Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Podsumowanie

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Streszczenie

Rozwój nowych terapii przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) został zahamowany przez brak modeli przedklinicznych, które dokładnie reprezentują chorobę. Wykazano, że modele ksenoprzeszczepów (PDX) przerzutów do OUN pochodzące od pacjentów lepiej reprezentują fenotypowe i molekularne cechy choroby ludzkiej, a także lepiej odzwierciedlają heterogeniczność i dynamikę klonalną nowotworów pacjentów u ludzi w porównaniu z historycznymi modelami linii komórkowych. Istnieje wiele miejsc, które można wykorzystać do wszczepienia tkanki pobranej od pacjenta podczas organizowania badań przedklinicznych, z których każde ma swoje zalety i wady, a każde nadaje się do badania różnych aspektów kaskady przerzutowej. W tym miejscu protokół opisuje, jak ustanowić modele PDX i przedstawia trzy różne podejścia do wykorzystania modeli PDX z przerzutami do OUN w badaniach przedklinicznych, omawiając każde z ich zastosowań i ograniczeń. Należą do nich implantacja boku, iniekcja ortotopowa do mózgu i iniekcja dosercowa. Podskórna implantacja boczna jest najłatwiejsza do monitorowania, a zatem najwygodniejsza w badaniach przedklinicznych. Ponadto zaobserwowano przerzuty do mózgu i innych tkanek po implantacji boku, co wskazuje, że guz przeszedł wiele etapów przerzutów, w tym wynaczynienie, wynaczynienie i kolonizację. Wstrzyknięcie ortotopowe do mózgu jest najlepszą opcją do rekapitulacji mikrośrodowiska guza mózgu i jest przydatne do określenia skuteczności leków biologicznych w przekraczaniu bariery krew-mózg (BBB), ale omija większość etapów kaskady przerzutów. Wstrzyknięcie dosercowe ułatwia przerzuty do mózgu, a także jest przydatne do badania tropizmu narządów. Chociaż ta metoda pomija wcześniejsze etapy kaskady przerzutowej, komórki te nadal będą musiały przetrwać krążenie, wynaczynić i skolonizować. Na użyteczność modelu PDX ma zatem wpływ droga inokulacji nowotworu, a wybór, który z nich wykorzystać, powinien być podyktowany pytaniem naukowym i ogólnymi celami eksperymentu.

Wprowadzenie

Częstość występowania przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wzrosła w ostatnich latach^1,2,3. Tradycyjne terapie przerzutów do OUN, takie jak resekcja guza, radioterapia całego mózgu i radiochirurgia stereotaktyczna, były w dużej mierze paliatywne i rzadko lecznicze, i mogą prowadzić do wyniszczających skutków ubocznych, takich jak pogorszenie funkcji poznawczych¹. Ostatnio opracowywanych jest wiele nowych terapii celowanych i immunologicznych do leczenia przerzutów do OUN, które dają nadzieję na zwiększenie skuteczności leczenia, a jednocześnie mają mniej skutków ubocznych⁴.

Przełożenie wyników przedklinicznych na znaczące kliniczne punkty końcowe często wymaga skutecznych i predykcyjnych strategii modelowania. Historycznie rzecz biorąc, modele ksenoprzeszczepów linii komórkowych były standardem w badaniach przedklinicznych w badaniach nad przerzutami do OUN. Jednak te modele linii komórkowych nie odzwierciedlają prawdziwego zachowania guza gospodarza ani nie reprezentują histologicznej lub molekularnej heterogeniczności choroby. Co więcej, modele linii komórkowych są w stanie przystosować się do warunków wzrostu in vitro, a tym samym utracić pierwotne właściwości guza gospodarza. Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), które wszczepiają guz pacjenta do myszy z niedoborem odporności lub humanizowanej, są coraz częściej stosowane w translacyjnych badaniach nad rakiem. Naukowcy wykazali, że modele PDX mogą zwykle wiernie odtworzyć wzrost guza, charakterystykę histologiczną, utrzymać niejednorodność guza, potencjał przerzutowy i molekularne cechy genetyczne. Ponadto modele PDX są prognostyczne i charakteryzują się okresem utajenia guza PDX z całkowitym przeżyciem pacjenta, a także wykazano, że dokładnie przewidują odpowiedź terapeutyczną w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów^5,6.

Pojawiły się PDX z przerzutami do OUN. W większości przypadków zostały one opracowane jako nowotwory pochodzące z jednego źródła, takie jak niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC)⁷, rak piersi8^,9 i czerniak^10,11. Ostatnio opracowano i scharakteryzowano dużą i zróżnicowaną kolekcję modeli PDX, reprezentujących osiem różnych podtypów histologicznych¹². Wykazano, że modele PDX dla przerzutów do OUN bardzo przypominają pierwotny guz pacjenta, zarówno histologicznie, jak i molekularnie, a także wykazały histologiczne unikalne różnice i podobieństwa^10,12. Ponadto, podczas gdy większość modeli PDX z przerzutami do OUN utrzymuje heterogeniczność klonalną ludzkich nowotworów, niektóre wykazywały dowody na sukcesję klonalną¹², co czyni je również idealnymi do badania oporności na terapie poprzez monitorowanie zmian klonalnych po leczeniu.

