Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.
Artykuł metodologiczny
Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie aktywności neuronalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki u czuwających zwierząt jest bardzo skutecznym podejściem do badania funkcji obwodów nerwowych w neuronauce systemowej. Jednak wysoka absorbancja i rozpraszanie światła w tkance ssaków ograniczają obrazowanie przyżyciowe głównie do powierzchownych obszarów mózgu, pozostawiając głębokie obszary mózgu, takie jak hipokamp, poza zasięgiem mikroskopii optycznej. W tym filmie pokazujemy przygotowanie i implantację niestandardowego okna obrazowania, aby umożliwić przewlekłe obrazowanie in vivo grzbietowego regionu hipokampa CA1 u myszy zachowujących się jak głowa. Wykonane na zamówienie okienko jest uzupełnione o kaniulę infuzyjną, która umożliwia ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych i leków do obszaru obrazowania. Łącząc ten preparat z obrazowaniem szerokokątnym, przeprowadziliśmy długoterminowe rejestrowanie aktywności neuronalnej za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika wapnia z dużych podzbiorów neuronów u zachowujących się myszy przez kilka tygodni. Wykazaliśmy również przydatność tego preparatu do obrazowania napięcia z rozdzielczością pojedynczego skoku. Wysokowydajne, genetycznie kodowane wskaźniki aktywności neuronalnej i naukowe kamery CMOS pozwoliły na cykliczną wizualizację subkomórkowych szczegółów morfologicznych pojedynczych neuronów w wysokiej rozdzielczości czasowej. Omówiono również zalety i potencjalne ograniczenia opisywanej metody oraz jej kompatybilność z innymi technikami obrazowania.
Wprowadzenie
Hipokamp to kluczowy obszar mózgu odpowiedzialny za uczenie się i pamięć1, a także za nawigację przestrzenną2. Zanik hipokampa jest związany z zaburzeniami neurologicznymi i psychiatrycznymi obejmującymi utratę pamięci i pogorszenie funkcji poznawczych3,4,5. U myszy hipokamp jest bardzo dobrze ugruntowanym modelem do badania przestrzennego, kontekstowego i asocjacyjnego uczenia się oraz tworzenia pamięci na poziomie komórkowym i sieciowym4,5. Mechanistyczne badania uczenia się i pamięci wymagają podłużnego badania struktury i funkcji neuronów u zachowujących się myszy. Obrazowanie fluorescencyjne w połączeniu z genetycznie kodowanymi sondami6 zapewnia bezprecedensowe możliwości rejestrowania dynamiki napięcia membrany7,8, calcium transients9, oraz zmiany strukturalne10 na dużych podzbiorach neuronów wewnątrzżyciowych. Jednak optyczny dostęp do hipokampa u myszy jest utrudniony przez korę, która może osiągnąć ponad 1 mm grubości. Tutaj opisaliśmy procedurę montażu wykonanego na zamówienie urządzenia do obrazowania i jego przewlekłego wszczepienia do głowy myszy w celu długotrwałego dostępu optycznego do podregionu CA1 grzbietowego hipokampa u zachowujących się myszy. Kaniula infuzyjna zintegrowana z implantem obrazowym umożliwia podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do neuronów w polu widzenia. Opisany preparat w połączeniu z mikroskopią szerokokątną umożliwia powtarzalne obrazowanie dużych podzbiorów neuronów u zachowujących się myszy w długich okresach czasu. Wykorzystaliśmy ten preparat do ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia i napięcia w regionie CA1 hipokampa poprzez celowane wstrzyknięcie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) do rejestracji aktywności neuronalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki. Przeprowadziliśmy również podłużne obrazowanie wapnia odpowiednich podzbiorów neuronów w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej u zachowujących się zwierząt. Ponadto preparat ten jest kompatybilny z mikroskopią wielofotonową i mikroendoskopią, co jeszcze bardziej rozszerza zestaw technik obrazowania do badania sieci neuronalnych na poziomie komórkowym i subkomórkowym u zachowujących się myszy. Opisaliśmy krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów z protokołem. Omówiliśmy również możliwe pułapki i ograniczenia metody.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Westlake.
1. Montaż implantu
UWAGA: Montaż implantu obrazującego jest technicznie prosty i wymaga jedynie produktów dostępnych w handlu (Rycina 1, patrz również Tabela materiałów). Płytki głowowe mogą zostać wykonane w lokalnym warsztacie mechanicznym z płyt ze stali nierdzewnej lub tytanu). Sugerujemy przygotowanie zapasu w pełni zmontowanych implantów przed rozpoczęciem zabiegów chirurgicznych. Po zakończeniu eksperymentów in vivo implanty można odzyskać i wykorzystać wielokrotnie. W niektórych przypadkach może być konieczne jedynie ponowne przymocowanie kaniuli infuzyjnej poprzez lutowanie lub wymiana szkiełka przykrywkowego.
- Przygotuj wszystkie sześć kluczowych komponentów sprzętowych do montażu i instalacji implantów obrazujących (Rycina 1).
Rycina 1: Sześć kluczowych komponentów sprzętowych do montażu i instalacji implantu obrazującego. (A) Kanula zastępcza. (B) Kanula prowadząca. (C) Kanula obrazująca. (D) Szkiełko podstawowe. (E) Płytka mocowana do czaszki. (F) Kanula wewnętrzna. Pasek skali: 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Włącz urządzenie do lutowania i rozgrzej je do wymaganej temperatury.
UWAGA: Temperatura zależy od rodzaju użytego spoiwa lutowniczego. - Wyszlifuj powierzchnię boczną kaniuli obrazującej za pomocą drobnoziarnistego papieru ściernego, aby usunąć warstwę tlenków i tym samym ułatwić silniejsze lutowanie.
- Ustaw pozycję kaniuli obrazującej oraz kaniuli wstrzykującej (kaniuli prowadzącej z włożoną kaniulą zastępczą), korzystając z uchwytów pomocniczych (Rysunek 2A,B).
- Za pomocą strzykawki z igłą nanieś niewielką ilość odpowiedniego topnika w miejsce połączenia kaniuli obrazującej i wstrzykującej na 5 sekund, a następnie usuń kroplę.
