Method Article

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

DOI:

10.3791/62268

⸱

June 3rd, 2021

 , 
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktyna, główny składnik cytoszkieletu, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu struktury i funkcji neuronów. W stanach fizjologicznych aktyna występuje w równowadze w dwóch formach: monomerycznej kulistej (G-aktyna) i spolimeryzowanej nitkowatej (F-aktyna). Na zakończeniach synaptycznych cytoszkielet aktynowy stanowi podstawę krytycznych funkcji pre- i postsynaptycznych. Co więcej, dynamiczne zmiany stanu polimeryzacji aktyny (interkonwersja między globularnymi i nitkowatymi formami aktyny) są ściśle związane ze zmianami w strukturze i funkcji synaps związanymi z plastycznością. Przedstawiamy tutaj zmodyfikowaną metodologię opartą na fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w warunkach ex vivo. Test wykorzystuje fluorescencyjnie znakowaną falloidynę, falotoksynę, która specyficznie wiąże się z włóknami aktynowymi (F-aktyna), zapewniając bezpośrednią miarę spolimeryzowanej aktyny nitkowatej. Jako dowód zasadniczy przedstawiamy dowody na przydatność testu zarówno w homogenatach ludzkiej tkanki mózgowej gryzoni, jak i pośmiertnych. Stosując latrunkulinę A (lek depolimeryzujący filamenty aktynowe), potwierdzamy przydatność testu w monitorowaniu zmian poziomów F-aktyny. Ponadto rozszerzamy test na biochemiczne frakcje izolowanych zakończeń synaptycznych, w których potwierdzamy zwiększoną polimeryzację aktyny po stymulacji przez depolaryzację z wysokim zewnątrzkomórkowym K +.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktyna białka cytoszkieletu bierze udział w wielu funkcjach komórkowych, w tym w wsparciu strukturalnym, transporcie komórkowym, ruchliwości i podziale komórek. Aktyna występuje w równowadze w dwóch formach: monomerycznej aktyny globularnej (G-aktyna) i spolimeryzowanej aktyny nitkowatej (F-aktyna). Gwałtowne zmiany w statusie polimeryzacji aktyny (wzajemna konwersja między jej formami G i F) powodują szybkie składanie i rozkładanie włókien oraz leżą u podstaw ich regulacyjnych ról w fizjologii komórki. Aktyna stanowi główny składnik neuronalnej struktury cytoszkieletu i wpływa na szeroki zakres funkcji neuronalnych1,2. Warto zauważyć, że cytoszkielet aktynowy stanowi integralną część platformy strukturalnej zakończeń synaptycznych. W związku z tym jest głównym wyznacznikiem morfogenezy i fizjologii synaps oraz odgrywa fundamentalną rolę w kontroli wielkości, liczby i morfologii synaps3,4,5. W szczególności dynamiczna polimeryzacja i depolimeryzacja aktyny jest kluczowym wyznacznikiem przebudowy synaps związanej z plastycznością synaptyczną leżącą u podstaw procesów pamięci i uczenia się. Rzeczywiście, zarówno funkcje presynaptyczne (takie jak uwalnianie neuroprzekaźników6,7,8,9,10), jak i postsynaptyczne (dynamiczne przebudowywanie związane z plastycznością11,12,13,14) krytycznie polegają na dynamicznych zmianach stanu polimeryzacji cytoszkieletu aktynowego.

W warunkach fizjologicznych, poziomy F-aktyny są dynamicznie i ściśle regulowane przez multimodalny szlak obejmujący modyfikację potranslacyjną4,15,16 oraz białka wiążące aktynę (ABPs)4,17. ABP mogą wpływać na dynamikę aktyny na wielu poziomach (takich jak inicjowanie lub hamowanie polimeryzacji, indukowanie rozgałęziania się włókien, odcinanie włókien na mniejsze kawałki, promowanie depolimeryzacji i ochrona przed depolimeryzacją), a z kolei podlegają ścisłej kontroli modulacyjnej, wrażliwej na różne sygnały zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe18,19,20. Takie kontrole regulacyjne na wielu poziomach dyktują ścisłą regulację dynamiki aktyny w cytoszkielecie synaptycznym, dostrajając pre- i postsynaptyczne aspekty fizjologii neuronów zarówno w stanie podstawowym, jak i indukowanym aktywnością.