Opisane tutaj protokoły opisują metody tworzenia PDX i różne drogi inokulacji stosowane w badaniach przedklinicznych nad przerzutami do OUN (Rysunek 1). Te metody implantacji różnią się zdolnością do naśladowania wzrostu i przerzutów. W tym miejscu protokół podkreśla zastosowania dla każdej drogi implantacji i pokazuje, w jaki sposób można je wykorzystać do badania przerzutów do OUN.

Protokół

Poniżej znajduje się seria protokołów krok po kroku, używanych zarówno do tworzenia modeli PDX przez podskórną implantację boku, jak i do zakładania badań przedklinicznych, które umożliwiają testowanie terapii, które mogą pomóc w ocenie zmian biologicznych i różnych etapów kaskady przerzutowej. We wszystkich badaniach i modelach wykorzystano 3-8 tygodniowe samice myszy NOG. Wszystkie próbki tkanek zostały pobrane za świadomą zgodą zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC).

1. Tworzenie i propagacja modeli PDX przez implantację boczną

1. Ustanowienie modeli PDX
   1. Po chirurgicznym wycięciu guza od pacjenta na sali operacyjnej, świeże tkanki nowotworowe należy przechowywać w odpowiednim roztworze (takim jak DMEM) i natychmiast umieścić je na lodzie. Użyj nadmiaru roztworu do przechowywania (>10 ml), aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona.
   2. Przenieść tkankę do naczynia do hodowli tkankowej i spłukać 5 ml DPBS.
      UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu technik aseptycznych. Należy podjąć środki ostrożności poprzez noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) w celu ochrony przed możliwymi czynnikami zakaźnymi dla ludzi.
   3. Usuń martwicze obszary z guza.
      UWAGA: Można to rozpoznać jako biały, papkowaty obszar w kierunku środka tkanki.
   4. Pokrój pozostałą tkankę na około 2 x 2 x 2 mm kawałki
   .
   5. Przenieś tkanki do probówki mikrowirówkowej zawierającej matrycę błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu i przechowuj je na lodzie. Upewnij się, że użyto wystarczającej ilości macierzy błony podstawnej (>200 μl), aby całkowicie zanurzyć każdy fragment tkanki.
   6. Kriokonserwować pozostałe tkanki, które nie zostaną wszczepione, zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.3.
   7. Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Zastosuj weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje.
   8. Zidentyfikuj miejsce implantacji na myszy.
      UWAGA: Powinien znajdować się na prawej lub lewej stronie myszy, zwykle oznaczony z boku po stronie brzucha, ogonowo do klatki piersiowej.
   9. Aby przygotować obszar operacyjny, ogol sierść i zdezynfekuj ją trzema naprzemiennymi peelingami jodu powidonu i 70% etanolu.
   10. Za pomocą kleszczy podnieś skórę myszy i wykonaj 0,5-1 cm nacięcie na skórze.
   11. Powoli włóż nożyczki chirurgiczne pod skórę w miejscu nacięcia, aby utworzyć kieszeń (o głębokości 0,5-1 cm) w przestrzeni podskórnej.
   12. Ostrożnie umieść jeden kawałek guza w kieszeni i popchnij go, wepchnij na dno kieszeni, aby zapobiec wysunięciu się guza.
   13. Zamknij nacięcie za pomocą nylonowych szwów chirurgicznych 4-0.
       UWAGA: Można również stosować inne metody zamykania ran, takie jak niewchłanialne lub wchłanialne szwy i klipsy do ran.
   14. Przenieś mysz z powrotem do klatki i monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia po znieczuleniu, aż będzie w stanie ambulatoryjnym.
       UWAGA: Leki przeciwbólowe nie są wymagane, ale można je podawać, jeśli u myszy obserwuje się ból.
   15. Monitoruj wzrost guza co tydzień. Oczekuje się, że na mysz przypada jeden guz.
       UWAGA: Objętość guza po przeszczepie początkowo wydaje się zmniejszać, ale nie jest to powód do niepokoju. Uważa się, że guz przyjął, gdy staje się wyczuwalny palpacyjnie i wchodzi w logarytmiczną fazę wzrostu. Ten pierwszy fragment reprezentuje pokolenie F0.
   16. Gdy guzy zaczną rosnąć, mierz je trzy razy w tygodniu. Zmierz długość i szerokość guzów za pomocą suwmiarki. Aby obliczyć objętość guza, użyj wzoru: długość x szerokość x szerokość / 2.
   17. Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, gdy guzy mają średnicę większą niż 15 mm, używając najdłuższej strony guza. Przeprowadzić eutanazję poprzez wdychanie CO₂ w komorze indukcyjnej CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną.
