły do określonej pozycji (piksela) na obrazie, za każdym razem, gdy używane są detektory zliczające elektrony. W określonym polu widzenia zbieranych jest kilka klatek i nazywa się to filmem. Ponieważ niskie dawki elektronów są stosowane w celu uniknięcia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, które mogłyby zniszczyć próbkę, SNR jest bardzo niski, a klatki odpowiadające temu samemu filmowi muszą zostać uśrednione, aby uzyskać obraz ujawniający informacje strukturalne o próbce. Jednak nie tylko prosta średnia jest stosowana, próbka może ulegać przesunięciom i innym rodzajom ruchów w czasie obrazowania z powodu ruchu wywołanego wiązką, który należy skompensować. Klatki z kompensacją przesunięcia i uśrednione tworzą mikrofotografię.

Po uzyskaniu mikrofotografii, musimy oszacować aberracje wprowadzone przez mikroskop dla każdej z nich, zwane Funkcją Transferu Kontrastu (CTF), która reprezentuje zmiany kontrastu mikrofotografii w funkcji częstotliwości. Następnie cząstki można wybrać i wyekstrahować, co nazywa się wybieraniem cząstek. Każda cząstka powinna być małym obrazem zawierającym tylko jedną kopię badanej próbki. Istnieją trzy rodziny algorytmów wybierania cząstek: 1) te, które wykorzystują tylko podstawową parametryzację wyglądu cząstki, aby znaleźć je w całym zestawie mikrofotografii (np. rozmiar cząstek), 2) te, które uczą się, jak wyglądają cząstki od użytkownika lub wstępnie wytrenowanego zestawu, oraz 3) te, które używają szablonów obrazów. Każda rodzina ma inne właściwości, które zostaną pokazane później.

Wyodrębniony zestaw cząstek znalezionych na mikrofotografiach zostanie wykorzystany w procesie klasyfikacji 2D, który ma dwa cele: 1) oczyszczenie zestawu cząstek poprzez odrzucenie podzbioru zawierającego obrazy czystego szumu, nakładające się na siebie cząstki lub inne artefakty, oraz 2) uśrednione cząstki reprezentujące każdą klasę mogą być użyte jako początkowe informacje do obliczenia początkowej objętości 3D.

Początkowe obliczenie objętości 3D to kolejny kluczowy krok. Problem uzyskania struktury 3D może być postrzegany jako problem optymalizacyjny w wielowymiarowym krajobrazie rozwiązań, gdzie globalnym minimum jest najlepsza objętość 3D, która reprezentuje oryginalną strukturę, ale można znaleźć kilka lokalnych minimów reprezentujących nieoptymalne rozwiązania i gdzie bardzo łatwo jest wpaść w pułapkę. Początkowy wolumen stanowi punkt wyjścia dla procesu wyszukiwania, więc złe oszacowanie początkowego wolumenu może uniemożliwić nam znalezienie globalnego minimum. Począwszy od początkowej objętości, etap klasyfikacji 3D pomoże odkryć różne stany konformacyjne i ponownie oczyścić zestaw cząstek; Celem jest uzyskanie strukturalnie jednorodnej populacji cząstek. Następnie etap udoskonalania 3D będzie odpowiedzialny za dopracowanie parametrów kątowych i translacyjnych dla każdej cząstki, aby uzyskać najlepszą możliwą objętość 3D.

Na koniec, w ostatnich krokach, uzyskana rekonstrukcja 3D może zostać wyostrzona i wypolerowana. Ostrzenie to proces wzmacniania wysokich częstotliwości zrekonstruowanej objętości, a polerowanie jest krokiem w kierunku dalszego dopracowania niektórych parametrów, takich jak CTF lub kompensacja ruchu wywołanego wiązką, na poziomie cząstek. Ponadto niektóre procedury walidacji mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia osiągniętej rozdzielczości na końcu przepływu pracy.

Po wszystkich tych krokach, procesy śledzenia i dokowania⁷ pomogą nadać biologiczne znaczenie uzyskanej rekonstrukcji 3D, budując modele atomowe de novo lub dopasowując istniejące modele. Jeśli osiągniemy wysoką rozdzielczość, procesy te powiedzą nam o położeniu struktur biologicznych, a nawet różnych atomów, w naszej strukturze.

Scipion⁸ pozwala na stworzenie całego przepływu pracy, łącząc najważniejsze pakiety przetwarzania obrazów w sposób integracyjny. Xmipp⁹, Relion¹⁰, CryoSPARC¹¹, Eman¹², Spider¹³, Cryolo¹⁴, Ctffind¹⁵, CCP4¹⁶, Phenix¹⁷ i wiele innych pakietów można dołączyć do Scipion. Zawiera również wszystkie niezbędne narzędzia, które zapewniają integrację, interoperacyjność, identyfikowalność i odtwarzalność, aby w pełni śledzić cały przepływ pracy przetwarzania obrazu⁸.

Jednym z najpotężniejszych narzędzi, które Scipion pozwala nam używać, jest konsensus, który oznacza porównywanie wyników uzyskanych za pomocą kilku metod w jednym kroku przetwarzania, tworząc kombinację informacji przekazywanych różnymi metodami w celu wygenerowania dokładniejszego wyniku. Może to przyczynić się do zwiększenia wydajności i poprawy osiągniętej jakości w szacowanych parametrach. Należy pamiętać, że prostszy przepływ pracy można zbudować bez użycia metod konsensusu; Widzieliśmy jednak moc tego narzędzia^22,25, a przepływ pracy przedstawiony w tym manuskrypcie będzie z niego korzystał w kilku krokach.

Wszystkie kroki, które zostały podsumowane w poprzednich akapitach, zostaną szczegółowo wyjaśnione w następnej sekcji i połączone w kompletny przepływ pracy za pomocą Scipion. Pokazane zostanie również, w jaki sposób korzystać z narzędzi konsensusu, aby osiągnąć wyższą zgodność w generowanych produktach. W tym celu wybrano przykładowy zbiór danych rybosomu Plasmodium falciparum 80S (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660). Zestaw danych składa się z 600 filmów składających się z 16 klatek o rozmiarze 4096x4096 pikseli o rozmiarze piksela 1,34Å wykonanych przy użyciu FEI POLARA 300 za pomocą kamery FEI FALCON II, o rozdzielczości zgłoszonej w EMDB to 3,2Ź⁸ .

Protokół

1. Tworzenie projektu w Scipion i importowanie danych

1. Otwórz Scipion i kliknij Utwórz projekt, określ nazwę projektu i miejsce, w którym zostanie on zapisany (Rysunek uzupełniający 1). Scipion otworzy okno projektu pokazujące płótno z panelem z listą dostępnych metod, każda z nich reprezentuje jedno narzędzie do przetwarzania obrazu, które można wykorzystać do zarządzania danymi.
   UWAGA: Ctrl+F może być użyty do znalezienia metody, jeśli nie pojawia się ona na liście.
2. Aby zaimportować filmy wykonane przez mikroskop, wybierz pwem - importuj filmy na lewym panelu (lub wpisz go naciskając Ctrl+F).
3. Otworzy się nowe okno (rysunek uzupełniający 2). Tam uwzględnij ścieżkę do danych i parametry pozyskiwania. W tym przykładzie użyj następującej konfiguracji: Napięcie mikroskopu 300 kV, Aberracja sferyczna 2,0 mm, Kontrast amplitudy 0,1, Współczynnik powiększenia 50000, Tryb częstotliwości próbkowania do Z obrazu i Rozmiar piksela 1,34 A. Po wypełnieniu wszystkich parametrów w formularzu kliknij przycisk Wykonaj.
   UWAGA: Po uruchomieniu metody na płótnie pojawia się pole w kolorze żółtym oznaczone jako uruchomione. Po zakończeniu metody pole zmieni kolor na zielony, a etykieta zmieni się na zakończoną. W przypadku wystąpienia błędu podczas wykonywania metody, pole pojawi się na czerwono, oznaczone jako niepowodzenie. W takim przypadku sprawdź dolną część płótna, w zakładce Dziennik wyjściowy pojawi się wyjaśnienie błędu.
4. Po zakończeniu metody sprawdź wyniki w dolnej części płótna na karcie Podsumowanie. W tym miejscu prezentowane są dane wyjściowe wygenerowane przez metodę, w tym przypadku zestaw filmów. Kliknij przycisk Analizuj wyniki, a pojawi się nowe okno z listą filmów.

