Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Witryfikacja dojrzałych komórek jajowych pobranych in vitro z jajników dorosłych i przed okresem dojrzewania u owiec

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62272

⸱

10 lipca 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, University of Sassari

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ma na celu dostarczenie standardowej metody witryfikacji oocytów dorosłych i młodych owiec. Obejmuje wszystkie etapy od przygotowania pożywki do dojrzewania in vitro do hodowli po ociepleniu. Oocyty są witryfikowane na etapie MII przy użyciu Cryotop, aby zapewnić minimalną niezbędną objętość.

Streszczenie

U zwierząt gospodarskich, systemy produkcji zarodków in vitro mogą być rozwijane i podtrzymywane dzięki dużej liczbie jajników i oocytów, które można łatwo uzyskać z rzeźni. Dorosłe jajniki zawsze mają kilka pęcherzyków antralnych, podczas gdy u dawców przed okresem dojrzewania maksymalna liczba oocytów jest dostępna w wieku 4 tygodni, kiedy jajniki mają szczytową liczbę pęcherzyków antralnych. Tak więc 4-tygodniowe jagnięta są uważane za dobrych dawców, nawet jeśli kompetencje rozwojowe oocytów przed okresem dojrzewania są niższe w porównaniu z ich dorosłymi odpowiednikami.

Podstawowe badania i zastosowania komercyjne byłyby wzmocnione przez możliwość udanej kriokonserwacji zeszklonych oocytów uzyskanych zarówno od dawców dorosłych, jak i przed okresem dojrzewania. Witryfikacja oocytów pobranych od dawców przed okresem dojrzewania pozwoliłaby również na skrócenie odstępu pokoleniowego, a tym samym zwiększenie przyrostu genetycznego w programach hodowlanych. Jednak utrata potencjału rozwojowego po kriokonserwacji sprawia, że oocyty ssaków są prawdopodobnie jednym z najtrudniejszych typów komórek do krioprezerwacji. Wśród dostępnych technik kriokonserwacji witryfikacja jest szeroko stosowana do oocytów zwierzęcych i ludzkich. Pomimo ostatnich postępów w tej technice, narażenie na wysokie stężenia środków krioprotekcyjnych, a także urazy chłodzące i stres osmotyczny nadal wywołują szereg zmian strukturalnych i molekularnych oraz zmniejszają potencjał rozwojowy oocytów ssaków. W tym miejscu opisujemy protokół witryfikacji oocytów owiec pobranych od dawców młodocianych i dorosłych i dojrzewających in vitro przed krioprezerwacją. Protokół obejmuje wszystkie procedury od dojrzewania oocytów in vitro po witryfikację, rozgrzewkę i okres inkubacji po ociepleniu. Oocyty zeszklone na etapie MII mogą być rzeczywiście zapłodnione po ociepleniu, ale potrzebują dodatkowego czasu przed zapłodnieniem, aby przywrócić uszkodzenia spowodowane procedurami kriokonserwacji i zwiększyć ich potencjał rozwojowy. W związku z tym warunki i czas hodowli po ociepleniu są kluczowymi krokami w przywracaniu potencjału rozwojowego oocytów, zwłaszcza gdy oocyty są pobierane od młodych dawców.

Wprowadzenie

Długoterminowe przechowywanie żeńskich gamet może oferować szeroki zakres zastosowań, takich jak poprawa hodowli zwierząt domowych poprzez programy selekcji genetycznej, przyczynianie się do zachowania różnorodności biologicznej poprzez program ochrony gatunków dzikich zwierząt ex-situ, oraz wspieranie badań i zastosowań biotechnologii in vitro dzięki dostępności przechowywanych oocytów do włączenia do produkcji zarodków in vitro lub programów transplantacji nuklearnej1, 2,3. Witryfikacja młodocianych oocytów zwiększyłaby również przyrost genetyczny poprzez skrócenie odstępu między generacjami w programach hodowlanych4. Witryfikacja poprzez ultraszybkie chłodzenie i ogrzewanie oocytów jest obecnie uważana za standardowe podejście do krioprezerwacji oocytów zwierząt gospodarskich5. U przeżuwaczy, przed witryfikacją, oocyty dojrzewają zwykle in vitro, po pobraniu z pęcherzyków uzyskanych z jajników pochodzących z rzeźni2. Jajniki dorosłe, a zwłaszcza jajniki przed okresem dojrzewania4,6, mogą rzeczywiście dostarczyć praktycznie nieograniczoną liczbę oocytów do kriokonserwacji.

