Artykuł metodologiczny

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

DOI:

10.3791/62277

⸱

27 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Iowa State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody inokulacji oparte na Agrobacterium są szeroko stosowane do wprowadzania wektorów wirusowych do tkanek roślinnych. Badanie to szczegółowo opisuje protokół wstrzykiwania siewek kukurydzy w pobliżu tkanki merystematycznej z Agrobacterium przenoszącym wektor wirusowy. Do optymalizacji tej metody wykorzystano rekombinowane klony wirusa mozaiki wyczyńca (FoMV) zaprojektowane do wyciszania genów i ekspresji genów, a jej zastosowanie rozszerzono o rekombinowany wirus mozaiki trzciny cukrowej (SCMV) zmodyfikowany do ekspresji genów. Fragmenty genów lub sekwencje kodujące, które są przedmiotem zainteresowania, są wprowadzane do zmodyfikowanego, zakaźnego genomu wirusa, który został sklonowany do binarnego wektora plazmidowego T-DNA pCAMBIA1380. Powstałe w ten sposób konstrukty plazmidowe przekształcają się w szczep Agrobacterium tumefaciens GV3101. Siewki kukurydzy w wieku 4 dni można wstrzykiwać w pobliże węzła chrzęstnego z bakteriami zawieszonymi w roztworzeMgSO4. Podczas zakażenia Agrobacterium T-DNA niosące genom wirusa jest przenoszone do komórek kukurydzy, co pozwala na transkrypcję genomu wirusowego RNA. Gdy rekombinowany wirus replikuje się i rozprzestrzenia ogólnoustrojowo w roślinie, na liściach można zaobserwować objawy wirusowe i zmiany fenotypowe wynikające z wyciszenia genów docelowych, zmiany naśladującej 22 (les22) lub fitoen-desaturazy (PDS) lub ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) można wykryć po oświetleniu światłem UV lub mikroskopią fluorescencyjną. Aby jednocześnie wykryć wirusa i ocenić integralność wstawki, RNA jest ekstrahowane z liści wstrzykniętej rośliny, a RT-PCR przeprowadza się przy użyciu starterów flankujących miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) przenoszącego wstawioną sekwencję. Protokół ten został skutecznie zastosowany w kilku genotypach kukurydzy i może być łatwo rozszerzony na inne wektory wirusowe, oferując w ten sposób dostępne narzędzie do wprowadzania wektorów wirusowych do kukurydzy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakaźne klony wielu wirusów roślinnych zostały zaprojektowane do indukowanego przez wirusa wyciszania genów (VIGS), nadekspresji genów (VOX), a ostatnio edycji genów za pomocą wirusa (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Wraz z opracowywaniem nowych konstruktów wirusowych należy również rozważyć metody skutecznego infekowania tkanek roślinnych tymi zmodyfikowanymi wirusami. Obecne metody wywoływania infekcji wirusowych w roślinach obejmują bombardowanie cząstkami, wcieranie transkryptów RNA in vitro lub klonów DNA, szczepienie nakłuciami naczyniowymi lub inokulację Agrobacterium tumefaciens (agroinokulacja)5,12,13,14,15,16,17. Każda z tych metod inokulacji ma swoje wady i zalety, do których należą koszty, zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt i wykonalność w ramach danego systemu wirusów roślinnych. Preferowane są metody wykorzystujące infiltrację lub wstrzyknięcie szczepów Agrobacterium zawierających binarne konstrukty T-DNA przeznaczone do dostarczania rekombinowanych wirusów, ponieważ są one proste i niedrogie. Brakuje jednak szczegółowych metod agroinokulacji gatunków jednoliściennych, takich jak Zea mays (kukurydza).

