Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Summary

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Abstract

Obrazowanie aktywności neuronalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki u czuwających zwierząt jest bardzo skutecznym podejściem do badania funkcji obwodów nerwowych w neuronauce systemowej. Jednak wysoka absorbancja i rozpraszanie światła w tkance ssaków ograniczają obrazowanie przyżyciowe głównie do powierzchownych obszarów mózgu, pozostawiając głębokie obszary mózgu, takie jak hipokamp, poza zasięgiem mikroskopii optycznej. W tym filmie pokazujemy przygotowanie i implantację niestandardowego okna obrazowania, aby umożliwić przewlekłe obrazowanie in vivo grzbietowego regionu hipokampa CA1 u myszy zachowujących się jak głowa. Wykonane na zamówienie okienko jest uzupełnione o kaniulę infuzyjną, która umożliwia ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych i leków do obszaru obrazowania. Łącząc ten preparat z obrazowaniem szerokokątnym, przeprowadziliśmy długoterminowe rejestrowanie aktywności neuronalnej za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika wapnia z dużych podzbiorów neuronów u zachowujących się myszy przez kilka tygodni. Wykazaliśmy również przydatność tego preparatu do obrazowania napięcia z rozdzielczością pojedynczego skoku. Wysokowydajne, genetycznie kodowane wskaźniki aktywności neuronalnej i naukowe kamery CMOS pozwoliły na cykliczną wizualizację subkomórkowych szczegółów morfologicznych pojedynczych neuronów w wysokiej rozdzielczości czasowej. Omówiono również zalety i potencjalne ograniczenia opisywanej metody oraz jej kompatybilność z innymi technikami obrazowania.

Introduction

Hipokamp to kluczowy obszar mózgu odpowiedzialny za uczenie się i pamięć¹, a także za nawigację przestrzenną². Zanik hipokampa jest związany z zaburzeniami neurologicznymi i psychiatrycznymi obejmującymi utratę pamięci i pogorszenie funkcji poznawczych^3,4,5. U myszy hipokamp jest bardzo dobrze ugruntowanym modelem do badania przestrzennego, kontekstowego i asocjacyjnego uczenia się oraz tworzenia pamięci na poziomie komórkowym i sieciowym^4,5. Mechanistyczne badania uczenia się i pamięci wymagają podłużnego badania struktury i funkcji neuronów u zachowujących się myszy. Obrazowanie fluorescencyjne w połączeniu z genetycznie kodowanymi sondami⁶ zapewnia bezprecedensowe możliwości rejestrowania dynamiki napięcia membrany^7,8, calcium transients⁹, oraz zmiany strukturalne¹⁰ na dużych podzbiorach neuronów wewnątrzżyciowych. Jednak optyczny dostęp do hipokampa u myszy jest utrudniony przez korę, która może osiągnąć ponad 1 mm grubości. Tutaj opisaliśmy procedurę montażu wykonanego na zamówienie urządzenia do obrazowania i jego przewlekłego wszczepienia do głowy myszy w celu długotrwałego dostępu optycznego do podregionu CA1 grzbietowego hipokampa u zachowujących się myszy. Kaniula infuzyjna zintegrowana z implantem obrazowym umożliwia podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do neuronów w polu widzenia. Opisany preparat w połączeniu z mikroskopią szerokokątną umożliwia powtarzalne obrazowanie dużych podzbiorów neuronów u zachowujących się myszy w długich okresach czasu. Wykorzystaliśmy ten preparat do ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia i napięcia w regionie CA1 hipokampa poprzez celowane wstrzyknięcie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) do rejestracji aktywności neuronalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki. Przeprowadziliśmy również podłużne obrazowanie wapnia odpowiednich podzbiorów neuronów w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej u zachowujących się zwierząt. Ponadto preparat ten jest kompatybilny z mikroskopią wielofotonową i mikroendoskopią, co jeszcze bardziej rozszerza zestaw technik obrazowania do badania sieci neuronalnych na poziomie komórkowym i subkomórkowym u zachowujących się myszy. Opisaliśmy krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów z protokołem. Omówiliśmy również możliwe pułapki i ograniczenia metody.

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Westlake.

1. Montaż implantów

UWAGA: Montaż implantu do obrazowania jest technicznie prosty i wymaga tylko dostępnych na rynku elementów (Rysunek 1, zobacz także Tabelę Materiałów). Płyty czołowe mogą być produkowane w lokalnym warsztacie mechanicznym przy użyciu płyt ze stali nierdzewnej lub tytanu. Sugerujemy przygotowanie zapasu w pełni zmontowanych implantów przed rozpoczęciem operacji. Po przeprowadzeniu eksperymentów in vivo implanty mogą być odzyskane i ponownie użyte. W niektórych przypadkach może to wymagać jedynie ponownego zamocowania kaniuli infuzyjnej poprzez przylutowanie lub wymianę szkła nakrywkowego.

1. Przygotuj wszystkie sześć kluczowych elementów sprzętowych do montażu i instalacji implantów do obrazowania (Rysunek 1).