   18. Wytnij guz z boku zwierzęcia, wykonując nacięcie. Delikatnie wyciąć guz nożyczkami i kleszczami. Aby to zrobić, najpierw odetnij skórę na wierzchu guza, a następnie odetnij guz od warstwy mięśniowej poniżej.
   19. Przenieść tkankę nowotworową do >10 ml odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM). Natychmiast umieść go na lodzie. Guz ten może być kriokonserwowany lub przenoszony do innego zestawu myszy. Rozważ ten fragment jako F1.
       UWAGA: Ponowne pasażowanie spowodowałoby przejście guza F2 i tak dalej.
2. Propagacja modeli PDX
   1. Zacznij od wyciętego guza przechowywanego w roztworze do przechowywania z kroku 1.1.19.
   2. Przenieść tkankę do naczynia do hodowli tkankowej i spłukać 5 ml DPBS.
   3. Usuń martwicze obszary z guza.
   4. Pokrój tkankę na około 2 x 2 x 2 mm kawałki
   .
   5. Przenieść tkanki do probówki mikrowirówkowej zawierającej matrycę błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (>200 μl) i przechowywać na lodzie.
   6. Kriokonserwować pozostałą tkankę, która nie jest używana do rozmnażania, zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.3.
   7. Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje.
   8. Zidentyfikuj miejsce implantacji na myszy.
      UWAGA: Powinien znajdować się na prawej lub lewej stronie myszy, zwykle w okolicy brzucha, ogonowo do klatki piersiowej.
   9. Aby przygotować obszar operacyjny, ogol sierść i zdezynfekuj ją trzema naprzemiennymi peelingami jodu powidonu i 70% etanolu.
   10. Wykonaj nacięcie 0,5-1 cm na jednym boku myszy.
   11. Powoli włóż nożyczki chirurgiczne pod skórę w miejscu nacięcia, aby utworzyć kieszeń (o głębokości 0,5-1 cm) w przestrzeni podskórnej.
   12. Ostrożnie umieść jeden kawałek guza w kieszeni i wepchnij go na dno kieszeni, aby zapobiec wyślizgnięciu się guza.
   13. Zamknij nacięcie za pomocą nylonowych szwów chirurgicznych 4-0 lub innych metod zamykania rany.
   14. Przenieś mysz z powrotem do klatki i monitoruj jej powrót do zdrowia po znieczuleniu, aż będzie w stanie ambulatoryjnym.
       UWAGA: Leki przeciwbólowe nie są wymagane, ale można je podawać, jeśli u myszy obserwuje się ból.
   15. Podczas utajenia (faza bez wzrostu) monitoruj wzrost guza co tydzień. Oczekuje się, że na mysz przypada jeden guz.
       UWAGA: Objętość guza po przeszczepie początkowo wydaje się zmniejszać, ale nie jest to powód do niepokoju. Uważa się, że guz jest przyjmowany, gdy staje się wyczuwalny palpacyjnie i zaczyna stale rosnąć.
   16. Gdy guzy zaczną rosnąć, mierz je trzy razy w tygodniu. Zmierz długość i szerokość guzów za pomocą suwmiarki. Oblicz objętość guza za pomocą wzoru: długość x szerokość x szerokość / 2.
   17. Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, gdy guzy mają średnicę większą niż 15 mm, używając najdłuższej strony guza. Przeprowadzić eutanazję poprzez wdychanie CO2 w komorze indukcyjnej CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną.
   18. Wyciąć guz z boku zwierzęcia, wykonując nacięcie i delikatnie wycinając guz nożyczkami i kleszczami.
   19. Przenieś tkankę nowotworową do >10 ml odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM), a następnie natychmiast umieść na lodzie.
3. Kriokonserwacja guzów PDX
   1. Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, gdy guzy mają średnicę większą niż 15 mm, używając najdłuższej strony guza. Przeprowadzić eutanazję poprzez wdychanie CO₂ w komorze indukcyjnej CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną.
   2. Wyciąć guz z boku zwierzęcia, wykonując nacięcie i delikatnie wycinając guz nożyczkami i kleszczami.
   3. Przenieś tkankę nowotworową do >10 ml odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM), a następnie natychmiast umieść na lodzie.
   4. Przenieść tkankę do naczynia do hodowli tkankowej i spłukać 5 ml DPBS.
   5. Usuń martwicze obszary z guza.
   6. Pokrój tkankę na około 2 x 2 x 2 mm kawałki
   .
   7. Przenieś tkankę do krioprobówek zawierających 20% DMEM, 70% FBS i 10% DMSO.
   8. Przenieś krioprobówki do pojemnika do krioprezerwacji i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
   9. Gdy krioprobówki zostaną schłodzone do temperatury -80 °C, przenieś je do magazynu ciekłego azotu.

