Artykuł metodologiczny

Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62262

⸱

4 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt, 2German Cancer Consortium (DKTK) and DKFZ

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Badania przesiewowe oparte na fragmentach za pomocą NMR to solidna metoda szybkiej identyfikacji małych cząsteczek wiążących biomakromolekuły (DNA, RNA lub białka). Przedstawiono protokoły opisujące przygotowanie próbek w oparciu o automatyzację, eksperymenty NMR i warunki akwizycji oraz przepływy pracy analizy. Technika ta pozwala na optymalne wykorzystanie do detekcji jąder aktywnych zarówno 1H, jak i 19F NMR.

Streszczenie

Badania przesiewowe oparte na fragmentach (FBS) to dobrze zweryfikowana i akceptowana koncepcja w procesie odkrywania leków, zarówno w środowisku akademickim, jak i przemysłowym. Największą zaletą badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR jest ich zdolność nie tylko do wykrywania spoiw powyżej 7-8 rzędów wielkości powinowactwa, ale także do monitorowania czystości i jakości chemicznej fragmentów, a tym samym do uzyskiwania wysokiej jakości wyników i minimalnej liczby wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych. Warunkiem wstępnym w ramach FBS jest przeprowadzanie wstępnej i okresowej kontroli jakości biblioteki fragmentów, określanie rozpuszczalności i integralności chemicznej fragmentów w odpowiednich oraz tworzenie wielu bibliotek obejmujących różne rusztowania, aby pomieścić różne klasy docelowe makrocząsteczek (białka/RNA/DNA). Ponadto wymagana jest szeroko zakrojona optymalizacja protokołu przesiewowego opartego na NMR w odniesieniu do ilości próbek, szybkości akwizycji i analizy na poziomie konstruktu biologicznego/przestrzeni fragmentów, w przestrzeni warunków (bufor, dodatki, jony, pH i temperatura) oraz w przestrzeni ligandów (analogi ligandów, stężenie ligandów). Przynajmniej w środowisku akademickim te badania przesiewowe były do tej pory podejmowane ręcznie w bardzo ograniczony sposób, co prowadziło do ograniczonej dostępności infrastruktury do badań przesiewowych nie tylko w procesie opracowywania leków, ale także w kontekście opracowywania sond chemicznych. Aby sprostać wymaganiom w sposób ekonomiczny, przedstawiono zaawansowane przepływy pracy. Korzystają one z najnowszego, najnowocześniejszego, zaawansowanego sprzętu, za pomocą którego pobieranie próbek cieczy może być napełniane w sposób kontrolowany temperaturą do probówek NMR w sposób zautomatyzowany. 1Widma oparte na ligandach H/19F NMR są następnie zbierane w określonej temperaturze. Wysokowydajny podajnik próbek (podajnik próbek HT) może obsłużyć ponad 500 próbek w blokach o kontrolowanej temperaturze. To, w połączeniu z zaawansowanymi narzędziami programowymi, przyspiesza gromadzenie i analizę danych. Ponadto opisano zastosowanie procedur badań przesiewowych na próbkach białek i RNA w celu uświadomienia sobie ustalonych protokołów dla szerokiej bazy użytkowników w badaniach biomakromolekularnych.

Wprowadzenie

Badanie przesiewowe oparte na fragmentach jest obecnie powszechnie stosowaną metodą identyfikacji raczej prostych cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej (MW <250 Da), które wykazują słabe wiązanie z celami makromolekularnymi, w tym białkami, DNA i RNA. Początkowe trafienia z głównych ekranów służą jako podstawa do przeprowadzenia wtórnego badania przesiewowego dostępnych na rynku większych analogów trafień, a następnie do wykorzystania opartych na chemii strategii wzrostu fragmentów lub łączenia. Ogólnie rzecz biorąc, aby platforma do odkrywania leków w oparciu o fragmenty (FBDD) odniosła sukces, potrzebna jest solidna metoda biofizyczna do wykrywania i charakteryzowania słabych trafień, biblioteka fragmentów, cel biomolekularny oraz strategia chemii kontrolnej. Cztery powszechnie stosowane metody biofizyczne w kampaniach odkrywania leków to testy przesunięcia termicznego, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), krystalografia i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Spektroskopia NMR pełniła różne role na różnych etapach FBDD. Oprócz zapewnienia czystości chemicznej i rozpuszczalności fragmentów w bibliotece fragmentów rozpuszczonych w zoptymalizowanym systemie buforowym, eksperymenty NMR obserwowane za pomocą ligandów mogą wykrywać wiązanie fragmentu z celem o niskim powinowactwie, a obserwowane w celu eksperymenty NMR mogą wyznaczyć epitop wiążący fragment, umożliwiając w ten sposób szczegółowe badania zależności struktura-aktywność. W ramach mapowania epitopów, zmiany przesunięcia chemicznego oparte na NMR mogą nie tylko zidentyfikować ortosteryczne miejsca wiązania, ale także miejsca allosteryczne, które mogą być tajemnicze i dostępne tylko w tak zwanych wzbudzonych stanach konformacyjnych celu biomolekularnego. Jeśli cel biomolekularny wiąże już endogenny ligand, zidentyfikowane uderzenia fragmentów można łatwo sklasyfikować jako allosteryczne lub ortosteryczne, wykonując eksperymenty konkursowe oparte na NMR. Określenie stałej dysocjacji (KD) oddziaływania ligand-cel jest ważnym aspektem w procesie FBDD. Miareczkowanie chemiczne oparte na NMR, obserwowane ligand lub cel, można łatwo przeprowadzić w celu określenia KD. Główną zaletą NMR jest to, że badania interakcji są wykonywane w roztworze i w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. W ten sposób można badać wszystkie stany konformacyjne do analizy interakcji ligand/fragment z jego celem. Co więcej, podejścia oparte na NMR są nie tylko ograniczone do badań przesiewowych dobrze sfałdowanych rozpuszczalnych białek, ale są również stosowane w celu dostosowania do większej przestrzeni docelowej, w tym DNA, RNA, białek związanych z błoną i wewnętrznie nieuporządkowanych1.

Biblioteki fragmentów są nieodzowną częścią procesu FBDD. Ogólnie rzecz biorąc, fragmenty działają jako początkowe prekursory, które ostatecznie stają się częścią (podstrukturą) nowego inhibitora opracowanego dla celu biologicznego. Kilka leków (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) zostało zgłoszonych jako fragmenty i obecnie są z powodzeniem stosowane w klinikach. Zazwyczaj fragmenty są cząsteczkami organicznymi o niskiej masie cząsteczkowej (<250 Da) o wysokiej rozpuszczalności i stabilności w wodzie. Starannie przygotowana biblioteka fragmentów, zawierająca zazwyczaj kilkaset fragmentów, już teraz może obiecywać efektywną eksplorację przestrzeni chemicznej. Ogólny skład bibliotek fragmentów ewoluował z biegiem czasu i najczęściej był uzyskiwany poprzez rozbiór znanych leków na mniejsze fragmenty lub projektowany obliczeniowo. Te zróżnicowane biblioteki fragmentów zawierają głównie płaskie aromatyczne lub heteroatomy i są zgodne z regułą Lipińskiego 5 6 lub z aktualnym trendem komercyjnym Reguła 3 7, ale unikaj grup reaktywnych. Niektóre biblioteki fragmentów zostały również wyprowadzone lub złożone z wysoce rozpuszczalnych metabolitów, produktów naturalnych i/lub ich pochodnych8. Ogólnym wyzwaniem stawianym przez większość bibliotek fragmentów jest łatwość dalszego procesu chemicznego.