Rysunek 1: Sześć kluczowych elementów sprzętowych do montażu i instalacji implantu do obrazowania. (A) Atrapa kaniuli. (B) Kaniula prowadząca. (C) Kaniula obrazowa. (D) Szklana szklana osłona. (E) Płyta główna. (F) Kaniula wewnętrzna. Podziałka: 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Włącz spawarkę i podgrzej ją do wymaganej temperatury.
   UWAGA: Temperatura zależy od użytej cyny spawalniczej.
3. Wypoleruj boczną powierzchnię kaniuli obrazowej za pomocą drobnego papieru ściernego, aby usunąć warstwę utlenioną, a tym samym ułatwić mocniejsze.
4. Dostosuj położenie kaniuli obrazowania i kaniuli iniekcyjnej (kaniula prowadząca z włożoną atrapą kaniuli) za pomocą pomocnych rąk (Rysunek 2A,B).
5. Za pomocą strzykawki z igłą nanieść niewielką ilość odpowiedniego rodzaju topnika na miejsce połączenia między obrazowaniem a wstrzykiwaniem kaniul przez 5 sekund, a następnie usunąć kroplę.
   UWAGA: Do tego preparatu użyliśmy dostępnego na rynku topnika, który jest określony przez producenta jako przeznaczony do części ze stali nierdzewnej, ponieważ kaniule obrazowe i infuzyjne są wykonane ze stali nierdzewnej. W przypadku innych materiałów wykorzystywanych do produkcji kaniul, użytkownik końcowy powinien wybrać topnik, który może spawać wybrany materiał.
6. Rozpuść cynę lutowniczą i nałóż ją na miejsce połączenia potraktowane topnikiem ( Rysunek 2).
   UWAGA: Unikaj nadmiaru cyny lutowniczej, ponieważ będzie to wymagało niepotrzebnie większej kraniotomii podczas operacji.

Rysunek 2: Schemat montażu kaniuli iniekcyjnej, składającej się z kaniuli prowadzącej z włożoną atrapą kaniuli, z kaniulą obrazowania. (A) Kąt między kaniulą iniekcyjną a kaniulą obrazową powinien wynosić około 45 stopni. (B) Końcówka kaniuli iniekcyjnej powinna znajdować się dokładnie na krawędzi kaniuli obrazowej. (C) Odpowiedni rozmiar cyny spawalniczej używanej do kaniul obrazowych i iniekcyjnych (czerwona linia oznacza kontur kropli cyny). (D) Nieodpowiedni rozmiar cyny spawalniczej, którego należy unikać podczas opracowywania implantu (czerwona linia oznacza kontur kropli cyny). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Poczekaj, aż cyna lutownicza ostygnie. Zwykle trwa to kilka sekund.
8. Upewnij się, że kaniula iniekcyjna nie jest zablokowana, wkładając atrapę kaniuli z obu kierunków.
9. Nałóż utwardzany promieniami UV klej optyczny na spodzie kaniuli obrazowej za pomocą wykałaczki lub igły strzykawkowej 26 G.
10. Za pomocą cienkiej pęsety ostrożnie umieść szkło nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze do kaniuli obrazowej.
    UWAGA: Pozycjonowanie szkła musi być wykonane precyzyjnie na kaniuli obrazowej, bez zbytniego przesuwania szkła po dotknięciu kleju optycznego. W przeciwnym razie szkło ulega zabrudzeniu, co obniża jakość obrazowania.
11. Utwardzaj klej przez co najmniej godzinę przy naświetleniu UV o długości fali 350-400 nm ze standardowej ręcznej lampy UV.
    UWAGA: Użyty klej musi być optycznie przezroczysty. W przeciwnym razie obniży to jakość okna obrazowania.
    UWAGA: Unikaj ekspozycji skóry i oczu, nosząc okulary chroniące przed promieniowaniem UV, rękawice i fartuch laboratoryjny.
12. Umyj kaniulę w 70% etanolu, wysusz na powietrzu i przechowuj w sterylnym pojemniku do czasu operacji.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby szkło nakrywkowe było tak czyste i nienaruszone, jak to tylko możliwe. Zastosowany klej optyczny jest stabilny chemicznie w 70% etanolu.

2. Implantacja okienna

1. Etapy przygotowania przed zabiegiem
   1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie.
   2. Przygotuj 1x PBS i 70% etanol na dwóch oddzielnych szalkach Petriego.
   3. Opcjonalnie: Dezynfekować obszar operacyjny za pomocą światła UV przez co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego.
      UWAGA: Praca w możliwie najbardziej sterylnych warunkach zaowocuje udanymi i długotrwałymi (nawet 6 miesięcy) szklanymi oknami czaszkowymi. Zanieczyszczenie może w większości przypadków skutkować zmniejszoną przezroczystością okna lub ciężkim stanem zapalnym.
2. Zabiegu chirurgicznego
   1. Bezpośrednio przed zabiegiem wysterylizuj obszar operacyjny 70% etanolem.
   2. Zważyć zwierzę i podać podskórnie przedoperacyjną dawkę środka przeciwbólowego zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem na zwierzętach.
   3. Znieczulić mysz izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% do utrzymania, natężenie przepływu powietrza 0,3-0,5 l/min). Użyj techniki szczypania ogona i szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone. Obserwuj parametry życiowe zwierzęcia, takie jak oddychanie, SpO₂ i tętno przez cały czas trwania zabiegu.
   4. Użyj trymera lub kremu do depilacji, aby usunąć sierść od karku do oczu.
   5. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce nad chirurgiczną poduszką grzewczą (utrzymując temperaturę 37 °C). Zabezpiecz głowę za pomocą nauszników. Lekko popchnij głowę we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że głowa jest mocno zamocowana.
   6. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu zwierzęcia podczas zabiegu.
   7. Wysterylizuj miejsce operowane betadyną, a następnie trzykrotnie 70% etanolem przed wykonaniem nacięcia.
   8. Usuń skórę nad czubkiem czaszki, zaczynając od poziomego cięcia wzdłuż podstawy głowy, następnie dwa nacięcia w kierunku rostralnym, prawie sięgające powiek, a następnie dwa ukośne cięcia, które zbiegają się na linii środkowej.
   9. Za pomocą dwóch sterylnych wacików bawełnianych cofnij tkankę łączącą, a także mięśnie tylnej części szyi, do krawędzi czaszki.
      UWAGA: Staraj się unikać uszkadzania naczyń krwionośnych (zwłaszcza tych ukrytych w mięśniu) podczas manipulacji.
   10. Nałóż kroplę roztworu lidokainy (~0,1 ml) na powierzchnię okostnej na 2 minuty, aby uniknąć nadmiernego bólu. Opcjonalnie, aby zmniejszyć obrzęk mózgu po usunięciu czaszki, 0,1 ml 1% deksametazonu można wstrzyknąć podskórnie.
   11. Delikatnie zeskrob cały odsłonięty obszar czaszki skalpelem, aby uzyskać suchą i szorstką powierzchnię, która pozwoli klejowi i cementowi dentystycznemu lepiej przylegać, a tym samym spowodować przewlekłą implantację.
   12. Umieść końcówkę igły zamontowanej na stacji stereotaktycznej na bregmie, ustaw wszystkie trzy współrzędne (AP: Przednie-Tylne; ML: Przyśrodkowo-Boczny; DV: grzbietowo-brzuszny) jako 0.
   13. Umieść końcówkę igły na lambda i sprawdź, czy współrzędna AP wynosi 0, aby potwierdzić, że pozycja głowicy jest pionowa, a także, czy współrzędna ML wynosi 0, aby potwierdzić, że głowica jest ustawiona poziomo. Jeśli nie, wyreguluj odpowiednie pokrętła na stacji stereotaktycznej, aż współrzędne AP i ML będą mieścić się w granicach 0.1 mm.
   14. Przesuń końcówkę igły, aby znaleźć odpowiednie punkty do kraniotomii i zaznacz ich położenie na czaszce za pomocą cienkiego markera. W przypadku implantacji hipokampa istnieją 4 punkty o następujących współrzędnych (AP: -0.68, ML: -2.0) (AP: -3.68, ML: -2.0) (AP: -2.18, ML: -0.5) i (AP: -2.18, ML: -3.5)^11, a także (AP: -4.0, ML: -2.0) dla najbardziej ogonowego punktu kaniuli iniekcyjnej.
       UWAGA: Marker użyty na tym etapie musi być wysterylizowany przy użyciu oświetlenia UV przez co najmniej godzinę przed zabiegiem. Pokazane tutaj współrzędne dotyczą 6-8-tygodniowych myszy C57BL/6J. Współrzędne mogą się różnić ze względu na różny wiek lub szczepy myszy.
   15. Narysuj okrąg na podstawie czterech zaznaczonych punktów, a także konturu obszaru kaniuli iniekcyjnej po ogonowej stronie koła (Rysunek 3).

