Artykuł metodologiczny

Aktywacja 3D całego mózgu i mapowanie łączności funkcjonalnej u myszy przy użyciu przezczaszkowego funkcjonalnego obrazowania ultrasonograficznego

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62267

⸱

24 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics for Medicine Paris, ESPCI Paris, INSERM, CNRS, PSL Research University, 2Institute of Psychiatry and Neurosciences of Paris, INSERM U1266, Université de Paris, 3Iconeus, 4Department of Pharmacology and Toxicology, Jena University Hospital - Friedrich Schiller University Jena

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kwantyfikację wolumetrycznych zmian hemodynamicznych mózgu w mózgu myszy za pomocą funkcjonalnych ultradźwięków (fUS). Procedury dla mapy aktywacji funkcjonalnej 3D po stymulacji sensorycznej, a także łączności funkcjonalnej w stanie spoczynku są przedstawione jako przykłady ilustracyjne u myszy znieczulonych i obudzonych.

Streszczenie

Funkcjonalne obrazowanie ultrasonograficzne (fUS) to nowatorska metoda obrazowania mózgu, która opiera się na wysokiej czułości pomiaru objętości krwi mózgowej uzyskanej za pomocą ultraszybkiej angiografii dopplerowskiej. Ponieważ perfuzja mózgu jest silnie powiązana z lokalną aktywnością neuronalną, technika ta umożliwia mapowanie 3D całego mózgu aktywacji regionalnej wywołanej zadaniem, a także funkcjonalnej łączności w stanie spoczynku, nieinwazyjnie, z niezrównaną rozdzielczością czasoprzestrzenną i prostotą obsługi. W porównaniu z fMRI (funkcjonalnym rezonansem magnetycznym), główną zaletą obrazowania fUS jest umożliwienie pełnej kompatybilności z eksperymentami na zwierzętach czuwających i zachowujących się. Co więcej, mapowanie mózgu metodą fMRI u myszy, najczęściej stosowany model przedkliniczny w neurobiologii, pozostaje wyzwaniem technicznym ze względu na mały rozmiar mózgu i trudności w utrzymaniu stabilnych warunków fizjologicznych. Tutaj przedstawiamy prosty, niezawodny i solidny protokół obrazowania fUS całego mózgu u znieczulonych i wybudzonych myszy przy użyciu gotowego komercyjnego systemu fUS z zmotoryzowanym przetwornikiem liniowym, zapewniającym znaczną aktywację kory mózgowej po stymulacji sensorycznej, a także powtarzalny wzorzec funkcjonalnej łączności 3D do identyfikacji sieci.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad, neuroobrazowanie stało się ważnym narzędziem do badania funkcji i organizacji mózgu, umożliwiając naukowcom dokonywanie ważnych odkryć w dziedzinie neuronauki. Obecnie funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (fMRI) stało się złotym standardem klinicznej techniki neuroobrazowania do oceny aktywacji mózgu wywołanej przez zadanie lub lek oraz do mapowania funkcjonalnej łączności w spoczynku. Podczas gdy ludzkie fMRI ma wysoką niezawodność i czułość, mysie fMRI pozostaje technicznie trudne z wielu powodów1. Po pierwsze, fMRI ma słabą rozdzielczość przestrzenną i czasową. Niewielki rozmiar mózgu myszy wymusza użycie silnych pól magnetycznych przy użyciu drogich skanerów w celu uzyskania rozsądnej rozdzielczości przestrzennej. Po drugie, utrzymanie stabilnych parametrów fizjologicznych w wąskim zakresie umożliwiającym skuteczne sprzężenie nerwowo-naczyniowe jest bardzo trudne u znieczulonych myszy. Wreszcie, sygnał zależny od poziomu tlenu we krwi (BOLD), na którym opierają się badania fMRI, ma stosunkowo słabą czułość, co prowadzi do niskiego stosunku sygnału do szumu w przypadku zastosowania u myszy i często wymaga wielokrotnej prezentacji bodźca przez długi czas akwizycji w celu wykrycia niewielkich zmian. Mysz jest najczęściej wykorzystywanym modelem zwierzęcym w biomedycznych badaniach przedklinicznych, a ograniczenia te są częściowo odpowiedzialne za lukę translacyjną w neuropsychiatrii, utrudniając transpozycję nowych obiecujących celów terapeutycznych na stanowisku do skutecznych terapii przy łóżku pacjenta.

Funkcjonalne ultrasonografie (fUS) to niedawno opracowana technika neuroobrazowania oparta na ultraszybkim dopplerze2. Dzięki bezpośredniemu pobieraniu próbek objętości krwi mózgowej, technika ta umożliwia sondowanie aktywności mózgu w czasie rzeczywistym poprzez sprzężenie nerwowo-naczyniowe. W porównaniu z innymi technikami neuroobrazowania, fUS daje rozdzielczość przestrzenną 100 μm i rozdzielczość czasową w dziesiątkach milisekund. Technika ta umożliwia obrazowanie całego mózgu całych odcinków koronalnych mózgu myszy, całkowicie nieinwazyjnie. Co więcej, jest w pełni kompatybilny ze świadomymi i zachowującymi się zwierzętami3,4,5. Jednym z głównych obecnych ograniczeń fUS jest funkcja 2D, pozwalająca na jednoczesne nagrywanie pojedynczej płaszczyzny koronalnej. Podczas gdy wolumetryczny 3D fUS wykorzystujący przetworniki matrycy 2D został już z powodzeniem zademonstrowany na szczurach6 i potwierdzony na myszach7, jego obecny brak czułości wymaga pełnej kraniotomii, a także uśrednienia dużej liczby prób w celu wykrycia niewielkiej zmiany aktywności. Alternatywnie, przetworniki liniowe mogą być przesuwane w wielu pozycjach i wykonywać funkcjonalne obrazowanie płaszczyzna po płaszczyźnie, aby pokryć cały mózg. Technika ta wymaga jednak licznych powtórzeń paradygmatu eksperymentalnego i jako taka długi czas przyswajania (3-4 godziny dla mózgu myszy)8,9.