Biorąc pod uwagę ważną rolę aktyny w fizjologii neuronów, nie jest zaskakujące, że kilka badań dostarczyło dowodów na zmiany w dynamice aktyny jako krytyczne zdarzenia patogenne związane z szerokim zakresem zaburzeń neurologicznych, w tym neurodegeneracją, chorobami psychicznymi, a także dolegliwościami neurorozwojowymi3,21,22,23,24,25,26,27. Pomimo bogactwa danych badawczych wskazujących na kluczową rolę aktyny w fizjologii i patofizjologii neuronów, nadal istnieją znaczne luki w zrozumieniu dynamiki aktyny, szczególnie w cytoszkielecie synaptycznym. Potrzebne są dalsze badania naukowe, aby lepiej zrozumieć aktynę neuronalną i jej zmiany w warunkach patologicznych. Jednym z głównych obszarów zainteresowania w tym kontekście jest ocena stanu polimeryzacji aktyny. Istnieją komercyjne zestawy oparte na Western blotting (zestaw biochemiczny do testów in vivo G-aktyna/F-aktyna; Cytoszkielet SKU BK03728,29) i domowe testy do oceny poziomów F-aktyny6. Ponieważ jednak wymagają one biochemicznej izolacji F-aktyny i G-aktyny, a ich późniejsza kwantyfikacja opiera się na protokołach immunoblottingu, mogą być czasochłonne. W niniejszym dokumencie przedstawiamy test oparty na spektroskopii fluorescencji zaadaptowany z poprzedniego badania30 z modyfikacjami, które można wykorzystać do oceny zarówno podstawowych poziomów F-aktyny, jak i dynamicznych zmian w jej składaniu-demontażu. Warto zauważyć, że skutecznie zmodyfikowaliśmy pierwotny protokół, który wymaga próbek odpowiednich do kuwety o pojemności 1 ml do obecnego formatu płytki 96-dołkowej. W związku z tym zmodyfikowany protokół znacznie zmniejszył ilość tkanki/próbki wymaganą do testu. Ponadto dostarczamy dowodów na to, że protokół jest odpowiedni nie tylko dla homogenatów tkanki mózgowej, ale także dla frakcji subkomórkowych, takich jak izolowane zakończenia synaptyczne (synaptosomy i synaptoneurosomy). Wreszcie, test można zastosować do świeżo wypreparowanych tkanek mózgowych gryzoni i długotrwale przechowywanych próbek ludzkiego mózgu po śmierci. Warto zauważyć, że chociaż test jest prezentowany w kontekście neuronalnym, można go odpowiednio rozszerzyć na inne typy komórek i związane z nimi procesy fizjologiczne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami Komitetu ds. Etyki w Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Otago (Protokół Etyczny No. AUP95/18 i AUP80/17) oraz legislatura Nowej Zelandii. Ludzkie tkanki mózgowe pozyskano z Banku Tkanek Neurologicznych Szpitala Clínic-IDIBAPS BioBank w Barcelonie w Hiszpanii. Wszystkie protokoły pobierania tkanek zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Clínic w Barcelonie i uzyskano świadomą zgodę rodzin.