2. Drogi inokulacji w badaniach przedklinicznych

1. Podskórna implantacja boku.
   UWAGA: Podskórna implantacja boku może być stosowana w celu ułatwienia i może być pomocna w badaniu wszystkich etapów kaskady przerzutowej.
   1. Użyj rosnących guzów PDX lub kriokonserwowanych guzów PDX do początkowej implantacji boku.
   2. W przypadku rosnących guzów PDX, należy poddać myszy eutanazji przy użyciu metody zatwierdzonej przez IACUC, gdy guzy mają więcej niż 15 mm długości; wyciąć guz i przenieść tkankę nowotworową do odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM) i natychmiast umieścić na lodzie.
   3. W przypadku kriokonserwowanych guzów PDX należy szybko rozmrozić kriokonserwowaną tkankę PDX, zanurzając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   4. Wykonaj kroki 1.2.2-1.2.19.
2. Implantacja ortotopowa przez wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe do mózgu.
   UWAGA: Model ten może być używany do testowania skuteczności leków przekraczających barierę krew-mózg i do badania kolonizacji guza. Ta sekcja odnosi się przede wszystkim do stosowania zestawu do dysocjacji guza (patrz tabela materiałów). Różne typy tkanek wymagają różnych protokołów dysocjacji. Zaleca się, aby użytkownik przetestował i zoptymalizował protokół, aby zmaksymalizować skuteczność dysocjacji.
   1. Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, przy użyciu metody zatwierdzonej przez IACUC, gdy guzy mają więcej niż 15 mm długości.
   2. W sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego chirurgicznie wyciąć guzy PDX i przechowywać w DMEM na lodzie.
   3. Przygotować roztwór dysocjacyjny w odpowiedniej probówce, dodając mieszaninę enzymów do DMEM, jak wskazano w protokole producenta.
   4. Umyj guz w 5 ml DPBS w naczyniu do hodowli tkankowej.
   5. Usuń martwicze obszary z guza.
   6. Pokrój guz na małe kawałki o długości 2-4 mm.
   7. Przenieś kawałki guza do probówki zawierającej mieszankę enzymów.
   8. Podłącz rurkę do dysocjatora tkankowego i uruchom program odpowiedni dla typu tkanki. Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać informacje o odpowiednim programie do uruchomienia i wymaganym czasie dysocjacji.
   9. Po zakończeniu programu przecedź komórki przez sitko o średnicy 70 μm.
   10. Umyj sitko komórkowe 20 ml DMEM.
   11. Odwirować zdysocjowane komórki przy 300 x g przez 7 minut.
   12. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w DPBS.
   13. Policz komórki i rozcieńcz do wymaganego stężenia.
   14. Ustaw ramkę stereotaktyczną zgodnie z instrukcjami producenta i przygotuj poduszkę grzewczą dla myszy. Zdezynfekuj wszystkie obszary 70% etanolem.
   15. Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje.
   16. Przygotuj obszar operacyjny, goląc sierść na głowie myszy, aby odsłonić skórę głowy.
   17. Należy podać myszom odpowiednie leki przeciwbólowe, takie jak jedna dawka 1 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (SR) podawana we wstrzyknięciu podskórnym.
   18. Przenieś mysz do ramki stereotaktycznej. Upewnij się, że mysz gryzie blok gryzienia. Użyj nauszników, aby mocno zabezpieczyć głowę myszy.
       UWAGA: Mysz jest odpowiednio zabezpieczona, jeśli głowa nie porusza się po delikatnym popchnięciu kleszczami.
   19. Zdezynfekuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi peelingami z jodonu powidonu i 70% etanolu.
   20. Wykonaj podłużne nacięcie o długości 5-7 mm na skórze głowy, aby odsłonić czaszkę i cofnąć skórę głowy.
   21. Zeskrob okostną narzędziem chirurgicznym, takim jak kleszcze.
   22. Zlokalizuj bregmę na czaszce.
   23. Umieść igłę ramy stereotaktycznej na górze bregmy i zresetuj współrzędne do 0 lub zanotuj współrzędne na ramieniu.