W niniejszej pracy opisujemy solidną platformę eksperymentalną, w tym komercyjnie dostępny funkcjonalny skaner ultradźwiękowy i szybki przetwornik liniowy przełączający płaszczyznę z procedurami pozyskiwania danych 3D fUS u znieczulonych i wybudzonych myszy, umożliwiając wolumetryczne i przezczaszkowe funkcjonalne mapowanie mózgu myszy, nieinwazyjnie, bez środka kontrastowego i w krótkim czasie akwizycji. Ilustrujemy tę cechę, mapując aktywację kory somatosensorycznej po stymulacji wąsów, a także funkcjonalną łączność w stanie spoczynku. Oprócz przygotowania zwierząt i zbierania danych, opisujemy również procedurę wizualizacji, rejestracji atlasu i analizy sygnałów fUS w czasie rzeczywistym.

Protokół

Wszystkie przedstawione tutaj procedury zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 22 września 2010 r. (010/63/UE) oraz decyzją lokalnego komitetu etyki (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale numer 59, „Paris Centre et Sud”, projekt #2017-23). Dorosłe myszy (samce C57BL/6 Rj, wiek 2-3 miesiące, masa 20-30 g, z Janvier Labs, Francja) były kwaterowane po 4 osobniki w klatce, przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności, stałej temperaturze 22 °C oraz dostępie do pożywienia i wody ad libitum. Przed rozpoczęciem eksperymentów zwierzęta przeszły co najmniej tygodniowy okres aklimatyzacji do warunków bytowych.

1. Przygotowanie zwierząt do obrazowania fUS w znieczuleniu

  1. Znieczulenie
    1. Zważ mysz.
    2. Przygotuj mieszaninę ketaminy i ksylazyny w stężeniach odpowiednio 10 mg/mL i 2 mg/mL w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Podaj 0,2 mL roztworu ketaminy/ksylazyny drogą dostępu dojelitnego, używając igły 26 G i jednorazowej strzykawki 1 mL. Po kilku minutach umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym, upewniając się, że głowa znajduje się w pozycji poziomej.
    3. Podaj drugą dawkę środków znieczulających, aby osiągnąć całkowitą dawkę 100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny (uwzględniając dawkę początkową).
      UWAGA: Znieczulenie powinno trwać 1 h. Aby utrzymać stabilną sedację przez dłuższy czas, wstrzykuj 0,05 mL mieszaniny ketaminy/ksylazyny co 30 min drogą dostępu dojelitnego.
  2. Przygotowanie zwierzęcia do sesji obrazowania w znieczuleniu
    1. Nanieś maść do oczu (np. Ocry-Gel) na oczy myszy, aby zapobiec tworzeniu się zaćmy podczas sesji obrazowania. Ogol głowę myszy za pomocą trymera. Nałóż krem do depilacji i spłucz po kilku minutach. Powtarzaj czynność do całkowitego usunięcia włókien.
    2. Wprowadź podskórne piny w kończyny do rejestracji elektrokardiogramu (ECG). Nałóż na głowę odwirCowany żel ultradźwiękowy (1500 rpm, 5 min).
    3. Monitoruj głębokość znieczulenia przez cały czas trwania eksperymentów (łącznie z indukcją znieczulenia). Utrzymuj temperaturę zwierząt na poziomie 37 °C, używając koca grzewczego sprzężonego z sondą rektalną.
    4. Monitoruj następujące parametry fizjologiczne, które są pośrednimi wskaźnikami głębokości znieczulenia: Częstotliwość akcji serca (220-250 uderzeń na minutę – monitorowana za pomocą cienkich elektrod EKG wszczepionych podskórnie) oraz Częstotliwość oddechów (130-140 oddechów na minutę – monitorowana za pomocą spirometru podłączonego do systemu akwizycji ECG).
      ​UWAGA: Opis układu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1.

Schemat systemu skupionego ultradźwięku prowadzonego pod kontrolą USG do eksperymentów in vivo dotyczących stymulacji mózgu myszy.
Rysunek 1: Układ eksperymentalny do badań fUS u zwierząt w znieczuleniu. Opis układu eksperymentalnego przedstawiający całą aparaturę naukową niezbędną podczas eksperymentu w znieczuleniu. 1. Monitorowanie fizjologiczne: podgląd na żywo częstotliwości oddechowej i rytmu serca. 2. Czteroosiowy moduł silników (trzy przesunięcia i jeden obrót) monitorowany przez system Iconeus One (9), umożliwiający przeprowadzanie transkranialnych skanów tomograficznych 3D lub akwizycji 4D. 3a. Serwomotor napędzający stymulator wibrysów (3b.). Serwomotor jest sterowany przez kartę Arduino Uno, która jest zintegrowana z systemem Iconeus One (9) w celu synchronizacji wzorców stymulacji z sekwencjami obrazowania. 4.a. Sterownik pompy strzykawkowej. 4.b. Uchwyt strzykawki. 5.a. Monitor płyty temperaturowej sterujący płytą grzewczą. 5.b. Płyta grzewcza i termometr rektalny zintegrowane z monitorem płyty temperaturowej (5.a.). 6. Żel ultradźwiękowy umieszczony między głową zwierzęcia a głowicą ultradźwiękową, zapewniający sprzężenie akustyczne między nimi. 7. Głowica ultradźwiękowa 15 MHz. 8. Uchwyt głowicy łączący głowicę (7) z modułem silników (2). 9. Sprzęt i oprogramowanie Iconeus One, umożliwiające programowanie różnych sekwencji obrazowania i sterowanie modułem silników (2) napędzającym głowicę (7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie zwierząt do eksperymentów na myszach z unieruchomioną głową w stanie czuwania

