Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji

Summary

Badania przesiewowe oparte na fragmentach za pomocą NMR to solidna metoda szybkiej identyfikacji małych cząsteczek wiążących biomakromolekuły (DNA, RNA lub białka). Przedstawiono protokoły opisujące przygotowanie próbek w oparciu o automatyzację, eksperymenty NMR i warunki akwizycji oraz przepływy pracy analizy. Technika ta pozwala na optymalne wykorzystanie do detekcji jąder aktywnych zarówno ¹H, jak i ¹⁹F NMR.

Abstract

Badania przesiewowe oparte na fragmentach (FBS) to dobrze zweryfikowana i akceptowana koncepcja w procesie odkrywania leków, zarówno w środowisku akademickim, jak i przemysłowym. Największą zaletą badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR jest ich zdolność nie tylko do wykrywania spoiw powyżej 7-8 rzędów wielkości powinowactwa, ale także do monitorowania czystości i jakości chemicznej fragmentów, a tym samym do uzyskiwania wysokiej jakości wyników i minimalnej liczby wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych. Warunkiem wstępnym w ramach FBS jest przeprowadzanie wstępnej i okresowej kontroli jakości biblioteki fragmentów, określanie rozpuszczalności i integralności chemicznej fragmentów w odpowiednich oraz tworzenie wielu bibliotek obejmujących różne rusztowania, aby pomieścić różne klasy docelowe makrocząsteczek (białka/RNA/DNA). Ponadto wymagana jest szeroko zakrojona optymalizacja protokołu przesiewowego opartego na NMR w odniesieniu do ilości próbek, szybkości akwizycji i analizy na poziomie konstruktu biologicznego/przestrzeni fragmentów, w przestrzeni warunków (bufor, dodatki, jony, pH i temperatura) oraz w przestrzeni ligandów (analogi ligandów, stężenie ligandów). Przynajmniej w środowisku akademickim te badania przesiewowe były do tej pory podejmowane ręcznie w bardzo ograniczony sposób, co prowadziło do ograniczonej dostępności infrastruktury do badań przesiewowych nie tylko w procesie opracowywania leków, ale także w kontekście opracowywania sond chemicznych. Aby sprostać wymaganiom w sposób ekonomiczny, przedstawiono zaawansowane przepływy pracy. Korzystają one z najnowszego, najnowocześniejszego, zaawansowanego sprzętu, za pomocą którego pobieranie próbek cieczy może być napełniane w sposób kontrolowany temperaturą do probówek NMR w sposób zautomatyzowany. ¹Widma oparte na ligandach H/¹⁹F NMR są następnie zbierane w określonej temperaturze. Wysokowydajny podajnik próbek (podajnik próbek HT) może obsłużyć ponad 500 próbek w blokach o kontrolowanej temperaturze. To, w połączeniu z zaawansowanymi narzędziami programowymi, przyspiesza gromadzenie i analizę danych. Ponadto opisano zastosowanie procedur badań przesiewowych na próbkach białek i RNA w celu uświadomienia sobie ustalonych protokołów dla szerokiej bazy użytkowników w badaniach biomakromolekularnych.

Introduction

Badanie przesiewowe oparte na fragmentach jest obecnie powszechnie stosowaną metodą identyfikacji raczej prostych cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej (MW <250 Da), które wykazują słabe wiązanie z celami makromolekularnymi, w tym białkami, DNA i RNA. Początkowe trafienia z głównych ekranów służą jako podstawa do przeprowadzenia wtórnego badania przesiewowego dostępnych na rynku większych analogów trafień, a następnie do wykorzystania opartych na chemii strategii wzrostu fragmentów lub łączenia. Ogólnie rzecz biorąc, aby platforma do odkrywania leków w oparciu o fragmenty (FBDD) odniosła sukces, potrzebna jest solidna metoda biofizyczna do wykrywania i charakteryzowania słabych trafień, biblioteka fragmentów, cel biomolekularny oraz strategia chemii kontrolnej. Cztery powszechnie stosowane metody biofizyczne w kampaniach odkrywania leków to testy przesunięcia termicznego, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), krystalografia i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Spektroskopia NMR pełniła różne role na różnych etapach FBDD. Oprócz zapewnienia czystości chemicznej i rozpuszczalności fragmentów w bibliotece fragmentów rozpuszczonych w zoptymalizowanym systemie buforowym, eksperymenty NMR obserwowane za pomocą ligandów mogą wykrywać wiązanie fragmentu z celem o niskim powinowactwie, a obserwowane w celu eksperymenty NMR mogą wyznaczyć epitop wiążący fragment, umożliwiając w ten sposób szczegółowe badania zależności struktura-aktywność. W ramach mapowania epitopów, zmiany przesunięcia chemicznego oparte na NMR mogą nie tylko zidentyfikować ortosteryczne miejsca wiązania, ale także miejsca allosteryczne, które mogą być tajemnicze i dostępne tylko w tak zwanych wzbudzonych stanach konformacyjnych celu biomolekularnego. Jeśli cel biomolekularny wiąże już endogenny ligand, zidentyfikowane uderzenia fragmentów można łatwo sklasyfikować jako allosteryczne lub ortosteryczne, wykonując eksperymenty konkursowe oparte na NMR. Określenie stałej dysocjacji (K_D) oddziaływania ligand-cel jest ważnym aspektem w procesie FBDD. Miareczkowanie chemiczne oparte na NMR, obserwowane ligand lub cel, można łatwo przeprowadzić w celu określenia KD. Główną zaletą NMR jest to, że badania interakcji są wykonywane w roztworze i w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. W ten sposób można badać wszystkie stany konformacyjne do analizy interakcji ligand/fragment z jego celem. Co więcej, podejścia oparte na NMR są nie tylko ograniczone do badań przesiewowych dobrze sfałdowanych rozpuszczalnych białek, ale są również stosowane w celu dostosowania do większej przestrzeni docelowej, w tym DNA, RNA, białek związanych z błoną i wewnętrznie nieuporządkowanych¹.

Biblioteki fragmentów są nieodzowną częścią procesu FBDD. Ogólnie rzecz biorąc, fragmenty działają jako początkowe prekursory, które ostatecznie stają się częścią (podstrukturą) nowego inhibitora opracowanego dla celu biologicznego. Kilka leków (Venetoclax², Vemurafenib³, Erdafitinib⁴, Pexidartnib⁵) zostało zgłoszonych jako fragmenty i obecnie są z powodzeniem stosowane w klinikach. Zazwyczaj fragmenty są cząsteczkami organicznymi o niskiej masie cząsteczkowej (<250 Da) o wysokiej rozpuszczalności i stabilności w wodzie. Starannie przygotowana biblioteka fragmentów, zawierająca zazwyczaj kilkaset fragmentów, już teraz może obiecywać efektywną eksplorację przestrzeni chemicznej. Ogólny skład bibliotek fragmentów ewoluował z biegiem czasu i najczęściej był uzyskiwany poprzez rozbiór znanych leków na mniejsze fragmenty lub projektowany obliczeniowo. Te zróżnicowane biblioteki fragmentów zawierają głównie płaskie aromatyczne lub heteroatomy i są zgodne z regułą Lipińskiego 5 ⁶ lub z aktualnym trendem komercyjnym Reguła 3 ⁷, ale unikaj grup reaktywnych. Niektóre biblioteki fragmentów zostały również wyprowadzone lub złożone z wysoce rozpuszczalnych metabolitów, produktów naturalnych i/lub ich pochodnych⁸. Ogólnym wyzwaniem stawianym przez większość bibliotek fragmentów jest łatwość dalszego procesu chemicznego.