UWAGA: W tym przygotowaniu zastosowano dostępny w handlu topnik, który według specyfikacji producenta służy do lutowania elementów ze stali nierdzewnej, ponieważ kaniule obrazujące i infuzyjne są wykonane ze stali nierdzewnej. W przypadku zastosowania innych materiałów do produkcji kaniul, użytkownik końcowy powinien dobrać topnik umożliwiający lutowanie wybranego materiału. - Roztop spoiwo lutownicze i nanieś je w miejsce połączenia poddane działaniu topnika (Rysunek 2).
UWAGA: Należy unikać nadmiaru spoiwa lutowniczego, ponieważ wymusiłoby to niepotrzebnie większą kraniotomię podczas operacji.
Rycina 2: Schemat montażu kaniuli iniekcyjnej, składającej się z kaniuli prowadzącej z włożoną kaniulą zastępczą, wraz z kaniulą obrazującą. (A) Kąt między kaniulą iniekcyjną a kaniulą obrazującą powinien wynosić około 45 stopni. (B) Końcówka kaniuli iniekcyjnej powinna znajdować się dokładnie na krawędzi kaniuli obrazującej. (C) Odpowiednia wielkość cyny lutowniczej użytej do lutowania kaniuli obrazującej i iniekcyjnej (czerwona linia wskazuje obrys kropli cyny). (D) Nieodpowiednia wielkość cyny lutowniczej, której należy unikać podczas przygotowania implantu (czerwona linia wskazuje obrys kropli cyny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Odczekać do ostygnięcia cyny lutowniczej. Zazwyczaj trwa to kilka sekund.
- Potwierdzić, że kaniula iniekcyjna nie jest zablokowana, wkładając kaniulę atrapy z obu stron.
- Nanieść utwardzany promieniami UV klej optyczny na dolną stronę kaniuli obrazującej, używając wykałaczki lub igły strzykawki 26 G.
- Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie umieścić szkiełko podstawowe o rozmiarze odpowiadającym kaniuli obrazującej.
UWAGA: Pozycjonowanie szkiełka musi zostać wykonane precyzyjnie na kaniuli obrazującej, bez nadmiernego przesuwania szkiełka po zetknięciu się z klejem optycznym. W przeciwnym razie szkiełko ulegnie zabrudzeniu, co obniży jakość obrazowania. - Utwardzać klej przez co najmniej godzinę za pomocą promieniowania UV o długości fali 350-400 nm z zastosowaniem standardowej przenośnej lampy UV.
UWAGA: Stosowany klej musi być optycznie przezroczysty. W przeciwnym razie pogorszy to jakość okna obrazowania.
OSTROŻNIE: Aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami, należy nosić okulary z filtrem UV, rękawiczki oraz fartuch laboratoryjny. - Przemyć kaniulę w 70% etanolu, wysuszyć na powietrzu i przechowywać w sterylnym pojemniku do czasu operacji.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby szkiełko podstawowe pozostało jak najczystsze i nienaruszone. Stosowany klej optyczny jest stabilny chemicznie w 70% etanolu.
2. Implantacja okna
- Kroki przygotowawcze przed operacją
- Wszystkie instrumenty chirurgiczne należy wysterylizować w autoklawie.
- W dwóch oddzielnych szalkach Petriego należy przygotować 1x PBS oraz 70% etanol.
- Opcjonalnie: Przed rozpoczęciem procedury chirurgicznej należy zdezynfekować obszar operacyjny światłem UV przez co najmniej 20 minut.
UWAGA: Przeprowadzenie zabiegu w możliwie najbardziej sterylnych warunkach pozwoli na uzyskanie trwałych i stabilnych (nawet do 6 miesięcy) okien czaszkowych przykrytych szkłem. Zanieczyszczenie może w większości przypadków prowadzić do zmniejszenia przejrzystości okna lub silnego stanu zapalnego.
- Procedura chirurgiczna
- Bezpośrednio przed operacją należy wysterylizować obszar chirurgiczny 70% etanolem.
- Należy zważyć zwierzę i podać podskórnie przedoperacyjną dawkę leku przeciwbólowego zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem dotyczącym zwierząt.
- Myszy podaje się znieczulenie izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% do podtrzymania, przepływ powietrza 0,3-0,5 L/min). Należy zastosować technikę ucisku ogona i palca, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni oszołomione. Przez cały czas trwania procedury należy monitorować parametry życiowe zwierzęcia, takie jak oddychanie, SpO2 i tętno.
- Za pomocą trymera lub kremu do depilacji należy usunąć sierść z karku aż do oczu.
- Myszy umieszcza się w aparacie stereotaktycznym na podgrzewaczu chirurgicznym (utrzymując 37 °C). Głowę należy unieruchomić za pomocą prętów usznych. Należy lekko poruszyć głową we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że jest ona stabilnie zamocowana.
- Należy zastosować maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu gałek ocznych zwierzęcia podczas operacji.
- Przed wykonaniem nacięcia miejsce operacyjne należy wysterylizować betadyną, a następnie trzykrotnie 70% etanolem.
- Usuwa się skórę z górnej części czaszki, zaczynając od cięcia poziomego wzdłuż podstawy głowy, następnie wykonuje się dwa cięcia w kierunku rostralnym, niemal do powiek, a następnie dwa cięcia skośne zbiegające się w linii środkowej.
- Za pomocą dwóch sterylnych patyczków bawełnianych należy odsunąć tkankę łączną oraz mięśnie karku do krawędzi czaszki.
UWAGA: Podczas manipulacji należy starać się nie uszkodzić naczyń krwionośnych (zwłaszcza tych ukrytych w mięśniach). - Aby uniknąć nadmiernego bólu, na powierzchnię okostnej należy nanieść kroplę roztworu lidokainy (~0,1 mL) na 2 minuty. Opcjonalnie, aby zmniejszyć obrzęk mózgu po usunięciu fragmentu czaszki, można podać podskórnie 0,1 mL 1% deksametazonu.
- Całą odsłoniętą powierzchnię czaszki należy delikatnie zeskrobać skalpelem, aby stworzyć suchą i chropowatą powierzchnię, co zapewni lepszą przyczepność kleju i cementu dentystycznego, a w konsekwencji trwałość implantu.