Jedno z pierwszych doniesień o agroinokulacji w celu dostarczania wirusa zostało opublikowane w 1986 roku, kiedy genom wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) został wstawiony do konstruktu T-DNA, a powstały Agrobacterium przenoszący ten konstrukt został wtarty w rośliny rzepy18. Od tego czasu opracowano dodatkowe metody agroinokulacji. Na przykład, w przypadku wirusa mozaiki wyczyńca (FoMV), Nicotiana benthamiana może być użyta jako żywiciel pośredni do generowania cząsteczek wirusa w liściach, które stanowią źródło inokulum6. Inokulacja kukurydzy metodą nacierania przy użyciu zakażonych liści N. benthamiana jest skuteczna, szybka i prosta, ale użycie żywiciela pośredniego nie działa w przypadku wszystkich wirusów infekujących kukurydzę. Na przykład wirus mozaiki trzciny cukrowej (SCMV) nie może zainfekować N. benthamiana, co wymaga użycia alternatywnych źródeł inokulum dla wektorów pochodzących z tego wirusa. W 1988 roku wirus DNA Agrobacterium zawierający wirusa smug kukurydzy (MSV), został wprowadzony do siewek kukurydzy przez iniekcję (agroiniekcję), co pokazuje, że metody inokulacji oparte na Agrobacterium są również przydatne dla roślin jednoliściennych19. Pomimo tego wczesnego sukcesu w agroiniekcji, opublikowano niewiele badań wykorzystujących tę technikę w kukurydzy, co pozostawia otwarte pytania dotyczące możliwości zastosowania tej metody w przypadku wirusów RNA i wektorów VIGS, VOX i VEdGE20,21,22. Jednak szerokie zastosowanie agroiniekcji w gatunkach jednoliściennych jest obiecujące, ponieważ to ogólne podejście zostało zastosowane w storczykach, ryżach i pszenicy23,24,25,26,27,28.

Ten protokół został zoptymalizowany dla FoMV i szczepu Agrobacterium GV3101 i został również zastosowany do wektora SCMV. FoMV to potexwirus o szerokim zakresie żywicieli, który obejmuje 56 gatunków jednoliściennych i dwuliściennych29. FoMV ma jednoniciowy genom RNA o dodatnim znaczeniu 6,2 kilozasady (kb), który koduje pięć różnych białek z pięciu otwartych ramek odczytu (ORF)30,31,32,33,34,35. FoMV został wcześniej opracowany zarówno jako wektor VIGS, jak i VOX dla kukurydzy poprzez włączenie zakaźnego klonu do szkieletu plazmidu T-DNA6,36,37. Genom wirusa został zmodyfikowany do zastosowań VIGS poprzez dodanie miejsca klonowania (MCS1*) bezpośrednio za białkiem płaszcza (CP) (Rysunek 1A) 36. W przypadku aplikacji VOX i VEdGE promotor CP został zduplikowany i dodano drugie miejsce klonowania (MCS2), aby umożliwić wstawianie interesujących sekwencji między ORF 4 a CP ( Rysunek 1B) < sup class = "xref">6. Wektor FoMV zawierający zarówno MCS1, jak i MCS2 bez wstawień to pusty wektor FoMV (FoMV-EV) (Rysunek 1).

SCMV to niepowiązany wirus, który został opracowany dla VOX w kukurydzy38. Należy do rodziny Potyviridae, której kilka członków zostało zaprojektowanych do ekspresji obcych białek w planta39,40,41,42,43,44. Zakres żywicieli SCMV obejmuje kukurydzę, sorgo i trzcinę cukrową45,46, co czyni go cennym dla badań funkcjonalnych genów w tych głównych roślinach uprawnych36,38. SCMV ma dodatni sens, jednoniciowy genom RNA o długości około 10 kb47,48. Aby utworzyć wektor SCMV VOX, dobrze znane złącze P1/HCPro zostało wykorzystane jako miejsce insercji dla sekwencji heterologicznych38. Po tym miejscu klonowania następuje sekwencja kodująca miejsce rozszczepienia proteazy NIa-Pro, co prowadzi do produkcji białek niezależnych od poliproteiny SCMV (Figura 1C).

Plazmidy T-DNA przenoszące zakaźne cDNA tych rekombinowanych wirusów zostały przekształcone w szczep Agrobacterium GV3101. GV3101 to szczep typu nopalinowego, który jest dobrze znany z tego, że jest w stanie przenosić T-DNA do gatunków jednoliściennych, w tym kukurydzy26,28,49. Dodatkowo, w poprzednich badaniach agroiniekcji wykorzystano szczepy C58 lub jego pochodną GV3101, a także19,20,22,27.