16. Użyj wiertarki pneumatycznej z prędkością 10 000 obr./min, aby delikatnie "narysować" wzdłuż konturu zaznaczonego na czaszce.
17. Wiercić czaszkę, aż pozostanie bardzo cienka warstwa kości, która zwykle zaczyna się poruszać pod delikatnym dotykiem w środku.
18. Nałóż kroplę sterylnego 1x PBS na środek kraniotomii, podnieś płat kostny z czaszki za pomocą bardzo cienkich kleszczy lub dwóch igieł 26 G zbliżających się z przeciwnych stron.
    UWAGA: PBS pomoże usunąć fragment czaszki i zapobiec ewentualnemu krwawieniu opony twardej klasy ¹².
19. Zastosuj PBS, a następnie delikatnie zasysaj kilka razy igłą 26G, aby oczyścić powierzchnię opony twardej.
20. Delikatnie usuń oponę twardą za pomocą aspiracji lub nożyczek okulistycznych. Zastosuj delikatne ssanie (~-60 kPa), aby przeprowadzić ablację kory mózgowej, a także ciała modzelowatego nad hipokampem.
    UWAGA: Kora jest często bardziej żółta niż ciało modzelowate, a ciało modzelowate jest zwykle bielsze niż hipokamp. Ciało modzelowate jest zwykle łatwe do odróżnienia po włóknach neuronalnych biegnących w kierunku pionowym i poziomym, gdy obserwuje się je z góry (Ryc. 3).

Rysunek 3: Stereotaktyczne współrzędne lokalizacji hipokampa i procesu ablacji mózgu. (A) Cztery współrzędne krawędzi obszaru kraniotomii. (B) Całkowity obszar kraniotomii. (C-E) Reprezentatywne obrazy uzyskane podczas operacji (po lewej) i ich schemat ideowy (po prawej) wskazujący różne kolory i kierunki włókien nerwowych (A) kory mózgowej (B) ciała modzelowatego i (C) hipokampa widocznego podczas ablacji kory mózgowej. Podziałka: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Krwawienie w tym momencie wpłynie na widoczność tkanki mózgowej podczas kraniotomii. Zastosuj 1x PBS, a następnie delikatnie odsysaj, jednocześnie odsysając korę, aby pozbyć się krwi.
   UWAGA: Ciągłe krwawienie jest nieuniknione na tym etapie, a do pewnego stopnia ciągłe krwawienie jest oznaką prawidłowego ciśnienia krwi. W przeciwieństwie do implantacji okna obrazowania kory mózgowej, obecność krwi pod oknem optycznym jest dopuszczalna, ponieważ zostanie ona usunięta kilka dni po operacji. Optymalne jest wprowadzenie kaniuli obrazowej do utworzonego ubytku jak najszybciej po ablacji kory mózgowej.
2. Jeśli kraniotomia jest większa o <0,5 mm niż kaniula obrazowa, przed zamocowaniem implantu za pomocą SuperBond należy do pewnego stopnia uratować instalację kaniuli, stosując dodatkowe uszczelnienie Kwik Sil.
3. Jeśli kraniotomia jest mniejsza o <0,5 mm niż kaniula obrazowa, należy w pewnym stopniu uratować zabieg chirurgiczny, przycinając krawędź kraniotomii za pomocą cienkiej pęsety lub nożyczek okulistycznych, ponieważ pozostała kość na krawędzi kraniotomii jest cieńsza niż sama czaszka w wyniku wiercenia.
   UWAGA: Nie można uratować kranianiarzy, które przekraczają zakresy powyżej 0,5 mm. Odpowiednie działania w takich przypadkach powinny być zgodne z procedurą rozwiązania umowy zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt.