- Koniec igły zamontowanej na stacji stereotaktycznej należy umieścić na bregma i ustawić wszystkie trzy współrzędne (AP: przednio-tylna; ML: przyśrodkowo-boczna; DV: grzbietowo-brzuszna) na 0.
- Koniec igły należy umieścić na lambda i sprawdzić, czy współrzędna AP wynosi 0 (potwierdzenie pionowej pozycji głowy) oraz czy współrzędna ML wynosi 0 (potwierdzenie poziomego ustawienia głowy). Jeśli nie, należy regulować odpowiednie pokrętła stacji stereotaktycznej, aż obie współrzędne AP i ML znajdą się w przedziale 0,1 mm.
- Należy przesunąć koniec igły, aby znaleźć odpowiednie punkty do kraniotomii i zaznaczyć ich położenie na czaszce za pomocą cienkiego markera. W przypadku implantacji w hipokampie wyznacza się 4 punkty o następujących współrzędnych (AP: -0,68, ML: -2,0) (AP: -3,68, ML: -2,0) (AP: -2,18, ML: -0,5) oraz (AP: -2,18, ML: -3,5)11, a także (AP: -4,0, ML: -2,0) dla najbardziej kadalnego punktu kaniuli iniekcyjnej.
UWAGA: Marker używany w tym kroku musi zostać wysterylizowany światłem UV przez co najmniej godzinę przed operacją. Podane tutaj współrzędne dotyczą myszy C57BL/6J w wieku 6-8 tygodni. Współrzędne mogą się różnić w zależności od wieku lub szczepu myszy. - Na podstawie czterech zaznaczonych punktów należy narysować okrąg, a także obrys obszaru kaniuli iniekcyjnej po stronie kadalnej okręgu (Rysunek 3).
- Używając wiertarki pneumatycznej z prędkością 10 000 rpm, delikatnie „odrysuj” linię zaznaczoną na czaszce.
- Wierć w czaszce do momentu, aż pozostanie bardzo cienka warstwa kości, która w centralnej części zazwyczaj zaczyna drgać pod wpływem delikatnego dotyku.
- Nanieś kroplę sterylnego 1x PBS na środek kraniotomii, a następnie podnieś płat kostny z czaszki za pomocą pęsety z bardzo cienką końcówką lub dwóch igieł 26 G, zbliżając je z przeciwnych stron.
UWAGA: PBS ułatwi usunięcie fragmentu czaszki i zapobiegnie ewentualnemu krwawieniu opony twardej12. - Nanieś PBS, a następnie kilkakrotnie wykonaj delikatną aspirację za pomocą tępej igły 26G, aby oczyścić powierzchnię opony twardej.
- Delikatnie usuń oponę twardą, stosując aspirację lub nożyczki okulistyczne. Zastosuj delikatne ssanie (~-60kPa), aby usunąć korę mózgową oraz ciało modzelowate nad hipokampem.
UWAGA: Kora często ma bardziej żółty kolor niż ciało modzelowate, a ciało modzelowate jest zazwyczaj bielsze od hipokampa. Ciało modzelowate jest zazwyczaj łatwe do rozróżnienia dzięki włóknom neuronalnym biegnącym w kierunku pionowym i poziomym podczas obserwacji z góry (Rycina 3).
Rysunek 3: Współrzędne stereotaktyczne lokalizacji hipokampa oraz proces ablacji mózgu. (A) Cztery współrzędne krawędzi obszaru kraniotomii. (B) Cały obszar kraniotomii. (C-E) Reprezentatywne obrazy uzyskane podczas operacji (po lewej) oraz ich schemat (po prawej) wskazujący różne kolory i kierunki włókien nerwowych (A) kory mózgowej, (B) ciała modzelowatego oraz (C) hipokampa widocznego podczas ablacji kory. Pasek skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Krwawienie na tym etapie wpłynie na widoczność tkanki mózgowej w otworze trepanacyjnym. Należy zastosować 1x PBS, a następnie delikatnie odessać krew, aspirując korę.
UWAGA: Ciągłe krwawienie podczas tego kroku jest nieuniknione i w pewnym stopniu świadczy o prawidłowym ciśnieniu krwi. W przeciwieństwie do implantacji okna obrazującego korę, obecność krwi pod oknem optycznym jest dopuszczalna, ponieważ zostanie ona usunięta kilka dni po operacji. Optymalne jest wprowadzenie kaniuli obrazującej do powstałej jamie jak najszybciej po ablacji kory. - Jeśli otwór trepanacyjny jest większy od kaniuli obrazującej o <0,5 mm, można w pewnym stopniu skorygować instalację kaniuli, stosując dodatkowe uszczelnienie Kwik Sil przed utrwaleniem implantu za pomocą SuperBond.
- Jeśli otwór trepanacyjny jest mniejszy od kaniuli obrazującej o <0,5 mm, można w pewnym stopniu skorygować procedurę chirurgiczną, przycinając krawędź otworu trepanacyjnego za pomocą precyzyjnej pęsety lub nożyczek oftalmologicznych, ponieważ pozostała kość na krawędzi otworu jest cieńsza niż sama czaszka w wyniku wiercenia.
UWAGA: Trepanacje, w których różnica przekracza powyższy zakres 0,5 mm, nie mogą zostać skorygowane. W takich przypadkach należy podjąć odpowiednie działania zgodnie z procedurą eutanazji opisaną w protokole dotyczącym zwierząt.
- Ostrożnie wprowadź implant do otworu trepanacyjnego.
- Mocno naciśnij górną część implantu za pomocą igły w kształcie litery L, aby ustawić okno optyczne implantu jak najbliżej odsłoniętej powierzchni hipokampa. Wielokrotnie aplikuj PBS na czaszkę wokół implantu, a następnie odsysaj krew, aby w maksymalnym stopniu usunąć ją podczas wprowadzania implantu. Następnie nałóż cienką warstwę Kwik Sil pomiędzy implant a czaszkę, aby zapobiec przenikaniu cementu stomatologicznego pod czaszkę (Rysunek 4).
- Upewnij się, że okno optyczne implantu jest umieszczone bezpośrednio przy hipokampie, aby uniknąć gromadzenia się krwi lub innych płynów pod spodem.