  1. Operacja wszczepienia płytki głowowej
    1. Umieścić znieczulone zwierzę (kroki 1.1-1.2) w aparacie stereotaktycznym na podgrzewaczu (37 °C). Nałożyć żel ochronny do oczu i podać lidokainę s.c. (0,2 mL, 2 %) pod skórę skalpu za pomocą igły 26G, a następnie odczekać kilka minut.
      UWAGA: Monitorować poziom znieczulenia co 10-30 min, sprawdzając reakcję (lub jej brak) na mocne uciśnięcie palca u stopy.
    2. Wyonać nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego od strony kostnej potylicznej do początku kości nosowej. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wyciąć skórę nad oboma półkulami.
    3. Oczyścić czaszkę 1% roztworem jodu i usunąć pozostałości okostnej. Używając płytki głowowej jako szablonu, wywiercić w czaszce dwa otwory (średnica 1 mm) w celu rozmieszczenia śrub mocujących.
      OSTROŻNIE: Należy uważać, aby nie przewiercić czaszki na wylot, aby uniknąć uszkodzeń mózgu lub zapalenia opony twardej
    4. Ustawić płytkę głowową wraz ze śrubami. Użyć cementu dentystycznego do zamocowania śrub i płytki z przodu i z tyłu ramy, aby zapewnić stabilne trzymanie implantu.
      ​OSTROŻNIE: Należy uważać, aby nie nakładać cementu wewnątrz okna ramy, ponieważ znacznie obniża to jakość sygnału. Przykryć czaszkę cienką warstwą kleju chirurgicznego, aby chronić kość i uszczelnić rany po bokach okna obrazowania.
    5. Wyjąć zwierzę z aparatu stereotaktycznego po wyschnięciu cementu i odwrócić działanie znieczulenia poprzez podskórny zastrzyk atipamezolu w dawce 1 mg/kg. W celu złagodzenia bólu pooperacyjnego podać profilaktycznie meloksykam (5 mg/kg/dzień, s.c.).
    6. Umieścić zwierzę w klatce rekonwalescencyjnej na podgrzewaczu (37 °C). Mysz może wrócić do swojej klatki domowej z towarzyszami w ciągu kilku godzin. Na płytkę głowową nałożyć w celu ochrony magnetyczną nasadkę wydrukowaną w 3D (materiał z kwasu polimlekowego z wstawkami magnetycznymi) (Rycina 2A). Pozostawić mysz do rekonwalescencji na 4 do 6 dni przed rozpoczęciem habituacji do mobilnej klatki domowej (MHC).
      UWAGA: Całkowita masa nasadki i płytki głowowej wynosi 2,8 g.
  2. Obsługa i habituacja
    1. W 1. dniu po rekonwalescencji (PR) delikatnie trzymać mysz w dłoni przez 5-10 min kilka razy dziennie.
    2. W 2. dniu PR powtórzyć obsługę jak w dniu 1. i pozostawić zwierzę na 5-10 min do swobodnej eksploracji MHC.
      ​UWAGA: Puszczenie muzyki w tle w pomieszczeniu może pomóc w redukcji stresu u zwierzęcia.
    3. W 3. dniu PR pozwolić zwierzęciu swobodnie eksplorować MHC przez 5-10 min. Następnie ostrożnie chwycić płytkę głowową i delikatnie umieścić ją w zacisku, przesuwając ręcznie węglową klatkę, aby towarzyszyć myszy. Habituować zwierzę w pozycji z unieruchomioną głową przez 5-10 min. Pomiędzy sesjami treningowymi czyścić MHC 70% roztworem etanolu i płukać wodą z kranu.
      ​UWAGA: Należy upewnić się, że do MHC dociera wystarczający przepływ powietrza, zgodnie z zaleceniami producenta. Wysokość zacisku głowowego musi zostać ręcznie dostosowana, aby zapewnić komfortową pozycję.
    4. W 4. i 5. dniu PR wielokrotnie zaciskać mysz w MHC i stopniowo wydłużać czas unieruchomienia głowy, zaczynając od 5 min do 30 min. W celu habituacji nałożyć niewielką ilość soli fizjologicznej i żelu ultradźwiękowego na okno obrazowania.
    5. W 6. dniu PR powtórzyć protokół z dni 4/5 PR i ustawić głowicę nad głową zwierzęcia zgodnie z krokiem 3.1.
    6. W dniu eksperymentu postępować zgodnie z powyższym opisem. Następnie nawilżyć okno obrazowania solą fizjologiczną i nałożyć żel ultradźwiękowy. Rozpocząć śledzenie zwierzęcia i przejść do pozycjonowania głowicy (patrz poniżej).
      UWAGA: Unieruchomienie w MHC można również przeprowadzić poprzez owinięcie myszy szmatką. W takim przypadku myszy muszą zostać habituowane do procedury owijania przed unieruchomieniem głowy. Opis kompletnej konfiguracji eksperymentalnej do obrazowania w stanie czuwania przedstawiono na Rycina 2B.

