Method Article

Aktywacja 3D całego mózgu i mapowanie łączności funkcjonalnej u myszy przy użyciu przezczaszkowego funkcjonalnego obrazowania ultrasonograficznego

DOI:

10.3791/62267

⸱

February 24th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics for Medicine Paris, ESPCI Paris, INSERM, CNRS, PSL Research University, 2Institute of Psychiatry and Neurosciences of Paris, INSERM U1266, Université de Paris, 3Iconeus, 4Department of Pharmacology and Toxicology, Jena University Hospital - Friedrich Schiller University Jena

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kwantyfikację wolumetrycznych zmian hemodynamicznych mózgu w mózgu myszy za pomocą funkcjonalnych ultradźwięków (fUS). Procedury dla mapy aktywacji funkcjonalnej 3D po stymulacji sensorycznej, a także łączności funkcjonalnej w stanie spoczynku są przedstawione jako przykłady ilustracyjne u myszy znieczulonych i obudzonych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalne obrazowanie ultrasonograficzne (fUS) to nowatorska metoda obrazowania mózgu, która opiera się na wysokiej czułości pomiaru objętości krwi mózgowej uzyskanej za pomocą ultraszybkiej angiografii dopplerowskiej. Ponieważ perfuzja mózgu jest silnie powiązana z lokalną aktywnością neuronalną, technika ta umożliwia mapowanie 3D całego mózgu aktywacji regionalnej wywołanej zadaniem, a także funkcjonalnej łączności w stanie spoczynku, nieinwazyjnie, z niezrównaną rozdzielczością czasoprzestrzenną i prostotą obsługi. W porównaniu z fMRI (funkcjonalnym rezonansem magnetycznym), główną zaletą obrazowania fUS jest umożliwienie pełnej kompatybilności z eksperymentami na zwierzętach czuwających i zachowujących się. Co więcej, mapowanie mózgu metodą fMRI u myszy, najczęściej stosowany model przedkliniczny w neurobiologii, pozostaje wyzwaniem technicznym ze względu na mały rozmiar mózgu i trudności w utrzymaniu stabilnych warunków fizjologicznych. Tutaj przedstawiamy prosty, niezawodny i solidny protokół obrazowania fUS całego mózgu u znieczulonych i wybudzonych myszy przy użyciu gotowego komercyjnego systemu fUS z zmotoryzowanym przetwornikiem liniowym, zapewniającym znaczną aktywację kory mózgowej po stymulacji sensorycznej, a także powtarzalny wzorzec funkcjonalnej łączności 3D do identyfikacji sieci.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dwóch dekad, neuroobrazowanie stało się ważnym narzędziem do badania funkcji i organizacji mózgu, umożliwiając naukowcom dokonywanie ważnych odkryć w dziedzinie neuronauki. Obecnie funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (fMRI) stało się złotym standardem klinicznej techniki neuroobrazowania do oceny aktywacji mózgu wywołanej przez zadanie lub lek oraz do mapowania funkcjonalnej łączności w spoczynku. Podczas gdy ludzkie fMRI ma wysoką niezawodność i czułość, mysie fMRI pozostaje technicznie trudne z wielu powodów1. Po pierwsze, fMRI ma słabą rozdzielczość przestrzenną i czasową. Niewielki rozmiar mózgu myszy wymusza użycie silnych pól magnetycznych przy użyciu drogich skanerów w celu uzyskania rozsądnej rozdzielczości przestrzennej. Po drugie, utrzymanie stabilnych parametrów fizjologicznych w wąskim zakresie umożliwiającym skuteczne sprzężenie nerwowo-naczyniowe jest bardzo trudne u znieczulonych myszy. Wreszcie, sygnał zależny od poziomu tlenu we krwi (BOLD), na którym opierają się badania fMRI, ma stosunkowo słabą czułość, co prowadzi do niskiego stosunku sygnału do szumu w przypadku zastosowania u myszy i często wymaga wielokrotnej prezentacji bodźca przez długi czas akwizycji w celu wykrycia niewielkich zmian. Mysz jest najczęściej wykorzystywanym modelem zwierzęcym w biomedycznych badaniach przedklinicznych, a ograniczenia te są częściowo odpowiedzialne za lukę translacyjną w neuropsychiatrii, utrudniając transpozycję nowych obiecujących celów terapeutycznych na stanowisku do skutecznych terapii przy łóżku pacjenta.

Funkcjonalne ultrasonografie (fUS) to niedawno opracowana technika neuroobrazowania oparta na ultraszybkim dopplerze2. Dzięki bezpośredniemu pobieraniu próbek objętości krwi mózgowej, technika ta umożliwia sondowanie aktywności mózgu w czasie rzeczywistym poprzez sprzężenie nerwowo-naczyniowe. W porównaniu z innymi technikami neuroobrazowania, fUS daje rozdzielczość przestrzenną 100 μm i rozdzielczość czasową w dziesiątkach milisekund. Technika ta umożliwia obrazowanie całego mózgu całych odcinków koronalnych mózgu myszy, całkowicie nieinwazyjnie. Co więcej, jest w pełni kompatybilny ze świadomymi i zachowującymi się zwierzętami3,4,5. Jednym z głównych obecnych ograniczeń fUS jest funkcja 2D, pozwalająca na jednoczesne nagrywanie pojedynczej płaszczyzny koronalnej. Podczas gdy wolumetryczny 3D fUS wykorzystujący przetworniki matrycy 2D został już z powodzeniem zademonstrowany na szczurach6 i potwierdzony na myszach7, jego obecny brak czułości wymaga pełnej kraniotomii, a także uśrednienia dużej liczby prób w celu wykrycia niewielkiej zmiany aktywności. Alternatywnie, przetworniki liniowe mogą być przesuwane w wielu pozycjach i wykonywać funkcjonalne obrazowanie płaszczyzna po płaszczyźnie, aby pokryć cały mózg. Technika ta wymaga jednak licznych powtórzeń paradygmatu eksperymentalnego i jako taka długi czas przyswajania (3-4 godziny dla mózgu myszy)8,9.