UWAGA: Kluczowym punktem jest zapewnienie, aby szkiełko osłonowe kaniuli obrazującej przylegało bezpośrednio do hipokampa, co może wymagać delikatnego nacisku na górną część kaniuli podczas procesu instalacji i uszczelniania. To, czy górna strona kaniuli obrazującej jest równoległa do czaszki, nie ma krytycznego znaczenia dla końcowego dostępu optycznego, o ile okno optyczne przylega do hipokampa. - Biorąc pod uwagę średnią grubość kory nad obszarem CA1, pozostaw górną powierzchnię kaniuli obrazującej ok. 0.5 mm powyżej powierzchni czaszki, aby ułatwić przymocowanie kaniuli do czaszki (Rysunek 4).
- Upewnij się, że okno optyczne implantu jest umieszczone bezpośrednio przy hipokampie, aby uniknąć gromadzenia się krwi lub innych płynów pod spodem.
- Po utwardzeniu Kwik Sil, co zazwyczaj trwa nie więcej niż ok. 1 min, równomiernie nanieś Super-Bond C&B na powierzchnię czaszki, powierzchnię Kwik-Sil oraz górną powierzchnię implantu.
- Po utwardzeniu Super-Bond C&B, nanieś żywicę do baz protetycznych powyżej Super-Bond C&B, a także na skórę wokół nacięcia wykonanego na początku operacji.
UWAGA: Alternatywne rodzaje cementu są dostępne u wielu dostawców. Należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami producenta. - Po utwardzeniu żywicy do baz protetycznych, umieść płytkę głowową na żywicy wokół implantu i ustaw ją koncentrycznie względem kaniuli obrazującej. Nanieś więcej żywicy do baz protetycznych wokół i nad płytką głowową, aby utrwalić jej pozycję. Pozostaw do utwardzenia na kilka minut.
- Unikaj tworzenia grubej warstwy cementu wokół kaniuli, aby zapewnić lepszy dostęp obiektywu do okna obrazującego (Rysunek 4).
Rycina 4: Schemat implantacji okna w widoku (A) czołowym i (B) strzałkowym. (a) Płytka mocująca; (b) Żywica do baz protetycznych; (c) Superbond; (d) Kwik-Sil; (e) Kanula obrazująca; (f) Kanula do iniekcji; (g) Cyna lutownicza. (C): Mysz z zainstalowanym implantem po zabiegu chirurgicznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Rozcieńcz żywicę do baz protetycznych, aby zmniejszyć jej lepkość, co umożliwi wypełnienie zagłębień trudnodostępnych dla aplikatora.
- Nad oknem delikatnie umieść izolacyjną taśmę gumową, aby chronić je przed ewentualnym zanieczyszczeniem ściółką dla zwierząt.
- Po zakończeniu operacji wstrzyknij podskórnie lek przeciwzapalny, aby zapobiec wystąpieniu odpowiedzi zapalnej.
- Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce do czasu wybudzenia z narkozy.
- Przez 72 h po operacji monitoruj stan zdrowia myszy, obserwując jej ogólne zachowanie. Przez dwa do trzech dni po zabiegu, co 24 godziny, wstrzykuj podskórnie lek przeciwzapalny i przeciwbólowy, aby uśmierzyć ból i zmniejszyć odpowiedź zapalną.
UWAGA: W opiece pooperacyjnej możliwe jest zastosowanie alternatywnych procedur monitorowania, leków oraz dawek; dokładną procedurę należy sprawdzić w protokole dotyczącym zwierząt zatwierdzonym przez IUCAC. - Sprawdź okno 5-7 dni po operacji, aby zaobserwować unaczynienie pod oknem. W przypadku uzyskania przejrzystego okna zwierzę jest gotowe do iniekcji wirusa.
3. Iniekcja wirusa
UWAGA: Iniekcję wirusa przeprowadza się zazwyczaj od 5 do 7 dni po operacji. Przed podaniem wirusa należy potwierdzić, że okno obrazujące jest przejrzyste i umożliwia obserwację naczyń krwionośnych mózgu (Rycina 5). W niektórych przypadkach oczyszczenie okna może potrwać do 14–16 dni, co jest dopuszczalne, o ile nie stwierdzono stanu zapalnego mózgu.
Rysunek 5: Reprezentatywne zdjęcie okna optycznego (A) przed i (B) po wstrzyknięciu wirusa z dodatkiem barwnika FastGreen. Strzałka wskazuje tę samą strukturę naczyniową. Pasek skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
- Do probówki PCR dodać roztwór zapasowy barwnika Fast-green do roztworu wirusa rozcieńczonego do pożądanego miana w stosunku 1:9.
UWAGA: Barwnik Fast-green dodaje się w celu ułatwienia wizualizacji roztworu wirusa podczas wstrzykiwania. - Połączyć rurkę polietylenową ze strzykawką, a następnie wypełnić rurkę olejem mineralnym za pomocą pompy strzykawkowej.
- Połączyć kaniulę wewnętrzną z drugim końcem rurki, a następnie kilka razy wprowadzić i wycofać olej mineralny, aby upewnić się, że kaniula wewnętrzna nie jest zapchana.
- Zanestetyzować zwierzę izofluranem (4% dla indukcji, 1,5-2% dla podtrzymania, przepływ powietrza 0,3-0,5 L/min), unieruchomić głowę w aparacie stereotaktycznym na podkładce grzewczej (utrzymując 37 °C) i nałożyć maść do oczu.
- Pobrać 600 nL roztworu wirusa, wyjąć kaniulę zastępczą i wprowadzić kaniulę wewnętrzną połączoną ze strzykawką do iniekcji do kaniuli prowadzącej, a następnie wprowadzać wirusa z prędkością 50 nL/min przez łącznie 10 minut.
UWAGA: Sprawdzić pod stereomikroskopem, czy barwnik jest widoczny przez okno, aby potwierdzić pomyślne wstrzyknięcie wirusa (Rycina 5). - Po wstrzyknięciu pozostawić kaniulę wewnętrzną podłączoną przez 10 minut, aby umożliwić rozprzestrzenienie się wirusa pod oknem.