21. Delikatnie wprowadzić implant do kraniotomii.
22. Mocno dociśnij górną część implantu igłą w kształcie litery L, aby ustawić okienko optyczne implantu jak najbliżej odsłoniętej powierzchni hipokampa. Kilkakrotnie nakładaj PBS na czaszkę wokół implantu, a następnie odsysaj, aby usunąć jak najwięcej krwi podczas wprowadzania implantu. Następnie nałóż cienką warstwę Kwik Sil między implant a czaszkę, aby zapobiec wnikaniu cementu dentystycznego pod czaszkę (Rysunek 4).
    1. Upewnij się, że okienko optyczne implantu jest umieszczone dokładnie przy hipokampie, aby uniknąć gromadzenia się krwi lub innych płynów pod spodem.
       UWAGA: Krytycznym punktem jest upewnienie się, że szkło nakrywkowe kaniuli obrazowej jest umieszczone tuż przy hipokampie, co może wymagać delikatnego nacisku na kaniulę podczas procesu instalacji i uszczelniania. To, czy górna strona kaniuli obrazowej jest równoległa do czaszki, nie ma decydującego znaczenia dla ostatecznego dostępu optycznego, o ile okienko optyczne jest umieszczone przy hipokampie.
    2. Zgodnie ze średnią grubością kory powyżej obszaru CA1, utrzymuj górną powierzchnię kaniuli obrazowania powyżej powierzchni czaszki na ~0,5 mm, aby ułatwić przymocowanie kaniuli do czaszki (Rysunek 4).
23. Po utwardzeniu Kwik Sil, co zwykle trwa nie dłużej niż ~1 minutę, nałóż Super-Bond C&B równomiernie na powierzchnię czaszki, powierzchnię Kwik-Sil i górną powierzchnię implantu.
24. Po utwardzeniu Super-Bond C&B nałóż żywicę bazową na protezę zębową na Super-Bond C&B, a także na skórę wokół nacięcia wykonanego na początku operacji.
    UWAGA: Alternatywne rodzaje cementu są dostępne u wielu dostawców. Postępuj zgodnie z odpowiednimi instrukcjami producenta.
25. Po utwardzeniu żywicy podstawy protezy należy umieścić płytkę głowicy na żywicy wokół implantu i ustawić ją w koncentrycznym kierunku z kaniulą obrazową. Nałóż więcej żywicy bazowej protezy wokół i nad płytą główną, aby ustalić jej położenie. Pozwól mu utwardzić się przez kilka minut.
    1. Unikaj tworzenia grubej warstwy cementu wokół kaniuli, aby zapewnić lepszy dostęp do okienka obrazowania za pomocą soczewki obiektywu (Rysunek 4).

Rysunek 4: Schemat ideowy implantacji okna w widoku (A) koronalnym i (B) strzałkowym. a) płyta czołowa; b) żywica na bazie protezy; c) Superbond; d) Kwik-Sil; e) kaniula obrazowa; f) kaniula iniekcyjna; (g) Cyna lutownicza. (C): Mysz z zainstalowanym implantem po operacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Rozcieńczyć żywicę bazową protezy, aby zmniejszyć jej lepkość, umożliwiając w ten sposób wypełnienie zastrzeżeń, które są trudno dostępne za pomocą aplikatora.

26. Delikatnie umieść izolacyjną gumową taśmę nad oknem, aby chronić okno przed możliwym zanieczyszczeniem ściółką dla zwierząt.
27. Po zakończeniu operacji wstrzyknij podskórnie lek przeciwzapalny, aby zapobiec reakcji zapalnej.
28. Umieść zwierzę w ciepłej klatce, aż wyzdrowieje ze znieczulenia.
29. Sprawdź stan zdrowia myszy przez 72 godziny po operacji, obserwując ogólne zachowanie. Leki przeciwzapalne i przeciwbólowe wstrzykuje się podskórnie przez dwa-trzy dni po operacji co 24 godziny, aby złagodzić ból i zmniejszyć reakcję zapalną.
    UWAGA: W przypadku opieki pooperacyjnej możliwe są alternatywne procedury monitorowania, leki i dawki, dokładne informacje na temat procedury można znaleźć w zatwierdzonym przez IUCAC protokole dla zwierząt.
30. Sprawdź okno 5-7 dni po zabiegu, aby obserwować naczynia krwionośne pod oknem. W przypadku przezroczystego okna zwierzę jest gotowe do wstrzyknięcia wirusa.

3. Wstrzyknięcie wirusa

UWAGA: Wstrzyknięcie wirusa zwykle następuje w ciągu 5-7 dni po zabiegu. Przed wstrzyknięciem wirusa należy potwierdzić, że okno obrazowania jest czyste i możliwe jest obserwowanie unaczynienia mózgu (Ryc. 5). W niektórych przypadkach oczyszczenie okna może potrwać do 14-16 dni, co jest również dopuszczalne, jeśli nie zostanie wykryte zapalenie mózgu.

Rysunek 5: Reprezentatywny obraz okna optycznego (A) przed i (B) po wstrzyknięciu wirusa uzupełnionego barwnikiem FastGreen. Strzałka wskazuje tę samą strukturę naczyniową. Podziałka: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Dodać roztwór podstawowy Fast-green barwnik do roztworu wirusa, rozcieńczony do pożądanego miana, w stosunku 1:9 w probówce do PCR.
   UWAGA: Szybki zielony barwnik jest dodawany w celu ułatwienia wizualizacji roztworu wirusa podczas wstrzykiwania.
2. Połącz rurkę polietylenową ze strzykawką, a następnie napełnij rurkę olejem mineralnym za pomocą pompy strzykawkowej.
3. Podłącz kaniulę wewnętrzną do drugiego końca rurki, zaparz i odciągnij olej mineralny kilka razy, aby upewnić się, że kaniula wewnętrzna nie jest zatkana.
4. Znieczulić zwierzę izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% do utrzymania, przepływ powietrza 0,3-0,5 l/min), zamocować głowę w ramce stereotaktycznej nad poduszką grzewczą (utrzymując 37 °C), nałożyć maść do oczu.
5. Pobrać 600 nl roztworu wirusa, wyjąć atrapę kaniuli i włożyć wewnętrzną kaniulę podłączoną do strzykawki iniekcyjnej do kaniuli prowadzącej, podawać wirusa z prędkością 50 nL/min łącznie przez 10 minut.
   UWAGA: Sprawdź, czy barwnik jest widoczny przez okienko za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby potwierdzić pomyślne wstrzyknięcie wirusa (Rysunek 5).
6. Po wstrzyknięciu należy trzymać kaniulę wewnętrzną podłączoną przez 10 minut, aby wirus mógł rozprzestrzenić się pod oknem.
7. Delikatnie wyjmij kaniulę wewnętrzną z kaniuli prowadzącej i zamknij ją atrapą kaniuli.
8. Umieść zwierzę w ciepłej klatce, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu.
   UWAGA: Zazwyczaj myszy są gotowe do obrazowania w ciągu 10-20 dni po wstrzyknięciu wirusa. Poziom ekspresji i czas zależą od serotypu i promotora wirusa używanego do kierowania ekspresją genów.