2. Wyrównanie filmu: od filmów do mikrofotografii

1. Użyj metody xmipp3 - wyrównanie optyczne, która implementuje Optical flow¹⁹. Aby wypełnić formularz, należy użyć następujących parametrów (Rysunek uzupełniający 3): filmy wejściowe to filmy uzyskane w kroku 1, zakres w polu Klatki do wyrównania wynosi od 2 do 13, pozostałe opcje pozostają przy wartościach domyślnych. Uruchom program.
   UWAGA: Parametry pogrubione w formularzu muszą być zawsze wypełnione. Pozostałe będą miały wartość domyślną lub nie będą obowiązkowo wymagane. W górnej części okna formularza znajdują się pola, w których rozmieszczone są zasoby obliczeniowe, takie jak wątki, interfejsy MPI lub procesory GPU.
2. Kliknij na Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane mikrofotografie i trajektorię szacowanych przesunięć (Rysunek 1). Dla każdego widzianego mikrografu: spójrz na gęstość widmową mocy (PSD), trajektorie uzyskane w celu wyrównania filmu (jeden punkt na klatkę) we współrzędnych kartezjańskich i biegunowych oraz nazwę pliku uzyskanej mikrofotografii (klikając na nią, mikrografię można sprawdzić). Zauważ, że cząstki próbki są znacznie bardziej widoczne na mikrofotografii w porównaniu z pojedynczą klatką filmu.

3. Szacowanie CTF: obliczanie aberracji mikroskopu

1. Najpierw użyj metody grigoriefflab - ctffind¹⁵. Konfiguracja jest następująca: mikrografy wejściowe są danymi wyjściowymi kroku 2, współczynnik ręcznego zmniejszania próbkowania CTF jest ustawiony na 1,5, a zakres rozdzielczości wynosi od 0,06 do 0,42. Ponadto w Opcjach zaawansowanych (które można znaleźć, wybierając tę opcję na Poziomie Eksperta formularza) ustaw Rozmiar okna na 256. Pozostałe parametry pozostają z wartościami domyślnymi (rysunek uzupełniający 4).
   UWAGA: W większości metod w Scipion opcja Advanced pokazuje więcej parametrów konfiguracyjnych. Z tych opcji należy korzystać ostrożnie, gdy program, który ma zostać uruchomiony, jest całkowicie znany, a znaczenie parametrów jest zrozumiałe. Niektóre parametry mogą być trudne do wypełnienia bez patrzenia na dane; w takim przypadku Scipion pokazuje magiczną różdżkę po prawej stronie, która pokaże okno kreatora (Rysunek uzupełniający 5). Na przykład w polu Rozdzielczość tego formularza jest to szczególnie przydatne, ponieważ wartości te powinny być wybrane tak, aby w przybliżeniu pokrywały obszar od pierwszego zera do ostatniego zauważalnego pierścienia PSD.
2. Kliknij Execute (Wykonaj) i Analizuj wyniki (Rysunek 2) po zakończeniu metody. Sprawdź, czy szacowany CTF jest zgodny z eksperymentalnym. W tym celu spójrz na PSD i porównaj szacowane pierścienie w rogu z tymi pochodzącymi z danych. Sprawdź również uzyskane wartości rozmycia, aby znaleźć nieoczekiwane wartości, a odpowiednie mikrofotografie można odrzucić lub ponownie przeliczyć. W tym przykładzie można użyć całego zestawu mikrofotografii.
   UWAGA: Użyj przycisków w dolnej części okna, aby utworzyć podzbiór mikrofotografii (z czerwonym przyciskiem Mikrografie) i przeliczyć CTF (z czerwonym przyciskiem Przelicz CTF), jeśli zajdzie taka potrzeba.
3. Aby doprecyzować poprzednie oszacowanie, użyj xmipp3 - ctf estimation²⁰. Wybierz jako Mikrografie wejściowe dane wyjściowe kroku 2, wybierz opcję Użyj defoci z poprzedniego oszacowania CTF, jako Poprzednie oszacowanie CTF wybierz dane wyjściowe grigoriefflab - ctffind, a na poziomie zaawansowanym zmień rozmiar okna na 256 (Rysunek uzupełniający 6). Uruchom to.
4. Kliknij Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane CTF-y. W przypadku tej metody więcej danych jest szacowanych i reprezentowanych w kilku dodatkowych kolumnach. Ponieważ żaden z nich nie pokazuje nieprawidłowych wartości szacunkowych, wszystkie mikrofotografie zostaną wykorzystane w kolejnych krokach.