U bydła, po witryfikacji i ociepleniu oocytów, wydajność blastocyst na poziomie >10% była powszechnie zgłaszana przez kilka laboratoriów w ciągu ostatniej dekady3. Jednak u małych przeżuwaczy witryfikacja oocytów jest nadal uważana za stosunkowo nową zarówno dla oocytów młodych, jak i dorosłych, a standardowa metoda witryfikacji oocytów owiec nie została jeszcze ustalona2,5. Pomimo ostatnich osiągnięć, zeszklony i ogrzany oocyt rzeczywiście wykazuje kilka zmian funkcjonalnych i strukturalnych, które ograniczają jego potencjał rozwojowy7,8,9. W związku z tym niewiele artykułów donosiło o rozwoju blastocyst na poziomie 10% lub więcej w zeszklonych/ogrzanych oocytach owiec2. Zbadano kilka podejść mających na celu ograniczenie wyżej wymienionych zmian: optymalizacja składu roztworów do witryfikacji i rozmrażania10,11; eksperymentowanie z wykorzystaniem różnych urządzeń kriogenicznych8,12,13; oraz stosowanie określonych zabiegów podczas dojrzewania in vitro (IVM)4,14,15 i/lub podczas rekonwalescencji po rozgrzewce6.

Tutaj opisujemy protokół witryfikacji oocytów owiec pobranych od młodych i dorosłych dawców i dojrzewających in vitro przed kriokonserwacją. Protokół obejmuje wszystkie procedury od dojrzewania oocytów in vitro po witryfikację, ocieplenie i okres hodowli po ociepleniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół dla zwierząt i wdrożone procedury opisane poniżej są zgodne z wytycznymi etycznymi obowiązującymi na Uniwersytecie w Sassari, zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej 86/609/WE i zaleceniem Komisji Wspólnot Europejskich 2007/526/WE.

1. Przygotowanie pożywki do manipulacji oocytami

  1. Przygotować pożywkę do transportu pobranych jajników, uzupełniając sól fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco o 0,1 g/l penicyliny i 0,1 g/l streptomycyny (PBS).
  2. Przygotować pożywkę do pobrania oocytów i dojrzewania, rozcieńczając 9,5 g pożywki do hodowli tkankowej (TCM) 199 w proszku z 1 litrem wody Milli-Q uzupełnionej penicyliną (0,1%) i streptomycyną (0,1%).
    1. Po rozcieńczeniu przefiltrować 100 ml pożywki i przechowywać ją w temperaturze 4 °C jako pożywkę do dojrzewania (SMM) do użycia przez jeden tydzień.
    2. Przygotować pożywkę zbiorczą (CM), uzupełniając pozostałe 900 ml 25 mM HEPES, 0,36 g/l wodorowęglanu i 0,1% (w/v) alkoholu poliwinylowego (PVA) (pH 7,3, osmolalność 290 mOsm/kg).
  3. Przygotować pożywkę dojrzewającą z SMM uzupełnioną 0,021 g/l wodorowęglanu, 10% surowicy owczej poddanej obróbce cieplnej, 1 j.m./ml FSH, 1 j.m./ml LH, 100 μl cysteaminy i 8 mg/ml pirogronianu.
    UWAGA: Pożywkę dojrzewającą w objętości 10 ml należy inkubować w normalnych warunkach (w maksymalnie wilgotnej atmosferze w temperaturze 39 °C przy 5% CO2 w powietrzu) przez co najmniej 4 godziny przed użyciem.
  4. Przygotować pożywkę bazową (BM) do manipulacji oocytami po dojrzewaniu in vitro, składającą się z PBS bez Ca++ i Mg++, uzupełnioną 20% płodową surowicą cielęcą (FCS).