4. Obrazowanie obudzonych myszy pod mikroskopem szerokokątnym.

UWAGA: Przygotowana płyta głowy zapewnia niezwykłą stabilność implantu obrazowego, a tym samym pozwala na obrazowanie wzdłużne u myszy obudzonych i zachowujących się przy minimalnych artefaktach ruchu.

1. Nałóż na mysz 4% izofluranu przez kilka minut, przymocuj jej płytkę główną do widelca głowy, a następnie przymocuj widelec do bieżni.
   UWAGA: Widelec głowicy i bieżnia są dostosowane do płyty czołowej używanej w tym badaniu, zapoznaj się z materiałami pomocniczymi, aby uzyskać odpowiednie pliki cad. Indukcja myszy przed unieruchomieniem głowy jest opcjonalna, ponieważ możliwe jest przyzwyczajenie zwierzęcia do tej procedury.
2. Przesuń bieżnię pod stolik mikroskopu i umieść okienko optyczne pod soczewką obiektywu.
3. Użyj soczewki obiektywowej o małym powiększeniu, aby znaleźć najlepsze pole widzenia (FOV) do obrazowania funkcjonalnego, a następnie przełącz się na soczewkę obiektywową o wyższej NA, aby rejestrować aktywność neuronalną w rozdzielczości pojedynczej komórki.
   UWAGA: Jeśli kaniula iniekcyjna nadal stanowi przeszkodę w osiągnięciu odległości roboczej przez soczewkę obiektywu, należy użyć drucianego obcinacza, aby odciąć kaniulę iniekcyjną od płyty głowicy.

Results

Obrazowanie in vivo aktywności neuronalnej za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia. Obrazowanie in vivo rozpoczyna się średnio 3-4 tygodnie po implantacji, jeśli osiągnięty zostanie wystarczający poziom ekspresji transgenu. W tym czasie obrzęk mózgu i krwotok są zwykle całkowicie ustąpione, a unaczynienie mózgu można łatwo zaobserwować przez okno optyczne. Tutaj wykorzystaliśmy opisany preparat do wykonania powtarzających się zapisów aktywności neuronalnej w grzbietowym regionie hipokampa CA1 u zachowujących się myszy pod fluorescencyjnym mikroskopem szerokokątnym. Aby zarejestrować aktywność neuronalną, użyliśmy jasnego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia o nazwie NCaMP7¹³, który wykazuje podobną czułość wapnia i rozdzielczość czasową do GCaMP6s¹⁴. Aby wyrazić wskaźnik NCaMP7 w hipokampie, wstrzyknęliśmy wirusa rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 za pomocą kaniuli infuzyjnej i rozpoczęliśmy obrazowanie długości geograficznej po 14 dniach od wstrzyknięcia. Do rejestrowania aktywności neuronalnej użyliśmy soczewki obiektywu powietrznego 10x NA 0,3 i kamery Hamamatsu OrcaFusion sCMOS, która umożliwiała obrazowanie w polu widzenia ~1,5x1,5 mm przy częstotliwości do 100 Hz. Zielona fluorescencja została wzbudzona przez dostępną na rynku diodę LED o długości fali 470 nm przy użyciu standardowego zestawu filtrów GFP. Średnia głębokość obrazowania osiągana w kanale zielonym wynosi około 50-120 μm, co pozwala na rejestrację aktywności neuronalnej głównie w warstwie oriens i warstwie piramidalnej. Głębokość obrazowania w kanałach bliskiej podczerwieni może wynosić do 200 μm, docierając do głębszych warstw hipokampa⁸. Średni czas nagrywania na FOV wynosił 6-12 minut, chociaż możliwe są znacznie dłuższe sesje obrazowania, ponieważ NCaMP7 charakteryzuje się wyjątkowo wysoką fotostabilnością i nie zaobserwowano wykrywalnej fototoksyczności (Rysunek 6).