4. Wybieranie cząstek: znajdowanie cząstek na mikrofotografiach

1. Przed przystąpieniem do kompletacji należy przeprowadzić wstępny proces mikrofotografii. Otwórz xmipp3 - wstępnie przetwarzaj mikrofotografie, ustaw jako mikrografie wejściowe te uzyskane w kroku 2 i wybierz opcje Usuń uszkodzone piksele? z wielokrotnością standardowej wartości 5 i Mikrografie w dół? ze współczynnikiem próbkowania w dół równym 2 (Rysunek uzupełniający 7). Kliknij Wykonaj i sprawdź, czy rozmiar powstałych mikrofotografii został zmniejszony.
2. Do pobierania użyj xmipp3 - ręczne pobieranie (krok 1) i xmipp3 - automatyczne pobieranie (krok 2)²¹. Ręczne pobieranie pozwala na ręczne przygotowanie zestawu cząstek, z którymi krok automatycznego pobierania nauczy się i wygeneruje kompletny zestaw cząstek. Najpierw uruchom xmipp3 - ręczne pobieranie (krok 1) z mikrografiami wejściowymi jako mikrografiami uzyskanymi w poprzednim procesie wstępnym. Kliknij na Execute (Wykonaj), a pojawi się nowe interaktywne okno (Rysunek 3).
3. W tym oknie prezentowana jest lista mikrofotografii (Rysunek 3a) oraz innych opcji. Zmień rozmiar (px) na 150, będzie to rozmiar pudełka zawierającego każdą cząstkę. Wybrana mikrofotografia pojawi się w większym oknie. Wybierz region i wybierz wszystkie widoczne w nim cząstki (Rysunek 3b). Następnie kliknij Aktywuj szkolenie, aby rozpocząć naukę. Pozostałe obszary mikrofotografii są wybierane automatycznie (Rysunek 3c). Sprawdź wybrane cząstki i dołącz więcej, klikając na nie, lub usuń niewłaściwe za pomocą shift+kliknięcie, jeśli to konieczne.
4. Wybierz następną mikrofotografię w pierwszym oknie. Mikrofotografia zostanie automatycznie pobrana. Sprawdź ponownie, aby w razie potrzeby uwzględnić lub usunąć niektóre cząstki. Powtórz ten krok z około 5 mikrofotografiami, aby stworzyć reprezentatywny zestaw treningowy.
5. Gdy to zrobisz, kliknij Współrzędne w oknie głównym, aby zapisać współrzędne wszystkich wybranych cząstek. Zestaw uczący cząstek jest gotowy do przejścia do automatycznego wybierania w celu zakończenia procesu dla wszystkich mikrofotografii.
6. Otwórz xmipp3 - automatyczne pobieranie (krok 2) wskazujące, że w Xmipp pobieranie cząstek uruchamia poprzednie pobieranie ręczne, a mikrografy wybierają jako takie same jak nadzorowane. Kliknij Wykonaj. Ta metoda wygeneruje jako dane wyjściowe zestaw około 100000 współrzędnych.
7. Zastosuj podejście oparte na konsensusie, więc przeprowadź drugą metodę wybierania, aby wybrać cząstki, w których obie metody są zgodne. Open sphire - cryolo picking¹⁴ i wybierz wstępnie przetworzone mikrofotografie jako mikrofotografie wejściowe, Użyj modelu ogólnego? do Tak, z progiem ufności 0,3 i rozmiarem pudełka 150 (rysunek uzupełniający 8). Uruchom to. Metoda ta powinna również wygenerować około 100000 współrzędnych.
8. Uruchom xmipp3 - deep consensus picking²². Ponieważ współrzędne wejściowe obejmują dane wyjściowe sphire — wybieranie kriolologiczne (krok 4.7) i xmipp3 — automatyczne wybieranie (krok 4.6), ustaw opcję Wybierz typ modelu na wstępnie wytrenowany i pomiń trenowanie i oceń bezpośrednio za pomocą wstępnie wytrenowanego modelu? na Tak (rysunek uzupełniający 9). Uruchom to.
9. Kliknij Analizuj wyniki i w nowym oknie kliknij ikonę oka obok opcji Wybierz cząstki/współrzędne z wysokimi wartościami "zScoreDeepLearning1". Otworzy się nowe okno z listą wszystkich cząstek (Rysunek 4). Wartości zScore w kolumnie dają wgląd w jakość cząstki, niskie wartości oznaczają złą jakość.
   1. Kliknij etykietę_xmipp_zScoreDeepLearning aby uporządkować cząstki od najwyższego do najniższego zScore. Wybierz cząstki o wskaźniku zScore wyższym niż 0,75 i kliknij Współrzędne, aby utworzyć nowy podzbiór. Powinno to utworzyć podzbiór o około 50000 współrzędnych.
10. Otwórz xmipp3 - głębokie czyszczenie mikrografów. Jako współrzędne wejściowe wybierz podzbiór uzyskany w poprzednim kroku, źródło mikrografów jest takie samo jak współrzędne i utrzymuj wartość Threshold na poziomie 0,75. Uruchom to. Sprawdź na karcie Podsumowanie, czy liczba współrzędnych została zmniejszona, chociaż w tym przypadku usunięto tylko kilka współrzędnych.
    UWAGA: Ten krok jest w stanie dodatkowo wyczyścić zestaw współrzędnych i może być bardzo przydatny w czyszczeniu innych zestawów danych z większą liczbą artefaktów filmowych, takich jak strefy węglowe lub duże zanieczyszczenia.
11. Uruchom xmipp3 - wyodrębnij cząstki (rysunek uzupełniający 10). Jako współrzędne wejściowe wskaż współrzędne uzyskane po poprzednim kroku, źródło mikrografów jako inne, mikrografy wejściowe jako dane wyjściowe kroku 2, oszacowanie CTF jako dane wyjściowe oszacowania xmipp3 - ctf, współczynnik próbkowania w dół do 3 i rozmiar pudełka na cząstki do 100. Na karcie Przetwarzanie wstępne formularza wybierz opcję Tak dla wszystkich. Uruchom to.
12. Sprawdź, czy dane wyjściowe powinny zawierać cząstki o zmniejszonym rozmiarze 100x100 pikseli i rozmiarze piksela 4,02 piksela/px.
13. Uruchom ponownie xmipp3 - wyodrębnij cząstki, zmieniając następujące parametry: zmniejszenie współczynnika próbkowania do 1 i rozmiar pudełka na cząstki do 300. Sprawdź, czy dane wyjściowe są tym samym zestawem cząstek, ale teraz w pełnej rozdzielczości.

5. Klasyfikacja 2D: grupowanie podobnych cząstek razem

1. Otwórz metodę cryosparc2 - 2d classification¹¹ z cząstkami wejściowymi, takimi jak te uzyskane w kroku 4.11, a w zakładce Klasyfikacja 2D Liczba klas na 128 zachowaj wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi. Uruchom to.
2. Kliknij na Analizuj wyniki, a następnie na ikonę oka obok opcji Wyświetl klasy cząstek za pomocą Scipion (Rysunek 5). Ta klasyfikacja pomoże oczyścić zestaw cząstek, ponieważ kilka klas będzie wydawać się hałaśliwych lub z artefaktami. Wybierz klasy zawierające dobre widoki. Kliknij Cząstki (czerwony przycisk w dolnej części okna), aby utworzyć podzbiór czyszczący.
3. Teraz otwórz xmipp3 - cl2d²³ i ustaw jako obrazy wejściowe obrazy uzyskane w poprzednim kroku i liczbę klas na 128. Kliknij na Execute.
   UWAGA: Ta druga klasyfikacja jest stosowana jako dodatkowy etap czyszczenia zestawu cząstek. Zwykle warto usunąć jak najwięcej hałaśliwych cząstek. Jeśli jednak wymagany jest prostszy przepływ pracy, można użyć tylko jednej metody klasyfikacji 2D.
4. Po zakończeniu metody sprawdź 128 wygenerowanych klas, klikając Analizuj wyniki i Co pokazać: klasy. Większość wygenerowanych klas pokazuje rzut makrocząsteczki z pewnym poziomem szczegółowości. Jednak niektóre z nich wydają się głośne (w tym przykładzie około 10 klas). Wybierz wszystkie dobre klasy i kliknij przycisk Klasy, aby wygenerować nowy podzbiór zawierający tylko dobre. Ten podzbiór będzie używany jako dane wejściowe dla jednej z metod generowania woluminu początkowego. Mając te same wybrane klasy, kliknij na Cząsteczki, aby utworzyć czystszy podzbiór po usunięciu tych należących do złych klas.
5. Otwórz pwem - podzbiór z pełnym zestawem elementów jako wyjściem 4.13 (wszystkie cząstki w pełnym rozmiarze), Utwórz losowy podzbiór na Nie, Inny zestaw jako podzbiór cząstek utworzonych w poprzednim kroku i Ustaw operację jako przecięcie. Spowoduje to wyodrębnienie poprzedniego podzbioru z cząstek w pełnej rozdzielczości.