- Ostrożnie wyjąć kaniulę wewnętrzną z kaniuli prowadzącej i ponownie założyć kaniulę zastępczą.
- Umieścić zwierzę w ciepłej klatce do czasu wybudzenia z narkozy.
UWAGA: Zazwyczaj myszy są gotowe do obrazowania w ciągu 10-20 dni po iniekcji wirusa. Poziom i czas ekspresji zależą od serotypu wirusa oraz promotora wykorzystanego do sterowania ekspresją genu.
4. Obrazowanie czuwających myszy pod mikroskopem szerokopolowym.
UWAGA: Przygotowana płytka głowowa zapewnia nadzwyczajną stabilność implantu obrazującego, co pozwala na podłużne obrazowanie u czuwających i wykazujących aktywność behawioralną myszy przy minimalnych artefaktach ruchowych.
- Zanurz mysz w 4% izofluranie przez kilka minut, przymocuj płytkę głowową do widelca głowowego, a następnie przymocuj widelec głowowy do bieżni.
UWAGA: Widelec głowowy i bieżnia zostały dostosowane do płytki głowowej użytej w tym badaniu; odpowiednie pliki CAD znajdują się w Materiałach Wspierających. Indukcja znieczulenia myszy przed fiksacją głowy jest opcjonalna, ponieważ możliwe jest przyzwyczajenie zwierzęcia do tej procedury. - Przesuń bieżnię pod stolik mikroskopu i ustaw okno optyczne pod obiektywem.
- Użyj obiektywu o niskim powiększeniu, aby znaleźć optymalne pole widzenia (FOV) dla obrazowania funkcjonalnego, a następnie przełącz się na obiektyw o wyższej aperturze numerycznej (NA), aby zarejestrować aktywność neuronalną z rozdzielczością pojedynczych komórek.
UWAGA: Jeśli kaniula do iniekcji wciąż stanowi przeszkodę uniemożliwiającą obiektywowi osiągnięcie odległości roboczej, użyj cęgów drutowych, aby odciąć kaniulę od płytki głowowej.
Wyniki
Obrazowanie in vivo aktywności neuronalnej z użyciem genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia. Średnio obrazowanie in vivo rozpoczyna się 3–4 tygodnie po implantacji, jeśli osiągnięto wystarczający poziom ekspresji transgenu. Do tego czasu obrzęk mózgu i krwotoki zazwyczaj całkowicie ustępują, a naczynia krwionośne mózgu mogą być łatwo obserwowane przez okno optyczne. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy opisany preparat do wielokrotnych rejestracji aktywności neuronalnej w grzbietowej części obszaru CA1 hipokampa u myszy w stanie behawioralnym przy użyciu szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego. Do rejestracji aktywności neuronalnej użyliśmy jasnego genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia o nazwie NCaMP713, który wykazuje podobną czułość na wapń i rozdzielczość czasową co GCaMP6s14. Aby uzyskać ekspresję wskaźnika NCaMP7 w hipokampie, wstrzyknęliśmy wirusa rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 za pomocą kaniuli infuzyjnej i rozpoczęliśmy obrazowanie podłużne 14 dni po iniekcji. Do rejestracji aktywności neuronalnej użyliśmy obiektywu powietrznego 10x NA 0.3 oraz kamery Hamamatsu OrcaFusion sCMOS, która umożliwiła obrazowanie w polu widzenia (FOV) o rozmiarach ~1.5x1.5 mm z częstotliwością do 100 Hz. Fluorescencja zielona była wzbudzana za pomocą dostępnej komercyjnie diody LED 470 nm przy użyciu standardowego zestawu filtrów GFP. Średnia głębokość obrazowania osiągnięta w kanale zielonym wynosi około 50–120 µm, co pozwala na rejestrację aktywności neuronalnej głównie w stratum oriens i stratum pyramidale. Głębokość obrazowania w kanałach bliskiej podczerwieni może wynosić do 200 µm, docierając do głębszych warstw hipokampa8. Średni czas rejestracji na jedno FOV wynosił 6–12 min, choć możliwe są znacznie dłuższe sesje obrazowania, ponieważ NCaMP7 charakteryzuje się niezwykle wysoką fotostabilnością, a nie zaobserwowano wykrywalnej fototoksyczności (Rycina 6).
Rysunek 6: Rejestracja aktywności neuronalnej w neuronach hipokampa z wykorzystaniem genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia o zielonej fluorescencji. (A) Wybrany obszar widzenia (FOV) obrazowany za pomocą szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego w kanale zielonym. (B) 15 obszarów zainteresowania (ROI) odpowiadających pojedynczym neuronom pokazanym na A, wybranych na podstawie projekcji odchylenia standardowego całego zapisu. (C) Reprezentatywne ślady fluorescencji z pojedynczych prób dla 15 wybranych neuronów z B. (D) Reprezentatywne powiększenie 2 śladów wapniowych pokazanych w odpowiadających im kolorowych polach na C. Pasek skali, 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
W celu uzyskania śladów fluorescencji, obszary zainteresowania (ROI) odpowiadające somatom neuronów zostały wysegmentowane ręcznie i przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageJ. Przed analizą obrazów korekcja ruchu nie była wymagana, co jest typowe dla procedur po zapisie u zwierząt budzących się, ponieważ pozyskane zbiory danych nie wykazywały artefaktów ruchu dzięki wysokiej stabilności implantu obrazującego. Reprezentatywny zapis optyczny aktywności neuronów z hipokampa u budzącej się, wykazującej aktywność myszy w pojedynczej próbie przedstawiono na Ryc. 6. Ręcznie wybrano 15 ROI odpowiadających somatom neuronów z tego samego pola widzenia (FOV) pokazanego na Ryc. 6B, a ślady fluorescencji dla pojedynczej próby w każdym ROI przedstawiono na Ryc. 6C. Ryc. 6D przedstawia dwa reprezentatywne fragmenty śladów fluorescencji z dwóch różnych ROI. Przeprowadzono 4 kolejne sesje obrazowania tego samego FOV w odstępach 3-dniowych. Możliwa była identyfikacja i obrazowanie tych samych neuronów w określonych FOV przez co najmniej dwa tygodnie (w niniejszym badaniu nie przeprowadzono dłuższych sesji obrazowania, jednak ta sama metoda była wcześniej stosowana w badaniach obrazowania u myszy trwających do 6 miesięcy7; Ryc. 7). W badaniu tym zastosowano wektor AAV/DJ-CAG, który zapewniał silną ekspresję badanego genu nawet 21 dni po dostarczeniu wirusa (Ryc. uzupełniająca 1). Ciągła ekspresja utrudniała długoterminową identyfikację tych samych neuronów ze względu na zwiększone tło fluorescencyjne i pojawienie się nowych neuronów wykazujących ekspresję wskaźnika wapnia. W związku z tym wybór serotypu AAV oraz promotora sterującego ekspresją genu docelowego powinien być jednym z kluczowych aspektów podczas projektowania eksperymentu, szczególnie jeśli wymagane jest podłużne obrazowanie tego samego podzbioru neuronów. Jakość obrazowania pozwoliła na rozdzielenie dendrytów proksymalnych oraz wizualizację naczyń krwionośnych.