   24. Przesuń ramię o 1 mm do tyłu (doogonowo) i 1 mm w bok, na prawo od linii środkowej.
   25. Zaznacz to miejsce trwałym markerem. Jeśli na ramieniu znajduje się szczelina na strzykawkę, przymocuj znacznik do szczeliny strzykawki, aby zaznaczyć miejsce.
   26. Wywierć mały otwór w czaszce w tym miejscu. Nie wywieraj zbyt dużego nacisku, aby zapobiec wwiercaniu się w mózg.
   27. Załaduj strzykawkę Hamiltona o pojemności 5 μl, 26 g z 5-10 x 10⁴ ogniwami, w objętości 1-2 μl i przymocuj do ramienia stereotaktycznego.
   28. Powoli wprowadzić igłę strzykawki Hamilton na 2 mm do mózgu.
   29. Rozpocznij wstrzykiwanie komórek z żądaną szybkością, zwykle 0,2-0,5 μl/min.
   30. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę z mózgu.
   31. Wypełnij otwór zadziorów woskiem kostnym.
   32. Zamknij nacięcie szwami chirurgicznymi lub klejem chirurgicznym.
   33. Przenieś mysz z powrotem do klatki i monitoruj jej powrót do zdrowia po znieczuleniu.
   34. Regularnie monitoruj stan zwierząt i poddawaj je eutanazji, gdy zostaną spełnione kryteria humanitarnego punktu końcowego określone w zatwierdzonym protokole.
       UWAGA: Pomyślny wzrost guza w mózgu skutkuje pogorszeniem stanu zwierzęcia, co często objawia się pochyleniem głowy, szorstką sierścią, zgarbionym ciałem, zmrużonymi oczami, zmniejszoną aktywnością i niską oceną kondycji ciała (BCS < 2).
   35. Przeprowadzić sekcję zwłok zwierząt poddanych eutanazji, a następnie analizę histologiczną w celu potwierdzenia obecności guzów w mózgu. Rejestruj czas potrzebny od implantacji do eutanazji.
3. Implantacja modeli PDX metodą iniekcji dosercowej
   UWAGA: Model ten może być używany do badania tropizmu narządów, gdy komórki nowotworowe są w krążeniu. W tej sekcji używany jest również zestaw do dysocjacji guza i wymaga optymalizacji pod kątem typu tkanki.
   1. Wykonaj kroki 2.2.1-2.2.13.
   2. Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje.
   3. Następnie ustaw mysz w pozycji leżącej.
   4. Aby przygotować obszar operacyjny na klatce piersiowej, ogol futro i zdezynfekuj je trzema naprzemiennymi peelingami jodu powidonu i 70% etanolu.
   5. Pobrać 0,5-10 x 10⁵ komórek do strzykawki na igle 28 G, do objętości 100 μl.
      UWAGA: Liczba wymaganych komórek różni się w zależności od agresywności modelu, a optymalna liczba komórek powinna być empirycznie określona dla każdego modelu.
   6. Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia (nieco na lewo od mostka myszy i w połowie odległości między wcięciem mostka a wyrostkiem ksylowym).
   7. Wbić igłę pionowo do myszy w miejscu wstrzyknięcia.
   8. Obserwuj pomyślne wejście do lewej komory przez cofanie się krwi wpływającej do strzykawki. Powoli dozuj komórki do lewej komory, nie przesuwając igły.
   9. Powoli wyciągnij igłę pionowo z myszy.
   10. Nałożyć kawałek sterylnej gazy na miejsce wstrzyknięcia i uciskać przez około 1 minutę, aż krwawienie ustanie, nadal umożliwiając ruchy klatki piersiowej w celu oddychania.
   11. Wyjmij mysz ze znieczulenia i pozwól jej dojść do siebie na rozgrzanej podkładce.
       UWAGA: Pomyślny wzrost guza skutkuje pogorszeniem stanu zwierzęcia, co często objawia się potarganą sierścią, zgarbionym ciałem, zmrużonymi oczami, zmniejszoną aktywnością i niską oceną kondycji ciała (BCS < 2).
   12. Regularnie monitoruj stan zwierząt i poddawaj je eutanazji, gdy zostaną spełnione kryteria humanitarnego punktu końcowego określone w zatwierdzonym protokole.
   13. Przeprowadzić sekcję zwłok w celu zidentyfikowania przerzutów u zwierząt poddanych eutanazji, a następnie analizę histologiczną w celu potwierdzenia obecności guzów w narządzie docelowym. Zapisz czas potrzebny od wstrzyknięcia dosercowego do eutanazji.