2. Pobieranie i dojrzewanie oocytów

  1. Odzyskaj oocyty z jajników młodocianych (30-40 dni, masa ciała 6-10 kg) i dorosłych.
  2. Pobrać jajniki z rzeźni handlowej do laboratorium przetransportować w ciągu 1–2 godzin w PBS w temperaturze 27 °C.
  3. Po umyciu w świeżej pożywce PBS, pokrój jajniki w CM za pomocą mikroostrza, aby uwolnić zawartość pęcherzyka.
  4. W badaniu stereomikroskopowym z 60-krotnym powiększeniem wyselekcjonować kompleksy wzgórko-oocyty (COC) do dojrzewania in vitro, wybierając te z 4-10 warstwami komórek ziarnistych, oocytem o jednolitej cytoplazmie, jednorodnym rozmieszczeniem kropelek lipidów w cytoplazmie i o średnicy zewnętrznej około 90 μm (średnia).
  5. Umyj wybrane COC trzy razy w CM i na koniec przenieś je do pożywki do dojrzewania.
    UWAGA: W przypadku młodocianych oocytów, aby poprawić przeżywalność po witryfikacji, należy uzupełnić pożywkę dojrzewającą trehalozą o wielkości 100 μM.
  6. W przypadku dojrzewania in vitro przenieść 30–35 COC w 600 μl pożywki do dojrzewania na czterodołkowe szalki Petriego, pokryte 300 μl oleju mineralnego i inkubować je przez 22 (dorosłe oocyty)/24 (młodociane oocyty) h w 5% CO2 w powietrzu w temperaturze 39 °C.
  7. Po dojrzewaniu in vitro usunąć COC z komórek wzgórka poprzez delikatne pipetowanie. Po badaniu pod mikroskopem stereoskopowym z 60-krotnym powiększeniem należy wybrać do witryfikacji tylko te, które pokazują wytłoczenie na pierwszym ciele biegunowym, a więc na etapie metafazy II (MII).

3. Procedury pobierania nasienia, zamrażania i rozmrażania

  1. Przygotować podłoże bazowe do kriokonserwacji nasienia składające się z przedłużacza barana (200 mM Tris; 70 mM kwasu cytrynowego; 55 mM fruktozy; pH 7,2, osmolalność 300 mOsm/kg) uzupełnionego żółtkiem jaja 20% (v/v).
  2. Nasienie należy pobierać tylko w okresie lęgowym owiec (październik-listopad).
  3. Uzyskaj ejakulacje przez sztuczną pochwę od dorosłych baranów (w wieku 2-5 lat), utrzymywanych w środowisku zewnętrznym i karmionych żywą dawką podtrzymującą. Trzymaj barany oddzielnie w oddzielnych kojcach, ale z zachowaniem kontaktu wzrokowego między sobą.
  4. Powtarzaj pobieranie nasienia raz w tygodniu przez cały sezon lęgowy, aby uzyskać co najmniej 8 ejakulatów od każdego samca.
  5. Próbki nasienia należy przetransportować do laboratorium w temperaturze otoczenia w ciągu 5 minut po pobraniu i natychmiast przetworzyć. Połącz ejakulacje dwóch-trzech tryków i oceń spektrofotometrię stężenia plemników.
  6. Po zebraniu rozcieńczyć ejakulaty do 400 x 106 plemników/ml z podłożem bazowym do kriokonserwacji nasienia uzupełnionym 4% glicerolem. Następnie schłodzić rozcieńczone nasienie do temperatury 4 °C przez 2 godziny i zachować równowagę przez 20 minut przed zamrożeniem.
  7. Próbki nasienia zamrozić w postaci granulek (0,25 ml) na suchym lodzie, a następnie zanurzyć je w ciekłym azocie.
  8. W celu rozmrożenia umieścić granulki w wysterylizowanym szklanym sokole i zanurzyć je w łaźni wodnej na 20 s w temperaturze 39 °C.