W niniejszej pracy opisujemy solidną platformę eksperymentalną, w tym komercyjnie dostępny funkcjonalny skaner ultradźwiękowy i szybki przetwornik liniowy przełączający płaszczyznę z procedurami pozyskiwania danych 3D fUS u znieczulonych i wybudzonych myszy, umożliwiając wolumetryczne i przezczaszkowe funkcjonalne mapowanie mózgu myszy, nieinwazyjnie, bez środka kontrastowego i w krótkim czasie akwizycji. Ilustrujemy tę cechę, mapując aktywację kory somatosensorycznej po stymulacji wąsów, a także funkcjonalną łączność w stanie spoczynku. Oprócz przygotowania zwierząt i zbierania danych, opisujemy również procedurę wizualizacji, rejestracji atlasu i analizy sygnałów fUS w czasie rzeczywistym.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przedstawione tutaj procedury zostały wykonane zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 22 września 2010 r. (010/63/UE) i naszą lokalną komisją etyki (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', projekt #2017-23). Dorosłe myszy (samiec C57BL/6 Rj, w wieku 2-3 miesięcy, 20-30 g, z Janvier Labs, Francja) trzymano po 4 sztuki w klatce z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności, stałą temperaturą 22 °C oraz jedzeniem i wodą ad libitum. Przed rozpoczęciem eksperymentów zwierzętom zapewnia się minimalny tygodniowy okres aklimatyzacji do warunków w pomieszczeniach.

1. Przygotowanie zwierząt do znieczulonego obrazowania fUS

  1. znieczulenie
    1. Zważ mysz.
    2. Przygotować mieszaninę ketaminy i ksylazyny w stężeniu odpowiednio 10 mg/ml i 2 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Podawać dootrzewnowo 0,2 ml roztworu ketaminy/ksylazyny za pomocą igły o rozmiarze 26 i jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml. Po kilku minutach ustaw zwierzę na ramie stereotaktycznej, upewniając się, że głowa jest płaska.
    3. Podawać drugą objętość środków znieczulających, aby osiągnąć całkowitą dawkę 100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny (biorąc pod uwagę dawkę początkową).
      UWAGA: Znieczulenie powinno trwać 1 godzinę. Aby utrzymać stabilną sedację przez dłuższy czas, należy wstrzykiwać 0,05 ml mieszaniny ketaminy/ksylazyny co 30 minut dootrzewnowo.
  2. Przygotowanie zwierząt do sesji obrazowania w znieczuleniu
    1. Nałóż trochę maści do oczu (np. Ocry-Gel) na oczy myszy, aby uniknąć powstania zaćmy podczas sesji obrazowania. Ogol głowę myszy za pomocą trymera. Nałóż krem do depilacji i spłucz po kilku minutach. Powtarzaj, aż włosy zostaną całkowicie usunięte.
    2. Włóż szpilki podskórne do kończyn w celu rejestracji elektrokardiogramu (EKG). Umieść odwirowany żel ultradźwiękowy (1500 obr./min, 5 min) na głowie.
    3. Monitoruj głębokość znieczulenia przez cały czas trwania eksperymentów (w tym indukcji znieczulenia). Utrzymuj temperaturę zwierząt na poziomie 37 °C za pomocą koca grzewczego połączonego z sondą doodbytniczą.
    4. Monitoruj następujące parametry fizjologiczne, które są pośrednimi wskaźnikami głębokości znieczulenia: Tętno (220-250 uderzeń na minutę - monitorowane za pomocą elektrokardiogramu cienkich elektrod wszczepianych podskórnie) oraz Częstość oddechów (130-140 oddechów na minutę - monitorowane za pomocą spirometru podłączonego do systemu rejestracji EKG).
      UWAGA: Opis konfiguracji eksperymentalnej znajduje się w Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Konfiguracja eksperymentalna dla znieczulonych eksperymentów fUS. Opis stanowiska eksperymentalnego pokazujący cały sprzęt naukowy potrzebny podczas znieczulonego eksperymentu. 1. Monitorowanie fizjologiczne: wyświetlanie na żywo częstotliwości zarówno oddechowych, jak i sercowych. 2. Czteroosiowy moduł silnikowy (trzy translacje i jeden obrót) monitorowany przez system Iconeus One (9) i pozwalający na wykonywanie przezczaszkowych skanów tomograficznych 3D lub akwizycji 4D. ust. 3a. Serwomotor napędzający stymulator wąsów (3b.): Serwomotor jest sterowany przez kartę arduino uno, która jest połączona z systemem Iconeus One (9) w celu synchronizacji wzorców stymulacji z sekwencjami obrazowania. 4.a. Sterownik pompy strzykawkowej. Rozdział 4.b. Uchwyt na strzykawkę. 5.a. Monitor płyty temperaturowej sterujący płytą grzewczą. pkt 5.b. Płyta grzewcza i termometr doodbytniczy sprzężone z płytką monitorującą temperaturę (5.a.). 6. Żel ultradźwiękowy umieszczony między głową zwierzęcia a sondą ultradźwiękową, zapewniający akustyczne sprzężenie między nimi. 7. Sonda ultradźwiękowa 15 MHz. 8. Uchwyt sondy łączący sondę (7) z modułem silnika (2). 9. Sprzęt i oprogramowanie Iconeus One, umożliwiające programowanie różnych sekwencji obrazowania i sterowanie modułem silników (2) napędzającym sondę (7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie zwierząt do eksperymentów na myszach z głową na jawie