Centrum Biomolekularnego Rezonansu Magnetycznego (BMRZ) na Uniwersytecie Goethego we Frankfurcie jest partnerem iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), konsorcjum na rzecz strukturalnych infrastruktur badawczych dla wszystkich europejskich badaczy ze wszystkich dziedzin badań biochemicznych i biomedycznych. W ramach poprzedniej inicjatywy iNEXT, która zakończyła się w 2019 roku, stworzono bibliotekę fragmentów składającą się z 768 fragmentów, której celem było "minimum fragmentów i maksymalna różnorodność" obejmująca dużą przestrzeń chemiczną. Ponadto, w przeciwieństwie do innych bibliotek fragmentów, biblioteka fragmentów iNEXT została również zaprojektowana w oparciu o koncepcję "zrównoważonych fragmentów" w celu ułatwienia dalszej syntezy złożonych ligandów o wysokim powinowactwie i odtąd znana jako biblioteka wewnętrzna (Diamond, Structural Genomic Consortium i iNEXT).

Ustanowienie FBDD przez NMR wymaga siły roboczej, wiedzy i oprzyrządowania. W BMRZ opracowano zoptymalizowane przepływy pracy w celu wsparcia pomocy technicznej w zakresie przesiewania fragmentów za pomocą NMR. Obejmują one kontrolę jakości i ocenę rozpuszczalności biblioteki fragmentów ^{9, optymalizację} buforu dla wybranych celów, badania przesiewowe oparte na ligandach ^{1D obserwowanych przez 1}H lub ¹⁹F, eksperymenty konkurencyjne w celu rozróżnienia między wiązaniem ortosterycznym i allosterycznym, eksperymenty NMR z obserwacją docelową w 2D do mapowania epitopów oraz do charakteryzowania interakcji z wtórnym zestawem pochodnych początkowych uderzeń fragmentu. BMRZ opracowało zautomatyzowane procedury analizy, które zostały również wcześniej omówione w literaturze ^10,11, interakcji małych cząsteczek z białkami i posiada całą niezbędną zautomatyzowaną infrastrukturę do badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR. Zaimplementowano różnicę nasycenia NMR (STD-NMR), ligand wodny obserwowany za pomocą spektroskopii gradientowej (waterLOGSY) oraz eksperymenty relaksacyjne oparte na Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) w celu identyfikacji fragmentów w szerokim zakresie reżimów powinowactwa, a także najnowocześniejsze zautomatyzowane oprzyrządowanie NMR i oprogramowanie do odkrywania leków. Podczas gdy badania przesiewowe fragmentów oparte na NMR są dobrze znane w przypadku białek, podejście to jest rzadziej stosowane do znajdowania nowych ligandów oddziałujących z RNA i DNA. W ramach projektu BMRZ opracowano dowód słuszności koncepcji nowych protokołów umożliwiających identyfikację interakcji małych cząsteczek RNA/DNA. W kolejnych sekcjach tego wkładu przedstawiono zastosowanie procedur przesiewowych na próbkach białek i RNA w celu uświadomienia sobie ustalonych protokołów dla szerokiej bazy użytkowników w badaniach biomakromolekularnych.

Protocol

1. Biblioteka fragmentów

1. Własna biblioteka fragmentów
   UWAGA: W ramach jednego ze wspólnych działań badawczych iNEXT opracowano solidną i przyjazną dla chemii bibliotekę fragmentów pierwszej generacji¹², a następnie we współpracy z firmą Enamine stworzono drugą generację biblioteki, która jest znana jako biblioteka fragmentów DSI (Diamond-SGC-iNEXT) (od teraz określana jako "biblioteka wewnętrzna"). Biblioteka ta może być udostępniona w BMRZ do celów przesiewowych.
   1. Oceń bibliotekę fragmentów pod kątem jej integralności i rozpuszczalności przy użyciu wcześniej zgłoszonego protokołu opartego na NMR⁹.
      UWAGA: Własna biblioteka składa się z 768 fragmentów o bardzo dużej różnorodności chemicznej (>200 Singletonów). Przeprowadzenie badań przesiewowych w mieszaninach fragmentów może znacznie przyspieszyć kampanię przesiewową; jednak liczba fragmentów w miksie jest ograniczona ze względu na nakładanie się sygnału w ^{widmie 1}H-NMR. Większa różnorodność chemiczna oferowana przez własną bibliotekę pozwala na przygotowanie mieszanin zawierających 12 różnych fragmentów bez znaczącego nakładania się przesunięć chemicznych w obserwowanych widmach 1 H NMR.
   2. 103 fragmenty w 768 fragmentach posiadają atom fluoru. Do celów badań przesiewowych ¹⁹F podzielić wszystkie 103 fragmenty, które posiadają grupę fluorową, na 5 mieszanin w oparciu o nakładanie się na siebie co najmniej ¹⁹F przesunięcia chemicznego. Aby zminimalizować nakładanie się sygnałów w badaniu przesiewowym ¹⁹F, należy wykorzystać informacje o przesunięciu chemicznym z pomiarów pojedynczych związków do zaprojektowania mieszanin z maksymalną liczbą fragmentów i minimalnym nakładaniem się sygnału. Każda mieszanka składa się z 20-21 fragmentów z wyraźnymi przesunięciami chemicznymi ¹⁹F, co pozwala na jednoznaczne przypisanie fragmentów.
2. Biblioteka fragmentów zdefiniowana/dostarczona przez użytkownika
   1. Przeprowadzaj kampanie przesiewowe z biblioteką fragmentów zdefiniowaną przez użytkownika lub udostępnioną, jednak następujące kroki muszą poprzedzać kampanię przesiewową.
   2. Jeśli nie zostało to wcześniej określone przez użytkownika, należy przeprowadzić kontrolę jakości fragmentów w oparciu o NMR (w BMRZ stosuje się do tego zaawansowane narzędzia programowe; ⁹, Rozdział 6.1.1).
   3. Przed użyciem należy sprawdzić rozpuszczalność fragmentów w wybranym buforze dla celu biomolekularnego, integralności struktury i stężenia fragmentów.
   4. Zaprojektuj mieszaninę tak, aby zmniejszyć zarówno nakładanie się sygnałów w widmach NMR, jak i czas pomiaru.
   5. Mieszaniny należy projektować zgodnie z krokiem 4.2.
   6. Przesiewaj pojedyncze fragmenty lub podzbiór mieszanin zamiast całej biblioteki.

2. Przygotowanie próbki

UWAGA: Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe metodą NMR wykorzystuje robota pipetującego do przygotowania próbki. Widma NMR, ale także stabilizacja w ciągu kilku dni akwizycji sygnału białek, RNA i DNA są niezwykle wrażliwe na wahania temperatury, dlatego zautomatyzowane systemy sterowane temperaturą znacznie ułatwią stabilność pipetowanych próbek. W tym celu do robota pipetującego dołączone jest dodatkowe urządzenie, które działa w temperaturach od 4 do 40 °C, które umożliwia płynną obsługę próbek NMR w środowisku o kontrolowanej temperaturze.