4. Zapłodnienie in vitro i hodowla zarodków

  1. Przygotuj zapasy do utworzenia syntetycznego płynu jajowodowego (SOF).
    1. Przygotuj zapas A: 99,4 ml wody MilliQ, 6,29 g NaCl, 0,534 g KCl, 0,161 g KH2PO4, 0,182 gMgSO4 ·7H2O; i 0,6 ml mleczanu sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
    2. Przygotuj zapas B: 10 ml wody MilliQ, 0,210 g NaHCO3 i 2-3 g czerwieni fenolowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    3. Przygotuj zapas C: 10 ml wody MilliQ i 0,051 g pirogronianu sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    4. Przygotować zapas D: 10 ml wody MilliQ i 0,262 g CaCl2 2H2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    5. Przygotuj 10 ml SOF składającego się z 7,630 ml wody MilliQ, 1 ml bulionu A, 1 ml bulionu B, 0,07 ml zapasu C i 0,7 ml zapasu D.
    6. Przygotować pożywkę do zapłodnienia in vitro (IVF): SOF uzupełniony 2% surowicą owczą poddaną obróbce cieplnej, 10 μg/ml heparyny i 1 μg/ml hipotaryny (osmolalność 280-290 mOsm/kg).
      UWAGA: Pożywkę IVF w objętości 10 ml należy inkubować w standardowych warunkach (w maksymalnie wilgotnej atmosferze w temperaturze 39 °C przy 5% CO2, 5% O2 i 90% N2) co najmniej 4 godziny przed użyciem.
  2. Zamrożone/rozmrożone porcje nasienia przenieść do wysterylizowanej szklanej stożkowej probówki poniżej 1,5 ml ogrzanej pożywki IVF i inkubować przez 15 minut w temperaturze 39 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO2 w powietrzu.
  3. Po inkubacji ruchliwe plemniki płyną w kierunku wierzchołkowej części kolumny cieczy. Zbierz wierzchnią warstwę i obserwuj ocenę ruchliwości plemników.
    UWAGA: Parametry ruchliwości plemników należy oceniać za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA) z następującymi ustawieniami: 25 klatek uzyskanych w celu uniknięcia nakładania się ścieżek plemników, minimalny kontrast 10, minimalna prędkość średniej ścieżki 30 μm/s i ruchliwość postępowa > 80% prostoliniowości. Ten system ma specjalną konfigurację do oceny nasienia barana. Dla każdej próbki 5 μl podpróbki zawiesiny nasienia umieszcza się we wstępnie ogrzanej komorze analitycznej o głębokości 10 μm. Ruchliwość plemników ocenia się w temperaturze 37 °C przy 40-krotnym wzroście za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym, a co najmniej 500 plemników w każdej podpróbce powinno być analizowanych w co najmniej czterech różnych polach mikroskopowych. Oceniono odsetek plemników ruchliwych i ruchliwych ogółem. W przypadku zapłodnienia in vitro odsetek ruchliwych plemników powinien wynosić ≥ 30%.
  4. Rozcieńczyć ruchliwe plemniki pochodzące z pływania w końcowym stężeniu 1 x 106 plemników/ml i współinkubować je z oocytami MII w 300 μl pożywki IVF pokrytej olejem mineralnym na czterodołkowych szalkach Petriego.
  5. Po 22 godzinach przenieś przypuszczalne zygoty na czterodołkowe szalki Petriego zawierające SOF, uzupełnione 0,4% albuminą surowicy bydlęcej oraz aminokwasami egzogennymi i endogennymi w stężeniu jajowodowym, zgodnie z raportem 16 w oleju mineralnym i hoduj je w standardowych warunkach aż do stadium blastocysty.
  6. Po 22, 26 i 32 godzinach od inseminacji należy zarejestrować liczbę rozszczepionych komórek jajowych, wykazujących dwa odrębne blastomery, w badaniu pod mikroskopem stereoskopowym z 60-krotnym powiększeniem.
  7. Obserwuj zarodki codziennie, począwszy od piątego do dziewiątego dnia hodowli, a nowo powstałe blastocysty powinny być rejestrowane przez badanie pod mikroskopem stereoskopowym z 60-krotnym powiększeniem.