Centrum Biomolekularnego Rezonansu Magnetycznego (BMRZ) na Uniwersytecie Goethego we Frankfurcie jest partnerem iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), konsorcjum na rzecz strukturalnych infrastruktur badawczych dla wszystkich europejskich badaczy ze wszystkich dziedzin badań biochemicznych i biomedycznych. W ramach poprzedniej inicjatywy iNEXT, która zakończyła się w 2019 roku, stworzono bibliotekę fragmentów składającą się z 768 fragmentów, której celem było "minimum fragmentów i maksymalna różnorodność" obejmująca dużą przestrzeń chemiczną. Ponadto, w przeciwieństwie do innych bibliotek fragmentów, biblioteka fragmentów iNEXT została również zaprojektowana w oparciu o koncepcję "zrównoważonych fragmentów" w celu ułatwienia dalszej syntezy złożonych ligandów o wysokim powinowactwie i odtąd znana jako biblioteka wewnętrzna (Diamond, Structural Genomic Consortium i iNEXT).

Ustanowienie FBDD przez NMR wymaga siły roboczej, wiedzy i oprzyrządowania. W BMRZ opracowano zoptymalizowane przepływy pracy w celu wsparcia pomocy technicznej w zakresie przesiewania fragmentów za pomocą NMR. Obejmują one kontrolę jakości i ocenę rozpuszczalności biblioteki fragmentów 9, optymalizację buforu dla wybranych celów, badania przesiewowe oparte na ligandach 1D obserwowanych przez 1H lub 19F, eksperymenty konkurencyjne w celu rozróżnienia między wiązaniem ortosterycznym i allosterycznym, eksperymenty NMR z obserwacją docelową w 2D do mapowania epitopów oraz do charakteryzowania interakcji z wtórnym zestawem pochodnych początkowych uderzeń fragmentu. BMRZ opracowało zautomatyzowane procedury analizy, które zostały również wcześniej omówione w literaturze 10,11, interakcji małych cząsteczek z białkami i posiada całą niezbędną zautomatyzowaną infrastrukturę do badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR. Zaimplementowano różnicę nasycenia NMR (STD-NMR), ligand wodny obserwowany za pomocą spektroskopii gradientowej (waterLOGSY) oraz eksperymenty relaksacyjne oparte na Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) w celu identyfikacji fragmentów w szerokim zakresie reżimów powinowactwa, a także najnowocześniejsze zautomatyzowane oprzyrządowanie NMR i oprogramowanie do odkrywania leków. Podczas gdy badania przesiewowe fragmentów oparte na NMR są dobrze znane w przypadku białek, podejście to jest rzadziej stosowane do znajdowania nowych ligandów oddziałujących z RNA i DNA. W ramach projektu BMRZ opracowano dowód słuszności koncepcji nowych protokołów umożliwiających identyfikację interakcji małych cząsteczek RNA/DNA. W kolejnych sekcjach tego wkładu przedstawiono zastosowanie procedur przesiewowych na próbkach białek i RNA w celu uświadomienia sobie ustalonych protokołów dla szerokiej bazy użytkowników w badaniach biomakromolekularnych.

Protokół

1. Biblioteka fragmentów

  1. Wewnętrzna biblioteka fragmentów
    UWAGA: W ramach jednej z wspólnych działań badawczych iNEXT opracowano solidną i przyjazną dla dalszych etapów syntezy chemicznej bibliotekę fragmentów pierwszej generacji12, a następnie, we współpracy z firmą Enamine, stworzono drugą generację biblioteki, znaną jako biblioteka fragmentów DSI (Diamond-SGC-iNEXT)-poised (dalej nazywana „biblioteką wewnętrzną”). Biblioteka ta może zostać udostępniona w BMRZ do celów przesiewania.
    1. Ocenia się integralność i rozpuszczalność biblioteki fragmentów, korzystając z wcześniej opisanego protokołu opartego na NMR9.
      ​UWAGA: Biblioteka wewnętrzna składa się z 768 fragmentów o bardzo wysokiej różnorodności chemicznej (>20 singletonów). Przeprowadzenie przesiewania w mieszaninach fragmentów może znacznie przyspieszyć kampanię screeningową; jednak liczba fragmentów w jednej mieszaninie jest ograniczona ze względu na nakładanie się sygnałów w widmie 1H-NMR. Wyższa różnorodność chemiczna oferowana przez bibliotekę wewnętrzną pozwala na przygotowanie mieszanin zawierających 12 różnych fragmentów bez istotnego nakładania się przesunięć chemicznych w obserwowanych widmach 1H-NMR.
    2. 103 z 768 fragmentów posiada atom fluoru. W celu przeprowadzenia przesiewania 19F, należy podzielić wszystkie 103 fragmenty posiadające grupę fluorową na 5 mieszanin w oparciu o minimalne nakładanie się przesunięć chemicznych 19F. Aby zminimalizować nakładanie się sygnałów w przesiewaniu 19F, należy wykorzystać informacje o przesunięciu chemicznym z pomiarów pojedynczych związków, aby zaprojektować mieszaniny z maksymalną liczbą fragmentów i minimalnym nakładaniem się sygnałów. Każda mieszanina zawiera 20–21 fragmentów o wyraźnych przesunięciach chemicznych 19F, co pozwala na jednoznaczne przypisanie fragmentów.
  2. Zdefiniowana lub dostarczona przez użytkownika biblioteka fragmentów
    1. Przeprowadza się kampanie przesiewania z biblioteką fragmentów zdefiniowaną lub dostarczoną przez użytkownika; jednak przed rozpoczęciem kampanii należy wykonać następujące kroki.
    2. Jeśli użytkownik nie określi tego wcześniej, należy przeprowadzić kontrolę jakości fragmentów w oparciu o NMR (w BMRZ w tym celu wykorzystywane są zaawansowane narzędzia programistyczne; 9, Rozdział 6.1.1).
    3. Przed użyciem należy sprawdzić rozpuszczalność fragmentów w wybranym buforze dla celu biomolekularnego, integralność strukturalną oraz stężenie fragmentów.
    4. Należy zaprojektować mieszaninę, aby zmniejszyć zarówno nakładanie się sygnałów w widmach NMR, jak i czas pomiaru.
    5. Mieszaniny projektuje się zgodnie z krokiem 4.2.
    6. Przesiewa się pojedyncze fragmenty lub podzbiór mieszanin zamiast całej biblioteki.

2. Przygotowanie próbek

UWAGA: Przesiewowe badania wysokoprzepustowe metodą NMR wykorzystują robota pipetującego do przygotowania próbek. Widma NMR, a także stabilność białek, RNA i DNA w ciągu kilku dni akwizycji sygnału, są niezwykle wrażliwe na wahania temperatury, dlatego zautomatyzowane systemy z kontrolą temperatury znacznie ułatwią zachowanie stabilności pipetowanych próbek. W tym celu do robota pipetującego dołączone jest dodatkowe urządzenie pomocnicze, pracujące w zakresie od 4 do 40 °C, służące do obsługi cieczy z próbek NMR w środowisku z kontrolowaną temperaturą.