  1. Chirurgia płytki czołowej
    1. Umieść znieczulone zwierzę (kroki 1.1-1.2) w ramce stereotaktycznej na poduszce grzewczej (37 °C). Nałóż żel ochronny na oczy i podaj lidokainę s.c. (0,2 ml, 2%) pod skórę głowy za pomocą igły o rozmiarze 26 i odczekaj kilka minut.
      UWAGA: Monitoruj poziom znieczulenia co 10-30 minut w odpowiedzi (braku) na mocne uszczypnięcie palca.
    2. Wykonaj nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego od tyłu kości potylicznej do początku kości nosowej. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wytnij skórę na obu półkulach.
    3. Oczyść czaszkę 1% roztworem jodu i usuń pozostałą okostną. Używając płyty głowicy jako szablonu, wywierć dwa otwory (o średnicy 1 mm) w czaszce, aby umieścić kotwiące.
      UWAGA: Uważaj, aby nie przewiercić całkowicie czaszki, aby uniknąć uszkodzeń mózgu lub zapalenia opony twardej
    4. Ustaw płytę głowicy za pomocą. Użyj cementu dentystycznego, aby przymocować i płytę głowicy z przodu i z tyłu ramy, aby utrzymać dobry chwyt implantu.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie nakładać cementu wewnątrz okna ramy, ponieważ znacznie pogarsza to jakość sygnału. Przykryj czaszkę cienką warstwą kleju chirurgicznego, aby chronić kość i uszczelnić rany po stronie okienka obrazowania.
    5. Po wyschnięciu cementu należy wyjąć zwierzę z ramy stereotaktycznej i odwrócić znieczulenie, podając podskórnie atipamezol w dawce 1 mg/kg. Meloksykam podawany jest profilaktycznie (5 mg/kg mc./dobę, s.c.) w przypadku bólu pooperacyjnego.
    6. Umieścić zwierzę w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej (37 °C). Mysz może wrócić do domowej klatki z rodzeństwem z miotu w ciągu kilku godzin. Umieść magnetyczną nasadkę wydrukowaną w 3D (materiał kwasu polioctowego z wkładkami magnetycznymi) na główce w celu ochrony (Rysunek 2A). Pozostaw mysz do rekonwalescencji na 4 do 6 dni przed rozpoczęciem przyzwyczajania się do klatki w domku mobilnym (MHC).
      UWAGA: Łączna waga nakrętki i główki wynosi 2,8 g.
  2. Obchodzenie się i przyzwyczajenie
    1. W 1. dniu po rekonwalescencji (PR) delikatnie trzymaj mysz w dłoni przez 5-10 minut kilka razy dziennie.
    2. W dniu 2 PR powtórz obchodzenie się jak w dniu 1 i pozostaw zwierzę na 5-10 minut w celu swobodnego eksplorowania MHC.
      UWAGA: Odtwarzanie muzyki w tle w pokoju może pomóc zmniejszyć stres zwierzęcia.
    3. W dniu 3 PR pozwól zwierzęciu swobodnie eksplorować MHC przez 5-10 minut. Następnie ostrożnie chwyć główkę i delikatnie umieść ją w zacisku, ręcznie przesuwając klatkę węglową, która będzie towarzyszyć myszy. Przyzwyczajaj zwierzę do pozycji z głową na 5-10 minut. Wyczyść MHC między sesjami treningowymi 70% roztworem etanolu i spłucz wodą z kranu.
      UWAGA: Upewnij się, że MHC otrzymuje wystarczający przepływ powietrza zgodnie z zaleceniami producenta. Wysokość zacisku głowicy należy regulować ręcznie, aby zapewnić wygodną pozycję.
    4. W 4 i 5 dniu PR kilkakrotnie zaciskaj MHC myszy i stopniowo zwiększaj czas ustalania głowy, zaczynając od 5 minut do 30 minut. Nałóż trochę soli fizjologicznej i żelu ultradźwiękowego na okienko obrazowania, aby się przyzwyczaić.
    5. W dniu 6 PR powtórz protokół z dnia 4/5 PR i umieść sondę nad głową zwierzęcia zgodnie z krokiem 3.1.
    6. W dniu eksperymentu postępuj zgodnie z powyższym opisem. Następnie nawilż okienko obrazowania solą fizjologiczną i nałóż trochę żelu do ultradźwięków. Rozpocznij śledzenie zwierzęcia i przejdź do pozycjonowania sondy (patrz poniżej).
      UWAGA: Zaciskanie w MHC można również wykonać, owijając mysz szmatką. W takim przypadku myszy muszą być przyzwyczajone do procedury owijania przed unieruchomieniem głowy. Opis kompletnego zestawu eksperymentalnego do obrazowania w stanie czuwania znajduje się w Rysunek 2B.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Konfiguracja eksperymentalna do eksperymentów z przebudzeniem fUS. A. Schematyczna ilustracja magnetycznej osłony płyty czołowej chroniącej okno obrazowania (utworzonej za pomocą BioRender.com). Podczas sesji obrazowania (po lewej) pokrywa jest zdejmowana w celu zeskanowania mózgu w dużym otworze oferowanym przez płytę głowy. Ur. Zdjęcie eksperymentalnego zestawu do przezczaszkowego obrazowania wybudzenia u myszy swobodnie zachowujących się z głową zakutych w głowę. 1. System i oprogramowanie Iconeus One, pozwalające na ustawianie różnych sekwencji obrazowania i sterowanie modułem silników. 2. Czteroosiowy moduł silników (trzy translacje i jeden obrót) monitorowany przez system Iconeus One (1) i umożliwiający skany tomograficzne 3D lub akwizycje 4D. 3. Stół dozujący powietrze. 4. Klatka domu mobilnego (MHC). 5a,5b. Fotografie przedstawiające bliższe spojrzenie na środowisko zwierzęcia wewnątrz MHC. 6. System mocowania głowicy zaciskający płytę głowicy. 7. Uchwyt sondy łączący sondę z modułem silnika (2). 8. Sonda ultradźwiękowa 15 MHz. 9. Żel ultradźwiękowy umieszczony między główką myszy a sondą ultradźwiękową, zapewniający sprzężenie akustyczne między nimi. 10. Serwomotor napędzający stymulator wąsów. Serwomotor jest sterowany przez kartę Arduino Uno, która jest sprzężona z systemem Iconeus One za pomocą sygnału TTL (1) w celu synchronizacji wzorców stymulacji z sekwencjami obrazowania. C. Ilustracja różnych możliwości próbkowania przestrzennego (utworzonych za pomocą BioRender.com): w każdym przypadku sonda jest przesuwana od pierwszej pozycji do ostatniej, a obraz Dopplera jest rejestrowany w każdej pozycji w celu zrekonstruowania objętości stosowej. Proces ten jest stale powtarzany przez cały czas akwizycji. Gęste skanowanie (po lewej): odstęp między warstwami musi być wystarczająco mały (zwykle 400 μm, co odpowiada rozdzielczości wysokości), aby umożliwić obrazowanie wolumetryczne. Skanowanie rzadkie (po prawej): jeśli celem są odległe obszary funkcjonalne (w różnych pozycjach), możliwe jest również zmniejszenie próbkowania przestrzennego, aby zobrazować różne warstwy, które przecinają te obszary, bez uszczerbku dla próbkowania czasowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Pozycjonowanie sondy