1. Przygotowanie mieszaniny ligandów
   1. Przygotowanie próbek przesiewowych do pomiarów NMR za pomocą robota do przygotowywania próbek. Elastyczna konfiguracja robota pozwala na szeroki zakres zastosowań (np. odzyskiwanie próbek z probówek NMR z powrotem do pojemników magazynowych lub ogólne zadania związane z obsługą cieczy). Można stosować probówki NMR o różnych średnicach (1,7, 2,0, 2,5, 3,0 i 5,0 mm). System robota do pobierania próbek wraz z zaawansowanym oprogramowaniem sterującym odczytuje kod kreskowy przypisany do każdego typu pojemnika i optymalnie realizuje protokół napełniania cieczą.
   2. Do przygotowania mieszanin ligandów z własnej biblioteki należy używać fiolek z kodami kreskowymi. Fiolki z kodami kreskowymi gwarantują najwyższy poziom niezawodności i optymalną identyfikowalność próbek.
   3. Rozprowadź 768 związków na 8 płytkach w formacie 96-dołkowym. Stężenie wyjściowe każdego pojedynczego fragmentu wynosi 50 mM w d_6-DMSO/D₂O (9:1). W sumie przygotuj 64 mieszanki, z których każda zawiera 12 fragmentów. Końcowe stężenie każdego fragmentu w mieszance wynosi 4,2 mM.
      UWAGA: Robot pipetujący może obsługiwać różne typy pojemników o różnej geometrii (fiolki z próbnikiem kriogenicznym lub automatycznym, płytki 96-dołkowe o głębokości okrągłej lub kwadratowej, standardowe fiolki z kodami kreskowymi, probówki do mikrowirówek) i pomaga w wydajnym przenoszeniu cieczy do różnych probówek i stojaków NMR.

Rysunek 1: (A) Wysokowydajny robot do przygotowywania próbek NMR i napełniania probówek NMR zainstalowany w BMRZ. (B) Wysokowydajny podajnik próbek z indywidualnymi stojakami z kontrolowaną temperaturą, zainstalowany na spektrometrze 600 MHz w zakładzie BMRZ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie próbki przesiewowej ze ślepą próbą (widmo ligandu odniesienia) i z tarczą (ligand w obecności celu)
   1. Do przygotowania próbek przesiewowych NMR, w obecności docelowej biomolekuły (białka/RNA/DNA) i mieszaniny ligandów, należy użyć probówek do zmieniania próbek NMR HT o średnicy 3 mm wybranych z oferty standardowych probówek NMR firmy Bruker.
   2. Przenieść cel biomolekularny (np. ¹H Screening: 10 μM RNA lub białko) w określonym buforze przesiewowym do probówki NMR 3 mm (końcowa objętość 200 μL) ręcznie lub za pomocą robota pipetującego.
   3. W następnym kroku przenieś 10 μl (np. ¹H Screening) mieszaniny ligandów za pomocą systemu robotycznego do oznaczonych kodem kreskowym probówek NMR 3 mm zawierających docelową biomolekułę i wymieszaj za pomocą wbudowanego protokołu oprogramowania sterującego.
      UWAGA: Numer kodu kreskowego probówki NMR jest wygodnie i automatycznie włączany do pozyskanego zestawu danych NMR, zapewniając w ten sposób przepływ pracy zorientowany na ID bez żadnych pomyłek. Akcesorium do kontroli temperatury robota pipetującego pozwala na utrzymanie przygotowanych próbek w probówkach NMR w stałej temperaturze.
3. Warunki i parametry zdefiniowane przez nas
   1. Ustalenie optymalnych warunków buforowych do przeprowadzenia badań przesiewowych RNA i białka w oparciu o wewnętrzną bibliotekę fragmentów. Do RNA w BMRZ stosuje się następujące kondycjonowane próbki: 25 mM KPi, 50 mM KCl, pH 6,2. Mg²⁺ jest opcjonalne.
   2. Białka są niezwykle wrażliwe na warunki roztworu; należy stosować optymalne dla wybranego celu. Dla każdego z tych należy uzyskać dodatkowe widma referencyjne ligandów, które posłużą jako ślepa próba do analizy.
4. Warunki określone przez użytkownika
   UWAGA: W przypadkach, w których ustalone wewnętrznie warunki nie są odpowiednie dla celów, które mają być przesiewane przed potencjalnym użytkownikiem, należy wdrożyć następujące kroki.
   1. Wykonać ¹H-NMR samego buforu, aby zapewnić minimalne zakłócenia ze strony składników buforu podczas wykonywania i analizowania eksperymentów przesiewowych obserwowanych ligandami. Elementy zakłócające można odpowiednio zastąpić deuterowanymi odpowiednikami.
5. Ograniczenia w produkcji próbek (ilości docelowe)/warunki i dostępność
   UWAGA: Izolacja lub rekombinowana produkcja niektórych biomakrocząsteczek może w niektórych przypadkach okazać się wyzwaniem i skutkować ograniczoną dostępnością celu do przeprowadzenia udanej kampanii badań przesiewowych leków. W przypadku ograniczonej lub nieograniczonej dostępności celów, następujące alternatywy mogą być wykorzystane do przeprowadzenia udanego badania przesiewowego fragmentów opartego na NMR.
   1. W przypadku ograniczeń należy zastosować badanie przesiewowe ^{oparte na 19}F-NMR. Typowe ligandy fluorowane mają pojedynczy sygnał ¹⁹F; Dlatego używaj koktajli z 25-30 fragmentami bez nakładania się sygnału. Jest mniej sygnałów do analizy, brak zakłóceń sygnału ze strony komponentów bufora i mniej sygnałów, na których można polegać przy identyfikacji trafień.
   2. Jeśli nie jest to ograniczone, użyj większych ekranów, takich jak ¹H-NMR. Większa biblioteka fragmentów może być przesiewana. Zazwyczaj fragmenty składają się z więcej niż jednego protonu, co oznacza więcej sygnałów, na których można polegać podczas analizy.