6. Początkowe oszacowanie objętości: budowanie pierwszego przypuszczenia objętości 3D

1. W tym kroku oszacuj dwie początkowe objętości za pomocą różnych metod, a następnie użyj narzędzia konsensusu, aby wygenerować ostateczną szacowaną objętość 3D. Otwórz xmipp3 - zrekonstruuj metodę significant²⁴ z klasami wejściowymi jak te uzyskane po kroku 5, grupą symetrii jako c1 i zachowaj pozostałe parametry z ich wartościami domyślnymi (rysunek uzupełniający 11). Wykonaj to.
2. Kliknij Analizuj wyniki. Sprawdź, czy uzyskano wolumin o niskiej rozdzielczości o wymiarach 100x100x100 pikseli i rozmiarze piksela 4,02 μ/px.
3. Otwórz xmipp3 - przytnij/zmień rozmiar woluminów (Rysunek uzupełniający 12) używając jako woluminów wejściowych tych uzyskanych w poprzednim kroku, Zmienić rozmiar woluminów? na Tak, opcję Zmień rozmiar na Częstotliwość próbkowania i Zmień rozmiar częstotliwości próbkowania na 1,34 A/px. Uruchom to. Sprawdź na karcie Podsumowanie, czy wolumin wyjściowy ma prawidłowy rozmiar.
4. Teraz utwórz drugi wolumin początkowy. Otwórz relion - 3D initial model¹⁰, ponieważ cząstki wejściowe używają dobrych cząstek w pełnej rozdzielczości (wyjście 5,5) i ustawiają średnicę maski cząstek na 402A, zachowaj pozostałe parametry z wartościami domyślnymi. Uruchom to.
5. Kliknij Analizuj wyniki, a następnie w Wyświetlaj głośność z: plasterkami. Sprawdź, czy uzyskano objętość o niskiej rozdzielczości, ale z głównym kształtem struktury (rysunek uzupełniający 13).
6. Teraz otwórz pwem - join sets, aby połączyć dwa wygenerowane woluminy początkowe w celu utworzenia danych wejściowych do metody konsensusu. Po prostu wskaż Woluminy jako Typ wejścia i wybierz dwa początkowe woluminy w zestawie Wejść. Uruchom to. Dane wyjściowe powinny być zestawem zawierającym dwa elementy z obydwoma woluminami.
7. Narzędziem konsensusu jest to, które znajduje się w xmipp3 - swarm consensus²⁵. Otwórz to. Użyj jako pełnowymiarowych obrazów dobrych cząstek w pełnej rozdzielczości (wyjście 5,5), jako początkowych objętości zestawu z dwoma elementami wygenerowanymi w poprzednim kroku i upewnij się, że grupa symetrii to c1. Kliknij Wykonaj.
8. Kliknij Analizuj wyniki. Sprawdź, czy uzyskano bardziej szczegółową wolumin wyjściowy (Rysunek 6). Chociaż wokół struktury jest więcej szumu, aby mieć więcej szczegółów na mapie struktury, pomocne będą następujące kroki uściślające, aby uniknąć lokalnych minimów.
   UWAGA: Jeśli UCSF Chimera²⁶ jest dostępny, użyj ostatniej ikony w górnej części okna, aby wykonać wizualizację 3D uzyskanej objętości.
9. Otwórz i wykonaj relion - 3D auto-refine¹⁰, aby dokonać pierwszego kątowego przypisania cząstek w 3D. Jako Cząstki wejściowe wybierz wyjście 5.5 i ustaw średnicę maski cząstek na 402A. W zakładce Referencyjna mapa 3D wybierz jako Objętość wejściową tę uzyskaną w poprzednim kroku, Symetria jako c1 i Początkowy filtr dolnoprzepustowy do 30A (Rysunek uzupełniający 14).
10. Kliknij Analizuj wyniki. W nowym oknie wybierz final jako Volume do wizualizacji i kliknij Display volume with: slices, aby zobaczyć uzyskaną objętość. Sprawdź również korelację powłoki Fouriera (FSC), klikając na Wyświetl wykresy rozdzielczości w oknie wyników oraz pokrycie kątowe w Wyświetl rozkład kątowy: wykres 2D (Rysunek 7). Zrekonstruowana woluta zawiera znacznie więcej szczegółów (prawdopodobnie z niewielkimi rozmytymi obszarami w zewnętrznej części konstrukcji), a FSC przekracza próg 0,143 w okolicach 4,5A. Pokrycie kątowe obejmuje całą sferę 3D.

7. 3D klasyfikacja: odkrywanie stanów konformacyjnych

1. Stosując podejście oparte na konsensusie, można odkryć, czy w danych występują różne stany konformacyjne. Otwórz relion - klasyfikacja 3D¹⁰ (Rysunek uzupełniający 15). Jako cząstki wejściowe użyj tych właśnie uzyskanych w 6.10 i ustaw średnicę maski cząstek na 402A. Na karcie Referencyjna mapa 3D użyj jako objętości wejściowej objętości uzyskanej po kroku 6.10, ustaw Symetria na c1 i Początkowy filtr dolnoprzepustowy na 15A. Na koniec w zakładce Optymalizacja ustaw liczbę zajęć na 3. Uruchom to.
2. Sprawdź wyniki, klikając Analizuj wyniki, wybierz Pokaż klasyfikację w Scipion. Pokazane są trzy wygenerowane klasy i kilka interesujących miar. Pierwsze dwie klasy powinny mieć podobną liczbę przypisanych obrazów (kolumna rozmiaru) i wyglądać bardzo podobnie, podczas gdy trzecia ma mniej obrazów i bardziej rozmyty wygląd. Ponadto rlnAccuracyRotations i rlnAccuracyTranslations powinny być wyraźnie lepsze dla pierwszych dwóch klas. Wybierz dwie najlepsze klasy i kliknij przycisk Klasy, aby wygenerować podzbiór je zawierający.
3. Powtórz kroki 7.1 i 7.2, aby wygenerować drugą grupę dobrych klas. Oba te elementy będą stanowić dane wejściowe narzędzia konsensusu.
4. Otwórz i uruchom xmipp3 - consensus classes 3D i wybierz jako Input Classes dwa podzbiory wygenerowane w poprzednich krokach.
5. Kliknij Analizuj wyniki. Przedstawiona jest liczba zbieżnych cząstek między klasami: pierwsza wartość to liczba pokrywających się cząstek w pierwszej klasie podzbioru 1 i pierwszej klasie podzbioru 2, druga wartość to liczba pokrywających się cząstek w pierwszej klasie podzbioru 1 i drugiej klasie podzbioru 2 itd. Sprawdź, czy cząstki są losowo przypisane do klasy pierwszej lub drugiej, co oznacza, że metoda klasyfikacji 3D nie jest w stanie znaleźć zmian konformacyjnych. Biorąc pod uwagę ten wynik, cały zestaw cząstek zostanie wykorzystany do dalszego przetwarzania.