  1. Uruchom oprogramowanie (np. IcoScan) i utwórz sesję eksperymentalną. Przejdź do menu Przesuń sondę, aby dostosować pozycję sondy ultradźwiękowej za pomocą klawiatury nawigacyjnej.
    UWAGA: Sonda powinna być umieszczona około 1 mm nad głową zwierzęcia. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że sonda ma kontakt z żelem ultradźwiękowym przed rozpoczęciem jakiejkolwiek sekwencji obrazowania.
  2. Rozpocznij akwizycję w trybie Live View i w razie potrzeby dostosuj pozycję sondy za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym CBV (objętości krwi w mózgu). Ustaw mózg na środku obrazu. Zoptymalizuj parametry obrazowania, aby uchwycić najwyższy stosunek sygnału do szumu.
    UWAGA: W eksperymentach na obudzonych myszach rozmiar otworu musi zostać zmniejszony, aby uniknąć artefaktów wywołanych skurczem mięśni bocznych.

4. Skan angiograficzny i rejestracja w atlasie

  1. Otwórz opcję Angio 3D w oprogramowaniu do akwizycji. Na panelu ustawień wstępnych dostosuj parametry skanowania (pierwszy wycinek, ostatni wycinek i rozmiar kroku), aby zeskanować cały mózg (Rysunek 3A, B) i rozpocznij akwizycję.
    UWAGA: Ustawiając parametry skanowania, upewnij się, że skan obejmie tylną część mózgu
  2. Pozostaw otwarte oprogramowanie do akwizycji i uruchom oprogramowanie do analizy i wizualizacji danych (np. IcoStudio), a następnie załaduj skan angio 3D. Poruszaj się po objętości akwizycji za pomocą panelu 3 widoków i wybierz kierunek skanowania koronalnego: przednio-tylny lub tylno-przedni.
  3. Przejdź do panelu rejestracji mózgu. Załaduj szablon odniesienia do myszy, który będzie potrzebny w procesie rejestracji. Zarejestruj skan w Allen Mouse Common Coordinates Framework, korzystając z w pełni automatycznego lub ręcznego trybu rejestracji (Rysunek 3C).
  4. Sprawdź wynik, patrząc na superpozycję skanu 3D angio i szablonu referencyjnego lub patrząc na superpozycję skanu i atlasu referencyjnego Allena za pomocą panelu Atlas Manager (Rysunek 3D). Zapisz rejestrację jako plik .bps.
    UWAGA: Plik rejestracyjny może być ponownie wykorzystany do dowolnej innej akwizycji wykonanej podczas tej samej sesji eksperymentu.