Rysunek 7: Sekwencja obrazów z czterech różnych pól widzenia (FOV) z obszaru hipokampa śledzonych przez 12 dni. Zwierzęciu wszczepiono okno w dniu 0, a w dniu 7 wstrzyknięto wirusa rAAV/DJ-CAG-NCaMP7. Groty strzałek wskazują neuron śledzony w obrębie FOV. Paski skali: 80 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Obrazowanie in vivo aktywności neuronalnej z wykorzystaniem genetycznie kodowanego czujnika napięcia.
W niniejszym badaniu zastosowaliśmy również nowy genetycznie kodowany czujnik napięcia o nazwie SomArchon7, który umożliwia obrazowanie napięcia z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego kolca u zwierząt wykazujących aktywność behawioralną7,8. Aby uzyskać ekspresję SomArchon, wstrzyknęliśmy wirusa rAAV/DJ-CAG-SomArchon za pomocą kaniuli infuzyjnej i przeprowadziliśmy obrazowanie napięcia u myszy z unieruchomioną głową podczas zachowań kilka dni po iniekcji. Do rejestracji aktywności neuronalnej użyliśmy obiektywu 40x NA 0.8 oraz kamery Hamamatsu OrcaFusion sCMOS, co pozwoliło nam na obrazowanie pola widzenia (FOV) 150x40 µm przy częstotliwości akwizycji do 830 Hz. Białko GFP, będące częścią konstruktu SomArchon w celu ułatwienia wizualizacji ekspresji w widzialnym zakresie widma, można łatwo obrazować w kanale zielonym (pobudzenie LED 470/20 nm, emisja 525/50 nm), aby zlokalizować komórki interesujące nas w obrazowaniu napięcia. Optyczne pomiary napięcia przeprowadzono w kanale bliskiej podczerwieni (pobudzenie laserem 637 nm przy 3.4 W/mm2, emisja long pass 665 nm) z binningiem 4 x 4 przy częstotliwości akwizycji 830 Hz. Zarejestrowaliśmy spontaniczną aktywność neuronu hipokampa u budzącej się myszy ze średnim stosunkiem sygnału do szumu (SNR) wynoszącym 7 na potencjał czynnościowy (Rycina 8).
Rysunek 8: Rejestracja aktywności neuronalnej w neuronach hipokampa z wykorzystaniem genetycznie kodowanego wskaźnika napięcia SomArchon fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni. (A) Wybrany obszar widzenia (FOV) obrazowany za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu szerokopolowego w kanale bliskiej podczerwieni. (B) Ślad fluorescencji z pojedynczej próby dla neuronu z panelu A. (C) Reprezentatywne powiększenie śladu napięcia w odpowiadającym mu obszarze zaznaczonym ramką w panelu B. Pasek skali: 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Histologia
Po zakończeniu badania obrazowania funkcjonalnego przeprowadza się analizę pośmiertną w celu potwierdzenia prawidłowego umieszczenia implantu, obszaru ekspresji wirusa oraz lokalizacji białka zainteresowania w obrazowanych neuronach. Do histologicznej weryfikacji ekspresji wirusa i położenia implantu wykorzystano przekroje czołowe mózgu utrwalonego w PFA, które badano pod fluorescencyjnym mikroskopem szerokopolowym (Rysunek 9A, C). Do pozyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości pojedynczych neuronów wykazujących ekspresję wskaźnika wapnia, a także wskaźnika napięcia, użyto mikroskopu konfokalnego (Rysunek 9B, D). Do wizualizacji ogólnej morfologii skrawka mózgu zastosowano barwienie DAPI. Dodatkowo skrawki mózgu można ocenić za pomocą immunohistochemii w celu weryfikacji astrogliozy lub gliozy wywołanej implantacją okna i ekspresją wirusową. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że procedura ta nie wywołała zauważalnej gliozy7.
Rycina 9: Weryfikacja histologiczna położenia okna optycznego i ekspresji wirusa. (A) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny koronalnego przekroju mózgu pokazujący umiejscowienie okna optycznego u myszy wykazującej ekspresję NCaMP. Pasek skali: 1 mm. (B) Reprezentatywny obraz konfokalny neuronów wykazujących ekspresję wskaźników NCaMP7. Pasek skali: 25 µm. (C) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny koronalnego przekroju mózgu pokazujący umiejscowienie okna optycznego u myszy wykazującej ekspresję SomArchon. Pasek skali: 1 mm. (D) Reprezentatywny obraz konfokalny neuronów wykazujących ekspresję wskaźników SomArchon. Pasek skali: 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 1: Analiza ilościowa względnej intensywności fluorescencji w zależności od czasu ekspresji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Tutaj opisujemy metodę długoterminowego obrazowania regionu CA1 hipokampa u zachowujących się myszy. Metoda opiera się na chronicznym wszczepianiu specjalnie dostosowanego okna obrazowania, które umożliwia również celowane podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do interesujących neuronów. Niniejszy protokół składa się z czterech głównych części: i) montażu implantu obrazowego; ii) instalacja implantu do obrazowania; iii) wstrzyknięcie wirusa za pomocą implantu do obrazowania; iv) obrazowanie funkcjonalne u zachowujących się myszy. Poniżej opisujemy i omawiamy krytyczne kroki w protokole, rozwiązywanie problemów, modyfikacje i ograniczenia metody. Omówiono również znaczenie metody i jej potencjalne alternatywne zastosowania.