  1. Przygotowanie mieszaniny ligandów
    1. Przygotuj próbki do pomiarów NMR za pomocą robota do przygotowywania próbek. Elastyczna konfiguracja robota umożliwia szeroki zakres zastosowań (np. odzyskiwanie próbek z probówek NMR z powrotem do pojemników do przechowywania lub ogólne zadania związane z pipetowaniem cieczy). Można stosować probówki NMR o różnych średnicach (1,7, 2,0, 2,5, 3,0 i 5,0 mm). System robota do próbek wraz z zaawansowanym oprogramowaniem sterującym odczytuje kod kreskowy przypisany do każdego typu pojemnika i optymalnie wykonuje protokół napełniania cieczą.
    2. Do przygotowania mieszanin ligandów z wewnętrznej biblioteki należy użyć fiolek z kodami kreskowymi. Fiolki z kodami kreskowymi gwarantują najwyższy poziom niezawodności i optymalną identyfikowalność próbek.
    3. Rozdziel 768 związków do 8 płytek w formacie 96-dołkowym. Stężenie zapasowe każdego pojedynczego fragmentu wynosi 50 mM w d6-DMSO/D2O (9:1). W sumie przygotuj 64 mieszaniny, z których każda zawiera 12 fragmentów. Końcowe stężenie każdego fragmentu w mieszaninie wynosi 4,2 mM.
      UWAGA: Robot pipetujący może obsługiwać różne rodzaje pojemników o różnej geometrii (fiolki do kriogenicznego lub automatycznego próbkowania, płytki 96-dołkowe głębokie okrągłe lub kwadratowe, standardowe fiolki z kodami kreskowymi, probówki do mikrocentryfugi) i wspomaga efektywne przenoszenie cieczy do różnych probówek NMR i statywów.

figure-protocol-1
Rysunek 1: (A) Robot do wysokoprzepustowego przygotowania próbek do NMR oraz napełniania probówek NMR, zainstalowany w BMRZ. (B) Wysokoprzepustowy system wymiany próbek z indywidualnie kontrolowanymi temperaturami regałów, zainstalowany na spektrometrze 60 MHz w placówce BMRZ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

  1. Przygotowanie próbek do przesiewania: próbki ślepej (spektrum liganda referencyjnego) oraz z celem (ligand w obecności celu)
    1. Do przygotowania próbek do przesiewania NMR, w obecności biomolekuły celu (białka/RNA/DNA) i mieszaniny ligandów, należy użyć probówek do automatycznego wymiennika próbek NMR HT o średnicy 3 mm, wybranych z portfolio standardowych probówek NMR firmy Bruker.
    2. Przenieść biomolekularny cel (np. przesiewanie 1H: 10 µM RNA lub białka) w określonym buforze przesiewającym do probówki NMR 3 mm (objętość końcowa 20 µL) ręcznie lub za pomocą robota pipetującego.
    3. W następnym kroku przenieść 10 µL (np. przesiewanie 1H) mieszaniny ligandów za pomocą systemu robotycznego do zakodowanych probówek NMR 3 mm zawierających biomolekułę celu i wymieszać zgodnie z wbudowanym protokołem oprogramowania sterującego.
      ​UWAGA: Numer kod kreskowy probówki NMR jest wygodnie i automatycznie włączany do pozyskanego zbioru danych NMR, co zapewnia zorientowany na identyfikację przepływ pracy bez żadnych pomyłek. Akcesorium do kontroli temperatury robota pipetującego pozwala na utrzymanie przygotowanych próbek w probówkach NMR w stałej temperaturze.
  2. Warunki i parametry zdefiniowane wewnętrznie
    1. Ustalić optymalne warunki buforowe do przeprowadzania przesiewania RNA i białek przeciwko wewnętrznej bibliotece fragmentów. W BMRZ dla RNA stosuje się następujące warunki próbek: 25 mM KPi, 50 mM KCl, pH 6.2. Mg2+ jest opcjonalny.
    2. Białka są niezwykle wrażliwe na warunki roztworu; należy stosować bufory optymalne dla wybranego celu. Dla każdego z tych buforów należy pozyskać dodatkowe widma referencyjne ligandów, które posłużą jako próbki ślepe dla analizy.
  3. Warunki określone przez użytkownika
    UWAGA: W przypadkach, gdy warunki ustanowione wewnętrznie nie są odpowiednie dla celów przesiewanych przez potencjalnego użytkownika, należy wdrożyć następujące kroki.
    1. Przeprowadzić badanie 1H-NMR samego buforu, aby zapewnić minimalne zakłócenia ze strony składników buforu podczas przeprowadzania i analizowania eksperymentów przesiewania z obserwacją ligandów. Zakłócające składniki można odpowiednio zastąpić odpowiednikami deuterowanymi.
  4. Ograniczenia w produkcji próbek (ilości celu)/warunki i dostępność
    UWAGA: Izolacja lub rekombinacyjna produkcja niektórych biomakromolekuł może w pewnych przypadkach okazać się trudna i skutkować ograniczoną dostępnością celu niezbędnego do przeprowadzenia udanej kampanii przesiewania leków. W przypadku ograniczonej lub nieograniczonej dostępności celów, do przeprowadzenia udanego przesiewania fragmentów w oparciu o NMR można wykorzystać następujące alternatywy.
    1. W przypadku ograniczonej dostępności zastosować przesiewanie oparte na 19F-NMR. Typowe ligandy fluorowane posiadają pojedynczy sygnał 19F; dlatego należy stosować koktajle zawierające 25-30 fragmentów bez nakładania się sygnałów. Do analizy jest mniej sygnałów, nie występują zakłócenia sygnałów ze strony składników buforu i istnieje mniej sygnałów, na których można polegać przy identyfikacji trafień.
    2. W przypadku nieograniczonej dostępności zastosować szersze przesiewanie, takie jak 1H-NMR. Można wtedy przesiewać większą bibliotekę fragmentów. Typowo fragmenty składają się z więcej niż jednego protonu, co oznacza więcej sygnałów, na których można polegać podczas analizy.

3. Warunki akwizycji NMR

  1. Ogólnie określone warunki wewnętrzne
    1. Spektrometr wyposażony w HT sample changer (automatyzacja)
      1. Do wysokoprzepustowego przesiewania (screening) należy używać płytek 96-dołkowych, które mogą być mierzone wyłącznie przy użyciu HT sample changer. HT sample changer oferuje również możliwość indywidualnej regulacji temperatury każdego racka.
      2. W celu uzyskania optymalnego stosunku sygnału do szumu należy użyć spektrometru z sondą kriogeniczną chłodzoną helem lub azotem. Automatyczny moduł strojenia i dopasowania (ATM) jest niezbędny do automatyzacji.
    2. Zestawy parametrów & sekwencje impulsów
      ​UWAGA: Wiele eksperymentów NMR pozwala na charakteryzację zdarzeń wiązania. Identyfikacja hitów różni się w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Poniższe eksperymenty są rutynowo stosowane w kampaniach przesiewowych BMRZ. Niemniej jednak, zmiany mogą zostać wprowadzone dla kampanii przesiewowych zdefiniowanych przez użytkownika oraz zgodnie z jego specyfikacją.
      1. W przypadku korzystania z oprogramowania TopSpin należy uwzględnić zestaw parametrów dla eksperymentów opartych na ligandach: SCREEN_STD, SCREEN_T1R, SCREEN_T2, SCREEN_WLOGSY. Zestaw parametrów zawiera wszystkie niezbędne parametry oraz sekwencje impulsów: STD: stddiffesgp.3; T1ρ: t1rho_esgp2d; T2: cpmg_esgp2d; oraz waterLOGSY: ephogsygpno.2.
      2. We wszystkich wymienionych eksperymentach należy stosować excitation sculpting13 do tłumienia sygnału wody. Jako referencję należy wykorzystać 1D excitation sculpting (zgesgp). Liczba skanów zależy od czułości systemu (natężenie pola magnetycznego i głowica sondy), stężenia próbki oraz wyboru eksperymentu. Zalecane wartości to: 1D z NS=64, T1ρ & T2 z NS=128, STD z NS=256 oraz waterLOGSY z NS= 384 lub 512.
      3. W przypadku przesiewania 19F należy stosować eksperymenty 1D i T2: 1D: F19CPD (pp=zgig) dla głowicy sondy 19F{1H} oraz F19(pp=zg) dla głowicy sondy 19F/1H; SCREEN_19F_T2 (pp = cpmgigsp).
      4. Należy ustawić szerokość widma 20 ppm i częstotliwość wzbudzenia na -140 ppm. Czas eksperymentu wynosi od 1 do 5 godzin (należy zapewnić długoterminową stabilność biomakromolekuły) w zależności od sprzętu i stężenia próbki. Dla T2 czas CPMG powinien zmieniać się w zakresie od 0 ms do 20 ms.
    3. Przetwarzanie
      1. Eksperymenty STD, T1ρ i T2 należy rejestrować jako pseudo 2D. Do przetwarzania dwóch pojedynczych widm 1D program IconNMR wykorzystuje au-program proc_std z opcją relax lub bez niej. Pierwsza opcja dostarcza widmo 1D referencyjne oraz różnicę dwóch widm. Druga opcja daje dwa oddzielne widma z krótkim i długim czasem relaksacji. WaterLOGSY jest pojedynczym widmem 1D, które powinno zostać poddane korekcie fazy z ujemnym sygnałem dla rozpuszczalnika.
  2. Warunki specyficzne dla użytkownika
    1. Wszelkie wcześniej wspomniane parametry można dostosować do warunków zdefiniowanych przez użytkownika. Na przykład, jeśli białko dostarczone przez użytkownika nie jest stabilne w temperaturze zazwyczaj stosowanej w placówce, można przeprowadzić eksperymenty optymalizacyjne, zmieniając temperaturę, stężenie, warunki buforu itp.