Trzy geny markerowe zostały użyte do opracowania tego protokołu: dwa do wyciszania genów i jeden do ekspresji genów. Fragment 329 par zasad (bp) z uszkodzenia genu kukurydzy naśladującego 22 (les22, GRMZM2G044074) wykorzystano do skonstruowania wektora wyciszającego FoMV-LES22. Kiedy les22 jest wyciszony w kukurydzy, wzdłuż unaczynienia liści pojawiają się małe, okrągłe plamy komórek nekrotycznych, które rozszerzają się i łączą w duże obszary nekrotycznej tkanki liścia50. FoMV-PDS, zawierający 313 pz fragmentu genu fitoenu desaturazy genu sorgo (PDS, LOC110436156, 96% identyczność sekwencji z PDS kukurydzy, GRMZM2G410515), indukuje wyciszenie PDS w kukurydzy, co skutkuje powstawaniem małych smug fotobielonych komórek wzdłuż układu naczyniowego liści, które wydłużają się z czasem51. Nienaruszona sekwencja kodująca białko zielonej fluorescencji (GFP) została wykorzystana do wykazania ekspresji białka zarówno dla FoMV (FoMV-GFP), jak i SCMV (SCMV-GFP). Ekspresja GFP w liściach jest zazwyczaj najbardziej wykrywalna po 14 dniach od inokulacji (DPI)6. Chociaż wcześniej przeprowadzono badania z wykorzystaniem agroiniekcji wektorów wirusowych w kukurydzy, eksperymenty te wykazały jedynie, że agroiniekcja może ułatwić infekcję wirusową z zakaźnego klonu w siewkach kukurydzy i nie rozprzestrzeniać się na rekombinowane wirusy przeznaczone do zastosowań VIGS lub VOX19,20,21,22. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na poprzednich metodach agroiniekcji, w szczególności Grismley et al.19. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda agroiniekcji jest kompatybilna z wektorami VIGS i VOX, nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani alternatywnych gospodarzy jako źródeł inokulum oraz skraca całkowity czas i koszt wymagany do przygotowania i przeprowadzenia inokulacji w porównaniu z innymi powszechnymi metodami, które wymagają biolistyki lub transkrypcji in vitro. Protokół ten ułatwi badania genomiki funkcjonalnej w kukurydzy z zastosowaniami obejmującymi VIGS, VOX i VEdGE.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa plazmidu

UWAGA: Ten protokół może być stosowany do innych wektorów wirusowych lub szczepów Agrobacterium, ale może to wpłynąć na ogólny sukces inokulacji przez agroiniekcję. Zawsze wykonuj etapy inokulacji bakteryjnej i posiewu w okapie z przepływem laminarnym.