5. System Pozycjonowania Mózgu (BPS)

  1. W oprogramowaniu IcoStudio upewnij się, że skan angiograficzny i jego plik .bps (wygenerowany w kroku 4.4) są załadowane.
  2. Przejdź do panelu nawigacji mózgu. W panelu Menedżer atlasu nawiguj po atlasie mózgu imbusa imbusa imbusa myszy za pomocą nawigatora drzewa nadrzędnego/podrzędnego. Znajdź anatomiczne obszary docelowe i wybierz je, aby nałożyć je na skan w 3 widokach.
  3. Zwizualizuj docelowe regiony w panelu 3 widoków i wybierz płaszczyznę obrazowania, która nakłada się na obszary docelowe eksperymentu. Aby to zrobić, ręcznie ustaw dwa znaczniki w pozycji koronalnej, która obejmuje obszary zainteresowania.
  4. Kliknij Brain Positioning System (BPS), aby wyodrębnić wynikowe współrzędne motoryczne. Współrzędne te odpowiadają położeniu sondy, co pozwala na zobrazowanie docelowej płaszczyzny. Sprawdź podgląd obrazu, który jest obliczany na podstawie skanu naczynia.
  5. W oprogramowaniu IcoScan wejdź w panel Pozycjonowanie sondy i kliknij Wprowadź współrzędne BPS. Zastosuj współrzędne podane w kroku 5.4. Sonda porusza się i wyrównuje na docelowej płaszczyźnie obrazowania.
  6. Wykonaj akwizycję w trybie podglądu na żywo i sprawdź, czy bieżąca płaszczyzna obrazowania odpowiada prognozie podanej w kroku 5.4.
    UWAGA: Możliwe jest również wybranie płaszczyzn przystrzałkowych/nieortogonalnych.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Szybki przezczaszkowy skan angioograficzny i rejestracja mózgu w celu precyzyjnego pozycjonowania sondy. A. Schematyczne przedstawienie mózgu myszy skanowanego przezczaszkowo przez sondę ultradźwiękową od pierwszego wycinka koronalnego (zielony) do ostatniego wycinka koronalnego (niebieski) podczas szybkiego skanowania angiograficznego. Aktualnie zobrazowany wycinek (reprezentowany na czerwono) porusza się krok po kroku od tyłu (zielony) do przodu (niebieski) mózgu. Utworzony za pomocą BioRender.com B. Zrzut ekranu oprogramowania do akwizycji IcoScan w panelu Angio 3D. Wstępnie ustawione parametry po prawej stronie konfigurują szybkie skanowanie. Pozycje w mm pierwszego wycinka, ostatniego wycinka i wielkości kroku muszą być dobrze dobrane, aby skanować liniowo cały mózg. C. Zrzut ekranu oprogramowania do przetwarzania IcoStudio. Szybki skan 3D Angio jest automatycznie rejestrowany w szablonie referencyjnym mózgu myszy. Trzy widoki (po lewej) pokazują superpozycję układu naczyniowego i atlasu Allena mózgu myszy w widoku koronalnym, strzałkowym i osiowym. D. Liniowy układ (montaż) 16 warstw (z 31) ze skanu 3D angio, z zarejestrowanym atlasem referencyjnym Allena nałożonym na układ krwionośny. E. Zrzut ekranu panelu Brain Navigation pokazujący przewidywaną płaszczyznę obrazowania odpowiadającą współrzędnym motorycznym obliczonym przez oprogramowanie dzięki dwóm znacznikom umieszczonym w środku lewej i prawej pierwotnej kory somatosensorycznej, obszaru pól beczkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

6. Eksperyment wywołany zadaniem: stymulacja wąsów

  1. Zdefiniuj sekwencję stymulacji, w tym czas stymulacji, czas między stymulacjami i liczbę powtórzeń.
  2. Uruchom sekwencję 3D fUS, definiując całkowity czas przejęcia, liczbę pozycji, a także czas martwy między pozycjami. W przypadku automatycznej stymulacji zsynchronizowanej z systemem akwizycji poprzez wejście TTL, przed rozpoczęciem akwizycji należy wybrać opcję Trig-IN.
    UWAGA: W przypadku wyników przedstawionych w tej pracy, stymulacja została dostarczona za pomocą bawełnianego wacika umieszczonego tak, aby umożliwić odchylenie większości wąsów w kierunku grzbietowym/brzusznym. Został on zamocowany na serwomotorze napędzanym przez kartę Arduino UNO, podłączonym do systemu Iconeus One w celu zapewnienia synchronizacji. Zalecane parametry stymulacji to 30 s ON, 30 s OFF, amplituda 20° i częstotliwość 4 Hz. Alternatywnie, stymulacja może być również dostarczana ręcznie poprzez odchylanie wąsów w określonych momentach podczas akwizycji.
  3. Otwórz akwizycję w oprogramowaniu IcoStudio i wejdź do menu Mapa aktywacji. Wypełnij pole wzorca aktywacji godzinami rozpoczęcia i zakończenia, a następnie oblicz mapę aktywacji. Dostosuj parametry wyświetlania dla wizualizacji. Eksportuj mapę aktywacji jako plik .h5 do analizy off-line.
    UWAGA: Aktywacja jest szacowana przy użyciu podejścia opartego na uogólnionym modelu liniowym (GLM), w którym bodziec jest konwoluowany przez domyślną odpowiedź hemodynamiczną myszy (HRF). Alternatywnie, aktywację można wizualizować bezpośrednio, szacując korelację Pearsona między wzorcem stymulacji a sygnałem hemodynamicznym z każdego woksela.