Układ obrazowania mózgu myszy; system płytki głownej, schemat sprzętu skanującego, metoda skanowania gęstego/rzadkiego.
Rysunek 2: Układ eksperymentalny do badań fUS u zwierząt w stanie czuwania. A. Schematyczna ilustracja magnetycznej osłony płytki głownej chroniącej okno obrazowania (stworzona za pomocą BioRender.com). Podczas sesji obrazowania (po lewej) osłona jest zdejmowana, aby skanować mózg w dużej aperturze oferowanej przez płytkę głowną. B. Fotografia układu eksperymentalnego do transkranialnego obrazowania myszy w stanie czuwania z unieruchomioną głową, wykazujących swobodne zachowania. 1. System i oprogramowanie Iconeus One, umożliwiające konfigurację różnych sekwencji obrazowania oraz sterowanie modułem silników. 2. Czteroosiowy moduł silników (trzy translacje i jeden obrót) monitorowany przez system Iconeus One (1), umożliwiający skany tomograficzne 3D lub akwizycje 4D. 3. Stół z dozownikiem powietrza. 4. Mobilna klatka domowa (MHC). 5a,5b. Fotografie przedstawiające zbliżenia otoczenia zwierzęcia wewnątrz MHC. 6. System unieruchomienia głowy zaciskający płytkę głowną. 7. Uchwyt sondy łączący sondę z modułem silników (2). 8. Sonda ultradźwiękowa 15 MHz. 9. Żel ultradźwiękowy umieszczony pomiędzy głową myszy a sondą ultradźwiękową, zapewniający sprzężenie akustyczne między nimi. 10. Serwomotor napędzający stymulator wibrysów. Serwomotor jest sterowany przez kartę Arduino Uno, która jest połączona z systemem Iconeus One za pomocą sygnału TTL (1) w celu synchronizacji wzorców stymulacji z sekwencjami obrazowania. C. Ilustracja różnych możliwości próbkowania przestrzennego (stworzona za pomocą BioRender.com): w każdym przypadku sonda przesuwa się krok po kroku od pierwszej do ostatniej pozycji, a w każdym punkcie rejestrowany jest obraz Dopplera w celu rekonstrukcji skumulowanej objętości. Proces ten jest stale powtarzany przez cały czas akwizycji. Skan gęsty (po lewej): krok pomiędzy plastrami musi być na tyle mały (zazwyczaj 400 µm, co odpowiada rozdzielczości w osi Z), aby umożliwić obrazowanie wolumetryczne. Skan rzadki (po prawej): jeśli celem są oddalone od siebie regiony funkcjonalne (w różnych pozycjach), możliwe jest również zmniejszenie próbkowania przestrzennego, aby obrazować różne plastry przecinające te regiony, nie pogarszając przy tym próbkowania czasowego. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

3. Pozycjonowanie sondy

  1. Uruchom oprogramowanie (np. IcoScan) i utwórz sesję eksperymentalną. Przejdź do menu Move Probe, aby dostosować położenie głowicy ultradźwiękowej za pomocą klawiatury nawigacyjnej.
    UWAGA: Głowica powinna znajdować się około 1 mm nad głową zwierzęcia. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek sekwencji obrazowania kluczowe jest zapewnienie kontaktu głowicy z żelem do badań USG.
  2. Uruchom akwizycję w trybie Live View i w razie potrzeby skoryguj położenie głowicy, korzystając z obrazowania CBV (objętości krwi mózgowej) zwierzęcia w czasie rzeczywistym. Wycentruj mózg na obrazie. Zoptymalizuj parametry obrazowania, aby uzyskać jak najwyższy stosunek sygnału do szumu.
    UWAGA: W eksperymentach na czuwających myszach należy zmniejszyć rozmiar apertury, aby uniknąć artefaktów wywołanych skurczami mięśni bocznych.

4. Skan angiograficzny i rejestracja w atlasie

  1. Otwórz opcję Angio 3D w oprogramowaniu akwizycyjnym. W panelu ustawień wstępnych dostosuj parametry skanowania (pierwszy przekrój, ostatni przekrój i wielkość kroku), aby zeskanować cały mózg (Rycina 3A, B), a następnie rozpocznij akwizycję.
    UWAGA: Podczas ustawiania parametrów skanowania upewnij się, że skan obejmie tylną część mózgu
  2. Pozostaw otwarte oprogramowanie akwizycyjne, uruchom program do analizy i wizualizacji danych (np. IcoStudio) i załaduj skan angio 3D. Przeglądaj wolumen akwizycji, korzystając z panelu trzech widoków, i wybierz Kierunek Skanowania Koronalnego: przednio-tylny lub tylno-przedni.
  3. Przejdź do Panelu Rejestracji Mózgu. Załaduj szablon referencyjny myszy, który będzie potrzebny do procesu rejestracji. Zarejestruj skan w Allen Mouse Common Coordinates Framework, korzystając z trybu rejestracji w pełni automatycznego lub ręcznego (Rycina 3C).
  4. Sprawdź wynik, analizując nałożenie skanu angio 3D na szablon referencyjny lub nałożenie skanu na atlas referencyjny Allen za pomocą panelu Atlas Manager (Rycina 3D). Zapisz rejestrację jako plik .bps.
    UWAGA: Plik rejestracji można ponownie wykorzystać dla każdej innej akwizycji wykonanej podczas tej samej sesji eksperymentalnej.

5. System pozycjonowania mózgu (BPS)

  1. W oprogramowaniu IcoStudio upewnij się, że załadowano obraz angiograficzny oraz powiązaną z nim plik .bps (wygenerowany w kroku 4.4).
  2. Przejdź do panelu Brain Navigation Panel. W panelu Atlas Manager, korzystając z nawigatora drzewiastego, przejdź przez atlas mózgu myszy Allena (Allen brain atlas). Znajdź docelowe regiony anatomiczne i zaznacz je, aby nałożyć je na skan w widoku 3D (3-views).
  3. Zwizualizuj docelowe regiony w panelu 3-view i wybierz płaszczyznę obrazowania, która pokrywa się z regionami docelowymi dla eksperymentu. W tym celu ręcznie ustaw dwa markery w pozycji koronarnej obejmującej regiony zainteresowania.
  4. Kliknij Brain Positioning System (BPS), aby wyekstrahować wynikowe współrzędne motorowe. Współrzędne te odpowiadają pozycji sondy umożliwiającej obrazowanie wybranej płaszczyzny. Sprawdź podgląd obrazu obliczonego na podstawie skanu angiograficznego.
  5. W oprogramowaniu IcoScan wejdź do panelu Probe positioning i kliknij Enter BPS coordinates. Wprowadź współrzędne podane w kroku 5.4. Sonda przesunie się i ustawi w docelowej płaszczyźnie obrazowania.
  6. Wykonaj akwizycję podglądu na żywo i sprawdź, czy aktualna płaszczyzna obrazowania odpowiada przewidywaniom z kroku 5.4.
    UWAGA: Możliwe jest również wybranie płaszczyzn parasagitalnych lub nieortogonalnych.