  1. Konstrukcja tłumiąca FoMV
    UWAGA: Pożywka Luria-Bertani (LB) (Miller) jest używana do wszystkich pożywek, chyba że określono inaczej. Płynny LB wytwarza się przez zawieszenie 25 g granulek w 1 000 ml wody destylowanej i autoklawowanie na 15 minut w temperaturze 121 °C. Stałe podłoże LB jest podobnie wytwarzane z dodatkiem 1,5% agaru przed autoklawowaniem. Antybiotyki dodaje się po schłodzeniu LB do ~60 °C, a roztwór wlewa się do płytek Petriego o wymiarach 95 x 15 mm. Stężenia antybiotyków, które należy stosować, są następujące: ryfampicyna (rif) w stężeniu 25 μg/ml, gentamycyna (gentamycyna) w stężeniu 50 μg/ml i kanamycyna (kan) w stężeniu 50 μg/ml.
    1. PCR amplifikuje fragmenty genu kukurydzy, który ma zostać wyciszony (np. les22 lub pds) za pomocą startera do przodu z miejscem restrykcji PacI i startera odwrotnego z miejscem restrykcji XbaI. Umożliwi to ligację fragmentów genu do MCS1* wektora binarnego FoMV-pCAMBIA1380 w orientacji antysensownej.
      UWAGA: Skonfiguruj PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności, starterów do przodu i do tyłu po 10 μM każdy, plazmidowej matrycy DNA i wody, zgodnie ze specyfikacjami polimerazy DNA. Amplifikuj przez 35 cykli, stosując temperaturę wyżarzania zgodnie z temperaturą topnienia polimerazy DNA i startera (Tm) oraz wydłużenie 30 s na kilozasadę, która ma być amplifikowana.
    2. Wykonaj oczyszczanie PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie ze specyfikacją zestawu.
    3. Trawić oczyszczony produkt PCR i FoMV-EV za pomocą enzymów restrykcyjnych XbaI i PacI. Użyj 1 μg plazmidu lub całego oczyszczonego produktu PCR, 2 μl 10x buforu, 1 μl enzymu restrykcyjnego i dodaj wodę, aby uzyskać 20 μl końcowej objętości reakcji. Inkubować zgodnie ze specyfikacją enzymu.
    4. Związać strawiony produkt PCR i FoMV-EV wraz z ligazą DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.
    5. Przekształć ligowany plazmid w chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α za pomocą metody szoku cieplnego.
      1. Rozmrozić komórki na lodzie i dodać 3 μl plazmidu do probówki. Inkubować na lodzie przez 30 minut, a następnie szokować cieplnie przez 30 s w temperaturze 42 °C.
      2. Umieścić na lodzie na 5 minut, dodać 200 μl super optymalnego bulionu z represją kataboliczną (SOC) i pozwolić komórkom E. coli odzyskać sprawność w pożywce SOC przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min.
      3. Płytkę umieścić na pożywce LB selektywnej dla kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    6. Sprawdź kolonie pod kątem dokładnych klonów za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu starterów FM-5840F i FM-6138R (Tabela uzupełniająca 1). Prześlij 250 ng plazmidowego DNA do placówki, która wykona sekwencjonowanie Sangera. Na potrzeby tego eksperymentu próbki zostały wysłane do Iowa State University DNA Core Facility.
    7. Zaszczepić 2 ml płynnego LB wybraną kolonią i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min. Ekstrakcja plazmidowego DNA z hodowli nocnej za pomocą preparatu plazmidowego DNA do lizy alkalicznej52.
    8. Przekształć plazmidowe DNA w komórki szczepu Agrobacterium GV3101 metodą zamrażania i rozmrażania. Pozostawić 100 μl chemicznie kompetentnych komórek do rozmrożenia na lodzie, dodać 1-5 μl plazmidu i inkubować na lodzie przez 30 minut. Umieścić w ciekłym azocie na 1 minutę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Dodać 1 ml SOC, pozostawić do odzyskania na 2-3 godziny w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem, rozlać płytkę na pożywce rif, gent i kan selective LB i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
    9. Przesiać kolonie na obecność insertu za pomocą colony PCR. Wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną i wymieszaj ją z 30 μl wody. Przygotuj reakcję PCR, dodając 12,5 μl głównej mieszanki polimerazy, 1,25 μl każdego 10 μM startera, FM-5840F i FM-6138R, 3 μl zawiesiny kolonii bakteryjnej i wodę do końcowej objętości 25 μl. Cykl 35 razy w temperaturze wyżarzania 64 °C i czasie przedłużenia 1 min (1 min na każdy amplifikowany kb).