Wyniki

Guzy PDX rozmnażane z boku są najłatwiejsze do wszczepienia, monitorowania i wycięcia, i są ogólnie zalecane do początkowego zakładania i rozprzestrzeniania guzów PDX (Rysunek 1). Podczas tworzenia lub rozmnażania guzów PDX rozsądnie jest wszczepiać guzy wielu zwierzętom, ponieważ tempo wchłaniania guza może się różnić i nie każdy fragment guza zawsze będzie przyjmowany przez myszy. Opracowano metody tworzenia i namnażania PDX z przerzutami do OUN bezpośrednio w brain¹³. Jednak metody te są nadal trudniejsze ze względu na niższe wskaźniki przyjmowania, a nowotwory są znacznie trudniejsze do rozmnażania i monitorowania niż implantacja boku.

Jeśli guzy pacjenta nie są łatwo dostępne, przerzuty PDX do OUN można również uzyskać z różnych źródeł, w tym z repozytoriów laboratoriów akademickich lub firm komercyjnych. Po pozyskaniu guzów pierwszym priorytetem byłoby rozmnażanie i kriokonserwacja jak największej ilości materiału, zapewniając zachowanie dużej liczby guzów o niskim pasażu. Gwarantuje to, że dostępny jest materiał wystarczający do przeprowadzenia nieokreślonej liczby kolejnych badań z wykorzystaniem modeli PDX. Podobnie jak unieśmiertelnione linie komórkowe, guzy PDX powinny być kriokonserwowane i używane przy niskiej liczbie pasaży, ponieważ dryf genetyczny powoduje zmiany w fenotypie i genotypie PDX w czasie^12,14,15. Niezależnie od źródła nowotworów PDX, ważne jest wykonywanie częstych badań przesiewowych PDX i kolonii myszy zarówno pod kątem patogenów ludzkich, jak i mysich, takich jak HIV i zapalenie wątroby u ludzi oraz Corynebacterium bovis u myszy. Ograniczy to rozprzestrzenianie się niechcianych patogenów z PDX zarówno na osobę, która się z nimi obchodzi, jak i na inne myszy w badaniu i wiwarium.

Opisane tutaj metody implantacji mogą być używane do badania biologii nowotworów, oceny wielu aspektów kaskady przerzutowej oraz do badań przedklinicznych. Główną zaletą implantacji bocznej jest łatwość monitorowania guza w czasie, ponieważ guzy są widoczne, a jego wzrost można łatwo zmierzyć za pomocą suwmiarki. Ta metoda może być dobrym punktem wyjścia do ustalenia wykonalności docelowego leku. Implantacja wewnątrzczaszkowa jest preferowana, jeśli obecność mikrośrodowiska mózgu jest ważna i może zmienić wzrost lub profil molekularny guza. Ponadto implantacja wewnątrzczaszkowa umieszcza guz za barierą krew-mózg (BBB), co sprawia, że jest ona niezbędna do badań przedklinicznych oceniających skuteczność leków wymaganych do przejścia przez barierę krew-mózg. Jednak trudno jest monitorować wzrost guzów PDX i wymaga obrazowania radiologicznego lub bioluminescencyjnego, jeśli komórki są znakowane. Wiedza o tym, kiedy rozpocząć leczenie farmakologiczne przedklinicznie, wymagałaby albo danych obrazowych do monitorowania wzrostu, albo wiedzy na temat średniego przeżycia myszy z określonym guzem PDX. Co więcej, implantacja wewnątrzczaszkowa omija wszystkie istotne etapy kaskady przerzutowej, dzięki czemu nadaje się tylko do badania skuteczności leków i mikrośrodowiska guza w mózgu. Pomimo różnic w mikrośrodowisku guza, morfologia guzów PDX jest podobna niezależnie od miejsca implantacji, co można zaobserwować w tym guzie PDX (CM04) pochodzącym z przerzutu do mózgu, który pochodzi z guza pierwotnego drobnokomórkowego raka płuc (Ryc. 2). Morfologię drobnokomórkowego raka płuca komórek nowotworowych z małymi jądrami i skąpą cytoplazmą można zaobserwować w guzie boku, guzie wewnątrzczaszkowym i przerzutach do jamy brzusznej wynikających z wstrzyknięcia dosercowego. Co więcej, spontaniczne przerzuty z guzów zagnieżdżonych w boku były już wcześniej obserwowane¹², co sugeruje, że procesy przerzutowe, takie jak wewnątrznaczynienie, wynaczynienie i kolonizacja, mogą być rekapitulowane i badane w guzach boku, co w innym przypadku nie byłoby możliwe w przypadku guzów ortotopowych w mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, obserwuje się, że implantacja boczna jest odpowiednią metodą do badania biologii przerzutów do OUN i prowadzenia badań przedklinicznych.

Wstrzyknięcie dosercowe jest najczęściej używane do badania tropizmu narządów i potencjału przerzutowego nowotworów. Wstrzyknięte komórki nowotworowe musiałyby przejść kilka etapów kaskady przerzutowej, w tym przeżycie krążenia, wynaczynienie i kolonizację miejsca przerzutów. Podobnie jak w przypadku wstrzyknięcia ortotopowego do mózgu, śledzenie postępu przerzutów nowotworowych bez obrazowania radiologicznego lub znakowania komórek może być trudne. Jednak, podobnie jak w przypadku implantacji ortotopowej, udana inokulacja powoduje pogorszenie stanu zwierząt w miarę rozprzestrzeniania się guza. Rysunek 3A pokazuje przerzuty do mózgu po wstrzyknięciu do serca w modelu PDX z przerzutami do OUN, M2, który wywodzi się z czerniaka. Dosercowe wstrzyknięcie guza PDX (CM04) spowodowało przerzuty do jamy brzusznej i wątroby (Ryc. 3B). Inne oceniane narządy, takie jak płuca, nerki i jajniki, nie miały widocznych przerzutów.

Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający ogólny przebieg tworzenia, propagowania i używania PDX w badaniach przedklinicznych. Dla każdej metody inokulacji, etapy kaskady przerzutów są wymienione poniżej każdej metody. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Histologia guzów PDX według różnych metod inokulacji. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) guza PDX z przerzutami do OUN, który wywodzi się z drobnokomórkowego raka płuc (CM04) wszczepionego myszom z obniżoną odpornością trzema metodami, ma podobne cechy patohistologiczne i morfologiczne drobnokomórkowego raka płuc, z małymi jądrami i skąpą cytoplazmą. Panel iniekcji dosercowych wykazuje przerzuty do jamy brzusznej. Gniazda małych komórek i wysoki stosunek jądra do cytoplazmy są widoczne na wszystkich trzech obrazach. Obrazy zostały wykonane za pomocą skanera do slajdów i powiększone do 10x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przerzuty obserwowane po wstrzyknięciu dosercowym. Barwienie H&E tkanek z widocznymi przerzutami podczas oceny sekcji zwłok po wstrzyknięciu dosercowym (A) M2 i (B) CM04. Obrazy zostały wykonane (A) na skanerze do slajdów i powiększone do 1x (po lewej) lub 20x (po prawej) lub (B) na zwykłym mikroskopie przy 10-krotnym powiększeniu. Ten rysunek został zmodyfikowany w stosunku do naszej poprzedniej publikacji¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W niniejszym manuskrypcie szczegółowo opisano metody tworzenia i rozmnażania PDX. Wykazano również trzy różne metody inokulacji, które można wykorzystać do rozpoczęcia badań przedklinicznych podczas oceny przerzutów do OUN. Wybrana metoda powinna zależeć od celów eksperymentu. W niektórych przypadkach korzystne byłoby zastosowanie więcej niż jednej drogi inokulacji. Na przykład podskórna implantacja boku zapewnia proste podejście do badania skuteczności leku na wzrost guza i oceny leku pod kątem jego celu, a także zapewnia wizualizację wielkości guza, którą można łatwo monitorować i mierzyć. Jednak po ustaleniu docelowej wykonalności i właściwości przeciwnowotworowych wzrostu, można przeprowadzić badanie ortotopowe, aby ocenić skuteczność leku biologicznego w przekraczaniu bariery krew-mózg i zbadać jego wpływ w mikrośrodowisku guza mózgu. Ponadto przeżycie jest lepiej oceniane w badaniach ortotopowych i dosercowych.

Iniekcja śródczaszkowa modeli PDX z przerzutami do mózgu jest często modelem przedklinicznym z wyboru ze względu na obecność mikrośrodowiska mózgu i bariery krew-mózg. Jednak badania wykazały, że przerzuty do mózgu mają zdolność modyfikowania bariery krew-mózg, co wpływa na przepuszczalność cząsteczek do guza¹⁶. Te zmiany w BBB nie byłyby odzwierciedlone przez guzy zagnieżdżone wewnątrzczaszkowo, a z tego powodu przedkliniczne badania leków mogą nie w pełni odzwierciedlać odpowiedzi guzów pacjenta. Nawet z tym zastrzeżeniem, wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe pozostaje najlepszą metodą testowania przepuszczalności i skuteczności leków przekraczających barierę krew-mózg w modelach przedklinicznych. Innym wyzwaniem związanym z modelami wewnątrzczaszkowymi jest to, że są one trudne do monitorowania wzrostu guza i wymagają zastosowania technik obrazowania. Transdukcja wirusowa PDX za pomocą markerów fluorescencyjnych lub bioluminescencyjnych jest tradycyjnie stosowana, ale może być trudna do przeprowadzenia. Jednak opracowywanych jest kilka technik obrazowania do stosowania u myszy, które nie wymagają wprowadzania markerów, co może poprawić łatwość monitorowania tych ortotopowych guzów mózgu w badaniach przedklinicznych. Należą do nich technologie obrazowania, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i pozytonowa tomografia emisyjna (PET) oraz mikrotomografia komputerowa (micro-CT). Wreszcie, wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe może nie odzwierciedlać dokładnie mikrośrodowiska przerzutów do OUN poza mózgiem, na przykład w przypadku przerzutów do opon mózgowo-rdzeniowych. W takim przypadku można wykonać wstrzyknięcie do cisterna magna, aby dokładniej odwzorować przerzuty do opon mózgowo-rdzeniowych¹⁷.

Charakterystyka zarówno cech fenotypowych, jak i molekularnych modelu PDX jest istotna dla wyboru najlepszych modeli do badań przedklinicznych. Latencja guza może wynosić od 7 do 140 dni, a wskaźniki przyjmowania mogą być również bardzo zmienne¹². Optymalna liczba zwierząt do wszczepienia implantu i czas rozpoczęcia leczenia musiałyby opierać się na charakterystyce każdego modelu PDX i muszą być określone empirycznie. Co więcej, profil molekularny nowotworów PDX jest również ważny dla wyboru najbardziej reprezentatywnych modeli PDX do badań przedklinicznych. Im bardziej model molekularnie reprezentuje tkankę dawcy, tym bardziej prawdopodobne jest, że będzie predykcyjny w odpowiedzi klinicznej. Kluczowe znaczenie ma również zapewnienie, że cele wybrane na podstawie danych z badań na ludziach są obecne w PDX wybieranych do badań i utrzymują się przez kilka pokoleń, jak wykazano, sukcesja klonalna jest związana z innym profilem genomowym dominującego klonu. W związku z tym profile fenotypowe i molekularne guzów PDX z przerzutami do OUN zostały szeroko scharakteryzowane przez wiele pokoleń¹².