7. Funkcjonalna łączność 4D

  1. Uruchom sekwencję 3D fUS, definiując całkowity czas akwizycji, liczbę pozycji płaszczyzny obrazowania, a także czas martwy między pozycjami.
    UWAGA: W przypadku funkcjonalnej łączności 4D zalecamy czas akwizycji między każdym woluminem < 2,5 s (częstotliwość próbkowania co najmniej 0,4 Hz) i całkowity czas akwizycji co najmniej 10 minut (liczba punktów czasowych > 180).
  2. Zapisz akwizycję i załaduj ją do oprogramowania IcoStudio. W razie potrzeby załaduj plik .bps i strukturę współrzędnych mózgu myszy Allena. W Menedżerze atlasu wybierz regiony atlasu jako regiony zainteresowania (ROI).
  3. Wejdź do menu Łączność funkcjonalna i wybierz żądane regiony w menedżerze ROI. Wizualizuj wyniki jako macierz połączeń (analiza nadzorowana) lub mapa korelacji oparta na nasionach (bez nadzoru). Wybierz i dostosuj filtry przepustowości zgodnie z potrzebami i wyeksportuj wyniki korelacji do analizy statystycznej.
    UWAGA: W trybie obrazowania 3D fUS względne pozycje sondy są ustawiane ręcznie. W związku z tym możliwe są dwa rodzaje skanowania, które można wybrać w zależności od funkcjonalnego zastosowania: skany gęste i skany rzadkie (Rysunek 2C).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ilościowe określanie 3D zmian hemodynamicznych mózgu przezczaszkowo w mózgu myszy, w spoczynku lub w odpowiedzi na stymulację sensoryczną. Stymulacja wąsów, standardowy paradygmat mapowania aktywacji funkcjonalnej mózgu u gryzoni, została wybrana jako przykład reakcji wywołanej stymulacją sensoryczną. Rysunek 4 pokazuje reprezentatywną mapę aktywacji w odpowiedzi na mechaniczną stymulację wąsów u znieczulonej myszy, uzyskaną za pomocą przezczaszkowego obrazowania fUS. Całkowity czas próby wynosił 760 s, z 60 s punktem wyjściowym (przed i po stymulacji), 80 s stymulacji i 60 s czasem rekonwalescencji, powtórzonym 5x. Istotną aktywację określono z rozdzielczością ogólnego modelu liniowego (GLM) przy użyciu domyślnej funkcji odpowiedzi hemodynamicznej myszy (HRF). Aktywowane regiony (wyniki Z o wartości p >0,0000006 po rygorystycznej korekcji Bonferroniego dla wielokrotnego porównania) są wyświetlane jako wartości oznaczone kolorami nałożone na szablon wspólnej ramy współrzędnych Allena. Przebieg czasowy pod względem wokseli przeciwległej pierwotnej kory somatosensorycznej, obszar pola beczkowego (S1BF) ujawnił 15-20% wzrost CBV w porównaniu z wartością wyjściową.

figure-results-1
Rysunek 4: Mapy aktywacji przezczaszkowej i przebieg czasowy rCBV po stymulacji wąsów u myszy znieczulonej ketaminą/ksylazyną. A. Mapa aktywacji pokazująca znacząco aktywowane woksele po mechanicznej stymulacji prawych wąsów (80 s ON, 60 s OFF, 5x) w znieczuleniu ketamina/ksylazyna. Mapy uzyskano poprzez obliczenie wskaźników Z w oparciu o ogólną analizę modelu liniowego (GLM) z poprawką Bonferroniego do wielokrotnego porównania. Punkty Z (oznaczone kolorami) są nakładane na szablon 3D mózgu Allena (po zarejestrowaniu się w systemie pozycjonowania mózgu) i wyświetlane w trzech widokach: koronalnym (po lewej), strzałkowym (w środku) i osiowym (po prawej). Obszary anatomiczne z układu współrzędnych wspólnych mózgu myszy Allena są wyświetlane w celach informacyjnych. Aktywowane woksele są dobrze zlokalizowane w lewej korze S1BF. Podziałka: 1 mm. Każda objętość próbki została zeskanowana na przestrzeni 2,8 mm (co odpowiada 7 warstwom w kierunku elewacji) w ciągu 3,85 s, co pozwoliło na zarejestrowanie 20 próbek objętościowych podczas każdej odpowiedzi funkcjonalnej. B. Renderowanie 3D względnego wzrostu objętości krwi mózgowej (rCBV) wywołanego stymulacją wąsów w porównaniu z poziomem wyjściowym. Anatomiczny zarys S1BF jest zaznaczony na niebiesko. C. Przebieg w czasie zmian CBV w lewym S1BF (niebieski) i zastosowany odpowiedni bodziec (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten sam paradygmat został zastosowany w myszy zachowującej się jak głowa w mobilnej klatce domowej przy użyciu ustawienia wybudzenia IcoScan. Rysunek 5 przedstawia mapę aktywacji po eksperymencie z wielokrotną stymulacją wąsów przy użyciu eksperymentalnej konfiguracji opisanej w Rysunek 2. Kilka tylnych i ogonowych wąsów stymulowano według następującego wzorca: linia bazowa 30 s, a następnie pięć kolejnych prób 30 s ON (4 Hz) i 30 s OFF (Rysunek 5C). Stymulacja była dostarczana za pomocą serwomotoru napędzanego kartą Arduino UNO, wyzwalającego sekwencję akwizycji obrazu w celu synchronizacji. Istotną aktywację określono z rozdzielczością ogólnego modelu liniowego (GLM) przy użyciu domyślnej funkcji odpowiedzi hemodynamicznej myszy (HRF). Wielokrotną korektę porównawczą wykonano metodą Bonferroniego. Konwencjonalny poziom alfa wynoszący 0,05 został znormalizowany przez całkowitą liczbę wokseli w objętości akwizycji, co dało ostateczny rygorystyczny próg 0,000003.