4. Analiza danych

  1. Kontrola jakości biblioteki fragmentów (d6-DMSO/bufor specyficzny) i kwantyfikacja
    1. CMC-q
      UWAGA: Kontrola jakości bibliotek fragmentów jest niezbędna przed rozpoczęciem kampanii przesiewowych. Ponadto, w przypadku zastosowania w kilku kampaniach przesiewowych, należy zapewnić długoterminową stabilność biblioteki fragmentów, dlatego konieczne jest przeprowadzanie okresowej oceny jej jakości. W tym celu do oceny jakościowej i ilościowej wykorzystuje się zintegrowane oprogramowanie CMC-q oraz CMC-a z systemu TopSpin. CMC-q i CMC-a to moduły oprogramowania w ramach TopSpin, które umożliwiają sprawną akwizycję oraz analizę, w tym weryfikację struktury przy użyciu 1Widmo H-NMR uzyskane z małych cząsteczek organicznych 9.
      1. W celu oceny integralności należy przygotować próbki o stężeniu fragmentu 1 mM w d6-DMSO. Próbki należy przygotować w sposób zautomatyzowany za pomocą robota pipetującego, przenosząc ciekłą próbkę do probówki NMR o średnicy 3 mm.
      2. Do oceny rozpuszczalności należy użyć próbki zawierającej 1 mM związku w 50 mM buforze fosforanowym sodu o pH 7,4, 150 mM chlorku sodu i 90% H2O2O/ 10% D20 i 1 mM soli sodowej kwasu 3-(trimetylosililo)propionowego-2,2,3,3-d4 (TMSP-Na).
      3. Rejestruj widma NMR w temperaturze 298 K lub 293 K przy użyciu spektrometru NMR o częstotliwości 600 MHz, wyposażonego w kriogeniczną sondę TCI 5 mm z potrójnym rezonansem oraz automatyczny zmieniacz próbek HT, który pozwala na jednoczesną obsługę 579 próbek.
      4. W celu skonfigurowania oprogramowania CMC-q należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi, która opisuje proces tworzenia użytkownika IconNMR, aktywację FastLaneNMR oraz zmianę próbnikowej autowzystalarki wysokoprzepustowej (HT).
      5. Kalibruj 90° impuls i zapisz go w tabeli prosol w programie TopSpin.
      6. Umieść płytkę 96-dołkową z próbkami w jednym z 5 dostępnych miejsc w statywie automatycznego zmieniacza próbek HT..
      7. Aby załadować plik SDF (structure data file), który powinien zawierać proponowaną strukturę chemiczną, unikalny identyfikator oraz pozycję każdej próbki w partii w wysokoprzepustowym (HT) urządzeniu do wymiany próbek, należy przejść do Przeglądaj w oknie konfiguracji CMC-q i kliknij Otwórz po wybraniu pliku z rozszerzeniem .sdf.
      8. W ustawieniach CMC.q Batch Automation należy ustawić typ weryfikacji definiujący eksperyment do pomiaru, użytkownika IconNMR oraz zdefiniować rozpuszczalnik.
      9. Zdefiniuj pliki SDF dla ścieżki do pliku SDF, identyfikatora cząsteczki oraz pozycji próbki.
      10. Rozpocznij akwizycję, klikając w StartKliknij w Rozpocznij akwizycję Ponownie. Konfigurację CMC-q można również zapisać, klikając w Zapisz.
      11. Szczegółowy opis etapów konfiguracji CMC-q znajduje się w instrukcji obsługi firmy Bruker.
    2. CMC-a
      1. W przypadku CMC-a należy użyć modułu oprogramowania w programie Topspin, który umożliwia analizę, w tym weryfikację struktury z wykorzystaniem widma 1H-NMR uzyskanego z małych cząsteczek organicznych9.
  2. Projektowanie mieszanin
    UWAGA: Odpowiedni projekt mieszanin odgrywa istotną rolę w badaniach przesiewowych z wykorzystaniem NMR jako platformy. Duża liczba fragmentów w mieszaninach pozwala na szybsze przeprowadzenie przesiewu, ale zwiększa ryzyko wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Mniejsza liczba fragmentów zmniejsza to ryzyko, ale wydłuża czas trwania badania. Generalnie podczas tworzenia mieszanin należy unikać nakładania się sygnałów. W przypadku korzystania z biblioteki wewnętrznej kwestię tę można pominąć dla 1Przesiewanie H, ponieważ biblioteka została specjalnie zaprojektowana tak, aby była zróżnicowana i wykazywała niewielkie nakładanie się sygnałów przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej różnorodności chemicznej. Oznacza to z kolei, że w celu stworzenia 64 mieszanin nie jest konieczne przeprowadzanie specjalnej procedury projektowej.
    1. Jako 19Przesiewanie F opiera się na fragmentach biblioteki wewnętrznej zawierających fluor, a biblioteka ta nie została stworzona w celu zredukowania nakładania się sygnałów dla tych konkretnych fragmentów; należy zaprojektować odpowiednią mieszaninę.
    2. Zmierz widma pojedynczych związków dla wszystkich fragmentów zawierających 19F.
    3. Zanotuj informacje o przesunięciu chemicznym każdego sygnału.
    4. Na podstawie tych informacji należy wybrać po 20–21 fragmentów na mieszaninę. Pozwala to na przygotowanie 5 mieszanin zawierających każda po 20–21 fragmentów bez nakładania się sygnałów, co umożliwia półautomatyczną analizę danych.
  3. Identyfikacja hitów w obrębie biomakromolekuły i liganda w obserwowanym oddziaływaniu biomakromolekuła-ligand
    UWAGA: Istnieją różne definicje trafienia (hit) pomiędzy 19F i 1Procedura screeningu H. Poniższe kryteria identyfikacji hitów zostały przez nas opracowane i opierają się na określonych zasadach. Określanie hitów ma charakter wysoce subiektywny i może różnić się w zależności od użytkownika. Niemniej jednak, w celu zachowania walidacji i wiarygodności, kluczowe jest, aby zasady identyfikacji hitów nie ulegały zmianie po ich ustaleniu.
    1. 1Ekran H
      1. Aby pewnie wyznaczyć trafienia, należy przeprowadzić pomiar 1D 1Widma H, waterLOGSY i T2 eksperymenty relaksacyjne zarówno w obecności, jak i wykluczeniu celu w celu identyfikacji wiążących cząsteczek. Wszystkie trzy eksperymenty mają potencjał do wykazania zdarzenia wiązania. Jeśli w widmach próbki w porównaniu z widmami kontrolnymi widoczna jest zmiana przesunięcia chemicznego (CSP) przekraczająca 6 Hz, uznaje się to za wskazanie trafienia. To samo dotyczy sytuacji, gdy w badaniu waterLOGSY występuje silny sygnał dodatni, a także gdy T22 widoczny jest spadek w widmach próbek. Zdarzenia wiązania można wykazać we wszystkich trzech eksperymentach, porównując widma próbek z odpowiadającymi im widmami tła. Zdarzenia wiązania mogą jednak nie być widoczne we wszystkich trzech eksperymentach. Z tego powodu ustalono, że aby zaklasyfikować fragment jako hit wiążący, muszą wystąpić co najmniej dwa z opisanych wcześniej zdarzeń.
      2. Użyj narzędzia FBS w programie TopSpin, aby zdefiniować stan fragmentów jako wiążące, niejednoznaczne, nieznane, agregaty lub niewiążące.
      3. Po zakończeniu przygotowywania mieszaniny, zatwierdź ją w narzędziu FBS.
      4. W karcie podsumowania w projekcie FBS kliknij Utwórz raport z przesiewuSpowoduje to otwarcie okna służącego do utworzenia pliku .xlsx. Użytkownik może następnie wybrać, czy w arkuszu kalkulacyjnym mają zostać uwzględnione wszystkie ligandy, tylko ligandy wiążące, tylko ligandy niewiążące czy ligandy niejednoznaczne.
    2. 19Ekran F
      1. Aby rozróżnić związki nie wiążące (non-binder), słabo wiążące (week-binder) i silnie wiążące (strong-binder), stosuje się następujący wzór: iloraz całek z pomiaru celu przy 200 ms i pomiaru tła przy 20 ms dzieli się przez iloraz całek z pomiaru celu przy 0 ms i pomiaru tła przy 0 ms:
        figure-protocol-2
        UWAGA: Pozwala to na uzyskanie wartości w zakresie od 0 do ~1 (wynik trafienia, tzw. hit-score), co umożliwia wyznaczenie progów dla każdego stanu wiązania.
      2. Średnią z pomiaru referencyjnego dla 20 ms należy przyjąć jako próg bazowy w celu oznaczenia przypadków, w których wynik trafienia (hit-score) przekracza 1. Może to wystąpić, jeśli zaimportowane całki zawierają wartości ujemne lub jeśli pomiar referencyjny jest wyższy od pomiaru docelowego. Wynik trafienia ≤ 0,67 uznaje się za słabe trafienie (weak-hit). < 0,3 to silny sygnał, a cokolwiek > 0,67 jako brak trafienia. Przykład przedstawiono w Rycina 2.