Schemat przepływu obrazowania mózgu: akwizycja Angio 3D, rejestracja, nawigacja, wyniki wizualne.
Rycina 3: Szybki skan angiograficzny przezczaszkowy i rejestracja mózgu dla precyzyjnego pozycjonowania głowicy. A. Schematyczne przedstawienie skanowania mózgu myszy metodą przezczaszkową za pomocą głowicy ultradźwiękowej, od pierwszego przekroju wieńcowego (zielony) do ostatniego przekroju wieńcowego (niebieski) podczas szybkiego skanowania angiograficznego. Obecny obrazowany przekrój (oznaczony na czerwono) przesuwa się krok po kroku od tyłu (zielony) do przodu (niebieski) mózgu. Stworzone za pomocą BioRender.com B. Zrzut ekranu oprogramowania do akwizycji IcoScan w panelu Angio 3D. Predefiniowane parametry po prawej stronie konfigurują szybkie skanowanie. Pozycje w mm pierwszego przekroju, ostatniego przekroju oraz wielkość kroku muszą być odpowiednio dobrane, aby liniowo zeskanować cały mózg. C. Zrzut ekranu oprogramowania do przetwarzania IcoStudio. Szybki skan Angio 3D jest automatycznie rejestrowany do wzorca referencyjnego mózgu myszy. Trzy widoki (po lewej) pokazują superpozycję naczyń krwionośnych i atlasu mózgu myszy Allena w rzutach wieńcowym, strzałkowym i osiowym. D. Liniowy układ (montaż) 16 przekrojów (z 31) ze skanu Angio 3D z nałożonym zarejestrowanym referencyjnym atlasem Allena na naczynia krwionośne. E. Zrzut ekranu panelu Nawigacji Mózgu (Brain Navigation) pokazujący przewidywaną płaszczyznę obrazowania odpowiadającą współrzędnym motorycznym obliczonym przez oprogramowanie dzięki dwóm markerom umieszczonym w centrum lewej i prawej pierwotnej kory somatosensorycznej, w obszarze pól beczkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

6. Eksperyment wywoływany zadaniem: stymulacja wibrysy

  1. Zdefiniuj wcześniej sekwencję stymulacji, uwzględniając czas stymulacji, czas między stymulacjami oraz liczbę powtórzeń.
  2. Uruchom sekwencję 3D fUS, definiując całkowity czas akwizycji, liczbę pozycji oraz czas martwy między pozycjami. W przypadku automatycznej stymulacji zsynchronizowanej z systemem akwizycji za pomocą wejścia TTL, przed rozpoczęciem akwizycji wybierz opcję Trig-IN.
    UWAGA: Dla wyników przedstawionych w niniejszej pracy stymulacja była dostarczana przy użyciu patyczka higienicznego umieszczonego w taki sposób, aby umożliwić odchylenie większości wibrysów w kierunku grzbietowym/brzusznym. Został on zamocowany na serwomotorze sterowanym przez kartę Arduino UNO, połączoną z systemem Iconeus One w celu zapewnienia synchronizacji. Zalecane parametry stymulacji to 30 s ON, 30 s OFF, amplituda 20° i częstotliwość 4 Hz. Alternatywnie stymulację można przeprowadzić ręcznie, odchylając wibrysy w określonych czasach podczas akwizycji.
  3. Otwórz akwizycję w oprogramowaniu IcoStudio i przejdź do menu Activation map. Wypełnij pole wzorca aktywacji czasami rozpoczęcia i zakończenia, a następnie oblicz mapę aktywacji. Dostosuj parametry wyświetlania w celu wizualizacji. Eksportuj mapę aktywacji jako plik .h5 do analizy offline.
    ​UWAGA: Aktywację szacuje się przy użyciu uogólnionego modelu liniowego (GLM) z bodźcem splotowanym z domyślną odpowiedzią hemodynamiczną (HRF) myszy. Alternatywnie aktywację można wizualizować bezpośrednio, szacując korelację Pearsona między wzorcem stymulacji a sygnałem hemodynamicznym z każdego woksela.

7. 4D łączność funkcjonalna

  1. Przeprowadź sekwencję 3D fUS, definiując całkowity czas akwizycji, liczbę pozycji płaszczyzn obrazowania oraz czas martwy pomiędzy pozycjami.
    UWAGA: W przypadku 4D konektywności funkcjonalnej zalecamy czas akwizycji pomiędzy poszczególnymi wolumenami < 2,5 s (częstotliwość próbkowania co najmniej 0,4 Hz) oraz całkowity czas akwizycji wynoszący co najmniej 10 min (liczba punktów czasowych > 180).
  2. Zapisz akwizycję i wczytaj ją do oprogramowania IcoStudio. Jeśli jest to konieczne, wczytaj plik .bps oraz układ współrzędnych mózgu myszy Allena. W Atlas manager wybierz obszary atlasu jako obszary zainteresowania (ROI).
  3. Wejdź do menu Functional Connectivity i wybierz żądane obszary w menedżerze ROI. Zwizualizuj wyniki jako macierz konektywności (analiza nadzorowana) lub mapę korelacji opartą na ziarnie (analiza nienadzorowana). Wybierz i dostosuj filtry pasmowe według uznania, a następnie wyeksportuj wyniki korelacji do analizy statystycznej.
    UWAGA: W trybie obrazowania 3D fUS względne pozycje sondy są ustawiane ręcznie. W związku z tym możliwe są dwa rodzaje skanów, które można wybrać w zależności od zastosowania funkcjonalnego: skany gęste oraz skany rzadkie (Rysunek 2C).