3. Warunki akwizycji NMR

1. Ogólne warunki określone we własnym zakresie
   1. Spektrometr wyposażony w podajnik próbek HT (automatyzacja)
      1. Do wysokoprzepustowych badań przesiewowych należy używać płytek 96-dołkowych, które można zmierzyć tylko za pomocą podajnika próbek HT. Podajnik próbek HT oferuje również możliwość indywidualnego hartowania każdego statywu.
      2. Aby uzyskać optymalny stosunek sygnału do szumu, należy użyć spektrometru z sondą kriogeniczną chłodzoną helem lub azotem. Do automatyzacji niezbędny jest zautomatyzowany moduł strojenia i dopasowywania (ATM).
   2. Zestawy parametrów i sekwencje impulsów
      UWAGA: Wiele eksperymentów NMR może charakteryzować zdarzenia wiązania. Identyfikacja trafień różni się w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Poniższe eksperymenty są rutynowo stosowane w kampaniach przesiewowych BMRZ. Niemniej jednak można wprowadzać zmiany dla zdefiniowanych przez użytkownika kampanii przesiewowych i zgodnie ze specyfikacjami użytkownika.
      1. Jeśli używasz oprogramowania TopSpin, dołącz zestaw parametrów dla eksperymentów opartych na ligandach: SCREEN_STD, SCREEN_T1R, SCREEN_T2 SCREEN_WLOGSY. Zestaw parametrów zawiera wszystkie niezbędne parametry i sekwencje impulsów: STD: stddiffesgp.3; T_1ρ: t1rho_esgp2d; T₂: cpmg_esgp2d; i waterLOGSY: ephogsygpno.2.
      2. Dla wszystkich wymienionych eksperymentów użyj excitation sculpting¹³ jako tłumienia wody. W celach informacyjnych użyj rzeźbienia wzbudzenia 1D (zgesgp). Liczba skanów zależy od czułości systemu (natężenie pola magnetycznego i głowica sondy), stężenia próbki i wyboru eksperymentu. Zalecenia to: 1D z NS=64, T_1ρ i T₂ z NS=128, STD z NS=256 i waterLOGSY z NS= 384 lub 512.
      3. W przypadku badania przesiewowego ¹⁹F należy użyć zarówno eksperymentów 1D, jak i T₂: 1D: F19CPD (pp=zgig) dla głowicy ^{sondy 19}F{¹H} i F19(pp=zg) dla głowicy sondy ¹⁹F/¹H; SCREEN_19F_T2 (pp = cpmgigsp).
      4. Użyj szerokości widmowej 220 ppm i częstotliwości wzbudzenia na poziomie -140 ppm. Czas eksperymentu wynosi od 1 do 5 godzin (zapewnia długoterminową stabilność biomakrocząsteczki) w zależności od sprzętu i stężenia próbki. W przypadku_T2 czas CPMG powinien zmieniać się między 0 ms a 200 ms.
   3. przetwarzanie
      1. Nagraj eksperymenty STD,_T1ρ i_T2 jako pseudo 2D. Aby przetworzyć dwa pojedyncze widma 1D, IconNMR używa proc_std au-program z opcją relaksu lub bez niej. Pierwsza opcja zapewnia odniesienie 1D i różnicę dwóch widm. Druga opcja daje dwa oddzielne widma z krótkim i długim czasem relaksacji. waterLOGSY jest pojedynczym sygnałem 1D, który powinien być fazowany ujemnym sygnałem rozpuszczalnika.
2. Warunki specyficzne dla użytkownika
   1. Dostosuj dowolny z wcześniej wymienionych parametrów do warunków zdefiniowanych przez użytkownika. Na przykład, jeśli białko dostarczone przez użytkownika zakładu nie jest stabilne w ogólnie stosowanej temperaturze, eksperymenty optymalizacyjne można przeprowadzić przy różnych temperaturach, stężeniach, warunkach buforowych itp.

4. Analiza danych

1. Biblioteka fragmentów QC (d6-DMSO/specyficzny bufor) i kwantyfikacja
   1. CMC-q
      UWAGA: Kontrola jakości bibliotek fragmentów jest niezbędna przed rozpoczęciem kampanii przesiewowych. Ponadto należy zapewnić długoterminową stabilność biblioteki fragmentów w celu zastosowania kilku kampanii przesiewowych, dlatego też należy przeprowadzać okresową ocenę jakości biblioteki. W tym celu do oceny jakości i ilości wykorzystywane jest zintegrowane oprogramowanie CMC-q i CMC-a firmy TopSpin. CMC-q i CMC-a to moduły oprogramowania w Topspin, które umożliwiają płynną akwizycję, analizę wraz z weryfikacją struktury przy użyciu widma ¹H-NMR uzyskanego z małych cząsteczek organicznych ⁹.
      1. Aby zapewnić integralność, należy przygotować próbki do oceny o stężeniu fragmentów 1 mM w d6-DMSO. Próbki można przygotowywać w sposób zautomatyzowany za pomocą robota pipetującego poprzez napełnianie próbki płynnej do probówki NMR o średnicy 3 mm.
      2. Do oceny rozpuszczalności należy użyć próbki składającej się z 1 mM związku w 50 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,4, 150 mM chlorku sodu, 90% H₂O/ 10% D₂O i 1 mM soli sodowej kwasu 3-(trimetylosililo)propiono-2,2,3,3-d4 (TMSP-Na).
      3. Zbieraj widma NMR w temperaturze 298 K lub 293 K za pomocą spektrometru NMR 600 MHz wyposażonego w sondę kriogeniczną TCI TCI o potrójnym rezonansie 5 mm i podajnik próbek HT, który może obsłużyć 579 próbek jednocześnie.
      4. Aby skonfigurować oprogramowanie CMC-q, postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi, która implementuje utworzenie użytkownika IconNMR, aktywację FastLaneNMR i zmianę podajnika próbek HT.
      5. Skalibruj impuls 90° i zapisz go w tabeli prosol TopSpin.
      6. Umieść płytkę z 96 dołkami na próbki w jednej z 5 pozycji stojaka w podajniku próbek HT.
      7. Aby załadować plik SDF (plik danych strukturalnych), który powinien zawierać proponowaną strukturę chemiczną, unikalny identyfikator oraz pozycję w podajniku próbek HT każdej próbki w partii, przejdź do opcji Przeglądaj w oknie Ustawienia CMC-q i kliknij przycisk Otwórz po wybraniu pliku kończącego się na .sdf.
      8. W ustawieniach CMC.q Batch Automation ustaw typ weryfikacji, który definiuje eksperyment, który będzie mierzony, użytkownika IconNMR i zdefiniuj rozpuszczalnik.
      9. Zdefiniuj pliki SDF dla ścieżki do pliku SDF, identyfikatora cząsteczki i pozycji próbki.
      10. Rozpocznij pobieranie, klikając przycisk Start. Kliknij ponownie Rozpocznij akwizycję. Konfigurację CMC-q można również zapisać, klikając przycisk Save (Zapisz).
      11. Aby uzyskać szczegółowy opis kroków konfiguracji CMC-q, postępuj zgodnie z instrukcjami instrukcji obsługi firmy Bruker.
   2. CMC-a
      1. W przypadku CMC-a należy użyć modułu oprogramowania w Topspin, który umożliwia analizę, w tym weryfikację struktury za pomocą widma 1H-NMR uzyskanego z małych cząsteczek organicznych⁹.
2. Projektowanie mieszanki
   UWAGA: Właściwy projekt mieszaniny odgrywa ważną rolę w badaniach przesiewowych przy użyciu NMR jako platformy. Duża liczba fragmentów w mieszaninie pozwala na szybsze badania przesiewowe, ale zwiększa ryzyko wyników fałszywie dodatnich i ujemnych. Mniejsza liczba zmniejsza to ryzyko, ale wydłuża czas potrzebny na przeprowadzenie badania przesiewowego. Ogólnie rzecz biorąc, podczas tworzenia mieszanin należy unikać nakładania się sygnałów. Korzystając z biblioteki wewnętrznej, można to pominąć w przypadku badania przesiewowego ¹H, ponieważ biblioteka została specjalnie zaprojektowana tak, aby była różnorodna i wykazywała niewielkie nakładanie się sygnałów przy zachowaniu wysokiej różnorodności chemicznej. To z kolei oznacza, że nie trzeba przechodzić specjalnej procedury projektowej w celu stworzenia 64 mieszanek.
   1. Ponieważ badanie przesiewowe ¹⁹F opiera się na fragmentach wewnętrznej biblioteki, które zawierają fluor, a biblioteka nie została stworzona w celu zmniejszenia nakładania się sygnałów dla tych konkretnych fragmentów, należy zaprojektować odpowiednią mieszankę.
   2. Zmierz widma pojedynczych związków dla wszystkich fragmentów zawierających ¹⁹F.
   3. Zwróć uwagę na informacje o przesunięciu chemicznym każdego sygnału.
   4. Zgodnie z tymi informacjami wybierz 20-21 fragmentów na mieszankę. To z kolei daje 5 mieszanin, z których każda zawiera 20-21 fragmentów bez nakładania się sygnałów i umożliwia półautomatyczną analizę danych.
3. Przeprowadzić identyfikację trafień w obrębie obserwowanej interakcji biomakrocząsteczka-ligand w ligandzie
   UWAGA: Istnieją różne definicje trafienia w procedurze kontroli przesiewowej ¹⁹F i ¹H. Poniższe identyfikacje trafień zostały przez nas skonfigurowane i są zgodne z określonymi zasadami. Temat określania trafień jest bardzo subiektywny i może się różnić w zależności od użytkownika. Niemniej jednak niezwykle ważne jest, aby zasady identyfikacji trafień nie uległy zmianie po uzgodnieniu, aby zachować walidację i wiarygodność.
   1. Ekran ¹H
      1. Aby z pewnością określić trafienia, należy uzyskać widma 1D ¹H, eksperymenty relaksacyjne waterLOGSY i T₂ zarówno w obecności, jak i bez celu w celu identyfikacji spoiw. Wszystkie trzy eksperymenty mają potencjał, aby wykazać zdarzenie wiązania. Jeżeli w widmach próbki widoczny jest CSP większy niż 6 Hz w porównaniu z widmami ślepej próby, uznaje się to za wskazanie do trafienia. To samo dotyczy sytuacji, gdy widoczny jest silny sygnał dodatni w waterLOGSY, a także ponad 30% redukcja_T2 w widmach próbki. Zdarzenia wiązania można przedstawić we wszystkich trzech eksperymentach, porównując próbkę zawierającą widma z odpowiednimi widmami ślepej próby. Jednak zdarzenia wiążące mogą nie być widoczne we wszystkich trzech eksperymentach. W związku z tym przyjęto, że muszą wystąpić co najmniej dwa z opisanych wcześniej zdarzeń, aby można było zakwalifikować fragment jako trafienie wiążące.
      2. Użyj narzędzia FBS w TopSpin, aby zdefiniować stan fragmentów na wiążące, niejednoznaczne, nieznane, zagregowane i niewiążące.
      3. Po zakończeniu miksowania zatwierdź go w narzędziu FBS.
      4. W zakładce podsumowania w projekcie FBS kliknij Utwórz raport z selekcji. Spowoduje to otwarcie okna, które utworzy plik .xlsx. Użytkownik może następnie wybrać między wszystkimi ligandami, tylko ligandem wiążącym, nie tylko ligandem wiążącym i niejednoznacznymi ligandami, które mają być zgłaszane w arkuszu kalkulacyjnym.
   2. ¹⁹F Ekran
      1. Aby odróżnić spoiwo bez spoiwa, spoiwo tygodniowe i mocne spoiwo, należy podzielić iloraz całkowania między pomiarem docelowym 200 ms a pomiarem ślepym 200 ms przez iloraz pomiaru celu 0 ms i stosuje się pomiar ślepej próby 0 ms:
         