    10. Zaszczepić 2-5 ml płynnego LB (rif, gent, kan) odpowiednią kolonią Agrobacterium. Pozostaw na noc do wyrośnięcia w temperaturze 28 °C, wstrząsając przy 225 obr./min.
    11. Wymieszaj nocną kulturę z 50% roztworem glicerolu w stosunku 1:1. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
  2. Konstrukcja wyrażenia FoMV
    1. PCR wzmacnia interesującą sekwencję kodowania, w tym kodony start i stop (np. GFP), jak opisano w 1.1.1, dodając miejsce restrykcyjne Bsu36I na starterze do przodu i miejsce restrykcyjne PspOMI na starterze odwrotnym, aby umożliwić klonowanie kierunkowe w orientacji sensownej do MCS2.
    2. Wykonaj oczyszczanie PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie ze specyfikacją zestawu.
    3. Trawić produkt PCR i FoMV-EV za pomocą enzymów restrykcyjnych Bsu36I i PspOMI, jak opisano w 1.1.3.
    4. Związać strawiony produkt PCR i FoMV-EV wraz z ligazą DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.
    5. Przekształcić w DH5α chemicznie kompetentne komórki E. coli przy użyciu metody szoku cieplnego, jak opisano w 1.1.5. Płytkę umieścić na pożywce LB selektywnej dla kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    6. Sprawdź kolonie pod kątem dokładnych klonów za pomocą sekwencjonowania Sangera, jak opisano w 1.1.6, przy użyciu starterów 5AmuS2 i 5AmuA2 (Tabela uzupełniająca 1).
    7. Zaszczepić 2 ml płynnego LB wybraną kolonią i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 225 obr./min. Ekstrakcja plazmidowego DNA z hodowli nocnej za pomocą preparatu plazmidowego DNA do lizy alkalicznej52.
    8. Przekształć plazmidowe DNA w chemicznie kompetentne komórki szczepu Agrobacterium GV3101 za pomocą metody zamrażania i rozmrażania, jak opisano w 1.1.8. Płytkę na pożywkach selektywnych LB rif, gent i kan i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
    9. Przesiać kolonie na obecność insercji za pomocą PCR kolonii przy użyciu starterów 5AmuS2 i 5AmuA2.
    10. Zaszczepić 2-5 ml płynnego LB (rif, gent, kan) odpowiednią kolonią Agrobacterium. Wstrząsać przez noc z prędkością 225 obr./min w temperaturze 28 °C.
    11. Wymieszaj nocną kulturę z 50% roztworem glicerolu w stosunku 1:1. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
  3. Konstrukcja wyrażenia SCMV
    1. PCR amplifikuje gen będący przedmiotem zainteresowania (np. GFP) z wyłączeniem kodonu stop, jak opisano w 1.1.1, w tym miejsce trawienia PspOMI na starterze do przodu i miejsce trawienia SbfI na starterze odwrotnym, aby umożliwić kierunkowe klonowanie do wektora binarnego SCMV-pCAMBIA1380.
      UWAGA: Insert musi być sklonowany w ramce z poliproteiną wirusa.
    2. Wykonaj oczyszczanie PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie ze specyfikacją zestawu.
    3. Trawić produkt PCR i SCMV-EV za pomocą enzymów restrykcyjnych PspOMI i SbfI, jak opisano w ppkt 1.1.3.
    4. Liżować strawiony produkt PCR i SCMV-EV wraz z ligazą DNA T4 zgodnie z protokołem producenta.
    5. Przekształcić produkt w chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α przy użyciu metody szoku cieplnego, jak opisano w ppkt 1.1.5. Płytkę umieścić na pożywce kan selective LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    6. Badanie przesiewowe kolonii w celu uzyskania dokładnych klonów za pomocą sekwencjonowania Sangera, jak opisano w 1.1.6 przy użyciu starterów SC-745F i HCProR1 (Tabela uzupełniająca 1).
    7. Zaszczepić 2 ml płynnego LB wybraną kolonią i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min. Wyekstrahuj plazmidowe DNA z nocnej hodowli za pomocą preparatu DNA plazmidu do lizy alkalicznej52.
    8. Przekształć plazmidowe DNA w chemicznie kompetentne komórki szczepu Agrobacterium GV3101 przy użyciu metody zamrażania i rozmrażania, jak opisano w 1.1.8. Płytkę na pożywkach selektywnych LB rif, gent i kan i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
    9. Przesiać kolonie na obecność insertu z colony PCR ze starterami SC-745F i HCProR1, jak opisano w 1.1.9.
    10. Zaszczepić 2-5 ml płynnego LB (rif, gent, kan) odpowiednią kolonią Agrobacterium. Wstrząsać przez noc z prędkością 225 obr./min w temperaturze 28 °C.
    11. Wymieszaj nocną kulturę z 50% roztworem glicerolu w stosunku 1:1. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.