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje trójwymiarową kwantyfikację zmian hemodynamicznych w mózgu myszy przeprowadzaną transkranialnie, w stanie spoczynku lub w odpowiedzi na stymulację sensoryczną. Stymulacja wibrysów, będąca standardowym paradygmatem mapowania funkcjonalnej aktywacji mózgu u gryzoni, została wybrana jako przykład odpowiedzi wywołanej stymulacją sensoryczną. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywną mapę aktywacji w odpowiedzi na mechaniczną stymulację wibrysów u znieczulonej myszy, uzyskaną za pomocą transkranialnego obrazowania fUS. Całkowity czas próby wynosił 760 s, z 60 s linii bazowej (przed i po stymulacji), 80 s stymulacji i 60 s czasu regeneracji, powtórzonym 5 razy. Istotną aktywację określono za pomocą modelu liniowego (GLM), stosując domyślną funkcję odpowiedzi hemodynamicznej (HRF) dla myszy. Obszary aktywne (wyniki Z z p-value >0.0000006 po rygorystycznej korekcie Bonferroniego dla wielokrotnych porównań) są przedstawione jako wartości zakodowane kolorystycznie i nałożone na szablon wspólnego układu współrzędnych Allena. Przebieg czasowy w obrębie poszczególnych wokseli przeciwległej pierwotnej kory somatosensorycznej, w regionie pola beczkowatego (S1BF), wykazał wzrost CBV o 15-20% w porównaniu do linii bazowej.

Mapowanie aktywności mózgu, kolorowe schematy mózgu, wykres CBV, analiza funkcjonalna, modele 3D.
Rysunek 4: Mapy aktywacji przezczaszkowej i przebieg czasowy rCBV po stymulacji wibrysów u myszy znieczulonej ketaminą/ksylazyną. A. Mapa aktywacji pokazująca istotnie aktywowane woksele po mechanicznej stymulacji prawych wibrysów (80 s ON, 60 s OFF, 5x) pod znieczuleniem ketaminą/ksylazyną. Mapy uzyskano poprzez obliczenie wyników Z (Z-scores) na podstawie analizy modelu liniowego (GLM) z korekcją Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. Wyniki Z (oznaczone kolorami) nałożono na trójwymiarowy szablon mózgu Allena (po rejestracji za pomocą systemu pozycjonowania mózgu) i przedstawiono w trzech rzutach: czołowym (lewo), strzałkowym (środek) i osiowym (prawo). Dla odniesienia wyświetlono regiony anatomiczne z wspólnego układu współrzędnych mózgu myszy Allena. Aktywowane woksele znajdują się precyzyjnie w obrębie lewej kory S1BF. Pasek skali: 1 mm. Każda objętość próbki była skanowana na obszarze 2,8 mm (co odpowiada 7 plastrom w kierunku pionowym) w czasie 3,85 s, co pozwoliło na zarejestrowanie 20 próbek objętościowych podczas każdej odpowiedzi funkcjonalnej. B. Rendering 3D wzrostu względnej objętości krwi mózgowej (rCBV) wywołanego stymulacją wibrysów w porównaniu z poziomem bazowym. Anatomiczne wyznaczenie S1BF zaznaczono na niebiesko. C. Przebieg czasowy zmian CBV w lewej S1BF (niebieski) oraz odpowiadający mu zastosowany bodziec (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Ten sam paradygmat zastosowano u myszy z unieruchomioną głową podczas zachowań w mobilnej klatce domowej, korzystając z ustawienia dla zwierząt w stanie czuwania systemu IcoScan. Rycina 5 przedstawia mapę aktywacji po eksperymencie z wielokrotną stymulacją wibrysów z wykorzystaniem układu eksperymentalnego opisanego na Rycini 2. Kilka tylnych i ogonowych wibrysów stymulowano według następującego schematu: 30 s linii bazowej, a następnie pięć następujących po sobie prób składających się z 30 s stymulacji ON (4 Hz) i 30 s przerwy OFF (Rycina 5C). Stymulacja była realizowana za pomocą serwomotoru sterowanego kartą Arduino UNO, która wyzwalała sekwencję akwizycji obrazów w celu synchronizacji. Istotną aktywację określono za pomocą ogólnego modelu liniowego (GLM) z wykorzystaniem domyślnej funkcji odpowiedzi hemodynamicznej (HRF) dla myszy. Korekcję wielokrotnych porównań przeprowadzono metodą Bonferroniego. Konwencjonalny poziom alfa 0,05 został znormalizowany przez całkowitą liczbę wokseli w objętości akwizycji, co doprowadziło do uzyskania końcowego rygorystycznego progu 0,000003.