1. Przygotowanie i odczynników

  1. Przygotować następujące do homogenizacji tkanki mózgowej i przygotowania wzbogaconej frakcji zakończeń synaptycznych:
    Bufor homogenizacyjny: 5 mM HEPES, pH 7,4 uzupełniony 0,32 M sacharozy
    Bufor do redukcji: 5 mM Tris, pH 7,4 uzupełniony 0,32 M sacharozy
    Bufor myjący: 5 mM Tris, pH 8,1
    1,2 M sacharoza
    1,0 M sacharoza
    0,85 M sacharozy
  2. Dodaj domową lub komercyjną mieszankę inhibitorów proteazy i fosfatazy.
    UWAGA: Użyliśmy wersji Complete Protease Inhibitor Mix bez EDTA (1 tabletka na 10 ml buforu) i koktajlu inhibitorów fosfatazy IV (1:100; objętość: objętość).
  3. Przygotować następujące i odczynniki do utrwalania, przepuszczalności i wiązania falloidyny:
    Bufor Krebsa: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM glukozy, 20 mM HEPES, pH 7,4
    1 M KCl
    25% aldehyd glutarowy (roztwór podstawowy)
    Bufor Krebsa zawierający 0,1 % Triton X-100 i 1 mg/ml NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Phalloidyna w DMSO
    Bufor Krebsa zawierający 0,32 M sacharozy
    50 μM latrunkuliny A w DMSO (roztwór podstawowy)
    1 M KCl (roztwór podstawowy)
    UWAGA: Falloidyna jest toksyczna (LD50 = 2 mg/kg) i należy obchodzić się z nią ostrożnie. Wdychanie aldehydu glutarowego jest toksyczne i powinno być przenoszone pod wyciąg.
  4. Przechowywać w temperaturze 4 °C, a falloidynę i latrunkulinę A w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Nie zaleca się długotrwałego przechowywania. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Homogenizacja tkanki mózgowej

  1. Homogenizować kriokonserwowaną lub świeżo wypreparowaną tkankę mózgową szczura w 10 objętościach buforu homogenizacyjnego w szklanej probówce Pottera-Elvehjema i tłuczku na lodzie.
    UWAGA: Optymalna homogenizacja uzyskuje się poprzez 15-20 ręcznych uderzeń tłuczka dla tkanek mózgowych. Pomyślną homogenizację można potwierdzić poprzez płynny przepływ zawiesiny przez szklaną rurkę. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Określić stężenie białka w homogenacie za pomocą testu Bradforda31.
    UWAGA: Można również zastosować alternatywne domowe lub komercyjne testy do oceny białka.
  3. Rozcieńczyć próbki homogenatu w buforze Krebsa w stężeniu 2-3 mg białka/ml w objętości 50 μl,
    UWAGA: W niektórych naszych eksperymentach inkubujemy homogenaty z 2 μM latrunkuliną A lub DMSO (kontrole) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. W tym celu homogenaty zawiesza się w 48 μl buforu Krebsa i dodaje 2 μl 50 μM latrunkuliny A lub 2 μl DMSO. Ponadto w celu immunoblottingu po inkubacji pobiera się niewielką ilość próbki (10 μg).
  4. Utrwalić próbki homogenatu (sekcja 5).