         UWAGA: Daje to wartości z zakresu od 0 do ~1 (wynik trafienia), co umożliwia przypisanie progów dla każdego stanu powiązania.
      2. Użyj średniej z referencyjnego pomiaru 200 ms jako progu bazowego, aby oznaczyć przypadki, w których wynik trafienia przekracza 1. Może się tak zdarzyć, jeśli zaimportowane całki zawierają wartości ujemne lub pomiar odniesienia jest wyższy niż pomiar docelowy. Wynik trafienia ≤ 0,67 jest uważany za słabe trafienie, < 0,33 za mocne trafienie, a wszystko > 0,67 za brak trafienia. Przykład jest pokazany w Rysunek 2.

Rysunek 2: Identyfikacja trafienia dla badania ^{przesiewowego 19}F. Przekrój ^{widm 19}F CPMG NMR przykładowego związku. To obrazowe przedstawienie wyjaśnia właściwości spoiwa. ^{Rozdział 19}Widma F-CPMG związku uzyskanego z próbek mieszaniny w obecności i bez RNA. Wartości reprezentują unormowane wartości całkowite odpowiedniego piku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. analiza danych
   1. Przygotowanie danych do analizy
      UWAGA: Ważne jest, aby pozyskane dane nie posiadały widocznych wad. Oznacza to, że dane, w przypadku których podkładkowanie było problematyczne lub tłumienie wody było niewystarczające, nie powinny być brane pod uwagę do analizy. Zaleca się raczej ponowne zapisanie danych i upewnienie się, że wszystko jest w porządku z próbką (np. brak pęcherzyków powietrza), temperaturą, podkładkami i tłumieniem wody. Poprawność danych można zawsze ocenić podczas porównywania sygnałów DMSO.
   2. ¹H seansu
      1. Aby przeanalizować dane z przesiewu ¹H, użyj narzędzia FBS (wymaga dodatkowej licencji) w TopSpin 4.0.9.
      2. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi narzędzia FBS, aby rozpocząć analizę danych. Poniższe kroki podsumowują procedurę opisaną w instrukcji.
      3. Przechowuj dane BMRZ NMR z kampanii przesiewowych w taki sposób, aby każda mieszanina przesiewowa miała swój własny katalog, w którym podkatalog zawiera różne eksperymenty zmierzone na próbce.
      4. W przypadku korzystania z narzędzia FBS należy przechowywać widma referencyjne, które zawierają wszystkie dane zapisane z próbek bez celu biomolekularnego, ale z mieszaninami, a także pojedynczym związkiem mierzonym w różnych katalogach /nmr. Jest to ważne, ponieważ narzędzie FBS poprosi o ścieżkę katalogu każdego z osobna.
         UWAGA: Narzędzie FBS rozpozna katalog jako projekt przesiewowy, jeśli następujące zestawy danych były przechowywane w tym samym katalogu, w którym przechowywane są mieszaniny próbki przesiewowej (csv, dokumenty XML FragmentScreen i plik BAK).
      5. W przypadku korzystania z TopSpin 4.0.9 należy utworzyć bezpośrednią ścieżkę do katalogu zawierającego pozyskane dane, tzw. DIR. Wybierz katalog /nmr, w którym wszystkie mieszaniny powinny mieć odrębny katalog.
      6. Aby uruchomić narzędzie FBS w próbkowaniu przesiewowym, przeciągnij symbol projektu FBS na środek okna TopSpin. W wybranym katalogu powinien pojawić się symbol projektu FBS, jeśli wcześniej wspomniane zbiory danych zostały do niego skopiowane.
      7. Okno Opcje ekranowania opartego na fragmentach powinno otwierać się automatycznie podczas pierwszego wczytywania nowego projektu FBS. W tym oknie wybierz plik koktajlowy. Plik koktajlowy to plik csv zawierający przypisanie nazwy miksów, nazwę każdego fragmentu oraz ich podział na mieszanki. Zdefiniuj również folder widm liganda referencyjnego, który zawiera wszystkie zmierzone widma pojedynczych fragmentów. Na koniec zdefiniuj referencyjny pusty folder eksperymentu, który zwykle jest folderem zawierającym zestawy danych mieszanek bez badanego celu.
      8. Opcje rastrowania opartego na fragmentach mają zakładkę o nazwie Typy widm, która pozwala zdefiniować badane widma, a także kolor wyświetlania widm. Ustaw Spectype zgodnie z wcześniej przetworzonymi danymi. Na karcie Układ wyświetlania zdefiniuj widma, które będą ze sobą porównywane zgodnie z ich typami specyfikacji.
      9. Naciśnij przycisk OK, aby uruchomić projekt FBS.
      10. Patrząc na dane, otworzy się osobne okno, podsumowujące wszystkie mieszanki koktajlowe i wszystkie ligandy każdej mieszanki w tabeli. Dwukrotne kliknięcie komórki spowoduje otwarcie odpowiednich zestawów danych, porównujących na przykład widma ¹H 1D Blank ze zbiorem danych zawierającym cel.
      11. Przed przypisaniem spoiw upewnij się, że piki referencyjne (DMSO wszystkich pomiarów, a także pojedyncze związki) pasują do siebie i mają takie samo przesunięcie chemiczne. Jeśli zaobserwujesz różnice, skoryguj je, korzystając z opcji przetwarzania szeregowego od TopSpin.
      12. Opcja przetwarzania szeregowego znajduje się na karcie Proces w obszarze Zaawansowane. Stosuje zmiany do wszystkich wybranych widm ze zbioru danych. W ten sposób typy spec mogą być łatwo przypisane do numerów eksperymentów, a wszystkie widma mogą być przesunięte jednocześnie, aby wyrównać się z odniesieniem.
   3. ¹⁹F Projekcja
      1. Dla pierwszej analizy ^{mieszanin 19}F należy utworzyć plik całkowania dla każdej mieszaniny. Aby zdefiniować region integracji, należy kliknąć na funkcję Integruj w zakładce Analizuj. Upewnij się, że dla każdego fragmentu mieszaniny zdefiniowany jest wyraźny obszar integracji dla odpowiadającego ^{mu 19}F-singal.
      2. Użyj przycisku Zapisz/Eksportuj regiony integracji, aby wyeksportować plik integracji do wykorzystania w przyszłości. Zapisz wszystkie używane pliki integracji w C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng lub w odpowiedniej ścieżce katalogu instalacyjnego TopSpin.
      3. W przypadku danych ¹⁹F otwórz zestaw danych z badanym celem lub bez niego.
      4. Aby załadować plik integracji do bieżącego spektrum, otwórz ponownie zakładkę Analizuj, przejdź do Integracja i za pomocą przycisku Odczyt/Importuj regiony integracji załaduj odpowiedni plik integracji. Spowoduje to załadowanie wszystkich zdefiniowanych regionów tego pliku do bieżącego spektrum.
      5. Zapisz i wróć, aby znaleźć listę wszystkich zintegrowanych regionów w zakładce Całki. Skopiuj ją do arkusza kalkulacyjnego lub innego narzędzia używanego do dalszej analizy danych.
      6. Powtórz tę procedurę dla każdej mieszanki, z celem i bez.
   4. Zarządzanie danymi
      1. Aby ułatwić użytkowanie i zwiększyć produktywność, należy skonfigurować jednolity przepływ pracy do dalszej analizy i przechowywania pozyskanych danych. Zarówno w przypadku przesiewania ¹H, jak i ¹⁹F należy użyć specjalnie zaprojektowanego arkusza kalkulacyjnego dla każdego z nich.
         UWAGA: W przypadku przesiewania ¹H było to wykorzystywane wyłącznie do zarządzania danymi i podsumowania każdego celu, podczas gdy w przypadku przesiewania ¹⁹F wykorzystywano iloraz opisany w rozdziale 4.3 do automatycznego oznaczania każdego fragmentu jako trafienia/braku trafienia po skopiowaniu do niego danych całkowych. Zmniejsza to ryzyko błędu ludzkiego podczas analizy, zakładając, że plik został prawidłowo skonfigurowany, i ułatwia udostępnianie informacji, ponieważ wszystkie ważne informacje są zebrane w jednym miejscu w pliku, który może otworzyć praktycznie każdy bez konieczności korzystania z dodatkowych programów do wstępnego przyjrzenia się danym.