5. Witryfikacja i ocieplanie oocytów

UWAGA: Przeprowadź witryfikację zgodnie z metodą minimalnej objętości niezbędnej (MEV) za pomocą urządzenia cryotops17.

  1. Równoważyć grupę pięciu oocytów w temperaturze 38,5 °C przez 2 minuty w BM. Zastosowanie BM gwarantuje niskie stężenie wapnia ([Ca2++] 2,2 mg/dl)10.
  2. Odwodnić oocyty przez 3-minutową ekspozycję na roztwór równoważący zawierający 7,5% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO) i 7,5% (v/v) glikolu etylenowego (EG) w BM.
  3. Przenieś oocyty do roztworu witryfikacyjnego zawierającego 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG i 0,5 M trehalozy w BM przed załadowaniem ich do urządzenia kriotopowego i bezpośrednim zanurzeniem w ciekłym azocie w ciągu 30 s.
  4. Aby ogrzać się do temperatury biologicznej, przenieś zawartość każdego urządzenia do witryfikacji z ciekłego azotu do 200 μl kropli 1,25 M trehalozy w BM przez 1 minutę w temperaturze 38,5 °C i delikatnie wymieszaj, aby ułatwić mieszanie.
  5. Aby ułatwić usuwanie wewnątrzkomórkowych krioprotektantów, należy stopniowo przenosić oocyty do 200 μl kropli zmniejszających się roztworów trehalozy (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehalozy w BM) przez 30 s w temperaturze 38,5 °C, a następnie równoważyć przez 10 minut w temperaturze 38,5 °C w BM.

6. Ocena jakości oocytów po ociepleniu

  1. Po podgrzaniu inkubować oocyty przez 6 godzin w PBS bez Ca++ i Mg++ plus 20% FCS (BM) w 5% CO2 w powietrzu w temperaturze 38,5 °C.
    UWAGA: Zdolność oocytów do przywracania cech biologicznych i strukturalnych po witryfikacji jest w stosunku do gatunków i klas użytych oocytów.
  2. Ponieważ zdolność oocytów do regeneracji uszkodzeń kriokonserwacyjnych zależy od czasu, należy ocenić jakość oocytów w różnych punktach czasowych hodowli in vitro (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) po podgrzaniu, aby określić optymalne okno czasowe dla zapłodnienia oocytów.
    UWAGA: W oocycie dorosłej owcy optymalny czas to 4 godziny po rozgrzaniu; W przypadku oocytu przed pokwitaniem optymalny czas to 2 godziny po rozgrzaniu.

7. Ocena przeżycia oocytów

  1. Bezpośrednio po podgrzaniu i dla każdego punktu czasowego hodowli po ociepleniu oceń morfologicznie oocyty za pomocą odwróconego mikroskopu ze 100-krotnym powiększeniem.
    UWAGA: Oocyty ze zmianami strukturalnymi, takimi jak słaba cytoplazma, uszkodzenie osłony przejrzystej i/lub błony, należy klasyfikować jako zdegenerowane.
  2. Walidacja oceny integralności membrany za pomocą podwójnego różnicowego barwienia fluorescencyjnego.
  3. Inkubować oocyty w 2 ml BM zawierającego jodek propidyny (PI; 10 μg/ml) i Hoechst 33342 (10 μg/ml) przez 5 minut w 5% CO2 w powietrzu w temperaturze 38,5 °C.
  4. Po trzykrotnym umyciu w świeżym BM obserwować oocyty pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu filtra wzbudzającego o długości fali 350 nm i emisji 460 nm dla Hoechst 33342 oraz filtra wzbudzającego o długości fali 535 nm i emisji 617 nm dla PI.
    UWAGA: oocyty z nienaruszoną błoną można rozpoznać po niebieskiej fluorescencji kolorowego DNA za pomocą Hoechst 33342. Oocyty z uszkodzonymi błonami wykazują czerwoną fluorescencję z powodu barwienia DNA PI.