figure-results-2
Rysunek 5: Mapy aktywacji i przebieg czasowy rCBV po stymulacji wąsów u czujnie zachowującej się myszy. A. Mapa aktywacji pokazująca znacząco aktywowane woksele po mechanicznej stymulacji prawych wąsów (30 s ON, 30 s OFF, 5x) u obudzonej myszy w mobilnej klatce. Mapy uzyskano poprzez obliczenie wskaźników Z w oparciu o ogólną analizę modelu liniowego (GLM) z poprawką Bonferroniego dla wielokrotnego porównania (normalizacja przez całkowitą liczbę wokseli). Punkty Z (oznaczone kolorami) są nakładane na szablon 3D mózgu Allena (po rejestracji w Brain Positioning System) i wyświetlane w trzech widokach: koronalnym (po lewej), strzałkowym (w środku) i osiowym (po prawej). Regiony anatomiczne z Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework są wyświetlane w celach informacyjnych. Aktywowane woksele są dobrze zlokalizowane w lewej korze S1BF. Pręty podziałki, 1 mm. Każda objętość próbki została zeskanowana na przestrzeni 1,6 mm (co odpowiada 3 warstwom w kierunku elewacji) w ciągu 3,85 s, co pozwoliło na zarejestrowanie 17 próbek objętościowych podczas każdej odpowiedzi funkcjonalnej. B. Renderowanie 3D względnego wzrostu objętości krwi mózgowej (rCBV) wywołanego stymulacją wąsów w porównaniu z poziomem wyjściowym. Anatomiczny zarys S1BF jest zaznaczony na niebiesko. C. Ilustracja myszy w mobilnej klatce domowej podczas eksperymentu ze stymulacją prawego wąsa, podczas którego przeprowadzono pięć prób 30 s o łącznym czasie akwizycji 330 s. D. Chwilowy względny przebieg czasowy CBV wyodrębniony wewnątrz aktywowanego obszaru (niebieski), z nałożonym odpowiednim bodźcem (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6 pokazuje czasowe korelacje znormalizowanych spontanicznych fluktuacji CBV o niskiej częstotliwości (<0,2 Hz) między obszarami mózgu 3D (zidentyfikowanymi na podstawie rejestracji do wspólnego układu współrzędnych Allena) u myszy znieczulonej ketaminą i ksylazyną. Całkowity czas akwizycji wynosił 20 min (1200 s). Analiza nadzorowana przez Atlas ujawniła silne wzorce połączeń międzypółkulowych, z wynikającymi wartościami współczynników korelacji do 0,8. Analiza oparta na nasionach w hipokampie grzbietowym ujawniła znaczącą łączność międzypółkulową między prawym i lewym hipokampem, a także głębokie obszary zahipokampa i korę gruszkowatą. Region nasienny wybrany w S1BF również spowodował symetryczny (korowo-korowy) wzorzec korelacji, jak opisano wcześniej.

figure-results-3
Rysunek 6: Przezczaszkowa wolumetryczna funkcjonalna łączność mózgu myszy w stanie spoczynku w znieczuleniu ketaminą/ksylazyną oceniona po 20-minutowym akwizycji 3D fUS. A. Macierz korelacji oparta na regionach 3D wspólnego układu współrzędnych Allena zarejestrowanych na przezczaszkowej akwizycji funkcjonalnej. Macierz uzyskuje się przez obliczenie znormalizowanej korelacji Pearsona spontanicznych fluktuacji niskiej częstotliwości (<0,1 Hz) średnich sygnałów czasowych ze wszystkich wokseli zawartych w każdym zidentyfikowanym ROI po korekcie czasu warstwy. Każda próbkowana objętość została zeskanowana na ponad 1,6 mm w kierunku elewacji (odpowiadającym 4 warstwom) uzyskanym w ciągu 2,2 s. B. Analiza oparta na nasionach rzutowana na szablon 3D. Nasiona wyselekcjonowano w obrębie prawego hipokampa grzbietowego na β - 2,1 mm. Mapę korelacji uzyskuje się poprzez obliczenie współczynnika korelacji Pearsona między sygnałami czasowymi ziarna a każdym wokselem całej akwizycji po korekcie czasu wycinka. C. Mapa korelacji 3D oparta na analizie opartej na nasionach z wybranym regionem nasion w ramach S1BF na β - 2,1 mm. Podziałka skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody obrazowania całego mózgu są kluczowymi narzędziami do lepszego zrozumienia fizjologii i patologii mózgu. Opisana tutaj metoda pozwala na precyzyjną kwantyfikację sygnałów hemodynamicznych w żywym mózgu bezpośrednio na stanowisku laboratoryjnym. Niezrównana czułość i rozdzielczość czasoprzestrzenna ultradźwięków funkcjonalnych jest szczególnie dobrze dopasowana do fizjologii myszy. Reakcje funkcjonalne i sieci w stanie spoczynku mogą być mapowane w krótkim czasie akwizycji, podłużnie i bez konieczności uśredniania prób lub badanych w celu uzyskania wiarygodnego pomiaru. Odpowiednia kombinacja ultradźwiękowych sond liniowych o wysokiej czułości i szybkich konfiguracji zmotoryzowanych umożliwia wykonanie przezczaszkowego wolumetrycznego obrazowania fUS u myszy w rozsądnym czasie akwizycji. Protokół ten można wykonać na znieczulonych lub obudzonych myszach za pomocą mobilnej klatki domowej.