8. 3D uściślenie: udoskonalanie kątowych przypisań jednorodnej populacji

1. Również w tym kroku zastosuj podejście oparte na konsensusie. Najpierw otwórz i uruchom pwem - subset z pełnym zestawem elementów jako wyjściem 6.9, Utwórz losowy podzbiór na Tak i Liczba elementów na 5000. Dzięki temu tworzony jest podzbiór obrazów z poprzednim wyrównaniem w celu wytrenowania metody używanej w następnym kroku.
2. Otwórz xmipp3 - głębokie wyrównanie, ustaw obrazy wejściowe jako dane wyjściowe dobrych cząstek uzyskanych w 5.5, Objętość jako tę uzyskaną po 6.10, Trening wejściowy ustawiony jako ten utworzony w poprzednim kroku, Rozdzielczość docelową na 10A, a pozostałe parametry zachowaj z wartościami domyślnymi (Rysunek uzupełniający 16). Kliknij Wykonaj.
3. Kliknij Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskany rozkład kątowy, w którym nie ma brakujących kierunków, a pokrycie kątowe nieznacznie się poprawia w porównaniu do 6.10 (Rysunek 8).
4. Otwórz i wykonaj xmipp3 - porównaj kąty i wybierz jako Cząstki wejściowe 1 wyjście 6.9 i Cząstki wejściowe 2 wyjście 8.2, upewnij się, że grupa Symetria to c1. Ta metoda oblicza zgodność między xmipp3 - głębokie wyrównanie i relion - automatyczne uściślanie 3D.
5. Kliknij Analizuj wyniki, zostanie wyświetlona lista cząstek z uzyskanymi różnicami w przesunięciach i kątach. Kliknij na ikonę paska w górnej części okna, otworzy się kolejne okno, które umożliwia tworzenie wykresów obliczonych zmiennych. Wybierz _xmipp_angleDiff i kliknij Wykres, aby zobaczyć reprezentację różnic kątowych na cząstkę. Zrób to samo z _xmipp_shiftDiff. Na tych rysunkach, w przybliżeniu w połowie cząstek, obie metody są zgodne (Rysunek 9). Zaznacz cząstki o różnicach kątowych mniejszych niż 10º i utwórz nowy podzbiór.
6. Teraz otwórz xmipp3 - highres²⁷, aby dokonać lokalnego doprecyzowania przypisanych kątów. Najpierw wybierz jako Obrazy pełnowymiarowe obrazy uzyskane w poprzednim kroku, a jako Początkowe woluminy dane wyjściowe 6.9 ustaw Promień cząstki na 150 pikseli, a grupę Symetria na c1. Na karcie Przypisanie kątowe ustaw Wyrównanie obrazu na Lokalne, Liczba iteracji na 1 i Maksymalne. Rozdzielczość docelowa jako 5A/px (rysunek uzupełniający 17). Uruchom to.
7. Na karcie Podsumowanie sprawdź, czy wolumin wyjściowy jest mniejszy niż 300x300x300 pikseli i ma nieco większy rozmiar piksela.
8. Kliknij Analizuj wyniki, aby zobaczyć uzyskane wyniki. Kliknij na Wykresy rozdzielczości wyświetlacza, aby zobaczyć FSC, a na Objętość wyświetlacza: Zrekonstruowana, aby zobaczyć uzyskaną objętość (Rysunek uzupełniający 18). Uzyskuje się dobrą rozdzielczość głośności bliską 4-3,5A.
9. Kliknij Wyświetl cząstki wyjściowe i w oknie z listą cząstek kliknij ikonę paska. W nowym oknie wybierz opcję Wpisz jako histogram, ze 100 pojemnikami, wybierz etykietę _xmipp_cost, a na koniec naciśnij przycisk Drukuj (rysunek uzupełniający 19). W ten sposób prezentowany jest histogram etykiety kosztowej, który zawiera korelację cząstki z wybranym dla niej kierunkiem rzutowania. W tym przypadku uzyskuje się jednomodalną funkcję gęstości, która jest oznaką braku różnych populacji w zbiorze cząstek. W ten sposób wszystkie z nich zostaną wykorzystane do kontynuacji udoskonalenia
   UWAGA: W przypadku zobaczenia funkcji gęstości multimodalnej, zestaw cząstek należących do wyższego maksimum powinien być wybrany tak, aby kontynuować przepływ pracy tylko z nimi.
10. Otwórz i wykonaj ponownie xmipp3 - highres za pomocą opcji Kontynuuj z poprzedniego przebiegu? na Tak, ustaw jako Obrazy pełnowymiarowe te uzyskane po wersji 8.5, a następnie wybierz poprzedni przebieg z poprzednim wykonaniem Xmipp Highres. Na karcie Przypisanie kątowe ustaw Wyrównanie obrazu na Lokalne, z 1 iteracją i 2,6 A/px jako rozdzielczością docelową (pełna rozdzielczość).
11. Teraz dane wyjściowe powinny zawierać wolumin w pełnej rozdzielczości (rozmiar 300x300x300 pikseli). Kliknij na Analizuj wyniki, aby ponownie sprawdzić uzyskany wolumin i FSC, który teraz powinien być woluminem o wysokiej rozdzielczości około 3A (Rysunek 10).

9. Ocena i przetwarzanie końcowe

1. Otwórz xmipp3 - lokalna klasa MonoRes28. Ta metoda obliczy rozdzielczość lokalnie. Ustaw jako Głośność wejściową tę uzyskaną po 8.10, ustaw Czy chcesz używać połowy głośności? na Tak i Zakres rozdzielczości od 1 do 10A. Uruchom to.
2. Kliknij Analizuj wyniki i wybierz Pokaż histogram rozdzielczości i Pokaż kolorowe plasterki (Rysunek 11). Pokazana jest rozdzielczość w różnych częściach woluminu. Większość wokseli centralnej części struktury powinna prezentować rozdzielczości w okolicach 3A, podczas gdy najgorsze rozdzielczości osiąga się w częściach zewnętrznych. Również histogram rozdzielczości na woksel jest pokazany ze szczytem około (nawet poniżej) 3A.
3. Otwórz i uruchom xmipp3 - localdeblur sharpening²⁹, aby zastosować wyostrzanie. Jako Input Map wybierz ten uzyskany w 8.10, a jako Resolution Map ten uzyskany w poprzednim kroku za pomocą MonoRes.
4. Kliknij Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane woluminy. Otwórz ostatnią, odpowiadającą ostatniej iteracji algorytmu. Zaleca się otwarcie woluminu za pomocą innych narzędzi, takich jak UCSF Chimera²⁶, aby lepiej zobaczyć cechy woluminu w 3D (Rysunek 12).
5. Na koniec otwórz narzędzie walidacyjne zawarte w xmipp3 - validate overfitting³⁰, które pokaże, jak rozdzielczość zmienia się wraz z liczbą cząstek. Otwórz go i dołącz jako cząstki wejściowe cząstki uzyskane w kroku 8.5, ustaw Oblicz szum ograniczony dla rozdzielczości? na Tak, z początkową objętością referencyjną 3D jako wyjściem 8.10. W Opcjach zaawansowanych ustaw liczbę cząstekna "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (Rysunek uzupełniający 20). Uruchom to.
6. Kliknij Analizuj wyniki. Pojawią się dwa wykresy (Rysunek 13) wraz z ewolucją rozdzielczości, w zielonej linii, wraz ze wzrostem liczby cząstek użytych w rekonstrukcji. Czerwona linia reprezentuje rozdzielczość osiągniętą przy rekonstrukcji wyrównanego szumu Gaussa. Rozdzielczość poprawia się wraz z liczbą cząstek i obserwuje się dużą różnicę w rekonstrukcji z cząstek w porównaniu do tej z szumu, co jest wskaźnikiem posiadania cząstek z dobrą informacją strukturalną.
7. Na podstawie dotychczasowych wyników można by przeprowadzić dopasowanie modelu do objętości post-processingu, co pozwoliłoby na odkrycie struktur biologicznych makrocząsteczki.

Wyniki

Do przeprowadzenia testu wykorzystaliśmy zbiór danych rybosomu 80S Plasmodium falciparum (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660). Stosując protokół Scipion przedstawiony w poprzedniej sekcji, w tym konkretnym przykładzie uzyskano wysokorozdzielczą rekonstrukcję 3D objętości makrocząsteczki, wychodząc z informacji zebranych przez mikroskop, które składały się z bardzo zaszumionych obrazów zawierających projekcje 2D preparatu w dowolnej orientacji.

Główne wyniki uzyskane po przeprowadzeniu całego protokołu przedstawiono na Rysunku 10, Rysunku 11, oraz Rysunku 12. Rysunek 10 przedstawia uzyskaną objętość 3D przed postprocesingiem. Na Rysunku 10a widoczna jest krzywa FSC dla rozdzielczości 3 Å, która jest bardzo bliska granicy Nyquista (przy rozmiarze piksela wynoszącym 1,34 Å, granica Nyquista wynosi 2,6 Å). Rysunek 10b pokazuje wybrane przekroje zrekonstruowanej objętości 3D z wysokim poziomem szczegółowości i dobrze zdefiniowanymi strukturami. Na Rysunku 11 przedstawiono wyniki lokalnej analizy rozdzielczości uzyskanej objętości 3D. Widać, że większość wokseli w strukturze osiąga rozdzielczość poniżej 3 Å, głównie te znajdujące się w centralnej części struktury. Jednakże część zewnętrzna wykazuje gorszą rozdzielczość, co jest zgodne z rozmyciem występującym w tych obszarach na przekrojach na Rysunku 10b. Rysunek 12 przedstawia tę samą mapę 3D po postprocesingu, który pozwala uwypuklić wyższe częstotliwości objętości, ujawniając więcej szczegółów i poprawiając reprezentację, co jest szczególnie widoczne w prezentacji 3D na Rysunku 12c.