8. Ocena aktywności mitochondrialnej i poziomów wewnątrzkomórkowych ROS za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej

  1. Przygotuj sondę MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
    1. Rozcieńczyć zawartość 1 fiolki (50 μg) 1 ml DMSO w celu uzyskania roztworu o stężeniu 1 mM. Rozcieńczoną fiolkę należy przechowywać w ciekłym azocie.
    2. Rozcieńczyć roztwór o stężeniu 1 mM roztworem DMSO w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 100 μM i przechowywać go w temperaturze -80 °C w ciemności.
  2. Przygotować sondę dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCF-DA).
    1. RozcieńczyćH2DCF-DAw 0,1% poliwinylopirolidonie (PVA)/PBS, aby otrzymać pierwszy 100 mM roztwór. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -80 °C w ciemności.
    2. Rozcieńczyć pierwszy roztwór w 0,1% PVA/PBS, aby otrzymać roztwór podstawowy 100 μM. Przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności.
  3. Przygotować pożywkę montażową (MM): na 10 ml MM dodać 5 ml glicerolu, 5 ml PBS i 250 mg azydku sodu. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  4. Inkubować oocyty przez 30 minut w temperaturze 38,5 °C w BM z 500 nM MT-Red (roztwór podstawowy: 100 μM w DMSO).
  5. Po inkubacji z sondą MT-Red przemyć oocyty trzykrotnie w BM i inkubować przez 20 minut w tej samej pożywce zawierającej 5 μM H2DCF-DA (roztwór podstawowy: 100 μM w BM).
  6. Po wystawieniu na działanie sond umyj oocyty w BM i utrwal się w 2,5% aldehydzie glutarowym/PBS przez co najmniej 15 minut.
  7. Po utrwaleniu przemyć oocyty trzykrotnie w BM i umieścić na szkiełkach podstawowych w kropli MM o pojemności 4 μl z 1 mg/ml Hoechst 33342 za pomocą poduszek woskowych, aby uniknąć kompresji próbek.
  8. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu oceny.
  9. Wykonać analizę wycinków znakowanych immunologicznie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Mikroskop jest wyposażony w lasery Ar/He/Ne, wykorzystujące obiektyw olejowy 40/60x. Przeanalizuj sekcje według wzbudzenia sekwencyjnego.
  10. W celu oceny mitochondriów obserwuj próbki za pomocą lasera wielofotonowego w celu wykrycia MT-Red (ekspozycja: 579 nm; emisja: 599 nm).
  11. Użyj promienia lasera z jonami argonu o długości fali 488 nm i filtrze B-2 A (ekspozycja 495 nm i emisja 519 nm), aby wskazać dichlorofluoresceinę (DCF)18.
  12. W każdym pojedynczym oocycie zmierz intensywność fluorescencji MT-Red i DCF w płaszczyźnie równikowej19.
  13. Utrzymuj parametry związane z intensywnością fluorescencji na stałych wartościach podczas wszystkich akwizycji obrazu (energia lasera 26%, Ustawienia sekwencyjne 1: wzmocnienie PMT1 649-PMT2 wzmocnienie 482; Ustawienie sekwencyjne 2: wzmocnienie PMT1 625-PMT2 wzmocnienie 589; odsunięcie 0; Rozmiar otworka: 68).
  14. Wykonaj ilościową analizę intensywności fluorescencji za pomocą pakietu oprogramowania do analizy obrazu Leica LAS AF Lite, postępując zgodnie z procedurami ustandaryzowanymi przez20.
  15. Zrób zdjęcia raz, poruszając się po osi Z, aż do osiągnięcia płaszczyzny równikowej.
  16. Dla każdego zdjęcia przekształć do skali szarości i wyłączyć kanał 1 (związany z niebieskim Hoechst). Następnie ręcznie narysuj obszar zainteresowania (ROI) na opisanym obszarze, czyli wokół wrzeciona mejotycznego.
    UWAGA: Oprogramowanie może automatycznie odczytać średnią wartość pikseli na kanale 2 (FITC), odejmując od niego wartość tła.
  17. Zapisz średnie wartości pikseli i prześlij je do analizy statystycznej.