W opisanym protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, które są dość ważne dla udanej operacji: (i) przygotowanie wysokiej jakości implantu obrazowego; (ii) sterylne warunki chirurgiczne; (iii) aspiracja kory mózgowej; (iv) precyzyjne umieszczenie implantu do obrazowania; (v) wstrzyknięcie wirusa. Jak wskazuje krok 1.6, nadmiar cyny lutowniczej wymagałby większej kraniotomii, a tym samym zwiększa ryzyko stanu zapalnego. Bardzo ważne jest również, aby podczas mocowania szkła nakrywkowego do kaniuli obrazowej użyć odpowiedniej ilości kleju optycznego, jak wskazano w kroku 1.11, ponieważ niewystarczająca ilość może spowodować wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego do kaniuli obrazowej i jej zmętnienie. Z drugiej strony, nadmiar kleju optycznego może skutkować zmniejszoną przezroczystością szklanego okna. Ewentualne zanieczyszczenie implantu obrazowego może spowodować aktywną proliferację tkanki łącznej pod oknem optycznym i/lub ciężki stan zapalny, który doprowadzi do przedwczesnego zakończenia eksperymentu. Dlatego obrazowanie, montaż implantu i przygotowanie przed zabiegiem jest prawie tak samo ważne, jak sam zabieg chirurgiczny.
Podczas operacji część kory pod kraniotomią jest ablowana przez delikatne aspiracje, co skutkuje nieuchronnym krwawieniem. Krew w miejscu operacji znacznie zmniejsza widoczność tkanki mózgowej, która musi zostać usunięta. Komplikuje to precyzyjną ocenę wymaganej głębokości ablacji tkanek. Ostrożne przepłukiwanie pola operacyjnego PBS za każdym razem przed zastosowaniem ssania w celu usunięcia następnej części tkanki zapewnia lepszą kontrolę głębokości. Tkanka mózgowa powinna być zawsze usuwana małymi porcjami, krok po kroku, potwierdzając głębokość ablowanej tkanki przed przystąpieniem do dalszego odsysania. Dokładniejszą kontrolę ssania można również osiągnąć za pomocą cieńszej, igły. Sugerujemy użycie igły o średnicy 26 G, jednak średnica mniejsza niż 26 G jest bardziej podatna na zapychanie. Co więcej, zwykle potrzeba dużo praktyki, aby określić dokładną głębokość aspiracji wymaganą dla każdego zwierzęcia, ponieważ kolor kory, ciała modzelowatego i hipokampa może się różnić w zależności od myszy (ryc. 3).
Wprowadzenie i zabezpieczenie implantu obrazowego powinno być wykonane bardzo precyzyjnie, aby zapewnić jak najbliższe położenie okienka obrazowego względem grzbietowej powierzchni hipokampa. Wielkość przygotowanej kraniotomii powinna ściśle przylegać do implantu i umożliwiać jego wprowadzenie bez znacznego oporu. Jednocześnie nie powinno być widocznej szczeliny między czaszką a implantem, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie i uniknąć odsłonięcia tkanki mózgowej. Na wierzch implantu należy wywierać delikatny i stabilny nacisk podczas jego uszczelniania do czaszki. Jest prawie nieuniknione, że podczas wszczepiania implantu pod okienkiem obrazowym znajduje się krew. Jeśli zabieg chirurgiczny zostanie wykonany prawidłowo, okno powinno się oczyścić w ciągu 3-7 dni, a unaczynienie mózgu stanie się wyraźnie widoczne. Ważne jest również, aby upewnić się, że wirus został prawidłowo wstrzyknięty pod okno. W przypadku nieudanego wyrażenia, wirus może zostać ponownie wstrzyknięty wiele razy.
Główną komplikacją, z którą spotkaliśmy się w niektórych przypadkach, jest zmniejszona widoczność okna obrazowania. Istnieje kilka możliwych przyczyn złej jakości obrazowania: i) trwający stan zapalny; ii) wyrostek tkanki łącznej na szkle; iii) duża szczelina między oknem a hipokampem. Stan zapalny jest zwykle spowodowany zanieczyszczeniem podczas operacji lub niewłaściwie wysterylizowanym implantem obrazowym. Sugerujemy autoklawowanie narzędzi chirurgicznych przed i po każdym zabiegu, dezynfekcję obszaru operacyjnego tuż przed zabiegiem oraz noszenie czystego sprzętu ochrony osobistej podczas zabiegu. Implanty obrazowe powinny być oczyszczone po złożeniu, wysterylizowane i przechowywane w sterylnych warunkach. Rozrost tkanki łącznej na szkle implantu obrazowego może być spowodowany zanieczyszczeniem mechanicznym powierzchni szkła lub nadmiernym urazem tkanki mózgowej podczas ablacji kory mózgowej. Po zamontowaniu implantu ważne jest, aby upewnić się, że szklana powierzchnia jest czysta i gładka. Ponadto wszystkie fragmenty uszkodzonej tkanki mózgowej muszą zostać ostrożnie usunięte przed wprowadzeniem implantu obrazowego do kraniotomii. W niektórych przypadkach szczelina między szklanym oknem a hipokampem powoduje gromadzenie się płynu mózgowo-rdzeniowego, co obniża jakość obrazowania. Dlatego podczas zakładania implantu ważne jest, aby wprowadzić go do końca, aby zapewnić dobry kontakt między hipokampem a szklanym okienkiem. Czasami trudno jest określić dokładną przyczynę nieprzezroczystego okna obrazowania. Sugerujemy przeprowadzenie analizy pośmiertnej w celu ujawnienia warunków pod oknem optycznym i odpowiedniego dostosowania kolejnych operacji.