figure-protocol-3
Rysunek 2Identyfikacja hitów dla 19Przesiewy F. Przekrój przez 19Widma NMR f CPMG przykładowego związku. Ta reprezentacja graficzna wyjaśnia właściwości ligandu. 19Widma F-CPMG związku uzyskane z próbek mieszanin w obecności i przy braku RNA. Wartości reprezentują znormalizowane wartości całek odpowiadających pików. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Analiza danych
    1. Przygotowanie danych do analizy
      UWAGA: Ważne jest, aby pozyskane dane nie posiadały widocznych wad. Oznacza to, że do analizy nie powinny być brane pod uwagę dane, w których shimming był problematyczny lub supresja wody była niewystarczająca. Zaleca się ponowne zarejestrowanie danych, upewniając się, że wszystko jest w porządku z próbką (np. brak pęcherzyków powietrza), temperaturą, shimmingiem i supresją wody. Poprawność danych można zawsze ocenić, porównując sygnały DMSO.
    2. Screening 1H
      1. Do analizy danych screeningu 1H należy użyć narzędzia FBS (wymagana dodatkowa licencja) w programie TopSpin 4.0.9.
      2. W celu rozpoczęcia analizy danych należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku narzędzia FBS. Poniższe kroki podsumowują procedurę opisaną w podręczniku.
      3. Dane NMR BMRZ z kampanii screeningowych należy przechowywać w taki sposób, aby każda różna mieszanina screeningowa miała własny katalog, w którym podkatalog zawiera poszczególne eksperymenty przeprowadzone na próbce.
      4. W przypadku korzystania z narzędzia FBS należy przechowywać widma referencyjne, zawierające wszystkie dane z próbek bez celu biomolekularnego, ale z mieszaninami, a także pojedyncze związki zmierzone w różnych katalogach /nmr. Jest to ważne, ponieważ narzędzie FBS będzie prosić o ścieżkę katalogu dla każdego z nich z osobna.
        UWAGA: Narzędzie FBS rozpozna katalog jako projekt screeningowy, jeśli w tym samym katalogu, w którym przechowywane są mieszaniny próbki screeningowej, zapisane zostaną następujące zestawy danych (pliki csv, dokumenty XML FragmentScreen oraz plik BAK).
      5. Podczas korzystania z TopSpin 4.0.9 należy utworzyć bezpośrednią ścieżkę do katalogu zawierającego pozyskane dane, tzw. DIR. Wybierz katalog /nmr, w którym wszystkie mieszaniny powinny mieć odrębny katalog.
      6. Aby uruchomić narzędzie FBS dla screenowanej próbki, należy przeciągnąć symbol FBS project na środek okna TopSpin. W wybranym katalogu powinien pojawić się symbol FBS project, jeśli wcześniej wspomniane zestawy danych zostały do niego skopiowane.
      7. Okno Fragment Based Screening Options powinno otworzyć się automatycznie podczas pierwszego ładowania nowego projektu FBS. W tym oknie należy wybrać plik cocktail. Plik cocktail to plik csv zawierający przypisanie nazw mieszanin, nazw poszczególnych fragmentów oraz ich podział na mieszaniny. Należy również zdefiniować folder widm ligandów referencyjnych, który zawiera wszystkie zmierzone widma pojedynczych fragmentów. Na koniec należy zdefiniować folder referencyjnego eksperymentu blank, który zazwyczaj jest folderem zawierającym zestawy danych mieszanin bez badanego celu.
      8. Okno Fragment Based Screening Options posiada zakładkę Spectra types, która pozwala zdefiniować badane widma oraz kolor wyświetlania widm. Ustaw Spectype zgodnie z wcześniej przetworzonymi danymi. W zakładce Display layout należy zdefiniować widma, które będą ze sobą porównywane zgodnie z ich typami widm (spectypes).
      9. Naciśnij Ok , aby rozpocząć projekt FBS.
      10. Podczas przeglądania danych otworzy się osobne okno, podsumowujące wszystkie mieszaniny cocktail oraz wszystkie ligandy każdej mieszaniny w tabeli. Po dwukrotnym kliknięciu w komórkę otworzą się odpowiednie zestawy danych, porównując na przykład widma 1H 1D Blank z zestawem danych zawierającym cel.
      11. Przed przypisaniem binderów należy upewnić się, że piki referencyjne (DMSO dla wszystkich pomiarów oraz dla pojedynczych związków) pokrywają się i mają ten sam przesunięcie chemiczne. Jeśli zaobserwowano różnice, należy je skorygować, korzystając z opcji przetwarzania seryjnego w TopSpin.
      12. Opcja przetwarzania seryjnego znajduje się w zakładce Process w sekcji Advanced. Stosuje ona zmiany do wszystkich wybranych widm z zestawu danych. W ten sposób Spectypes mogą zostać łatwo przypisane do numerów eksperymentów, a wszystkie widma mogą zostać przesunięte jednocześnie, aby wyrównać je z referencją.
    3. Screening 19F
      1. Dla pierwszej analizy mieszanin 19F należy utworzyć plik integracji dla każdej mieszaniny. Aby zdefiniować obszar integracji, kliknij funkcję Integrate w zakładce Analyse . Upewnij się, że dla każdego fragmentu w mieszaninie zdefiniowany jest wyraźny obszar integracji dla odpowiadającego sygnału 19F.
      2. Użyj przycisku Save/Export integration regions, aby wyeksportować plik integracji do późniejszego użytku. Zapisz używane pliki integracji w C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng lub w odpowiedniej ścieżce katalogu instalacyjnego TopSpin.
      3. W przypadku danych 19F otwórz zestaw danych z badanym celem lub bez niego.
      4. Aby załadować plik integracji do aktualnego widma, ponownie otwórz zakładkę Analyse , przejdź do Integrate i za pomocą przycisku Read/Import integration regions załaduj odpowiedni plik integracji. Spowoduje to załadowanie wszystkich zdefiniowanych w tym pliku obszarów do aktualnego widma.
      5. Zapisz i wróć, aby znaleźć listę wszystkich zintegrowanych obszarów w zakładce Integrals . Skopiuj ją do arkusza kalkulacyjnego lub innego narzędzia używanego do dalszej analizy danych.
      6. Powtórz tę procedurę dla każdej mieszaniny, z celem i bez celu.
    4. Zarządzanie danymi
      1. Dla ułatwienia pracy i zwiększenia wydajności należy wprowadzić jednolity przepływ pracy dla dalszej analizy i przechowywania pozyskanych danych. Zarówno dla screeningu 1H, jak i 19F należy używać specjalnie zaprojektowanego arkusza kalkulacyjnego dla każdego z nich.
        UWAGA: W przypadku screeningu 1H służył on wyłącznie do zarządzania danymi i podsumowania każdego celu, natomiast w przypadku screeningu 19F wykorzystano wyjaśniony w rozdziale 4.3 iloraz do automatycznego etykietowania każdego fragmentu jako hit/no hit po skopiowaniu do niego danych z całek. Zmniejsza to ryzyko błędu ludzkiego podczas analizy (zakładając, że plik został prawidłowo skonfigurowany) i ułatwia udostępnianie informacji, ponieważ wszystkie istotne dane są zgromadzone w jednym miejscu w pliku, który może zostać otwarty przez niemal każdego bez potrzeby posiadania dodatkowych programów do wstępnego wglądu w dane.