Results

Kontrola jakości biblioteki fragmentów
Fragmenty z własnej biblioteki zostały dostarczone jako 50 mM roztworów podstawowych w 90% d6-DMSO i 10% D₂O (10% D₂O zapewnia minimalizację degradacji związku w wyniku powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania¹⁴). Próbki pojedynczego związku składały się z 1 mM liganda w 50 mM buforze fosforanowym (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl₂), pH 6,0 w 90% H₂O / 9% D₂O / 1% d6-DMSO. ¹Eksperymenty H-NMR fragmentów z biblioteki iNEXT mierzono na spektrometrze NMR 500/600 MHz. Dane te zostały następnie wykorzystane do identyfikacji pojedynczych związków w kampaniach przesiewowych ¹H przy użyciu oprogramowania CMC-q, które pozwala użytkownikowi w pełni pozyskać widma w sposób zautomatyzowany, a także oceniono jakość (rozpuszczalność i integralność) fragmentów w dodatku do analizy CMC-a. Wyniki automatycznej analizy z CMC-a są wyświetlane jako graficzne dane wyjściowe podobne do tego, co jest reprezentowane na Rysunek 3. Dane graficzne pokazują reprezentację płytki 96-dołkowej. Czerwone kółko oznacza, że ten fragment wykazuje niespójność w strukturze lub stężeniu. Zielone dołki wskazują, że fragment jest spójny.

Rysunek 3: Kontrola jakości biblioteki fragmentów. Schematyczne przedstawienie automatycznego wyjścia opartego na CMC-a. Oceniane są właściwości fragmentów, takie jak stężenie i integralność strukturalna. Zielony oznacza spójny, pomarańczowy w tym przypadku oznacza niespójny. Niespójne fragmenty są korygowane ręcznie zgodnie z pokazanym przepływem pracy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W przybliżeniu, 65% i 35% fragmentów zostało sklasyfikowanych odpowiednio jako spójne i niespójne, zarówno w DMSO, jak i buforze. Co więcej, 30% niespójnych sklasyfikowanych ligandów stało się spójnych po dokładnym ręcznym sprawdzeniu spectra⁹.

¹⁹F Projektowanie mieszanki
103 fragmenty zawierające jedną lub kilka grup fluorowych z własnej biblioteki podzielono na 5 mieszanek (A, B, C, D, E). Każda mieszanka składa się z 20 do 21 fragmentów. W tym przypadku mieszaniny musiały być starannie zaprojektowane, aby uniknąć nakładania się sygnałów. ^{Rozdział 19}F eksperymenty z relaksacją poprzeczną zmierzono dla każdej mieszaniny, w której zastosowano ciągi impulsów CPMG. Eksperymenty te mogą być modyfikowane poprzez zmianę opóźnień relaksacji. Przesunięcie chemiczne ¹⁹F mieszanin A-E można zobaczyć w Rysunek 4.

Rysunek 4: ¹⁹widm F 1D-NMR próbek mieszanin z wewnętrznej biblioteki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przygotowanie próbki
Przygotowanie próbki w procedurze przesiewania ¹⁹F odbywało się ręcznie lub za pomocą automatycznego pipetowania za pomocą robota pipetującego. Fragmenty w każdej mieszaninie miały stężenie 2,5 mM w 90% d6-DMSO i 10%_D2O. Końcowa objętość próbki przesiewowej wynosiła 170 μl z 5% D₂O jako środkiem blokującym. Każdą mieszaninę pipetowano dwa razy, jeden do roztworu zawierającego bufor (bez roztworu docelowego) i jeden do roztworu buforowego zawierającego tarczę. Stosunek celu do fragmentu ustalono na 1:1, co dało końcowe stężenie celu/liganda wynoszące 50 μM. Dodatkowo próbki kontrolne to docelowa biomolekuła w buforze przesiewowym bez mieszaniny w celu zapewnienia integralności celu, a także próbka kontrolna z samym buforem i_D2Ow celu zapewnienia jakości buforu.

Dane z badań przesiewowych ^{NMR 19}F-1D i ¹⁹F-CPMG-T₂ były pomiarami opisanymi w sekcji 3.1. Na przykład w przypadku RNA dla pojedynczej próbki docelowej w buforze uzyskano sekwencję echa skokowo-powrotnego (pp = zggpjrse,¹⁵).