Na rysunku 14 program Chimera²⁶ został wykorzystany do wizualizacji 3D otrzymanej objętości (rysunek 14a), mapy po post-processingu (rysunek 14b) oraz mapy rozdzielczości (rysunek 14c), pokolorowanej zgodnie z kodem kolorów rozdzielczości lokalnych. Może to dostarczyć jeszcze więcej informacji o otrzymanej strukturze. Narzędzie to jest bardzo przydatne do oceny jakości uzyskanej objętości, ponieważ pozwala dostrzec bardzo małe detale w pełnym kontekście 3D struktury. Przy odpowiednio wysokiej rozdzielczości można zidentyfikować nawet poszczególne elementy biochemiczne struktury (np. alfa-helisy na rysunku 14d). Na tym rysunku należy zwrócić uwagę na wysoką rozdzielczość osiągniętą we wszystkich centralnych częściach struktury 3D, co widoczne jest jako ciemnoniebieskie obszary na rysunku 14c.

Wszystkie poprzednie wyniki zostały osiągnięte dzięki prawidłowemu przebiegowi całego protokołu, jednak nie zawsze tak jest. Istnieje kilka sposobów na zidentyfikowanie nieprawidłowego działania procesu. W najbardziej ogólnym przypadku dzieje się tak, gdy uzyskana struktura ma niską rozdzielczość i nie jest w stanie ewoluować w strukturę o lepszych parametrach. Przykład takiego przypadku przedstawiono na Rysunku 15. Rozmyta objętość (Rysunek 15c) skutkuje niską wartością FSC, co można zaobserwować na krzywej FSC (Rysunek 15a) oraz na histogramie lokalnej estymacji (Rysunek 15b). Ten przykład został wygenerowany przy użyciu metody udoskonalania 3D z nieprawidłowymi danymi wejściowymi, ponieważ metoda ta oczekiwała pewnych specyficznych właściwości zestawu cząsteczek wejściowych, których te nie spełniały. Jak widać, zawsze bardzo ważne jest wiedzieć, jak poszczególne metody oczekują otrzymania danych i odpowiednio je przygotować. Generalnie, gdy uzyskano wynik taki jak na Rysunku 15, może to oznaczać problem w przepływie przetwarzania lub w samych danych źródłowych.

W całym przepływie pracy istnieje kilka punktów kontrolnych, które można analizować, aby sprawdzić, czy protokół przebiega prawidłowo. Na przykład bezpośrednio po wyborze cząsteczek (picking) kilka z omówionych wcześniej metod może posłużyć do ich uszeregowania i przypisania każdej z nich określonej oceny. W przypadku wystąpienia wadliwych cząsteczek metody te pozwalają na ich identyfikację i usunięcie. Również klasyfikacja 2D może być dobrym wskaźnikiem obecności wadliwego zestawu cząsteczek. Rysunek 16 przedstawia przykład takiego wadliwego zestawu. Na Rysunku 16a pokazano dobre klasy zawierające pewne szczegóły struktury, podczas gdy Rysunek 16b pokazuje klasy wadliwe, które są zaszumione lub niedocentrowane; w tym ostatnim przypadku widać, że wybór cząsteczek był błędny i dwie cząsteczki zdają się pojawiać razem. Kolejnym punktem kontrolnym jest wstępna estymacja objętości; Rysunek 17 przedstawia przykład poprawnej (Rysunek 17a) oraz błędnej (Rysunek 17b) estymacji wstępnej. Błędna estymacja powstała w wyniku nieprawidłowej konfiguracji metody. Należy wziąć pod uwagę, że wszystkie konfiguracje powinny być przeprowadzane starannie, z odpowiednim doborem każdego parametru w zależności od analizowanych danych. W przypadku braku mapy z minimalnymi informacjami strukturalnymi, następne udoskonalanie (refinement) nie pozwoli na uzyskanie dobrej rekonstrukcji.

W przypadku błędnej akwizycji, w której filmy nie zachowują informacji strukturalnych, niemożliwe będzie wyekstrahowanie z nich odpowiednich cząstek i uzyskanie pomyślnego wyniku przetwarzania. W takiej sytuacji należy zebrać więcej filmów, aby uzyskać trójwymiarową rekonstrukcję o wysokiej rozdzielczości. Jeśli jednak problem nie wynika z jakości akwizycji, istnieje kilka sposobów na rozwiązanie trudności pojawiających się w toku procesu przetwarzania. Jeżeli selekcja cząstek (picking) jest niewystarczająca, można spróbować naprawić ten etap, np. poprzez powtórzenie selekcji, zastosowanie innych metod lub próbę ręcznego wybrania większej liczby cząstek, aby pomóc algorytmom w ich nauce. Podczas klasyfikacji 2D, jeśli tylko kilka klas jest wysokiej jakości, należy również rozważyć powtórzenie procesu selekcji. Przy wstępnej estymacji objętości warto wypróbować kilka metod, jeśli niektóre z nich dały niedokładne wyniki. To samo dotyczy doprecyzowania 3D (3D refinement). Kierując się tym rozumowaniem, w niniejszym manuskrypcie przedstawiono kilka narzędzi konsensusowych, które mogą być bardzo użyteczne w unikaniu problemów i kontynuowaniu przetwarzania z dokładnymi danymi. Dzięki zastosowaniu konsensusu między kilkoma metodami możemy odrzucić dane, które są trudne do selekcji, klasyfikacji, wyrównania itp., co prawdopodobnie świadczy o słabej jakości danych. Jednakże, jeśli kilka metod zgadza się co do wygenerowanego wyniku, dane te prawdopodobnie zawierają cenne informacje pozwalające na kontynuację przetwarzania.

Zachęcamy czytelnika do pobrania większej liczby zbiorów danych i próby ich przetworzenia zgodnie z zaleceniami przedstawionymi w niniejszym manuskrypcie oraz do stworzenia podobnego przepływu pracy łączącego pakiety przetwarzające za pomocą Scipion. Próba przetworzenia zbioru danych jest najlepszym sposobem na poznanie możliwości narzędzi przetwarzających dostępnych w najnowocześniejszej technologii Cryo-EM, poznanie najlepszych zasad pokonywania potencjalnych trudności pojawiających się podczas przetwarzania oraz zwiększenie wydajności dostępnych metod w każdym konkretnym przypadku badawczym.