Analiza fMRI mózgu myszy; mapy Z-score, zmiany rCBV, ustawienie eksperymentu, wykres przebiegu czasowego.
Rysunek 5: Mapy aktywacji i przebieg czasowy rCBV po stymulacji wibrysów u budzącej się, zachowującej naturalną aktywność myszy. A. Mapa aktywacji pokazująca istotnie aktywowane woksele po mechanicznej stymulacji prawych wibrysów (30 s ON, 30 s OFF, 5x) u budzącej się myszy w mobilnej klatce domowej. Mapy uzyskano poprzez obliczenie Z-scores w oparciu o analizę modelu liniowego (GLM) z korektą Bonferroniego dla porównań wielokrotnych (normalizacja przez całkowitą liczbę wokseli). Z-scores (oznaczone kolorami) są nałożone na 3D szablon mózgu Allena (po rejestracji za pomocą Brain Positioning System) i przedstawione w trzech rzutach: czołowym (lewo), strzałkowym (środek) i osiowym (prawo). Dla odniesienia wyświetlono regiony anatomiczne z Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework. Aktywowane woksele znajdują się w obrębie lewej kory S1BF. Paski skali, 1 mm. Każda objętość próbki była skanowana na odcinku 1,6 mm (odpowiadającym 3 plastrom w kierunku wysokości) w czasie 3,85 s, co pozwoliło na zarejestrowanie 17 próbek objętościowych podczas każdej odpowiedzi funkcjonalnej. B. Rendering 3D wzrostu względnej objętości krwi w mózgu (rCBV) wywołanego stymulacją wibrysów w porównaniu do poziomu bazowego. Wyznaczenie anatomiczne S1BF zaznaczono kolorem niebieskim. C. Ilustracja myszy w mobilnej klatce domowej podczas eksperymentu stymulacji prawych wibrysów, podczas którego wykonano pięć 30 s prób, przy całkowitym czasie akwizycji wynoszącym 330 s. D. Bieżący przebieg czasowy względnego CBV wyekstrahowany z obszaru aktywowanego (niebieski), z naniesionym odpowiadającym mu bodźcem (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6 przedstawia korelacje czasowe znormalizowanych niskoczęstotliwościowych (<0.2 Hz) spontanicznych fluktuacji CBV pomiędzy 3D regionami mózgu (zidentyfikowanymi na podstawie rejestracji do wspólnego układu współrzędnych Allena) u myszy znieczulonej ketaminą i ksylazyną. Całkowity czas akwizycji wynosił 20 min (1200 s). Analiza nadzorowana atlasem ujawniła silne wzorce łączności międzyhemisferycznej, z wynikowymi wartościami współczynnika korelacji do 0.8. Analiza oparta na regionie ziarna w grzbietowej części hipokampa ujawniła istotną łączność międzyhemisferyczną pomiędzy prawym a lewym hipokampem, a także głębokimi regionami retrohipokampalnymi i korą piriformną. Region ziarna wybrany w S1BF również zaowocował symetrycznym (kortyko-kortykalnym) wzorcem korelacji, jak opisano wcześniej.

Analiza łączności mózgu; mapa ciepła współczynnika korelacji i schematy MRI; badania neuronaukowe.
Rysunek 6: Transkranialna wolumetryczna funkcjonalna łączność w stanie spoczynku mózgu myszy pod narkozą ketaminą/ksylazyną, oceniona na podstawie 20-minutowej 3D fUS.A. Macierz korelacji oparta na regionach 3D wspólnego układu współrzędnych Allena (Allen common coordinate framework) zarejestrowanych na transkranialnym obrazowaniu funkcjonalnym. Macierz uzyskano poprzez obliczenie znormalizowanej korelacji Pearsona dla spontanicznych fluktuacji niskoczęstotliwościowych (<0.1 Hz) średnich sygnałów czasowych ze wszystkich wokseli w obrębie każdego zidentyfikowanego ROI po korekcie czasu warstw (slice timing correction). Każda próbkowana objętość była skanowana na odcinku 1.6 mm w kierunku góra-dół (odpowiadającym 4 warstwom) w czasie 2.2 s. B. Analiza oparta na obszarze nasion (seed-based analysis) rzutowana na szablon 3D. Obszar nasion wybrano w prawym grzbietowym hipokampie przy β - 2.1 mm. Mapę korelacji uzyskano poprzez obliczenie współczynnika korelacji Pearsona pomiędzy sygnałami czasowymi obszaru nasion a każdym wokselem całego obrazowania po korekcie czasu warstw. C. Mapa korelacji 3D oparta na analizie seed-based z obszarem nasion wybranym w S1BF przy β - 2.1 mm. Paski skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Metody obrazowania całego mózgu są kluczowymi narzędziami do lepszego zrozumienia fizjologii i patologii mózgu. Opisana tutaj metoda pozwala na precyzyjną kwantyfikację sygnałów hemodynamicznych w żywym mózgu bezpośrednio na stanowisku laboratoryjnym. Niezrównana czułość i rozdzielczość czasoprzestrzenna ultradźwięków funkcjonalnych jest szczególnie dobrze dopasowana do fizjologii myszy. Reakcje funkcjonalne i sieci w stanie spoczynku mogą być mapowane w krótkim czasie akwizycji, podłużnie i bez konieczności uśredniania prób lub badanych w celu uzyskania wiarygodnego pomiaru. Odpowiednia kombinacja ultradźwiękowych sond liniowych o wysokiej czułości i szybkich konfiguracji zmotoryzowanych umożliwia wykonanie przezczaszkowego wolumetrycznego obrazowania fUS u myszy w rozsądnym czasie akwizycji. Protokół ten można wykonać na znieczulonych lub obudzonych myszach za pomocą mobilnej klatki domowej.