9. Analizy statystyczne

  1. Przeanalizuj następujące różnice: wskaźniki przeżycia w oocytach młodocianych i dorosłych, wskaźniki przeżycia i kompetencji rozwojowych w kontrolnych i leczonych trehalozą oocytach młodocianych, przeżywalność i aktywację partenogenetyczna oraz kompetencje rozwojowe dorosłych oocytów witryfikowanych pożywkami o różnym stężeniu wapnia, wskaźniki zapłodnienia i produkcja zarodków w oocytach młodocianych zeszklonych o niskim lub wysokim stężeniu wapnia, aktywne fenotypy mitochondriów w młodocianych oocytach zeszklonych W różnych punktach czasowych hodowli po ociepleniu i szybkościach aktywacji partenogenetycznej między dorosłymi i młodocianymi zeszklonymi oocytami za pomocą testu Chi kwadrat.
  2. Analizuj szybkość rozszczepienia i produkcję zarodków w szkliszczonych dorosłych oocytach w różnych punktach czasowych hodowli po ociepleniu, intensywność fluorescencji aktywności mitochondrialnej i poziomy wewnątrzkomórkowe ROS w młodocianych witryfikowanych oocytach w różnych punktach czasowych hodowli po ociepleniu za pomocą ANOVA po analizie jednorodności wariancji za pomocą testu Levene'a. Użyj testu post-hoc, testu Tukeya, aby podkreślić różnice między grupami.
  3. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą oprogramowania statystycznego i przyjmij prawdopodobieństwo P < 0,05 jako minimalny poziom istotności. Wszystkie wyniki są wyrażone jako średnia ± S.E.M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kriootrwałość oocytów pochodzących od dawczyń w wieku dojrzałym jest niższa w porównaniu z oocytami dorosłych. Pierwszym zaobserwowanym skutkiem jest niższy wskaźnik przeżycia po odmrożeniu w porównaniu z oocytami dorosłymi (Rycina 1A; test χ2, P<0,001). Oocytów pochodzące od młodych osobników wykazywały niższą integralność błony po odmrożeniu (Rycina 1B). Zastosowanie trehalozy w pożywce do dojrzewania miało na celu sprawdzenie, czy ten cukier moż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kriokonserwacja oocytów u zwierząt domowych może pozwolić nie tylko na długoterminową ochronę żeńskich zasobów genetycznych, ale także przyspieszyć rozwój biotechnologii embrionalnych. W związku z tym opracowanie standardowej metody witryfikacji oocytów przyniosłoby korzyści zarówno zwierzętom gospodarskim, jak i sektorowi badawczemu. W protokole tym przedstawiono kompletną metodę witryfikacji oocytów dorosłych owiec, która może stanowić solidny punkt wyjścia do opracowania skutecznego systemu witryfikacji oocytów młodoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy nie otrzymali żadnych konkretnych funduszy na tę pracę. Profesor Maria Grazia Cappai i dr Valeria Pasciu są wdzięczne za podkładanie głosu w filmie oraz za przygotowanie laboratorium podczas kręcenia filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2&,7′-dichlorofluorescin dioctanSigma-AldrichD-6883
Albumina frakcja bydlęca V, wolna od proteazySigma-AldrichA3059
Trichlorowodorek bisbenzimidu H 33342 (Hoechst 33342)Sigma-Aldrich14533
Chlorek wapnia (CaCl2 2H20)Sigma-AldrichC8106
Kwas cytrynowySigma-AldrichC2404
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeica Microsystems GmbH, WetzlarTCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop KitazatoMedyczne technologie
CysteaminaSigma-AldrichM9768
D- (-) FruktozaSigma-AldrichF0127
D(+)Trehaloza odwodnionaSigma-AldrichT0167
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma-AldrichD8537
Żółtko jajaSigma-AldrichP3556
Glikol etylenowy (EG)Sigma-Aldrich324558
FSHSigma-AldrichF4021
Kwas glutaminowySigma-AldrichG5638
Aldehyd glutarowySigma-AldrichG5882
GlicerolSigma-AldrichG5516
GlicynaSigma-AldrichG8790
HeparynaSigma-AldrichH4149
HEPESSigma-AldrichH4034
HiputarynaSigma-AldrichH1384
Mikroskop odwróconyDiaphot, Nikon
L-AlanineSigma-AldrichA3534
L-ArginineSigma-AldrichA3784
L-AsparaginaSigma-AldrichA4284
Kwas L-asparaginowySigma-AldrichA4534
L-CysteinaSigma-AldrichC7352