Rysunek 1. Wynik dopasowania klatek filmu. (a) Główne okno wyników z listą wszystkich wygenerowanych mikrografii oraz dodatkowymi informacjami: gęstością widmową mocy, trajektorią szacowanego dopasowania w współrzędnych biegunowych, trajektorią w współrzędnych kartezjańskich oraz nazwą pliku wygenerowanej mikrografii. (b) Trajektoria dopasowania przedstawiona w współrzędnych kartezjańskich. (c) Wygenerowana mikrografia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2. Wynik szacowania CTF za pomocą programu Ctffind. Główne okno z wynikami zawiera wykres z oszacowanym PSD (w rogu) wraz z PSD pochodzącym z danych oraz kilka parametrów defokusu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3. Okna ręcznego wybierania cząsteczek w programie Xmipp. (a) Główne okno z listą mikrografii do przetworzenia oraz innymi parametrami. (b) Ręczne wybieranie cząsteczek w obrębie obszaru mikrografii. (c) oraz (d) Automatycznie wybrane cząsteczki podlegające nadzorowi w celu stworzenia zestawu cząsteczek treningowych dla metody automatycznego wybierania Xmipp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Wynik głębokiego konsensusowego wyboru cząstek (deep consensus picking) w programie Xmipp. Parametr zScoreDeepLearning określa wagę jakości cząstki i jest kluczowy dla wykrywania wadliwych cząstek. (a) Najniższe wartości zScore są powiązane z artefaktami. (b) Najwyższe wartości zScore są powiązane z cząstkami zawierającymi makromolekułę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5. Wynik klasyfikacji 2D wykonanej w programie Cryosparc. Przedstawiono wygenerowane klasy (średnie podzbiorów cząsteczek pochodzących z tej samej orientacji). Kilka dobrych klas zaznaczono na czerwono (wykazujących pewien poziom szczegółowości), a niektóre klasy złe pozostały nieoznaczone (klasy zaszumione i niecentryczne). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6. Wstępna objętość 3D z wynikiem konsensusu roju (swarm consensus). Widok wstępnej objętości 3D uzyskanej po uruchomieniu narzędzia konsensusu xmipp3 – swarm consensus, z wykorzystaniem poprzednich szacunków wstępnej objętości 3D z programów Xmipp i Relion. (a) Objętość przedstawiona w formie przekrojów. (b) Wizualizacja 3D objętości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 7. Rafinacja wstępnej objętości 3D z wynikiem Relion. (a) Otrzymana krzywa FSC, przecinająca próg przy wartości około 4.5Å. (b) Pokrycie kątowe przedstawione jako widok górny sfery 3D. W tym przypadku, ze względu na brak symetrii, przypisane cząsteczki powinny pokrywać całą sferę. (c) Rafinowana objętość przedstawiona w przekrojach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 8. Wyrównanie 3D oparte na głębokim uczeniu z wynikiem Xmipp. Wyniki wygenerowane przez metodę xmipp3 - deep align dla wyrównania 3D. (a) Przypisanie kątowe dla każdej cząsteczki w formie macierzy transformacji. (b) Pokrycie kątowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 9. Wynik konsensusu dopasowania 3D. (a) Lista cząstek z uzyskanymi różnicami w parametrach przesunięcia i kątów. (b) Wykres różnic kątowych dla każdej cząstki. (c) Wykres różnicy przesunięcia dla każdej cząstki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 10. Wynik końcowej iteracji udoskonalania 3D. (a) Krzywa FSC. (b) Uzyskana objętość w pełnej rozdzielczości przedstawiona w przekrojach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 11. Analiza lokalnej rozdzielczości z wynikiem Xmipp. Wyniki metody xmipp3 – local MonoRes. (a) Niektóre reprezentatywne przekroje pokolorowane zgodnie z wartością rozdzielczości na woxel, zgodnie z kodem kolorystycznym. (b) Histogram lokalnej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 12. Wynik wyostrzania za pomocą Xmipp. Wyniki zastosowania metody xmipp3 - localdeblur sharpening. (a) Lista wolumenów uzyskanych w każdej iteracji. (b) Wolumen 3D uzyskany po ostatniej iteracji przedstawiony w formie przekrojów. (c) Reprezentacja 3D końcowego wolumenu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 13. Walidacja narzędzia do wykrywania przeuczenia w wynikach Xmipp. Wyniki walidacji przeuczenia w xmipp3. Linia zielona odpowiada rekonstrukcji z danych, a linia czerwona z szumu. (a) Odwrotność kwadratu rozdzielczości w funkcji logarytmu liczby cząstek. (b) Rozdzielczość w funkcji liczby cząstek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 14. Kilka reprezentacji 3D uzyskanej objętości. (a) Objętość po wstępnym przetwarzaniu. (b) Objętość po przetwarzaniu końcowym. (c) Rozdzielczość lokalna; ciemnoniebieskie woksele to te o wyższej rozdzielczości (2,75Å), a ciemnoczerwone woksele to te o niższej rozdzielczości (10,05Å). (d) Powiększenie objętości po przetwarzaniu końcowym, na którym widoczna jest alfa-helisa (czerwona owal). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 15. Przykład nieprawidłowej rekonstrukcji 3D. (a) Krzywa FSC z gwałtownym spadkiem i przekroczeniem progu przy niskiej rozdzielczości. (b) Histogram rozdzielczości lokalnej. (c) Objętość 3D w przekrojach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 16. Przykład klas 2D. (a) Dobre klasy wykazujące pewien poziom szczegółowości. (b) Złe klasy zawierające szum i artefakty (część górna uzyskana za pomocą Xmipp, dolna za pomocą CryoSparc). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 17. Przykład początkowej objętości 3D o różnej jakości. (a) Dobra początkowa objętość, w której można zaobserwować kształt makrocząsteczki. (b) Zła początkowa objętość, w której uzyskany kształt jest całkowicie inny od oczekiwanego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek dodatkowy 1. Tworzenie projektu w programie Scipion. Okno wyświetlane przez program Scipion, w którym można wybrać istniejący projekt lub utworzyć nowy, podając jego nazwę oraz lokalizację. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 2. Metoda importu filmów. Okno wyświetlane przez Scipion po otwarciu funkcji pwem - import movies. W tym miejscu należy wprowadzić główne parametry akwizycji, aby filmy były dostępne do przetworzenia w programie Scipion. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 3. Metoda dopasowania filmów. Okno wyświetlane przez program Scipion podczas korzystania z xmipp3 - optical alignment. Należy wprowadzić filmy wejściowe, zakres klatek branych pod uwagę przy dopasowaniu oraz niektóre inne parametry przetwarzania filmów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4. Metoda szacowania CTF za pomocą programu Ctffind. Formularz w programie Scipion ze wszystkimi polami niezbędnymi do uruchomienia programu Ctffind. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 5. Kreator w programie Scipion. Kreator pomagający użytkownikowi w wypełnianiu parametrów w formularzu. W tym przypadku kreator służy do uzupełnienia pola rozdzielczości w metodzie grigoriefflab-ctffind. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 6. Metoda doprecyzowania CTF za pomocą programu Xmipp. Formularz xmipp3 - ctf estimation ze wszystkimi parametrami służącymi do doprecyzowania wcześniej oszacowanej funkcji przenoszenia kontrastu (CTF). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 7. Metoda wstępnego przetwarzania mikrografii. Formularz xmipp3 – preprocess micrographs , który umożliwia wykonanie na nich określonych operacji. W tym przykładzie przydatne są funkcje Remove bad pixels oraz Downsample micrographs . Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 8. Metoda wyboru cząsteczek (picking) w programie Cryolo. Formularz do uruchomienia metody wyboru cząsteczek Cryolo z wykorzystaniem wstępnie wytrenowanej sieci. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 9. Metoda wyboru konsensusowego w programie Xmipp. Forma xmipp3 - deep consensus picking oparta na głębokim uczeniu w celu obliczenia konsensusu współrzędnych, z wykorzystaniem sieci wstępnie wytrenowanej na kilku zestawach współrzędnych uzyskanych za pomocą różnych metod wyboru. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 10. Metoda wyodrębniania cząstek. Dane wejściowe i przetwarzanie wstępne zakładki xmipp3 - wyodrębnianie cząsteczek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 11. Metoda wstępnej objętości 3D w programie Xmipp. Forma metody xmipp3 - reconstruct significant w celu uzyskania wstępnej mapy 3D. Przedstawiono karty Input oraz Criteria. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 12. Metoda zmiany rozmiaru wolumenu (Resize volume). Formularz służący do przycinania lub zmiany rozmiaru wolumenu. W tym przykładzie metoda ta jest wykorzystywana do wygenerowania pełnowymiarowego wolumenu po funkcji xmipp3 - reconstruct significant. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 13. Wstępna objętość 3D z wynikiem Relion. Widok uzyskanej wstępnej objętości 3D metodą relion - 3D initial model przedstawiony w przekrojach. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 14. Udoskonalenie początkowej objętości za pomocą programu Relion. Formularz metody relion - 3D auto-refine. W tym przykładzie została ona wykorzystana do udoskonalenia początkowej objętości oszacowanej po konsensusie. Wyświetlone są karty Input oraz Reference 3D map. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 15. Metoda klasyfikacji 3D. Formularz relion - 3D classification. Widoczne są karty Input, Reference 3D map oraz Optimisation. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 16. Dopasowanie 3D oparte na metodzie głębokiego uczenia. Okno ustawień dla metody xmipp3 - deep align. W tym przypadku konieczne jest wytrenowanie sieci przy użyciu zbioru treningowego, a następnie sieć ta przewidzi przypisanie kątowe dla każdej cząstki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 17. Metoda rafinacji 3D. Forma metody xmipp3 - highres. Przedstawiono karty Input oraz Angular assignment. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 18. Wynik pierwszej iteracji udoskonalenia 3D. (a) Krzywa FSC. (b) Uzyskana objętość (o mniejszym rozmiarze niż pełna rozdzielczość) przedstawiona w formie przekrojów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 19. Pierwsza iteracja analizy korelacji udoskonalania 3D. Po kliknięciu ikony paska w górnej części okna z listą cząsteczek pojawi się nowe okno. W oknie Plot columns można utworzyć histogram wybranego szacowanego parametru. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 20. Narzędzie do walidacji przeuczenia. Formuła metody xmipp3 - validate overfitting. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obecnie cryo-EM jest kluczowym narzędziem do ujawniania struktury 3D próbek biologicznych. Gdy za pomocą mikroskopu zbierzemy dobre dane, dostępne narzędzia przetwarzania pozwolą nam uzyskać rekonstrukcję 3D badanej makrocząsteczki. Przetwarzanie danych Cryo-EM jest w stanie osiągnąć rozdzielczość bliską atomowi, co jest kluczem do zrozumienia funkcjonalnego zachowania makrocząsteczki, a także ma kluczowe znaczenie w odkrywaniu leków.