Analiza danych
Procedura przesiewowa ¹⁹F została zastosowana do ryboprzełącznika TPP thiM z E. coli i białkowej kinazy tyrozynowej (PtkA) z M. tuberculosis wśród kilku innych celów¹⁶. Biblioteka przesiewania ¹⁹F zawiera 103 fragmenty, które są podzielone na 5 mieszanek oznaczonych od Mix A do E. Przygotowanie próbek przesiewowych można przeprowadzić ręcznie, bez użycia robota do pipetowania próbek. Roztwór zawierający 40 μM i M RNA (warunki buforowe) zmieszano z 3,2 μl z mieszanin. Kolejne próbki kontrolne przygotowano składające się z samego buforu, buforu z 5% DMSO (uprzednio zapewniającego stabilność biomakrocząsteczki w obecności pożądanego stężenia DMSO) oraz buforu z RNA. Te 13 próbek przesiewowych przygotowano i przeniesiono do probówek NMR o średnicy 3 mm. Kody kreskowe probówek NMR są skanowane, a każda mieszanina w obecności i bez RNA, a także próbki kontrolne zostały zmierzone zgodnie z wyżej wymienionymi eksperymentami ¹⁹F NMR przeprowadzonymi w temperaturze 298 K. Badanie przesiewowe thiM RNA w stosunku do wewnętrznej biblioteki przeprowadzono poprzez przeprowadzenie pomiarów T₂ z CPMG 0 ms i 200 ms dla każdej innej próbki. Prawidłowe podkładkowanie i tłumienie wody monitorowano po zakończeniu pomiarów, porównując wszystkie piki DMSO pod względem poszerzenia linii i utraty intensywności dodatkowo zmierzonych eksperymentów ¹H 1D dla wszystkich próbek. Przetwarzanie otrzymanych widm relaksacyjnych CPMG T₂ ¹⁹F przeprowadzono przy użyciu wcześniej przygotowanego i zautomatyzowanego makra w TopSpin. Analiza danych została przeprowadzona zgodnie z instrukcjami w sekcji protokołu. Integralne dane uzyskane z TopSpin (zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole) można szybko i łatwo ocenić za pomocą gotowego arkusza kalkulacyjnego lub innego podobnego programu, ustawiając odpowiednie warunki i progi. Jak opisano wcześniej, progi są przydatne przy definiowaniu spoiwa, słabego spoiwa lub braku spoiwa. Rysunek 5 pokazuje typowe wyniki widm CPMG odpowiednio dla tiM RNA i PtkA. W niektórych przypadkach konieczna była dalsza weryfikacja przez ekspertów.

Rysunek 5: Wycięte z ¹⁹widm F CPMG NMR pokazujące zmiany intensywności uzyskane z różnych czasów opóźnienia eksperymentów opartych na CPMG. (A) Reprezentacja spoiwa (trafienia) i nie-spoiwa w ¹⁹F przesiewaniu opartym na fragmentach wykonanym na ryboprzełączniku TPP thiM RNA z E. coli. (B) Reprezentacja spoiwa i niespoiwa w badaniu przesiewowym opartym na fragmentach ¹⁹F przeprowadzonym na PtkA z M. tuberculosis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

¹H Projekcja

Projektowanie mieszanki
Wykorzystywana biblioteka wewnętrzna jest na tyle różnorodna, ^{że na potrzeby}1-godzinnego badania przesiewowego nie wykonano projektu mieszanki. Oznacza to, że 64 mieszanki zostały przygotowane poprzez losowy wybór 12 do zmieszania w jednej mieszance.

Przygotowanie próbki
W przypadku ^1-godzinnegobadania przesiewowego przykładowego RNA SARS-CoV-2 przeprowadzono automatyczne pipetowanie przy użyciu robota pipetującego w celu przygotowania próbek. Fragmenty w każdej mieszaninie miały stężenie 4,2 mM w 90% d6-DMSO i 10%_D2O. Ostateczna objętość próbki przesiewowej wynosiła 200 μl z 5%_D2O jako środkiem blokującym. 64 próbki, z których każda zawierała inną mieszaninę o stężeniu 25 mM KPi, 50 mM KCl przy pH 6,2, pipetowano bez docelowego RNA. Odpowiednio, 64 próbki pipetowano z docelowym RNA, z których każda zawierała inną mieszaninę. Stosunek RNA do liganda ustalono na 1:20, co dało stężenie RNA 10 μM i stężenie liganda 200 μM.

Analiza danych
Do analizy ¹H wykorzystano narzędzie FBS w TopSpin. Aby określić, czy fragment jest trafieniem, przeprowadzono eksperymenty z przesunięciem chemicznym 1D, waterLOGSY i relaksacją_T2. Dla relaksacji_T2 spadek intensywności większy niż 30% był liczony jako trafienie, podczas gdy dla przesunięcia chemicznego przesunięcie większe niż 6 Hz było punktem odcięcia. waterLOGSY musiał wykazać znaczną zmianę sygnału (w tym przypadku z ujemnego na dodatni). Jeśli którekolwiek z tych trzech kryteriów były pozytywne, fragment był liczony jako trafienie. Dwa przykłady można zobaczyć w Rysunek 6.

Rysunek 6: ^1-godzinnebadanie przesiewowe przeprowadzone na przykładowym RNA SARS-CoV-2 pokazującym kryteria determinacji trafień. Akwizycja trzech różnych eksperymentów (¹H T₂ CPMG (5/100 ms), waterLOGSY i 1D ¹H). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Hit-1 pokazuje spadek T₂ o ~50% i CSP ≥ 6 Hz. waterLOGSY nie wykazuje wystarczająco znaczącej zmiany sygnału, aby można ją było również uznać za dodatnią. Ponieważ dwa z trzech eksperymentów są pozytywne, ten fragment jest liczony jako trafienie. W przypadku Hit-2, T₂ wykazuje spadek intensywności sygnału o ~80%, a wyraźną zmianę sygnału można zaobserwować w przypadku waterLOGSY. CSP nie jest w tym przypadku wystarczający, ale ponieważ dwa poprzednie kryteria są pozytywne, nadal jest liczony jako trafienie.

Discussion

Wszechstronność badań przesiewowych fragmentów/leków opartych na NMR. W ramach projektu BMRZ z powodzeniem wdrożono najnowocześniejsze zautomatyzowane oprzyrządowanie NMR, a także eksperymenty STD-NMR, waterLOGSY i relaksacyjne w celu identyfikacji fragmentów w szerokim zakresie powinowactwa do odkrywania leków. Zainstalowany sprzęt obejmuje wysokowydajnego robota do przygotowywania próbek oraz wysokowydajną jednostkę do przechowywania próbek, zmieniacza i akwizycji danych powiązaną ze spektrometrem 600 MHz. Niedawno zakupiona sonda kriogeniczna dla ¹H, ¹⁹F, ¹³C i ¹⁵N zapewnia wymaganą czułość dla proponowanych pomiarów i umożliwia odsprzężenie ¹H (1) podczas detekcji ¹⁹F. Sonda ta jest podłączona do najnowszej generacji konsoli NMR, która oferuje możliwość korzystania z zaawansowanych narzędzi programowych firmy Bruker, w tym CMC-q, CMC-assist, CMC-se i FBS (zawartych w TopSpin). Narzędzie do badań przesiewowych opartych na fragmentach (FBS) jest zawarte w najnowszej wersji TopSpin i pomaga analizować dane o wysokiej przepustowości, na które składają się eksperymenty z _{r-relaksacją} STD, waterLOGSY, T₂/T₁. Płynny zbiór próbek 1D 1H może być napełniany do probówek NMR w sposób zautomatyzowany za pomocą robota do napełniania próbek. Zazwyczaj blok 96 probówek (3 mm) jest napełniany w ciągu około dwóch godzin. 96-dołkowe stojaki na płytki są umieszczone bezpośrednio w podajniku próbek HT, który odczytuje kod kreskowy bloku i przypisuje probówki NMR do eksperymentów sterowanych przez oprogramowanie automatyzacji (IconNMR). W podajniku próbek HT można jednocześnie przechowywać i programować pięć 96-dołkowych stojaków na płytki. Temperatura każdego z poszczególnych regałów może być kontrolowana i regulowana oddzielnie. Dodatkowo, każda pojedyncza próbka może być wstępnie kondycjonowana (podgrzewanie wstępne i suszenie rurki w celu usunięcia skondensowanej wilgoci) do żądanej temperatury przed pomiarem.

Nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań. Jednym z szerokich zastosowań tego zautomatyzowanego badania przesiewowego opartego na NMR jest identyfikacja i opracowanie nowych ligandów wiążących się z celem biomakromolekularnym (DNA/RNA/białka). Te ligandy mogą zawierać inhibitory ortosteryczne i allosteryczne, które zazwyczaj wiążą się niekowalencyjnie. Co więcej, FBDD metodą NMR jest zwykle stosowany jako pierwszy krok do wyboru obiecujących związków, wymagania, które należy spełnić, to dostępność celu biomolekularnego w wystarczających ilościach. Cel ten dzieli się na dwa główne zadania.

Zadanie pierwsze polega na opracowaniu i scharakteryzowaniu własnej biblioteki fragmentów z następujących powodów: wstępna i okresowa kontrola jakości, charakterystyka i kwantyfikacja ponad 1000 fragmentów; oznaczanie rozpuszczalności fragmentów w zoptymalizowanych dla każdego celu, w szczególności dla docelowych białek; oraz utworzenie kilku bibliotek w celu dostosowania do różnych rusztowań i rozszerzenia na inne klasy makrocząsteczek. Zadanie drugie polega na zintegrowaniu przepływów pracy w zakresie projektowania leków opartych na fragmentach (FBDD) za pomocą NMR z wykorzystaniem: zautomatyzowanych badań przesiewowych obserwowanych ligandów 1D (obserwowano ¹H i ¹⁹F); zautomatyzowane testy zastępcze (eksperymenty konkurencyjne z (naturalnym) ligandem) w celu rozróżnienia wiązania ortosterycznego i allosterycznego; zautomatyzowane wtórne badania przesiewowe z wieloma fragmentami; zautomatyzowane badania przesiewowe białek 2D oraz wtórne badania przesiewowe zestawu pochodnych wokół początkowego trafienia z wykorzystaniem biblioteki EU-OPENSCREEN lub dowolnej innej biblioteki; oraz ponowne profilowanie badań przesiewowych biblioteki FDA pod kątem wybranych celów.

Ponadto można przeprowadzić metabotypowanie różnych linii komórkowych (istotnych dla choroby) w celu rozwikłania mechanizmów regulacyjnych, które łączą kontrolę cyklu komórkowego i metabolizm. Istnieje również funkcjonalna charakterystyka elementów regulacyjnych RNA/DNA/białka in vivo i in vitro w celu optymalizacji konstruktu/domeny (optymalizacja stabilności dla badań strukturalnych (badanie przesiewowe bufora, pH, temperatury i soli) oraz rozszerzenie badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR na białka błonowe i białka wewnętrznie nieuporządkowane, które są na ogół niedostępne dla innych technik.

Ograniczenia. Korzystanie z bibliotek ^{fragmentów 19}F i ¹H ma swoje plusy i minusy, z których kilka zostanie wymienionych w dalszej części. Największą zaletą pomiarów ¹⁹F w porównaniu z ¹H jest szybkość zarówno rzeczywistego czasu pomiaru, jak i późniejszej analizy, ponieważ mieszaniny zawierają prawie dwukrotnie więcej fragmentów i trzeba przeprowadzić mniej eksperymentów. Dalsza analiza jest również łatwiejsza w przypadku przesiewania ¹⁹F, ponieważ nie ma zakłóceń ze strony, a dodatkowo oferuje szerszy zakres przesunięć chemicznych przy prawie zerowym nakładaniu się sygnałów dla optymalnie zaprojektowanej mieszaniny fragmentów. Same widma są znacznie uproszczone, zwykle mają tylko jeden lub dwa sygnały na fragment, w zależności od liczby atomów fluoru. Analiza tych widm może być zatem zautomatyzowana, co ponownie skraca czas. Odbywa się to kosztem różnorodności chemicznej, przynajmniej w przypadku biblioteki wykorzystanej w tym badaniu. Ponieważ tylko ~13% biblioteki zawiera ¹⁹F, ale oczywiście wszystkie z nich nadają ^{się do wykorzystania}w 1 H screeningu, różnorodność fragmentów ¹⁹F będzie mniejsza. Można to obejść za pomocą specjalnie zaprojektowanych ^{bibliotek 19}F z większą liczbą fragmentów i większą różnorodnością chemiczną. Kolejną wadą ekranowania ¹⁹F jest mała liczba sygnałów na fragment. Fragmenty na ogół składają się z więcej niż jednego atomu wodoru. W związku z tym eksperymenty przesiewowe obserwowane ^{przez 1}godzinę mogą opierać się na różnych sygnałach dla tego samego fragmentu w celu wykrycia wiązania. Daje to większy stopień pewności przy identyfikowaniu trafień dla przesiewania ^1H, podczas gdy badanie ¹⁹F musi opierać się na jednym lub dwóch sygnałach podawanych na fragment.

Przedstawiono szczegółowy opis nowoczesnego, zautomatyzowanego oprzyrządowania do badań przesiewowych fragmentów opartego na NMR, oprogramowania i metod analizy oraz ich protokołów. Zainstalowany sprzęt obejmuje wysokowydajnego robota do przygotowywania próbek oraz wysokowydajną jednostkę do przechowywania, zmieniania i akwizycji próbek powiązaną ze spektrometrem 600 MHz. Niedawno zainstalowana kriogeniczna głowica sondy dla ¹H, ¹⁹F, ¹³C i ¹⁵N zapewnia wymaganą czułość dla proponowanych pomiarów ^{i umożliwia 1}H odsprzężenia podczas detekcji ¹⁹F. Co więcej, najnowsza generacja konsoli NMR oferuje możliwość korzystania z zaawansowanego oprogramowania analitycznego wspomagającego akwizycję i analizę w locie. Wyżej omówiona technologia, przepływy pracy i opisane protokoły powinny przyczynić się do niezwykłego sukcesu użytkowników realizujących FBS przez NMR.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker Avance III HD Matryca		spektrometru NMR Bruker 600 MHz
Przezroczyste polipropylenowe probówki do przechowywania z kodem kreskowym 2D	3731-11 0,75 ml V-DOLNA PROBÓWKA/STOJAK NA ZATRZASK	ThermoFisher Scientific	Probówki z kodami kreskowymi
Matrix SepraSeal i DuraSeal&	4463 Mata do nasadek, SeptraSeal 10/CS	ThermoFisher Scientific
SampleJet		Bruker	HT Podajnik próbek
SamplePro Tube		Robot do pipetowania	Bruker