3. Przygotowanie izolowanych zakończeń nerwowych

  1. Przygotowanie synaptosomów
    UWAGA: Można również użyć alternatywnych protokołów32,33 dla synaptosomów.
    1. Odwirować homogenat mózgu w temperaturze 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Wyrzuć granulkę, która jest surową frakcją jądrową.
    3. Następnie odwirować supernatant (S1) otrzymany w kroku 3.1.1 przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usuń supernatant (S2), który jest rozpuszczalną frakcją cytozolową.
    5. Zawiesić osad (P2) otrzymany w kroku 3.1.3, który jest surową frakcją synaptosomalną w buforze do rezawieszania.
      UWAGA: Objętość buforu do resuspensji zależy od ilości tkanki wyjściowej i ilości uzyskanego osadu. Na przykład, zaczynając od 150-300 mg tkanek mózgowych, otrzymany osad można ponownie zawiesić w 200 μl buforu do rezawieszania.
    6. Załadować zawieszone surowe synaptosomy na nieciągły gradient sacharozy złożony z równych objętości 0,85-1,0-1,2 M sacharozy.
      UWAGA: Zazwyczaj używamy 1 ml każdego roztworu sacharozy (na 150-300 mg tkanki). Można to zmienić w zależności od większych ilości tkanek. Nieciągłe gradienty można uzyskać za pomocą strzykawki 25G dociśniętej do wewnętrznej ścianki probówki ultrawirówki i delikatnego nakładania warstw sacharozy.
    7. Wirować przy 85 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ze względu na dużą prędkość wirowania wymagana jest ultrawirówka zdolna do wytworzenia próżni w celu zmniejszenia nagrzewania.
    8. Zebrać frakcję synaptosomalną na granicy faz między 1,0 a 1,2 M sacharozy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
    9. Przemyć frakcję synaptosomalną lodowatym buforem płuczącym przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Do przemywania frakcję synaptosomalną otrzymaną na granicy faz 1,0 i 1,2 M sacharozy zbiera się do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i dodaje się równą objętość buforu do przemywania zapewniającego usunięcie wysokiej zawartości sacharozy z pożywki.
    10. Ponownie przepłukać osad synaptosomalny lodowatym buforem homogenizacyjnym o stężeniu 12 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Zawiesić synaptosomy w buforze homogenizacyjnym na lodzie.
      UWAGA: W tym miejscu można na krótko wstrzymać działanie protokołu.
    12. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
    13. Zawiesić synaptosomy w buforze Krebsa w stężeniu 2-3 mg białka/ml w objętości 50 μl (47,5 μl, jeśli synaposomy mają być depolaryzowane przez KCl; patrz punkt 4).
      UWAGA: W celu ponownego wymieszania, frakcja synaptosomalna jest najpierw wirowana w temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie supernatant (bufor) jest usuwany. Osad synaptosomalny jest następnie ponownie zawieszany w buforze Krebsa poprzez delikatne pipetowanie za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl.
    14. Kontynuuj depolaryzację (sekcja 4).
  2. Przygotowanie synaptoneurosomów
    UWAGA: Można również stosować alternatywne protokoły34,35 dla synaptoneurosomów.
    1. Przepuścić homogenat mózgu przez wstępnie zwilżony filtr siatkowy o wielkości porów 100 μm w uchwycie filtra za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Wstępne zwilżanie wszystkich filtrów jest ważne, aby uniknąć utraty próbki i powinno być wykonywane przy użyciu bufora homogenizacyjnego. W tym celu bufor homogenizacyjny przepuszcza się przez filtry w uchwycie filtra za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aż bufor wypłynie.
    2. Zebrać filtrat (F1) do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    3. Powtórzyć proces (etapy 3.2.1 i 3.2.2) dla frakcji F1 w celu uzyskania drugiego filtratu (F2).
    4. Przepuścić filtrat F2 przez filtr siatkowy o wielkości porów 5 μm.
    5. Zebrać filtrat (F3) w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    6. Odwirować filtrat F3 przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Zawiesić osad (synaptoneurosomy) w buforze Krebsa na lodzie w stężeniu 2-3 mg białka/ml w objętości 50 μl (47,5 μl, jeśli synaptosomy mają być depolaryzowane przez KCl; patrz punkt 4).
      UWAGA: W tym miejscu można na krótko wstrzymać działanie protokołu.
    8. Oszacuj stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
    9. Kontynuuj depolaryzację (sekcja 4).

4. Depolaryzacja izolowanych końców synaptycznych za pośrednictwem KCl

  1. Równoważyć synaptosomy/synaptoneurosomy w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.
  2. Stymulować synaptosomy/synaptoneurosomy przez dodanie KCl, aby zwiększyć zewnątrzkomórkowe K+ do 50 mM przez 30 s w temperaturze 37 °C i dodać równą objętość buforu Krebsa do odpowiedniego niestymulowanego zestawu kontrolnego.
    UWAGA: Na przykład dodaj 2,5 μl 1 M KCl do synaptosomów zawieszonych w 47,5 μl buforu Krebsa; i dodać 2,5 μl buforu Krebsa do odpowiedniego niestymulowanego synaptosmu kontrolnego. W przypadku eksperymentów, w których bierze udział duża liczba próbek, należy postępować z nie więcej niż 2 próbkami na raz, tak aby czas depolaryzacji nie przekraczał 30 s.
  3. Zakończ stymulację, dodając aldehyd glutarowy (sekcja 5).