Scipion to oprogramowanie, które umożliwia tworzenie całego przepływu pracy łączącego najważniejsze pakiety przetwarzania obrazu w sposób zintegrowany, co pomaga w śledzeniu i odtwarzalności całego przepływu pracy przetwarzania obrazu. Scipion zapewnia bardzo kompletny zestaw narzędzi do przeprowadzenia przetwarzania; Jednak uzyskanie rekonstrukcji w wysokiej rozdzielczości zależy całkowicie od jakości pozyskanych danych i sposobu ich przetwarzania.

Aby uzyskać rekonstrukcję 3D w wysokiej rozdzielczości, pierwszym wymogiem jest uzyskanie dobrych filmów z mikroskopu, które zachowują informacje strukturalne w wysokiej rozdzielczości. Jeśli tak nie jest, przepływ pracy nie będzie w stanie wyodrębnić z danych informacji w wysokiej rozdzielczości. Następnie, pomyślny proces przetwarzania powinien być w stanie wyodrębnić cząstki, które naprawdę odpowiadają strukturze i znaleźć orientacje tych cząstek w przestrzeni 3D. Jeśli którykolwiek z kroków przepływu pracy zakończy się niepowodzeniem, jakość zrekonstruowanego woluminu ulegnie pogorszeniu. Scipion pozwala na użycie różnych pakietów w każdym z etapów przetwarzania, co pomaga znaleźć najbardziej odpowiednie podejście do przetwarzania danych. Ponadto, dzięki dostępności wielu pakietów, można stosować narzędzia konsensusu, które zwiększają dokładność poprzez znalezienie zgodności w szacowanych wynikach różnych metod. Ponadto szczegółowo omówiono w sekcji Reprezentatywne wyniki kilka narzędzi walidacji oraz sposób identyfikowania dokładnych i niedokładnych wyników na każdym etapie przepływu pracy, wykrywania potencjalnych problemów i sposobów ich rozwiązywania. Wzdłuż protokołu znajduje się kilka punktów kontrolnych, które mogą pomóc w uświadomieniu sobie, czy protokół działa poprawnie, czy nie. Niektóre z najistotniejszych to: kompletacja, klasyfikacja 2D, początkowe szacowanie objętości i wyrównanie 3D. Sprawdzanie danych wejściowych, powtarzanie kroku inną metodą lub korzystanie z konsensusu to opcje dostępne w Scipion, których użytkownik może użyć, aby znaleźć rozwiązania, gdy pojawią się problemy.

Jeśli chodzi o poprzednie podejścia do integracji pakietów w dziedzinie Cryo-EM, Appion³¹ jest jedynym, który pozwala na rzeczywistą integrację różnych pakietów oprogramowania. Jednak Appion jest ściśle powiązany z Leginon³², systemem do automatycznego zbierania obrazów z mikroskopów elektronowych. Główna różnica w stosunku do Scipion polega na tym, że model danych i pamięć masowa są mniej sprzężone. W ten sposób, aby stworzyć nowy protokół w Scipion, wystarczy opracować skrypt w Pythonie. Jednak w Appion programista musi napisać skrypt i zmienić bazową bazę danych. Podsumowując, Scipion został opracowany w celu uproszczenia konserwacji i rozbudowy.

W tym manuskrypcie przedstawiliśmy kompletny przebieg procesu przetwarzania Cryo-EM, wykorzystując rzeczywisty zestaw danych przypadków rybosomu Plasmodium falciparum 80S (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660). Omówione i omówione tutaj kroki można podsumować jako wyrównanie filmu, estymacja CTF, wybieranie cząstek, klasyfikacja 2D, wstępna estymacja mapy, klasyfikacja 3D, udoskonalanie 3D, ocena i przetwarzanie końcowe. W kilku z tych etapów wykorzystano różne pakiety, a narzędzia konsensusu zostały zastosowane. Ostateczna objętość zrekonstruowana w 3D osiągnęła rozdzielczość 3 A, a w objętości przetworzonej można wyróżnić niektóre struktury drugorzędowe, takie jak alfa-helisy, co pomaga opisać, jak atomy są ułożone w przestrzeni.

Przepływ pracy przedstawiony w tym manuskrypcie pokazuje, w jaki sposób Scipion może być używany do łączenia różnych pakietów Cryo-EM w prosty i zintegrowany sposób, aby uprościć przetwarzanie i jednocześnie uzyskać bardziej wiarygodne wyniki.

W przyszłości rozwój nowych metod i pakietów będzie się rozwijał, a oprogramowanie takie jak Scipion, które pozwoli na łatwą integrację wszystkich z nich, będzie jeszcze ważniejsze dla badaczy. Podejścia oparte na konsensusie będą bardziej odpowiednie nawet wtedy, gdy dostępnych będzie wiele metod o różnych podstawach, co pomoże uzyskać dokładniejsze oszacowania wszystkich parametrów zaangażowanych w proces rekonstrukcji w Cryo-EM. Śledzenie i odtwarzalność są kluczowe w procesie badawczym i łatwiejsze do osiągnięcia w przypadku Scipion dzięki wspólnej strukturze do wykonywania kompletnych przepływów pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
w tym artykule nie wykorzystano żadnego materiału	-	-	-