Metoda ta ma kilka podstawowych i technicznych ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę przed i w trakcie obrazowania in vivo. Jednym z głównych ograniczeń jest ablacja kory mózgowej. Podczas operacji usuwana jest część kory wzrokowej i czuciowej. Chociaż trudno jest precyzyjnie ocenić wpływ ablacji kory mózgowej, ponieważ usunięta tkanka mózgowa nie rzutuje bezpośrednio na hipokamp, kilka badań nie wykazało zauważalnego upośledzenia uczenia się zależnego od hipokampa lub innych istotnych funkcji hipokampa15,16. Należy również wziąć pod uwagę ograniczenia optyczne, zwłaszcza gdy używane są soczewki obiektywowe o wysokim NA. Na przykład w tym badaniu użyliśmy kaniuli o długości 1,75 mm i średnicy wewnętrznej 1,9 mm. Geometria tej kaniuli nie zachowa pełnego NA obiektywu powietrznego z NA większym niż ~0,5 lub soczewki wodnej z NA większym niż ~0,6, ponieważ odetnie część światła. Innym ograniczeniem, wspólnym dla wszystkich implantów do obrazowania mózgu, jest to, że część mózgu jest odsłonięta, co sprzyja utracie ciepła17,18. Jednak fizjologiczną temperaturę mózgu można łatwo przywrócić podczas obrazowania poprzez perfuzję ciepłego bufora.
Opisana metoda może być łatwo modyfikowana lub dostosowywana do innych zastosowań. Na przykład preparat można dostosować do obrazowania prążkowia7. Ponieważ prążkowie leży nieco głębiej niż hipokamp, do montażu implantu obrazowego należy użyć dłuższej kaniuli obrazowej. Sugerujemy stosowanie kaniuli obrazowej 2,0 mm. Współrzędne kraniotomii należy odpowiednio dostosować (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Ponadto wstrzyknięcie wirusa za pomocą kaniuli infuzyjnej pozwala na osiągnięcie ekspresji transgenu w cienkiej warstwie neuronów przy użyciu serotypu AAV o ograniczonym rozprzestrzenianiusię 19,20. Jest to szczególnie korzystne w przypadku obrazowania jednofotonowego ze względu na zmniejszoną nieostrą fluorescencję z głębszych warstw, a w rezultacie lepsze obrazowanie w rozdzielczości pojedynczej komórki. Co więcej, kaniula iniekcyjna może być również używana podczas obrazowania funkcjonalnego do podawania leków lub innych substancji chemicznych bezpośrednio do neuronów w polu widzenia (ryc. 5B). Ogólnie rzecz biorąc, kaniula infuzyjna dodaje użyteczne funkcje do implantu obrazowania, poprawiając jakość obrazowania dzięki ukierunkowanej ekspresji wirusa i umożliwiając farmakologiczną stymulację neuronów w polu widzenia. Zastosowana płyta głowicy zapewnia niezwykłą stabilność obrazowania implantu, minimalizując artefakty ruchu nawet u aktywnie poruszających się zwierząt na bieżni. Płyta czołowa jest mała i lekka, co powoduje minimalny dyskomfort dla zwierząt i pozostaje stabilna przez kilka miesięcy po zamontowaniu. Implant obrazujący jest również kompatybilny z obrazowaniem wielofotonowym 15,16,21 i może być łączony z mikroendoskopami22,23. Podobny implant obrazowy zastosowano również do obrazowania wielofotonowego głębszych struktur hipokampa, w tym warstwy promieniowej, luknozy warstwowej i zakrętu zębatego 16,24,25,26,27. Jednak celowanie w głębsze struktury hipokampa za pomocą AAV za pomocą kaniuli infuzyjnej może wymagać dalszej optymalizacji serotypu AAV i objętości19.
Wierzymy, że opisany protokół ułatwi badania, które mają na celu zbadanie aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w hipokampie zachowujących się myszy przy użyciu prostych i niedrogich zestawów obrazowania jednofotonowego.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Grupy BioInżynierii Molekularnej na Uniwersytecie Westlake za wszelką pomoc i pożyteczną dyskusję. Dziękujemy również Jinze Li i Jie-Min Jia z Uniwersytetu Westlake za pomoc w filmowaniu zabiegu chirurgicznego.
Ta praca była wspierana przez fundusze start-upowe z Fundacji Uniwersytetu Westlake, 2020 BBRF Young Investigator Grant oraz grant National Natural Science Foundation of China 32050410298 wszystko dla K.D.P.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkło nakrywkowe | Deckglä ser | 72296-03 | |
| Proteza zębowa Żywica bazowa | ShangHai Nowy materiał Centery Dentel | Nie | typu I, samokrzepnąca |
| kaniula atrapy | RWD Life Science Co., LTD | 62102 | OD 0,30 mm |
| Kaniula prowadząca | RWD Life Science Co., LTD | 62003 | Widelec głowicy 26G |
| N/ | A N/A | Wykonana na zamówienie | |
| płyta głowy | N/A | N/A | Wykonana na zamówienie |
| kaniula | obrazowaN/A | N/A | wykonane na zamówienie; OD 3mm, ID 2.7mm, Wysokość 1.8mm, #108 Wewnętrzna |
| kaniula | RWD Life Science Co., LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
| Kwik Sil | World Instrumenty precyzyjne | KWIK-SIL | |
| SuperBond C& B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C& Zestaw B |
| Zestaw | bieżni N/A | N/A | Wykonany na zamówienie |
| klej utwardzany promieniami UV | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |
Bibliografia
- Leutgeb, S., et al. Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).
- Henneman, W. J. P., et al. Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease. Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).
- Camicioli, R., et al. Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy. Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).
- Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience. Applied Sciences. 9 (3), 562(2019).
- Piatkevich, K. D., et al. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).
- Fan, L. Z., et al. All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1. Cell. 180 (3), 521-535 (2020).
- Shemesh, O. A., et al. Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
- Villa, K. L., et al. Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo. Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2013).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).
- Subach, O. M., et al. Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644(2020).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Kalmbach, A. S., Waters, J. Brain surface temperature under a craniotomy. Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).
- Roche, M., et al. In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation. eLife. 8, 47324(2019).
- Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols. Manfredssonn, F. P. , Springer. New York. 133-149 (2016).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
- Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus. Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147(2004).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740(2012).
- Attardo, A., et al. Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Castello-Waldow, T. P., et al. Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations. PLOS Biology. 18 (11), 3000928(2020).
Przedruki i uprawnienia