Stymulacja wąsów, bodziec sensoryczny użyty jako ilustracyjny przykład w tym manuskrypcie, jest standardowym paradygmatem aktywacji funkcjonalnej u gryzoni i wiarygodnym odczytem do badania przetwarzania sensorycznego, sprzężenia nerwowo-naczyniowego i ich zmian 5,6,10, 11. Podczas gdy zgrubne ręczne szczotkowanie wąsów może być preferowane ze względu na łatwość użycia, tej metodzie brakuje precyzji przestrzennej i czasowej. Zastosowanie automatycznego stymulatora, takiego jak ten opisany tutaj, uruchamiany za pomocą skanera obrazowania fUS, pozwala na lepszą kontrolę kilku parametrów, w tym czasu wystąpienia, przemieszczenia amplitudy, częstotliwości, a także kąta końcówki Q/grzebienia, co skutkuje lepszą odtwarzalnością między zwierzętami. Dodatkowo, bardziej precyzyjny czas stymulacji umożliwia modelowanie funkcji odpowiedzi hemodynamicznej (HRF) poprzez określenie parametrów czasu do wystąpienia i czasu do osiągnięcia szczytu12,13. Aby zapewnić lepszą precyzję co do liczby wąsów odchylonych podczas stymulacji (a tym samym obszaru aktywowanego obszaru), do tego protokołu można dostosować bardziej wyrafinowane stymulatory. Wiele innych bodźców, takich jak światło8, dźwięk14 lub prezentacja zapachu15, może być realizowanych przy użyciu tego samego protokołu.

Kompatybilność funkcjonalnego ultrasonografu z obudzonymi i zachowującymi się zwierzętami jest ważną zaletą w porównaniu z innymi technikami neuroobrazowania, umożliwiając funkcjonalne mapowanie aktywacji bez stronniczości znieczulenia. Korzystanie z mobilnej klatki domowej podnoszonej powietrzem jest dobrą alternatywą dla innych istniejących urządzeń mocowanych na głowę, takich jak bieżnie liniowe lub sferyczne. Ruch klatki domowej jest mocno zamocowany w głowie, ale daje myszowi złudzenie poruszania się po otoczeniu, co pozwala na połączenie szerokiego zakresu testów behawioralnych z obrazowaniem fUS16. Jednak procedura przyzwyczajenia do mocowania głowy stanowi ważny krok w kierunku zmniejszenia stresu, szczególnie w przypadku eksperymentów, w których można go uznać za czynnik zakłócający. Opisana tutaj procedura (6 dni obsługi i przyzwyczajenia do fiksacji głowy) daje solidne wyniki w zakresie stymulacji sensorycznej i funkcjonalnej łączności w stanie spoczynku. Może być jednak konieczne wydłużenie okresu przyzwyczajenia w przypadku bardziej wyrafinowanych testów behawioralnych17.

Oświadczenia

Jeremy Ferrier i Bruno-Félix Osmanski są pracownikami Iconeus. Thomas Deffieux, Zsolt Lenkei, Bruno-Félix Osmanski i Mickael Tanter są współzałożycielami i udziałowcami Iconeus.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Europejski Grant Naukowy (ERC) nr 339244-FUSIMAGINE, Narodową Agencję Badań finansującą 'Pinch' (ANR-18-CE37-005), Akcelerator Technologii Badawczych Inserm w Ultrasonografii Biomedycznej, techniczny rdzeń ElfUS IPNP, Inserm U1266, europejski program badawczy FUSIMICE of the Human Brain Project oraz EMBO Short-Term Fellowship 8439 dla Andrei Kliewer.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki BD Plastipak 1 mlHotscher, Francja303172
Igły BD Microlance 26 GaugeDutscher, Francja303800
Regulator temperatury zwierząt (płyta grzewcza sprzężona z sondą doodbytniczą)PhysitempTCAT-2DF
ArduinoArduinoArduino Uno-Rev3
AtipamezoleOrion Pharma, FrancjaAntysedan®5 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
Dental CimentSun Mé dical, Shiga, japoniaSuperbond C& B
Krem do depilacjiKloraneN/A
Maść pod oczyTVM, Wielka BrytaniaOcry-gel
Maszynka do golenia włosówWella ProfesionnalsN/A Płyty
czołoweNeurotar, FinlandiaModel 14
Iconeus One standardowy pakiet dla fUSIconeus, FrancjaIconeus One
Oprogramowanie akwizycyjne IcoScan ( v1.0)Iconeus, FrancjaIcoScan
Oprogramowanie analityczne IcoStudio (v1.0)Iconeus, FrancjaIcoStudio
Isoflurane Stacja anestezjologicznaMinerve, Esternay, Francja
KetamineVirbac, FrancjaKetamina1000100 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
LidokainaVetoquinolLurocaine®20 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
MedetomidineOrion Pharma, FrancjaDomitor®1 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
MeloxicamBoehringer lingelheimMetacam®0,5 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
Mobilna klatka domowa Duża z możliwością śledzeniaNeurotar, FinlandiaMHC-L-T-V4
Monitorowanie EKG i częstości oddechówSystemy AD, (USA) i oprogramowanie
SerwomotorFeetechFT90B
Rama stereotaktycznaDavid Kopf (Tujunga, USA)900-WAza pomocą adaptera myszy  (Ref: 922) i niepękające paski uszne (ref: 922)
Klej chirurgiczny3M, USAVetbond
Pompa strzykawkowaKD Scientific, USALegato® 130, Cat# 788130
Żel ultradźwiękowyDREXCO medical, FrancjaMedi'Gel
Xylazine 2%Bayer, FrancjaRompun®20 mg/ml roztwór do wstrzykiwań
LabChart

Bibliografia

  1. Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
  2. Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
  3. Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231(2020).
  4. Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
  5. Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
  6. Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
  7. Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
  8. Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
  9. Macé, É, et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
  10. Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
  11. Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
  12. Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
  13. Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954(2020).
  14. Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028(2018).
  15. Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110(2019).
  16. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869(2014).
  17. Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mapowanie całego mózguobjętość krwi mózgowej3D aktywacja mózguobrazowanie budzącej się myszystymulacja sensorycznaodpowiedź hemodynamicznarejestracja obrazu mózguanaliza oparta na obszarach zalążkowych
Aktywacja 3D całego mózgu i mapowanie łączności funkcjonalnej u myszy przy użyciu przezczaszkowego funkcjonalnego obrazowania ultrasonograficznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.