Rysunek 6: Rejestracja aktywności neuronalnej w neuronach hipokampa za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia z zieloną fluorescencją. (A) Wybrane pole widzenia zobrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym o szerokim polu widzenia w kanale zielonym. (B) 15 ROI odpowiadających pojedynczym neuronom pokazanym w A i wybranych przy użyciu rzutu odchylenia standardowego całego nagrania. (C) Reprezentatywne ślady fluorescencji w pojedynczej próbie 15 wybranych neuronów w B. (D) Reprezentatywny widok w powiększeniu 2 śladów wapnia pokazanych w odpowiednich kolorowych polach pokazanych w C. Pasek skali, 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Aby uzyskać ślady fluorescencji, obszary zainteresowania (ROI) odpowiadające somom neuronalnym zostały ręcznie podzielone na segmenty i przeanalizowane przez oprogramowanie ImageJ. Przed analizą obrazu, korekcją ruchu, powszechne procedury po rejestracji u obudzonych zwierząt nie były wymagane, ponieważ uzyskane zestawy danych nie wykazywały artefaktów ruchu ze względu na wysoką stabilność implantu obrazowego. Reprezentatywny jednopróbowy zapis optyczny aktywności neuronalnej z hipokampa u czujnie zachowującej się myszy przedstawiono na Rysunek 6. 15 ROI odpowiadających somom neuronalnym zostało wybranych ręcznie z tego samego pola widzenia pokazanego na Rysunek 6B, a ślady fluorescencji pojedynczej próby w każdym ROI są pokazane w Rysunek 6C. Rysunek 6D pokazuje dwie reprezentatywne części śladów fluorescencji z dwóch różnych ROI. Wykonaliśmy 4 kolejne sesje obrazowania dla tego samego pola widzenia w odstępach 3-dniowych. Możliwe było zidentyfikowanie i zobrazowanie tych samych neuronów w niektórych FOV przez co najmniej dwa tygodnie (dłuższe sesje obrazowania nie były wykonywane w tym badaniu, jednak ten sam preparat został użyty do 6-miesięcznego badania obrazowego na myszach wcześniej⁷; Rysunek 7). W tym badaniu użyliśmy wektora AAV / DJ-CAG, który napędzał silną ekspresję interesującego genu nawet 21 dni po dostarczeniu wirusa (ryc. uzupełniająca 1). Ciągła ekspresja komplikowała długotrwałą identyfikację tych samych neuronów ze względu na zwiększone tło fluorescencji i pojawienie się nowych neuronów wyrażających wskaźnik wapnia. W związku z tym wybór serotypu i promotora AAV w celu stymulowania ekspresji genów docelowych powinien być jednym z ważnych czynników branych pod uwagę podczas projektowania eksperymentalnego, w szczególności jeśli wymagane jest obrazowanie podłużne tego samego podzbioru neuronów. Jakość obrazowania pozwoliła na rozdzielenie dendrytów proksymalnych, a także uwidocznienie naczyń krwionośnych.

Rysunek 7: Sekwencja obrazów czterech różnych FOV z obszaru hipokampa śledzona przez 12 dni. Zwierzęciu wszczepiono okno w dniu 0 i wstrzyknięto mu wirusa rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 w dniu 7. Groty strzałek wskazują neuron śledzony w polu widzenia. Podziałka skali: 80 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie in vivo aktywności neuronalnej za pomocą genetycznie zakodowanego czujnika napięcia.
W tym badaniu użyliśmy również nowatorskiego, genetycznie kodowanego czujnika napięcia o nazwie SomArchon⁷, który pozwala na obrazowanie napięcia z rozdzielczością pojedynczego skoku pojedynczej komórki u zachowujących się zwierząt^7,8. Aby wyrazić SomArchon, wstrzyknęliśmy wirusa rAAV/DJ-CAG-SomArchon za pomocą kaniuli infuzyjnej i przeprowadziliśmy obrazowanie napięciowe u myszy zachowującej się z głową kilka dni po wstrzyknięciu. Do rejestrowania aktywności neuronalnej użyliśmy obiektywu o powiększeniu 40x NA 0,8 i kamery Hamamatsu OrcaFusion sCMOS, która pozwoliła nam zobrazować pole widzenia 150x40 μm z częstotliwością akwizycji do 830 Hz. Białko GFP, które jest częścią konstrukcji SomArchon w celu ułatwienia wizualizacji ekspresji w widzialnym zakresie widma, można łatwo zobrazować w kanale zielonym (wzbudzenie LED przy 470/20 nm, emisja 525/50 nm) w celu zlokalizowania komórek będących przedmiotem zainteresowania do obrazowania napięciowego. Optyczne zapisy napięcia wykonano w kanale bliskiej podczerwieni (wzbudzenie lasera 637 nm przy 3,4 W/^mm2, emisja 665 nm long pass) z binningiem 4 x 4 przy częstotliwości akwizycji 830 Hz. Zarejestrowaliśmy spontaniczną aktywność neuronu hipokampa u obudzonej myszy ze średnim SNR wynoszącym 7 na potencjał czynnościowy (Ryc. 8).

Rysunek 8: Rejestracja aktywności neuronalnej w neuronach hipokampa za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika napięcia bliskiej podczerwieni SomArchon. (A) Wybrane pole widzenia zobrazowane pod szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym w kanale bliskiej podczerwieni. (B) Jednopróbowy ślad fluorescencyjny neuronu w A. (C) Reprezentatywny widok w powiększeniu śladu napięcia w odpowiednim polu pokazanym w B. Pasek skali: 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Histologia
Po wykonaniu badania obrazowania funkcjonalnego przeprowadza się analizę pośmiertną w celu potwierdzenia prawidłowego umieszczenia implantu, obszaru ekspresji wirusa i lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w obrazowanych neuronach. W celu histologicznej weryfikacji ekspresji wirusa i umiejscowienia implantu, odcinki czołowe mózgu utrwalonego PFA badano pod fluorescencyjnym mikroskopem szerokokątnym (Ryc. 9A, C). Mikroskop konfokalny został użyty do uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości pojedynczych neuronów wyrażających wskaźnik wapnia, a także wskaźnik napięcia (Rysunek 9B, D). Barwienie DAPI wykorzystano do wizualizacji ogólnej morfologii wycinka mózgu. Ponadto wycinki mózgu można ocenić za pomocą immunohistochemii w celu zweryfikowania astroglejozy lub glejozy spowodowanej implantacją okienka i ekspresją wirusa. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że procedura nie wywołała zauważalnego glejaku⁷.