5. Utrwalanie i barwienie falloidyny próbek

  1. Dodać aldehyd glutarowy do próbek homogenatów/synaptosomalnych/synaptoneurosomalnych do końcowego stężenia 2,5% przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Dodaliśmy 6 μL 25% roztworu aldehydu glutarowego, tak aby końcowe stężenie aldehydu glutarowego w próbkach 50 μL (homogenaty/synaptosomy/synaptoneurosomy) wyniosło ok. 2,5%. Utrwalanie ma kluczowe znaczenie i powinno być szybkie, dlatego natychmiast po dodaniu aldehydu glutarowego próbka powinna być energicznie wirowana.
  2. Osadzać próbki w temperaturze 20 000 x g przez 5 minut.
  3. Usuń supernatant.
    UWAGA: Wyrzuć supernatant do dygestoria, ponieważ aldehyd glutarowy jest toksyczny.
  4. Przepuszczalność osadu przez ponowne zawieszenie w 100 μl buforu Krebsa zawierającego 0,1% Triton X-100 i 1 mg/ml NaHB4 przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Osadzać próbki w temperaturze 20 000 x g przez 5 minut.
  6. Usunąć bufor przepuszczalny.
  7. Przemyć osad 200 μl buforu Krebsa przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 5 minut.
  8. Ponownie zawiesić i zabarwić granulat 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (odpowiadający 500 μU) w 100 μL buforu Krebsa przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Inne odmiany fluorescencyjnych analogów falloidyny są dostępne w handlu i można je zastąpić w teście. Stężenie falloidyny i całkowita objętość próbki w inkubacji mogą wymagać modyfikacji w zależności od ilości i rodzaju badanej tkanki/próbki, a optymalne warunki powinny być odpowiednio znormalizowane.
  9. Odwirować zabarwione próbki o masie 20 000 x g przez 5 minut.
  10. Usunąć niezwiązaną falloidynę (supernatant).
  11. Przemyć próbkę 200 μl buforu Krebsa przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 5 minut.
  12. Zawiesić w 200 μl buforu Krebsa zawierającego 0,32 M sacharozy.
    UWAGA: W tym miejscu można na krótko wstrzymać działanie protokołu.

6. Analiza fluorometryczna i rozpraszanie światła

  1. Dozuj próbki Alexa Fluor 647 barwione falloidyną na czarnej 96-dołkowej płytce.
  2. Zmierzyć intensywność fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 645 nm i długości fali emisji 670 nm w czytniku płytek w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieść próbki z czarnej płytki 96-dołkowej na przezroczystą płytkę 96-dołkową za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl.
  4. Zmierz rozproszenie światła przy długości fali 540 nm, aby skorygować wszelkie straty, które mogły wystąpić podczas poprzednich etapów utrwalania, przepuszczalności i barwienia.
    UWAGA: Różnice w materiale biologicznym zachowanym w barwionych próbkach mogą być bardziej widoczne w przypadku mniejszych ilości materiału wyjściowego (patrz Dyskusja).
  5. Dołącz zestaw falloidyny Alexa Fluor 647 w buforze Krebsa w różnych stężeniach (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x i 1x odpowiadających 25, 50, 125, 175, 250, 375 i 500 μU) dla każdej partii testu jako krzywa standardowa.
    UWAGA: Jest to etap opcjonalny i nie ma wpływu na wyniki testu, zwłaszcza gdy poziomy F-aktyny są wyrażane w sposób względny (sekcja 7). W tym miejscu protokół można wstrzymać.

7. Analiza danych

  1. Ilość F-aktyny w próbkach jest wprost proporcjonalna do intensywności fluorescencji związanej falloidyny. Wyrazić w wartościach bezwzględnych jednostki związane falloidyną obliczone na podstawie krzywej liniowej oznaczonego wzorca falloidyny.
    UWAGA: Jako przykład patrz rysunki 2A-B, 3A, 4A-B i rysunek uzupełniający 2.
  2. Wyraż poziomy F-aktyny jako ułamek próbek kontrolnych.
    UWAGA: Jako example, patrz rysunki 5A-B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liniowość testu do oceny poziomów F-aktyny
Po pierwsze, ustalono standardową krzywą liniowego wzrostu fluorescencji falloidyny Alexa Fluor 647 i powtórzono ją dla każdego zestawu eksperymentów (Rysunek 1). Aby zbadać liniowy zakres testu, przetworzono różne ilości homogenatów mózgu od gryzoni (ryc. 2A i 2B) oraz pośmiertnych ludzi (ryc. 3A i 3B). Stwierdzono, że test jest liniowy w zakresie 50-200 μg białka, oc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj test, zasadniczo zaadaptowany z poprzedniego badania30 z modyfikacjami, wykorzystuje fallotoksynę, falloidynę oznaczoną znacznikiem fluorescencyjnym. Fluorescencyjne analogi falloidyny są uważane za złoty standard barwienia włókien aktynowych w utrwalonych tkankach 47,48,49. W rzeczywistości są to najstarsze narzędzia do specyficznej identyfikacji filamentów aktynowych50