Wyniki

Kontrola jakości biblioteki fragmentów
Fragmenty z wewnętrznej biblioteki dostarczono jako 50 mM roztwory zapasowe w 90% d6-DMSO i 10% D2O (dodatek 10% D2O zapewnia zminimalizowanie degradacji związków podczas wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania14). Pojedyncze próbki związków składały się z 1 mM liganda w 50 mM buforze fosforanowym (25 mM KPi pH 6,2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl2), pH 6,0 w 90% H2O/9% D2O/1% d6-DMSO. Eksperymenty 1H-NMR fragmentów z biblioteki iNEXT przeprowadzono na spektrometrze NMR 50/60 MHz. Dane te wykorzystano następnie do identyfikacji pojedynczych związków w kampaniach screeningu 1H przy użyciu oprogramowania CMC-q, które umożliwia w pełni zautomatyzowaną akwizycję widm, a za pomocą dodatku analitycznego CMC-a oceniono jakość (rozpuszczalność i integralność) fragmentów. Wyniki zautomatyzowanej analizy z CMC-a przedstawiono w formie graficznej, podobnej do tej ukazanej na Rysunku 3. Wyświetlony obraz przedstawia płytkę 96-dołkową. Czerwone koło oznacza, że fragment wykazuje niespójność struktury lub stężenia. Zielone dołki wskazują, że fragment jest spójny.

figure-results-1
Rysunek 3Kontrola jakości biblioteki fragmentów. Schematyczne przedstawienie zautomatyzowanego wyniku opartego na CMC-a. Oceniając właściwości fragmentów, takie jak stężenie i integralność strukturalna. Kolor zielony oznacza spójność, natomiast kolor pomarańczowy w tym przypadku oznacza niespójność. Niespójne fragmenty są poprawiane ręcznie zgodnie z przedstawionym schematem postępowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Około 65% i 35% fragmentów sklasyfikowano odpowiednio jako zgodne i niezgodne, zarówno w DMSO, jak i w buforze. Co więcej, 30% ligandów zaklasyfikowanych jako niezgodne stało się zgodnymi po dokładnej manualnej inspekcji widm9.

19Projekt mieszanin F
Sto trzy fragmenty zawierające jedną lub kilka grup fluorowych z wewnętrznej biblioteki podzielono na 5 mieszanin (A, B, C, D, E). Każda mieszanina składa się z 20 do 21 fragmentów. W tym przypadku mieszaniny musiały zostać starannie zaprojektowane, aby uniknąć nakładania się sygnałów. 19W celu pomiaru eksperymentów relaksacji poprzecznej F dla każdej z mieszanin zastosowano sekwencje impulsów CPMG. Eksperymenty te można modyfikować poprzez zmianę czasów opóźnienia relaksacji. 19Przesunięcia chemiczne jądra F dla mieszanin A-E przedstawiono w Rysunek 4.

figure-results-2
Rysunek 4: 19Widma 1D-NMR próbek mieszanin z wewnętrznej biblioteki. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przygotowanie próbek
Przygotowanie próbek w procedurze przesiewowej 19F przeprowadzano ręcznie lub za pomocą automatycznego pipetowania z wykorzystaniem robota pipetującego . Fragmenty w każdej mieszaninie miały stężenie 2,5 mM w 90% d6-DMSO i 10% D2O. Końcowa objętość próbki przesiewowej wynosiła 170 µL z dodatkiem 5% D2O jako czynnika blokującego. Każdą mieszaninę pipetowano dwukrotnie: raz do roztworu buforowego (bez celu) i raz do roztworu buforowego zawierającego cel. Stosunek celu do fragmentu ustawiono na 1:1, co skutkowało końcowym stężeniem celu/liganda wynoszącym 50 µM. Dodatkowo przygotowano próbki kontrolne składające się z biomolekuły celu w buforze przesiewowym bez mieszaniny w celu zapewnienia integralności celu, a także próbkę kontrolną zawierającą tylko bufor i D2O w celu sprawdzenia jakości buforu.

Dane przesiewowe NMR dla 19F-1D oraz 19F-CPMG-T2 zostały wyznaczone zgodnie z opisem w sekcji 3.1. Na przykład w przypadku RNA dla pojedynczej próbki celu w buforze zastosowano sekwencję echo z powrotem po skoku (pp = zggpjrse,15).