Pomimo wielu zalet stosowania modeli PDX z przerzutami do OUN, istnieje kilka ograniczeń związanych z ich stosowaniem. Po pierwsze, alternatywne mikrośrodowisko guza, a zwłaszcza brak układu odpornościowego, są dobrze udokumentowanymi ograniczeniami modeli PDX¹⁸. Ksenoprzeszczep ludzkiego guza u myszy powoduje zastąpienie ludzkiego zrębu przez zrąb myszy przy każdym kolejnym pasażu, a ludzki zrąb jest na ogół całkowicie zastąpiony po kilku przejściach¹⁹. Jednak różnice w mikrośrodowisku guza nie skutkują dużymi różnicami w profilu molekularnym guzów PDX implantowanych z boku w porównaniu z pierwotnym guzem^{pacjenta 12}, co sugeruje, że modele boczne nadal stanowią dobre modele eksperymentalne do badania przerzutów do OUN. Po drugie, wykorzystanie zwierząt z obniżoną odpornością skutkuje brakiem infiltracji komórek odpornościowych w guzie i ogólną odpowiedzią immunologiczną gospodarza, ograniczając podstawowy sposób, w jaki gospodarz próbuje zwalczać wzrost raka¹². Podczas gdy humanizowane myszy wszczepione ludzkimi komórkami odpornościowymi są dostępne do badania interakcji określonych komórek odpornościowych z guzem, nadal istnieje wiele pytań i kontrowersji dotyczących podejść, metod i interpretacji tych wyników²⁰.

Podczas gdy wykazano, że większość PDX jest genetycznie stabilna, my i inni wykazaliśmy, że w rzadkich przypadkach, nawet przy braku leczenia lub innych zewnętrznych nacisków selekcyjnych, mogą wystąpić zmiany w klonach guzów, takie jak niewielkie przejęcie klonów 12,14,15. Może to spowodować dramatyczne zmiany w profilu molekularnym, co ostatecznie sprawi, że guz nie będzie odzwierciedlał dominujących klonów w guzie pacjenta¹². Podczas gdy PDX wykazujące sukcesję klonalną mogą być wykorzystywane w badaniach przedklinicznych, wiele genów przeznaczonych do celowania (np. Her2) może zostać utraconych wraz z sukcesją klonalną. Dlatego zachęca się do częstych badań przesiewowych modeli PDX w celu ustalenia, czy nadal utrzymują one profil molekularny pożądanego klonu.

Podsumowując, modele PDX stanowią doskonały system modelowy do badania nie tylko przerzutów do OUN, ale także innych typów nowotworów. Opracowanie tych modeli wykazało, że w dużej mierze odzwierciedlają one profil fenotypowy, molekularny i niejednorodność przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego^{u ludzi} 8,9,10,12. Służą one jako skuteczne modele do badania zarówno biologii przerzutów do OUN, jak i służą również jako fizjologicznie istotne modele przedkliniczne, zastępując nadużywane modele linii komórkowych historycznie używane do badań in vivo przerzutów do OUN. Niewątpliwie istnieją różnice między PDX a guzem pacjenta dawcy^12,18. Wiedza o tych różnicach jest ważna dla prawidłowego planowania i realizacji badań przedklinicznych. Wreszcie, wybierając między kilkoma ścieżkami inokulacji, modele PDX są wszechstronne w swoim zastosowaniu, umożliwiając badanie wielu aspektów choroby. Modele PDX bez wątpienia odegrają ważną rolę w pogłębianiu naszej wiedzy na temat przerzutów do OUN i opracowywaniu nowych terapii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła 25G	VWR	BD305122
70 & micro; m Sitko do komórek	VWR	21008-952
Chusteczki 70% etanolu	VWR	470106-486
Wosk kostny	MedVet	W31G-RL
Mysz CIEA NOG	Taconic	NOG-F
DMEM	ThermoFisher	11965092
Ethiqa XR (buprenorfina SR)	MWI	072117
FBS	ThermoFisher
gentleMACS C Tube	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Disocation	Miltenyi	130-095-937
Strzykawka Hamilton	Sigma	20919
Matrigel o obniżonym czynniku wzrostu (GFR)	Corning	354230
Maść okulistyczna	MedVet	PH-PURALUBE-VET
PBS/DPBS	ThermoFisher	14040133
Waciki jodowe Povidone	VWR	15648-906
Ramka stereotaktyczna	Stoelting	51730
Wiertło chirurgiczne	Stoelting	58610
Klej chirurgiczny	MedVet	VG3
Nici chirurgiczne	MedVet	MMV-661-V
Strzykawka	VWR	53548-001
Zestaw do dysocjacji guza	Miltenyi	130-095-929