Method Article

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

DOI:

10.3791/62268

⸱

June 3rd, 2021

 , 
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktyna, główny składnik cytoszkieletu, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu struktury i funkcji neuronów. W stanach fizjologicznych aktyna występuje w równowadze w dwóch formach: monomerycznej kulistej (G-aktyna) i spolimeryzowanej nitkowatej (F-aktyna). Na zakończeniach synaptycznych cytoszkielet aktynowy stanowi podstawę krytycznych funkcji pre- i postsynaptycznych. Co więcej, dynamiczne zmiany stanu polimeryzacji aktyny (interkonwersja między globularnymi i nitkowatymi formami aktyny) są ściśle związane ze zmianami w strukturze i funkcji synaps związanymi z plastycznością. Przedstawiamy tutaj zmodyfikowaną metodologię opartą na fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w warunkach ex vivo. Test wykorzystuje fluorescencyjnie znakowaną falloidynę, falotoksynę, która specyficznie wiąże się z włóknami aktynowymi (F-aktyna), zapewniając bezpośrednią miarę spolimeryzowanej aktyny nitkowatej. Jako dowód zasadniczy przedstawiamy dowody na przydatność testu zarówno w homogenatach ludzkiej tkanki mózgowej gryzoni, jak i pośmiertnych. Stosując latrunkulinę A (lek depolimeryzujący filamenty aktynowe), potwierdzamy przydatność testu w monitorowaniu zmian poziomów F-aktyny. Ponadto rozszerzamy test na biochemiczne frakcje izolowanych zakończeń synaptycznych, w których potwierdzamy zwiększoną polimeryzację aktyny po stymulacji przez depolaryzację z wysokim zewnątrzkomórkowym K +.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktyna białka cytoszkieletu bierze udział w wielu funkcjach komórkowych, w tym w wsparciu strukturalnym, transporcie komórkowym, ruchliwości i podziale komórek. Aktyna występuje w równowadze w dwóch formach: monomerycznej aktyny globularnej (G-aktyna) i spolimeryzowanej aktyny nitkowatej (F-aktyna). Gwałtowne zmiany w statusie polimeryzacji aktyny (wzajemna konwersja między jej formami G i F) powodują szybkie składanie i rozkładanie włókien oraz leżą u podstaw ich regulacyjnych ról w fizjologii komórki. Aktyna stanowi główny składnik neuronalnej struktury cytoszkieletu i wpływa na szeroki zakres funkcji neuronalnych1,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami Komitetu ds. Etyki w Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Otago (Protokół Etyczny No. AUP95/18 i AUP80/17) oraz legislatura Nowej Zelandii. Ludzkie tkanki mózgowe pozyskano z Banku Tkanek Neurologicznych Szpitala Clínic-IDIBAPS BioBank w Barcelonie w Hiszpanii. Wszystkie protokoły pobierania tkanek zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Clínic w Barcelonie i uzyskano świadomą zgodę rodzin.

1. Przygotowanie i odczynników

  1. Przygotować następujące do homogenizacji tkanki mózgowej i przygotowania wzbogaconej frakcji zako....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liniowość testu do oceny poziomów F-aktyny
Po pierwsze, ustalono standardową krzywą liniowego wzrostu fluorescencji falloidyny Alexa Fluor 647 i powtórzono ją dla każdego zestawu eksperymentów (Rysunek 1). Aby zbadać liniowy zakres testu, przetworzono różne ilości homogenatów mózgu od gryzoni (ryc. 2A i 2B) oraz pośmiertnych ludzi (ryc. 3A i 3B). Stwierdzono, że test jest liniowy w zakresie 50-200 μg białka, oc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj test, zasadniczo zaadaptowany z poprzedniego badania30 z modyfikacjami, wykorzystuje fallotoksynę, falloidynę oznaczoną znacznikiem fluorescencyjnym. Fluorescencyjne analogi falloidyny są uważane za złoty standard barwienia włókien aktynowych w utrwalonych tkankach 47,48,49. W rzeczywistości są to najstarsze narzędzia do specyficznej identyfikacji filamentów aktynowych50

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), New Zealand Health Research Council (#16-597) oraz Department of Anatomy, University of Otago, Nowa Zelandia. Jesteśmy zadłużeni w Banku Tkanek Neurologicznych HCB-IDIBAPS BioBank (Hiszpania) za ludzkie tkanki mózgowe. Dziękujemy Jiaxian Zhang za pomoc w nagraniu i montażu filmu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,5 mL, grubościenna rurka poliwęglanowaBeckman Coulter349622Do wirowania gradientowego (przygotowanie synaptosomu)
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287Ligand specyficzny dla F-aktyny
Przeciwciało przeciwko   b-aktynaSanta Cruz BiotechnologySc-47778Do oceny całkowitych poziomów aktyny za pomocą immunoblottingu
Przeciwciało przeciwko GAPDHAbcamAb181602Do oceny poziomów GAPDH za pomocą immunoblottingu
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnikabarwnika Bio-Rad5000006Oszacowanie białka na podstawie Bradford
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC3306Składnik buforowy Krebsa
cOmplete, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich 4693159001Do hamowania endogennej aktywności proteazy podczas przygotowywania próbki
Corning 96-well Clear Flat Bottom PolistyrenCorning3596Do pomiarów rozpraszania światła
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270Składnik buforowy Krebsa
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD5879Rozpuszczalnik do falloidyny i latrunkuliny A
Fluorescencyjny skaner płaski (skaner na podczerwień Odyssey)Li-Cor BiosciencesDo wykrywania sygnałów immunoreaktywnych na immunoblotach
Roztwór aldehydu glutarowego (25% w wodzie)UtrwalaczSigma-AldrichG6257
HEPESSigma-AldrichH3375Składnik buforowy do przygotowania próbki i składnik buforowy Krebsa
Latrunkulina ASigma-AldrichL5163Depolimeryzator włókien aktynowych
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2· 6H2O)Sigma-AldrichM2670Składnik buforowy Krebsa
Mikropłytki Filtr
membranowy Mitex 5 mmMilliporeLSWP01300Przygotowanie synaptoneurosomów
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105Do pomiarów fluorometrycznych
Filtr siatkowy nylonowy 100 mmMilliporeNY1H02500Przygotowanie koktajlu inhibitorów fosfatazy synaptoneurosomów
IVAbcamab201115Do hamowania aktywności endogennej fosfatazy podczas przygotowywania próbki
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541Składnik buforowy Krebsa i do depolaryzacji zakończeń synaptycznych
Fosforan potasu jednozasadowy ((KH2PO4 )Sigma-AldrichP9791Składnik buforowy Krebsa
Borowodorek sodu (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Składnik buforu permeabilizacji
Chlorek sodu (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Składnik buforowy Krebsa
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Składnik buforowy Krebsa
SpectraMax i3xUrządzenia molekularneDo pomiarów fluorometrycznych
SacharozaFisher ChemicalS/8600/60Składnik buforowy do przygotowania próbki
Uchwyt filtra SwimnexMilliporeSx0001300Przygotowanie synaptoneurosomów
Młynek do tkanek 5 ml Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034Do homogenizacji tkanek
Triton X-100Sigma-AldrichX100Składnik buforu permeabilizacyjnego
Baza TrizmaSigma-AldrichT6066Składnik buforowy do przygotowania próbki
stopnia II

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin PolymerizationFluorescence SpectroscopyF Actin QuantificationBrain Tissue AssayPhalloidin StainingSynaptic TerminalsSynaptosome PreparationLatrunculin AHigh Throughput Assay96 Well Plate

Related Articles