Rysunek 9: Histologiczna weryfikacja pozycji okna optycznego i ekspresji wirusa. (A) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny wycinka mózgu w sekcji czołowej, pokazujący umiejscowienie okna optycznego u myszy wykazującej ekspresję NCaMP. Podziałka skali: 1 mm. (B) Reprezentatywny obraz konfokalny neuronów wyrażających wskaźniki NCaMP7. Pasek skali: 25 μm. (C) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny wycinka mózgu w przekroju koronalnym, pokazujący położenie okna optycznego myszy z ekspresją SomArchon. Pasek skali: 1 mm. (D) Reprezentatywny obraz konfokalny neuronów wyrażających wskaźniki SomArchon. Podziałka skali: 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uzupełniające Rysunek 1: Analiza ilościowa względnej intensywności fluorescencji wraz z czasem wyrażenia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Tutaj opisujemy metodę długoterminowego obrazowania regionu CA1 hipokampa u zachowujących się myszy. Metoda opiera się na chronicznym wszczepianiu specjalnie dostosowanego okna obrazowania, które umożliwia również celowane podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do interesujących neuronów. Niniejszy protokół składa się z czterech głównych części: i) montażu implantu obrazowego; ii) instalacja implantu do obrazowania; iii) wstrzyknięcie wirusa za pomocą implantu do obrazowania; iv) obrazowanie funkcjonalne u zachowujących się myszy. Poniżej opisujemy i omawiamy krytyczne kroki w protokole, rozwiązywanie problemów, modyfikacje i ograniczenia metody. Omówiono również znaczenie metody i jej potencjalne alternatywne zastosowania.

W opisanym protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, które są dość ważne dla udanej operacji: (i) przygotowanie wysokiej jakości implantu obrazowego; (ii) sterylne warunki chirurgiczne; (iii) aspiracja kory mózgowej; (iv) precyzyjne umieszczenie implantu do obrazowania; (v) wstrzyknięcie wirusa. Jak wskazuje krok 1.6, nadmiar cyny lutowniczej wymagałby większej kraniotomii, a tym samym zwiększa ryzyko stanu zapalnego. Bardzo ważne jest również, aby podczas mocowania szkła nakrywkowego do kaniuli obrazowej użyć odpowiedniej ilości kleju optycznego, jak wskazano w kroku 1.11, ponieważ niewystarczająca ilość może spowodować wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego do kaniuli obrazowej i jej zmętnienie. Z drugiej strony, nadmiar kleju optycznego może skutkować zmniejszoną przezroczystością szklanego okna. Ewentualne zanieczyszczenie implantu obrazowego może spowodować aktywną proliferację tkanki łącznej pod oknem optycznym i/lub ciężki stan zapalny, który doprowadzi do przedwczesnego zakończenia eksperymentu. Dlatego obrazowanie, montaż implantu i przygotowanie przed zabiegiem jest prawie tak samo ważne, jak sam zabieg chirurgiczny.

Podczas operacji część kory pod kraniotomią jest ablowana przez delikatne aspiracje, co skutkuje nieuchronnym krwawieniem. Krew w miejscu operacji znacznie zmniejsza widoczność tkanki mózgowej, która musi zostać usunięta. Komplikuje to precyzyjną ocenę wymaganej głębokości ablacji tkanek. Ostrożne przepłukiwanie pola operacyjnego PBS za każdym razem przed zastosowaniem ssania w celu usunięcia następnej części tkanki zapewnia lepszą kontrolę głębokości. Tkanka mózgowa powinna być zawsze usuwana małymi porcjami, krok po kroku, potwierdzając głębokość ablowanej tkanki przed przystąpieniem do dalszego odsysania. Dokładniejszą kontrolę ssania można również osiągnąć za pomocą cieńszej, igły. Sugerujemy użycie igły o średnicy 26 G, jednak średnica mniejsza niż 26 G jest bardziej podatna na zapychanie. Co więcej, zwykle potrzeba dużo praktyki, aby określić dokładną głębokość aspiracji wymaganą dla każdego zwierzęcia, ponieważ kolor kory, ciała modzelowatego i hipokampa może się różnić w zależności od myszy (ryc. 3).

Wprowadzenie i zabezpieczenie implantu obrazowego powinno być wykonane bardzo precyzyjnie, aby zapewnić jak najbliższe położenie okienka obrazowego względem grzbietowej powierzchni hipokampa. Wielkość przygotowanej kraniotomii powinna ściśle przylegać do implantu i umożliwiać jego wprowadzenie bez znacznego oporu. Jednocześnie nie powinno być widocznej szczeliny między czaszką a implantem, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie i uniknąć odsłonięcia tkanki mózgowej. Na wierzch implantu należy wywierać delikatny i stabilny nacisk podczas jego uszczelniania do czaszki. Jest prawie nieuniknione, że podczas wszczepiania implantu pod okienkiem obrazowym znajduje się krew. Jeśli zabieg chirurgiczny zostanie wykonany prawidłowo, okno powinno się oczyścić w ciągu 3-7 dni, a unaczynienie mózgu stanie się wyraźnie widoczne. Ważne jest również, aby upewnić się, że wirus został prawidłowo wstrzyknięty pod okno. W przypadku nieudanego wyrażenia, wirus może zostać ponownie wstrzyknięty wiele razy.

Główną komplikacją, z którą spotkaliśmy się w niektórych przypadkach, jest zmniejszona widoczność okna obrazowania. Istnieje kilka możliwych przyczyn złej jakości obrazowania: i) trwający stan zapalny; ii) wyrostek tkanki łącznej na szkle; iii) duża szczelina między oknem a hipokampem. Stan zapalny jest zwykle spowodowany zanieczyszczeniem podczas operacji lub niewłaściwie wysterylizowanym implantem obrazowym. Sugerujemy autoklawowanie narzędzi chirurgicznych przed i po każdym zabiegu, dezynfekcję obszaru operacyjnego tuż przed zabiegiem oraz noszenie czystego sprzętu ochrony osobistej podczas zabiegu. Implanty obrazowe powinny być oczyszczone po złożeniu, wysterylizowane i przechowywane w sterylnych warunkach. Rozrost tkanki łącznej na szkle implantu obrazowego może być spowodowany zanieczyszczeniem mechanicznym powierzchni szkła lub nadmiernym urazem tkanki mózgowej podczas ablacji kory mózgowej. Po zamontowaniu implantu ważne jest, aby upewnić się, że szklana powierzchnia jest czysta i gładka. Ponadto wszystkie fragmenty uszkodzonej tkanki mózgowej muszą zostać ostrożnie usunięte przed wprowadzeniem implantu obrazowego do kraniotomii. W niektórych przypadkach szczelina między szklanym oknem a hipokampem powoduje gromadzenie się płynu mózgowo-rdzeniowego, co obniża jakość obrazowania. Dlatego podczas zakładania implantu ważne jest, aby wprowadzić go do końca, aby zapewnić dobry kontakt między hipokampem a szklanym okienkiem. Czasami trudno jest określić dokładną przyczynę nieprzezroczystego okna obrazowania. Sugerujemy przeprowadzenie analizy pośmiertnej w celu ujawnienia warunków pod oknem optycznym i odpowiedniego dostosowania kolejnych operacji.