2. Przygotowanie sadzonek

  1. Posadź 1-2 nasiona kukurydzy (kukurydza cukrowa 'Golden Bantam', FR1064, B73 itp.) w podłożu uprawowym na bazie torfu w małych wkładkach umieszczonych w tacach na 4-7 dni przed wstrzyknięciem. Umieścić w komorze wzrostowej w ciągu 16 godzin dni w temperaturze 25 °C i 8 godzin nocy w temperaturze 22 °C (~185 promieniowania aktywnego fotosyntetycznie (PAR)) lub w szklarni poniżej 16 godzin dni w temperaturze 22-25 °C i 8 godzin nocy w temperaturze 22-25 °C (350-400 PAR).
    UWAGA: Podatność na Agrobacterium różni się w zależności od genotypu kukurydzy, wpływając na wskaźniki sukcesu. Ponadto niektóre wektory wirusowe mogą być niezgodne z niektórymi genotypami kukurydzy.
  2. Podlewaj regularnie i nawozić raz w tygodniu płynnym nawozem 15-5-15 w ilości 330 części na milion (PPM).

3. Przygotowanie Agrobacterium

  1. Na dzień przed wstrzyknięciem należy przygotować płynną pożywkę LB z odpowiednim antybiotykiem (rif, gent, kan) i zaszczepić szczepem Agrobacterium przenoszącym pożądany konstrukt wirusowy. Zaleca się dodanie 20 μl bulionu glicerolu do 50 ml LB, który powinien dać wystarczającą ilość kultury bakteryjnej do zaszczepienia >100 roślin i może być skalowany w górę lub w dół w zależności od potrzeb.
    UWAGA: Przygotuj wystarczającą ilość inokulum, aby uzyskać końcową ilość zawiesiny bakteryjnej co najmniej 1 ml przy gęstości optycznej 600 nm (OD>600) 1,0 na każde 4-5 roślin.
  2. Wytrząsać przy 225 obr./min w temperaturze 28 °C przez 24 godziny.
  3. Bakterie osadkowe przez 10 minut w 4 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  4. Dokładnie umyć granulki 1 ml wody dejonizowanej (DI), pipetując lub delikatnie wirując.
  5. Powtórz krok 3.3, aby osadzać bakterie.
  6. Zawiesić osad w 1 ml 10 mM roztworuMgSO4 przez pipetowanie lub delikatne wirowanie.
    1. Opcjonalnie dodać 200 μM acetosyringonu do roztworu. Chociaż powszechnie stosowany, acetosyringon zwiększa jedynie zdolność transformacyjną niektórych szczepów Agrobacterium. Autorzy nie stwierdzili, aby dodanie acetosyringonu wpływało na skuteczność tego protokołu (Tabela uzupełniająca 2).
      UWAGA: 10 mM roztwórMgSO4 można przygotować z 1 M roztworu podstawowego o pH 6,3 przechowywanego w temperaturze pokojowej. Roztwór prawdopodobnie nie będzie wymagał regulacji pH.
  7. Zmierzyć OD600 próbki za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć do 1,0 OD600 roztworem 10 mM MgSO4.
    UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania. Zawiesina bakteryjna może być przechowywana w temperaturze pokojowej do 5 godzin przed wstrzyknięciem.

4. Wtrysk

UWAGA: Siewki kukurydzy w wieku od 4 do 7 dni mogą być używane do iniekcji. Na tempo wzrostu sadzonek duży wpływ mają między innymi warunki wzrostu, ilość PAR (tj. wyższy PAR w szklarni niż w komorze wzrostowej) oraz genotyp, który może być trudny do kontrolowania w warunkach szklarniowych. Rośliny można wstrzykiwać już w wieku 4 dni, gdy mają 2-3 cm wysokości bez rozwiniętych liści i mają nawet 7 dni, gdy rozszerza się najniższy liść o zaokrąglonym końcu. Wskaźnik sukcesu tej metody inokulacji gwałtownie spada, gdy rośliny starzeją się powyżej 7 dni po siewie. Miejsce wstrzyknięcia jest takie samo bez względu na wiek sadzonek.