Stymulacja wąsów, bodziec sensoryczny użyty jako ilustracyjny przykład w tym manuskrypcie, jest standardowym paradygmatem aktywacji funkcjonalnej u gryzoni i wiarygodnym odczytem do badania przetwarzania sensorycznego, sprzężenia nerwowo-naczyniowego i ich zmian 5,6,10, 11. Podczas gdy zgrubne ręczne szczotkowanie wąsów może być preferowane ze względu na łatwość użycia, tej metodzie brakuje precyzji przestrzennej i czasowej. Zastosowanie automatycznego stymulatora, takiego jak ten opisany tutaj, uruchamiany za pomocą skanera obrazowania fUS, pozwala na lepszą kontrolę kilku parametrów, w tym czasu wystąpienia, przemieszczenia amplitudy, częstotliwości, a także kąta końcówki Q/grzebienia, co skutkuje lepszą odtwarzalnością między zwierzętami. Dodatkowo, bardziej precyzyjny czas stymulacji umożliwia modelowanie funkcji odpowiedzi hemodynamicznej (HRF) poprzez określenie parametrów czasu do wystąpienia i czasu do osiągnięcia szczytu12,13. Aby zapewnić lepszą precyzję co do liczby wąsów odchylonych podczas stymulacji (a tym samym obszaru aktywowanego obszaru), do tego protokołu można dostosować bardziej wyrafinowane stymulatory. Wiele innych bodźców, takich jak światło8, dźwięk14 lub prezentacja zapachu15, może być realizowanych przy użyciu tego samego protokołu.

Kompatybilność funkcjonalnego ultrasonografu z obudzonymi i zachowującymi się zwierzętami jest ważną zaletą w porównaniu z innymi technikami neuroobrazowania, umożliwiając funkcjonalne mapowanie aktywacji bez stronniczości znieczulenia. Korzystanie z mobilnej klatki domowej podnoszonej powietrzem jest dobrą alternatywą dla innych istniejących urządzeń mocowanych na głowę, takich jak bieżnie liniowe lub sferyczne. Ruch klatki domowej jest mocno zamocowany w głowie, ale daje myszowi złudzenie poruszania się po otoczeniu, co pozwala na połączenie szerokiego zakresu testów behawioralnych z obrazowaniem fUS16. Jednak procedura przyzwyczajenia do mocowania głowy stanowi ważny krok w kierunku zmniejszenia stresu, szczególnie w przypadku eksperymentów, w których można go uznać za czynnik zakłócający. Opisana tutaj procedura (6 dni obsługi i przyzwyczajenia do fiksacji głowy) daje solidne wyniki w zakresie stymulacji sensorycznej i funkcjonalnej łączności w stanie spoczynku. Może być jednak konieczne wydłużenie okresu przyzwyczajenia w przypadku bardziej wyrafinowanych testów behawioralnych17.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeremy Ferrier i Bruno-Félix Osmanski są pracownikami Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski i Mickael Tanter są współzałożycielami i udziałowcami Iconeus.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Europejski Grant Naukowy (ERC) nr 339244-FUSIMAGINE, Narodową Agencję Badań finansującą 'Pinch' (ANR-18-CE37-005), Akcelerator Technologii Badawczych Inserm w Ultrasonografii Biomedycznej, techniczny rdzeń ElfUS IPNP, Inserm U1266, europejski program badawczy FUSIMICE of the Human Brain Project oraz EMBO Short-Term Fellowship 8439 dla Andrei Kliewer.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawki BD Plastipak 1 mlHotscher, Francja303172
Igły BD Microlance 26 GaugeDutscher, Francja303800
Regulator temperatury zwierząt (płyta grzewcza sprzężona z sondą doodbytniczą)PhysitempTCAT-2DF
ArduinoArduinoArduino Uno-Rev3
AtipamezoleOrion Pharma, FrancjaAntysedan®5 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
Dental CimentSun Mé dical, Shiga, japoniaSuperbond C& B
Krem do depilacjiKloraneN/A
Maść pod oczyTVM, Wielka BrytaniaOcry-gel
Maszynka do golenia włosówWella ProfesionnalsN/A Płyty
czołoweNeurotar, FinlandiaModel 14
Iconeus One standardowy pakiet dla fUSIconeus, FrancjaIconeus One
Oprogramowanie akwizycyjne IcoScan ( v1.0)Iconeus, FrancjaIcoScan
Oprogramowanie analityczne IcoStudio (v1.0)Iconeus, FrancjaIcoStudio
Isoflurane Stacja anestezjologicznaMinerve, Esternay, Francja
KetamineVirbac, FrancjaKetamina1000100 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
LidokainaVetoquinolLurocaine®20 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
MedetomidineOrion Pharma, FrancjaDomitor®1 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
MeloxicamBoehringer lingelheimMetacam®0,5 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
Mobilna klatka domowa Duża z możliwością śledzeniaNeurotar, FinlandiaMHC-L-T-V4
Monitorowanie EKG i częstości oddechówSystemy AD, (USA) i oprogramowanie
SerwomotorFeetechFT90B
Rama stereotaktycznaDavid Kopf (Tujunga, USA)900-WAza pomocą adaptera myszy  (Ref: 922) i niepękające paski uszne (ref: 922)
Klej chirurgiczny3M, USAVetbond
Pompa strzykawkowaKD Scientific, USALegato® 130, Cat# 788130
Żel ultradźwiękowyDREXCO medical, FrancjaMedi'Gel
Xylazine 2%Bayer, FrancjaRompun®20 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
LabChart

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).">Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
  2. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).">Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
  3. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231(2020).">Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231(2020).
  4. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).">Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
  5. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).">Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
  6. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).">Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
  7. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).">Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
  8. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).">Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
  9. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).">Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
  10. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).">Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
  11. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).">Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
  12. Pain. , (2020).">Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
  13. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954(2020).">Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954(2020).
  14. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028(2018).">Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028(2018).
  15. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110(2019).">Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110(2019).
  16. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869(2014).">Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869(2014).
  17. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245(2020).">Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Functional Ultrasound ImagingWhole Brain MappingCerebral Blood VolumeFunctional Connectivity3D Brain ActivationAwake Mouse ImagingSensory StimulationHemodynamic ResponseBrain RegistrationSeed Based Analysis

Related Articles