Metoda ta ma kilka podstawowych i technicznych ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę przed i w trakcie obrazowania in vivo. Jednym z głównych ograniczeń jest ablacja kory mózgowej. Podczas operacji usuwana jest część kory wzrokowej i czuciowej. Chociaż trudno jest precyzyjnie ocenić wpływ ablacji kory mózgowej, ponieważ usunięta tkanka mózgowa nie rzutuje bezpośrednio na hipokamp, kilka badań nie wykazało zauważalnego upośledzenia uczenia się zależnego od hipokampa lub innych istotnych funkcji hipokampa^15,16. Należy również wziąć pod uwagę ograniczenia optyczne, zwłaszcza gdy używane są soczewki obiektywowe o wysokim NA. Na przykład w tym badaniu użyliśmy kaniuli o długości 1,75 mm i średnicy wewnętrznej 1,9 mm. Geometria tej kaniuli nie zachowa pełnego NA obiektywu powietrznego z NA większym niż ~0,5 lub soczewki wodnej z NA większym niż ~0,6, ponieważ odetnie część światła. Innym ograniczeniem, wspólnym dla wszystkich implantów do obrazowania mózgu, jest to, że część mózgu jest odsłonięta, co sprzyja utracie ciepła^17,18. Jednak fizjologiczną temperaturę mózgu można łatwo przywrócić podczas obrazowania poprzez perfuzję ciepłego bufora.

Opisana metoda może być łatwo modyfikowana lub dostosowywana do innych zastosowań. Na przykład preparat można dostosować do obrazowania prążkowia⁷. Ponieważ prążkowie leży nieco głębiej niż hipokamp, do montażu implantu obrazowego należy użyć dłuższej kaniuli obrazowej. Sugerujemy stosowanie kaniuli obrazowej 2,0 mm. Współrzędne kraniotomii należy odpowiednio dostosować (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Ponadto wstrzyknięcie wirusa za pomocą kaniuli infuzyjnej pozwala na osiągnięcie ekspresji transgenu w cienkiej warstwie neuronów przy użyciu serotypu AAV o ograniczonym rozprzestrzenianiu^{się 19,20}. Jest to szczególnie korzystne w przypadku obrazowania jednofotonowego ze względu na zmniejszoną nieostrą fluorescencję z głębszych warstw, a w rezultacie lepsze obrazowanie w rozdzielczości pojedynczej komórki. Co więcej, kaniula iniekcyjna może być również używana podczas obrazowania funkcjonalnego do podawania leków lub innych substancji chemicznych bezpośrednio do neuronów w polu widzenia (ryc. 5B). Ogólnie rzecz biorąc, kaniula infuzyjna dodaje użyteczne funkcje do implantu obrazowania, poprawiając jakość obrazowania dzięki ukierunkowanej ekspresji wirusa i umożliwiając farmakologiczną stymulację neuronów w polu widzenia. Zastosowana płyta głowicy zapewnia niezwykłą stabilność obrazowania implantu, minimalizując artefakty ruchu nawet u aktywnie poruszających się zwierząt na bieżni. Płyta czołowa jest mała i lekka, co powoduje minimalny dyskomfort dla zwierząt i pozostaje stabilna przez kilka miesięcy po zamontowaniu. Implant obrazujący jest również kompatybilny z obrazowaniem wielofotonowym ^15,16,21 i może być łączony z mikroendoskopami^22,23. Podobny implant obrazowy zastosowano również do obrazowania wielofotonowego głębszych struktur hipokampa, w tym warstwy promieniowej, luknozy warstwowej i zakrętu zębatego 16,24,25,26,27. Jednak celowanie w głębsze struktury hipokampa za pomocą AAV za pomocą kaniuli infuzyjnej może wymagać dalszej optymalizacji serotypu AAV i objętości¹⁹.

Wierzymy, że opisany protokół ułatwi badania, które mają na celu zbadanie aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w hipokampie zachowujących się myszy przy użyciu prostych i niedrogich zestawów obrazowania jednofotonowego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkło nakrywkowe	Deckglä ser	72296-03
Proteza zębowa  Żywica bazowa	ShangHai Nowy materiał Centery Dentel	Nie	typu I, samokrzepnąca
kaniula atrapy	RWD Life Science Co., LTD	62102	OD 0,30 mm
Kaniula prowadząca	RWD Life Science Co., LTD	62003	Widelec głowicy 26G
	N/	A N/A	Wykonana na zamówienie
płyta głowy	N/A	N/A	Wykonana na zamówienie
kaniula	obrazowaN/A	N/A	wykonane na zamówienie; OD 3mm, ID 2.7mm, Wysokość 1.8mm, #108 Wewnętrzna
kaniula	RWD Life Science Co., LTD	62203	0.30*0.14 (OD*ID, mm)
Kwik Sil	World Instrumenty precyzyjne	KWIK-SIL
SuperBond C& B	SUN MEDICAL	N/A	SuperBond C& Zestaw B
Zestaw	bieżni N/A	N/A	Wykonany na zamówienie
klej utwardzany promieniami UV	NORLAND PRODUCTS	NOA 60