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), New Zealand Health Research Council (#16-597) oraz Department of Anatomy, University of Otago, Nowa Zelandia. Jesteśmy zadłużeni w Banku Tkanek Neurologicznych HCB-IDIBAPS BioBank (Hiszpania) za ludzkie tkanki mózgowe. Dziękujemy Jiaxian Zhang za pomoc w nagraniu i montażu filmu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,5 mL, grubościenna rurka poliwęglanowaBeckman Coulter349622Do wirowania gradientowego (przygotowanie synaptosomu)
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287Ligand specyficzny dla F-aktyny
Przeciwciało przeciwko   b-aktynaSanta Cruz BiotechnologySc-47778Do oceny całkowitych poziomów aktyny za pomocą immunoblottingu
Przeciwciało przeciwko GAPDHAbcamAb181602Do oceny poziomów GAPDH za pomocą immunoblottingu
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnikabarwnika Bio-Rad5000006Oszacowanie białka na podstawie Bradford
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC3306Składnik buforowy Krebsa
cOmplete, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich 4693159001Do hamowania endogennej aktywności proteazy podczas przygotowywania próbki
Corning 96-well Clear Flat Bottom PolistyrenCorning3596Do pomiarów rozpraszania światła
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG8270Składnik buforowy Krebsa
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD5879Rozpuszczalnik do falloidyny i latrunkuliny A
Fluorescencyjny skaner płaski (skaner na podczerwień Odyssey)Li-Cor BiosciencesDo wykrywania sygnałów immunoreaktywnych na immunoblotach
Roztwór aldehydu glutarowego (25% w wodzie)UtrwalaczSigma-AldrichG6257
HEPESSigma-AldrichH3375Składnik buforowy do przygotowania próbki i składnik buforowy Krebsa
Latrunkulina ASigma-AldrichL5163Depolimeryzator włókien aktynowych
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2· 6H2O)Sigma-AldrichM2670Składnik buforowy Krebsa
Mikropłytki Filtr
membranowy Mitex 5 mmMilliporeLSWP01300Przygotowanie synaptoneurosomów
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105Do pomiarów fluorometrycznych
Filtr siatkowy nylonowy 100 mmMilliporeNY1H02500Przygotowanie koktajlu inhibitorów fosfatazy synaptoneurosomów
IVAbcamab201115Do hamowania aktywności endogennej fosfatazy podczas przygotowywania próbki
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541Składnik buforowy Krebsa i do depolaryzacji zakończeń synaptycznych
Fosforan potasu jednozasadowy ((KH2PO4 )Sigma-AldrichP9791Składnik buforowy Krebsa
Borowodorek sodu (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Składnik buforu permeabilizacji
Chlorek sodu (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Składnik buforowy Krebsa
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Składnik buforowy Krebsa
SpectraMax i3xUrządzenia molekularneDo pomiarów fluorometrycznych
SacharozaFisher ChemicalS/8600/60Składnik buforowy do przygotowania próbki
Uchwyt filtra SwimnexMilliporeSx0001300Przygotowanie synaptoneurosomów
Młynek do tkanek 5 ml Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034Do homogenizacji tkanek
Triton X-100Sigma-AldrichX100Składnik buforu permeabilizacyjnego
Baza TrizmaSigma-AldrichT6066Składnik buforowy do przygotowania próbki
stopnia II

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381(2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908(2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992(2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647(2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009(2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119(2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492(2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118(2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin PolymerizationFluorescence SpectroscopyF Actin QuantificationBrain Tissue AssayPhalloidin StainingSynaptic TerminalsSynaptosome PreparationLatrunculin AHigh Throughput Assay96 Well Plate

Related Articles