L-CystynaSigma-AldrichC8786
L-GlutaminaSigma-AldrichG3126
LHSigma-AldrichL6420
L-HistydynaSigma-AldrichH9511
L-IzoleucynaSigma-AldrichI7383
L-LeucynaSigma-AldrichL1512
L-LizynaSigma-AldrichL1137
L-MetioninaSigma-AldrichM2893
L-OrnitynaSigma-AldrichO6503
L-FenyloalaninaSigma-AldrichP5030
L-ProlinaSigma-AldrichP4655
L-SerynaSigma-AldrichS5511
L-TyrozynaSigma-AldrichT1020
L-WalinaSigma-AldrichV6504
Chlorek magnezu siedmiowodny (MgSO4.7H2O)Sigma-AldrichM2393
Komora licząca MaklerSefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.
Medium 199Sigma-AldrichM5017
Olej mineralnySigma-AldrichM8410
MitoTracker Red CM-H2XRosThermoFisherM7512
Surowica cieląt nowonarodzonych inaktywowana termicznie (FCS)Sigma-AldrichN4762
Sól sodowa penicyliny GSigma-AldrichP3032
Phenol RedSigma-AldrichP3532
Alkohol poliwinylowy (87-90% hydrolizowany, średnia molowa 30 000-70 000)Sigma-AldrichP8136
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP5405
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Jodek propidynySigma-AldrichP4170
Surowica owczaSigma-AldrichS2263
Azydek soduSigma-AldrichS2202
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Syrop w roztworze dl-mleczanu soduSigma-AldrichL4263
Pirogronian soduSigma-AldrichP2256
Analizator klasy plemnikówMicroptic SLS.C.A. v 3.2.0
Oprogramowanie statystyczne Minitab 18.12017 Minitab
Mikroskop stereoskopowyOlimpusSZ61
Siarczan streptomycynySigma-AldrichS9137
TaurynaSigma-AldrichT7146
TRISSigma-Aldrich15,456-3
biologiczne

Bibliografia

  1. Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
  2. Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
  3. Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  4. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
  5. Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
  6. Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
  7. Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
  8. Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
  9. Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
  10. Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
  11. Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
  12. Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
  13. Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
  14. Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
  15. Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
  16. Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
  17. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  18. Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
  19. Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  20. Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
  21. los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
  22. Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
  23. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
  24. Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
  25. Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
  26. Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
  27. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
  28. Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
  29. Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
  30. Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
  31. Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
  32. Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
  33. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  34. De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
  35. Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Witryfikacja oocyt wdojrzewanie in vitrooocyty owiecoocyty przedpubertalneoocyty doros etechnika kriokonserwacjihodowla po rozmro eniukompleks cumulus oocytmetoda Cryotopaktywno mitochondrialna
Witryfikacja dojrzałych komórek jajowych pobranych in vitro z jajników dorosłych i przed okresem dojrzewania u owiec
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.