Analiza danych
The 19Zastosowano procedurę przesiewową dla ryboswicza TPP thiM z E. coli oraz kinazę tyrozynową białek (PtkA) z *M. tuberculosis* spośród kilku innych celów16. The 19Biblioteka przesiewowa F zawiera 103 fragmenty podzielone na 5 mieszanin (Mixes) oznaczonych od Mix A do E. Przygotowanie próbek do przesiewu można przeprowadzić ręcznie, bez użycia robota do pipetowania próbek. 40 µM roztwór zawierający RNA (warunki buforowe) zmieszano z 3.2 µL z mieszanin. Przygotowano dodatkowe próbki kontrolne składające się z samego buforu, buforu z 5% DMSO (wcześniej należy upewnić się co do stabilności biomakrocząsteczki w obecności pożądanego stężenia DMSO) oraz buforu z RNA. Te 13 próbek przesiewowych przygotowano i przeniesiono do probótek NMR o średnicy 3 mm. Kody kreskowe probótek NMR zostały zeskanowane, a każda mieszanina w obecności i w nieobecności RNA, jak również próbki kontrolne, zostały zmierzone zgodnie z wyżej wymienioną 19Eksperymenty NMR z wykorzystaniem 19F przeprowadzono w temperaturze 298 K. Przesiewanie RNA thiM przeciwko wewnętrznej bibliotece wykonano poprzez przeprowadzenie T2 pomiary z wykorzystaniem CPMG o czasie 0 ms i 200 ms dla każdej z różnych próbek. Prawidłowe shimowanie oraz tłumienie sygnału wody monitorowano po zakończeniu pomiarów, porównując wszystkie piki DMSO pod kątem poszerzenia linii oraz utraty intensywności dodatkowo zmierzonych 1Eksperymenty 1D H dla wszystkich próbek. Przetwarzanie uzyskanych danych T CPMG2 19Spektra relaksacji F przeprowadzono odpowiednio przy użyciu wcześniej przygotowanego i zautomatyzowanego makra w programie TopSpin. Analizę danych wykonano zgodnie z instrukcjami zawartymi w sekcji protokołu. Dane całkowe uzyskane z TopSpin (zgodnie z instrukcjami w protokole) można szybko i łatwo ocenić za pomocą gotowego arkusza kalkulacyjnego lub dowolnego podobnego programu, ustawiając odpowiednie warunki i progi. Jak opisano wcześniej, progi są przydatne w definiowaniu silnych ligandów, słabych ligandów lub substancji nie wiążących. Rycina 5 przedstawia typowe wyniki widm CPMG odpowiednio dla RNA thiM oraz PtkA. W niektórych przypadkach wymagana była dalsza korekta ekspercka.

figure-results-3
Rysunek 5Wytnij z 19Widma CPMG NMR ukazujące zmiany intensywności uzyskane dla różnych czasów opóźnienia w eksperymentach opartych na sekwencji CPMG. (A) Przedstawienie związku wiążącego (hit) i związku niewiążącego w 19Przesiewanie oparte na fragmentach (FBS) przeprowadzone na rybosprzełączniku TPP RNA genu thiM pochodzącego z *E. coli*(B) Przedstawienie wiązacza i związku niewiążącego w 19Przesiewanie oparte na fragmentach przeprowadzone na PtkA z M. tuberculosis. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1Przesiewowe badanie H

Projekt mieszanin
Wykorzystana biblioteka wewnętrzna jest na tyle zróżnicowana, że na potrzeby skreningu 1H nie opracowano projektu mieszanin. Oznacza to, że przygotowano 64 mieszaniny poprzez losowy wybór 12 składników do każdej z nich.

Przygotowanie próbek
W celu przeprowadzenia przesiewu 1H dla przykładowego RNA SARS-CoV-2, do przygotowania próbek wykorzystano automatyczne pipetowanie za pomocą robota pipetującego. Fragmenty w każdej mieszaninie miały stężenie 4,2 mM w 90% d6-DMSO i 10% D2O. Końcowa objętość próbki przesiewowej wynosiła 200 µL z dodatkiem 5% D2O jako środka blokującego. Pipetowano 64 próbki, z których każda zawierała inną mieszaninę w 25 mM KPi i 50 mM KCl o pH 6,2, bez dodatku docelowego RNA. Analogicznie pipetowano 64 próbki z docelowym RNA, z których każda zawierała inną mieszaninę. Stosunek RNA:ligand ustalono na 1:20, co przełożyło się na stężenie RNA wynoszące 10 µM i stężenie ligandu wynoszące 20 µM.

Analiza danych
Do analizy 1H wykorzystano narzędzie FBS w programie TopSpin. Aby określić, czy dany fragment jest trafieniem (hit), przeprowadzono eksperymenty 1D przesunięcia chemicznego, waterLOGSY oraz relaksacji T2. W przypadku relaksacji T2 za trafienie uznawano spadek intensywności przekraczający 30%, natomiast dla przesunięcia chemicznego wartość graniczną ustalono na przesunięcie większe niż 6 Hz. Eksperyment waterLOGSY musiał wykazać znaczną zmianę sygnału (w tym przypadku z ujemnego na dodatni). Jeśli spełnione zostały dwa z trzech wymienionych kryteriów, fragment uznawano za trafienie. Dwa takie przykłady przedstawiono na Ryc. 6.

figure-results-4
Rycina 6: 1Przesiewowe badanie H wykonane na przykładowym RNA SARS-CoV-2, przedstawiające kryteria wyznaczania trafień. Pozyskanie danych z trzech różnych eksperymentów (1H T2 CPMG (5/10 ms), waterLOGSY oraz 1D 1H). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Hit-1 wykazuje spadek T2 o ok. 50% oraz CSP ≥ 6 Hz. W eksperymencie waterLOGSY nie zaobserwowano zmiany sygnału wystarczająco znaczącej, aby uznać go za pozytywny. Ponieważ dwa z trzech eksperymentów są pozytywne, fragment ten uznano za hit. W przypadku Hit-2 T2 wykazuje spadek intensywności sygnału o ok. 80%, a w badaniu waterLOGSY widoczna jest wyraźna zmiana sygnału. W tym przypadku CSP nie jest wystarczające, jednak ze względu na pozytywne spełnienie dwóch poprzednich kryteriów, fragment ten nadal uznaje się za hit.

Dyskusja

Wszechstronność badań przesiewowych fragmentów/leków opartych na NMR. W ramach projektu BMRZ z powodzeniem wdrożono najnowocześniejsze zautomatyzowane oprzyrządowanie NMR, a także eksperymenty STD-NMR, waterLOGSY i relaksacyjne w celu identyfikacji fragmentów w szerokim zakresie powinowactwa do odkrywania leków. Zainstalowany sprzęt obejmuje wysokowydajnego robota do przygotowywania próbek oraz wysokowydajną jednostkę do przechowywania próbek, zmieniacza i akwizycji danych powiązaną ze spektrometrem 600 MHz. Niedawno zakupiona sonda kriogeniczna dla 1H, 19F, 13C i 15N zapewnia wymaganą czułość dla proponowanych pomiarów i umożliwia odsprzężenie 1H (1) podczas detekcji 19F. Sonda ta jest podłączona do najnowszej generacji konsoli NMR, która oferuje możliwość korzystania z zaawansowanych narzędzi programowych firmy Bruker, w tym CMC-q, CMC-assist, CMC-se i FBS (zawartych w TopSpin). Narzędzie do badań przesiewowych opartych na fragmentach (FBS) jest zawarte w najnowszej wersji TopSpin i pomaga analizować dane o wysokiej przepustowości, na które składają się eksperymenty z r-relaksacją STD, waterLOGSY, T2/T1. Płynny zbiór próbek 1D 1H może być napełniany do probówek NMR w sposób zautomatyzowany za pomocą robota do napełniania próbek. Zazwyczaj blok 96 probówek (3 mm) jest napełniany w ciągu około dwóch godzin. 96-dołkowe stojaki na płytki są umieszczone bezpośrednio w podajniku próbek HT, który odczytuje kod kreskowy bloku i przypisuje probówki NMR do eksperymentów sterowanych przez oprogramowanie automatyzacji (IconNMR). W podajniku próbek HT można jednocześnie przechowywać i programować pięć 96-dołkowych stojaków na płytki. Temperatura każdego z poszczególnych regałów może być kontrolowana i regulowana oddzielnie. Dodatkowo, każda pojedyncza próbka może być wstępnie kondycjonowana (podgrzewanie wstępne i suszenie rurki w celu usunięcia skondensowanej wilgoci) do żądanej temperatury przed pomiarem.

Nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań. Jednym z szerokich zastosowań tego zautomatyzowanego badania przesiewowego opartego na NMR jest identyfikacja i opracowanie nowych ligandów wiążących się z celem biomakromolekularnym (DNA/RNA/białka). Te ligandy mogą zawierać inhibitory ortosteryczne i allosteryczne, które zazwyczaj wiążą się niekowalencyjnie. Co więcej, FBDD metodą NMR jest zwykle stosowany jako pierwszy krok do wyboru obiecujących związków, wymagania, które należy spełnić, to dostępność celu biomolekularnego w wystarczających ilościach. Cel ten dzieli się na dwa główne zadania.

Zadanie pierwsze polega na opracowaniu i scharakteryzowaniu własnej biblioteki fragmentów z następujących powodów: wstępna i okresowa kontrola jakości, charakterystyka i kwantyfikacja ponad 1000 fragmentów; oznaczanie rozpuszczalności fragmentów w zoptymalizowanych dla każdego celu, w szczególności dla docelowych białek; oraz utworzenie kilku bibliotek w celu dostosowania do różnych rusztowań i rozszerzenia na inne klasy makrocząsteczek. Zadanie drugie polega na zintegrowaniu przepływów pracy w zakresie projektowania leków opartych na fragmentach (FBDD) za pomocą NMR z wykorzystaniem: zautomatyzowanych badań przesiewowych obserwowanych ligandów 1D (obserwowano 1H i 19F); zautomatyzowane testy zastępcze (eksperymenty konkurencyjne z (naturalnym) ligandem) w celu rozróżnienia wiązania ortosterycznego i allosterycznego; zautomatyzowane wtórne badania przesiewowe z wieloma fragmentami; zautomatyzowane badania przesiewowe białek 2D oraz wtórne badania przesiewowe zestawu pochodnych wokół początkowego trafienia z wykorzystaniem biblioteki EU-OPENSCREEN lub dowolnej innej biblioteki; oraz ponowne profilowanie badań przesiewowych biblioteki FDA pod kątem wybranych celów.

Ponadto można przeprowadzić metabotypowanie różnych linii komórkowych (istotnych dla choroby) w celu rozwikłania mechanizmów regulacyjnych, które łączą kontrolę cyklu komórkowego i metabolizm. Istnieje również funkcjonalna charakterystyka elementów regulacyjnych RNA/DNA/białka in vivo i in vitro w celu optymalizacji konstruktu/domeny (optymalizacja stabilności dla badań strukturalnych (badanie przesiewowe bufora, pH, temperatury i soli) oraz rozszerzenie badań przesiewowych fragmentów opartych na NMR na białka błonowe i białka wewnętrznie nieuporządkowane, które są na ogół niedostępne dla innych technik.

Ograniczenia. Korzystanie z bibliotek fragmentów 19F i 1H ma swoje plusy i minusy, z których kilka zostanie wymienionych w dalszej części. Największą zaletą pomiarów 19F w porównaniu z 1H jest szybkość zarówno rzeczywistego czasu pomiaru, jak i późniejszej analizy, ponieważ mieszaniny zawierają prawie dwukrotnie więcej fragmentów i trzeba przeprowadzić mniej eksperymentów. Dalsza analiza jest również łatwiejsza w przypadku przesiewania 19F, ponieważ nie ma zakłóceń ze strony, a dodatkowo oferuje szerszy zakres przesunięć chemicznych przy prawie zerowym nakładaniu się sygnałów dla optymalnie zaprojektowanej mieszaniny fragmentów. Same widma są znacznie uproszczone, zwykle mają tylko jeden lub dwa sygnały na fragment, w zależności od liczby atomów fluoru. Analiza tych widm może być zatem zautomatyzowana, co ponownie skraca czas. Odbywa się to kosztem różnorodności chemicznej, przynajmniej w przypadku biblioteki wykorzystanej w tym badaniu. Ponieważ tylko ~13% biblioteki zawiera 19F, ale oczywiście wszystkie z nich nadają się do wykorzystaniaw 1 H screeningu, różnorodność fragmentów 19F będzie mniejsza. Można to obejść za pomocą specjalnie zaprojektowanych bibliotek 19F z większą liczbą fragmentów i większą różnorodnością chemiczną. Kolejną wadą ekranowania 19F jest mała liczba sygnałów na fragment. Fragmenty na ogół składają się z więcej niż jednego atomu wodoru. W związku z tym eksperymenty przesiewowe obserwowane przez 1godzinę mogą opierać się na różnych sygnałach dla tego samego fragmentu w celu wykrycia wiązania. Daje to większy stopień pewności przy identyfikowaniu trafień dla przesiewania 1H, podczas gdy badanie 19F musi opierać się na jednym lub dwóch sygnałach podawanych na fragment.

Przedstawiono szczegółowy opis nowoczesnego, zautomatyzowanego oprzyrządowania do badań przesiewowych fragmentów opartego na NMR, oprogramowania i metod analizy oraz ich protokołów. Zainstalowany sprzęt obejmuje wysokowydajnego robota do przygotowywania próbek oraz wysokowydajną jednostkę do przechowywania, zmieniania i akwizycji próbek powiązaną ze spektrometrem 600 MHz. Niedawno zainstalowana kriogeniczna głowica sondy dla 1H, 19F, 13C i 15N zapewnia wymaganą czułość dla proponowanych pomiarów i umożliwia 1H odsprzężenia podczas detekcji 19F. Co więcej, najnowsza generacja konsoli NMR oferuje możliwość korzystania z zaawansowanego oprogramowania analitycznego wspomagającego akwizycję i analizę w locie. Wyżej omówiona technologia, przepływy pracy i opisane protokoły powinny przyczynić się do niezwykłego sukcesu użytkowników realizujących FBS przez NMR.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez iNEXT-Discovery, projekt numer 871037, finansowany z programu Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bruker Avance III HD Matrycaspektrometru NMR Bruker 600 MHz
Przezroczyste polipropylenowe probówki do przechowywania z kodem kreskowym 2D3731-11 0,75 ml V-DOLNA PROBÓWKA/STOJAK NA ZATRZASKThermoFisher ScientificProbówki z kodami kreskowymi
Matrix SepraSeal i DuraSeal&4463 Mata do nasadek, SeptraSeal 10/CSThermoFisher Scientific
SampleJetBrukerHT Podajnik próbek
SamplePro TubeRobot do pipetowaniaBruker

Bibliografia

  1. Yanamala, N., et al. NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands. Chemical Biology & Drug Design. 75, 237-256 (2010).
  2. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).
  3. Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus. Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).
  4. Perera, T. P. S., et al. Discovery & pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor. Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).
  5. Zhang, C., et al. Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).
  6. Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).
  7. Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery. Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).
  8. Chávez-Hernández, A. L., Sánchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization. Molecular Informatics. 39, 2000050(2020).
  9. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).
  10. Gao, J., et al. Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex. PLoS One. 9, 88098(2014).
  11. Peng, C., et al. Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).
  12. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  13. Hwang, T. L., Shaka, A. J. Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients. Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).
  14. Gossert, A. D., Jahnke, W. NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).
  15. Sklenar, V., Bax, A. A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth. Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).
  16. Binas, O., et al. 19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens. ChemBioChem. , (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewanie fragment w metod NMRprzesiewanie oparte na fragmentachprojektowanie lek wwi zanie ligand wwysokoprzepustowe przesiewanieanaliza struktury bia ekanaliza struktury RNAWaterLOGSYeksperymenty CPMGautomatyzacja przygotowania pr bek
Badanie przesiewowe fragmentów oparte na NMR w minimalnym trybie próbki, ale maksymalnym trybie automatyzacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.