  1. Zakładając okulary ochronne, wstrzyknij zawiesinę bakteryjną do sadzonek 2-3 mm powyżej węzła chrzęstnego za pomocą igły 25G x 5/8" przymocowanej do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml.
    UWAGA: Węzeł chrząstek pokoleniowy to miejsce, w którym ostatecznie uformują się korzenie korony. Jest to najniższy węzeł w zakładzie. Zazwyczaj następuje zmiana koloru z zielonego na biały w węźle i poniżej niego. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się tuż nad merystemem. Wypreparowanie kilku sadzonek na tym etapie może pomóc w wizualizacji lokalizacji merystemu, a co za tym idzie, prawidłowego miejsca wstrzyknięcia.
  2. Delikatnie uciskać strzykawkę, aż zawiesina wypełni chrząszcz lub stanie się widoczna w okółku, w zależności od etapu wzrostu roślin. Jest to około 100-200 μl zawiesiny.
    UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie zawiesiny do sadzonki jest trudne, miejsce wstrzyknięcia może być zbyt niskie. Umiarkowane ciśnienie to wszystko, co powinno być potrzebne do wstrzyknięcia zawiesiny.
  3. Wstrzyknąć wszystkie sadzonki, zmieniając strzykawki i igły dla każdego konstruktu.

5. Ciągła pielęgnacja roślin

  1. Przeszczep wstrzyknięte sadzonki do doniczek o wymiarach 13 x 13 x 15 cm lub większych, gdy mają 7-8 dni.
  2. Utrzymuj warunki wzrostu (16 h fotoperiod i nawożenie raz w tygodniu).

6. Potwierdzenie zakażenia (Fenotypowo i RT-PCR)

  1. Fenotypowo oceniają rośliny w zakresie 14-21 DPI. Zmiany spowodowane wyciszeniem genów kontrolnych, zmiany naśladujące 22 lub desaturazy fitoenowej można łatwo zauważyć na liściach i różnią się one od objawów FoMV. Ekspresję GFP można wykryć za pomocą obrazowania mikroskopem fluorescencyjnym lub innym obrazowaniem światłem UV.
    UWAGA: Niektóre konstrukty/wektory wirusowe mogą potrzebować więcej czasu, aby pokazać objawy lub mogą w ogóle nie wykazywać żadnych objawów. Warunki silnego oświetlenia znacznie zwiększają fenotypy spowodowane wyciszaniem zmiany naśladującej 22 i desaturazy fitoenowej. Zmiany chorobowe mogą być mniej widoczne lub nie występować, jeśli rośliny są utrzymywane w warunkach słabego oświetlenia, takich jak komora wzrostowa, jednak rzeczywisty wskaźnik infekcji określony za pomocą RT-PCR nie powinien być zakłócony (Tabela 1).
  2. Aby potwierdzić infekcję molekularną, należy pobrać próbkę liścia 6 o rozdzielczości 14-21 DPI i wyekstrahować całkowite RNA za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Wykorzystanie wyekstrahowanego RNA jako matrycy do generowania pierwszej nici cDNA.
    1. Skonfiguruj reakcję cDNA z maksymalnie 5 μg całkowitego RNA, 1 μl losowych starterów heksamerowych, 1 μl starterów oligo (dT)18, 1 μl dNTP, 1 μl odwrotnej transkryptazy i wodą, aby uzyskać końcową objętość 14,5 μl.
  4. Używając starterów przeznaczonych dla konstruktu wirusa i cDNA jako matrycy, należy przeprowadzić PCR na każdej próbce, aby potwierdzić infekcję wirusową i określić integralność genu lub fragmentu genu będącego przedmiotem zainteresowania, jak opisano w 1.1.1, z wyjątkiem redukcji cykli do 25 dla FoMV i 30 dla SCMV, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich.
    1. W przypadku konstruktów wyciszających FoMV należy użyć starterów FM-5840F i FM-6138R w celu amplifikacji w poprzek MCS1*, który zawiera fragment genu kukurydzy. W przypadku konstruktów ekspresji FoMV użyj starterów 5AmuS2 i 5AmuA2 do amplifikacji w poprzek MCS2, który zawiera wstawiony gen.
    2. W przypadku konstruktów ekspresji SCMV użyj starterów SC745-F i HCProR1 do amplifikacji w poprzek MCS, który zawiera wstawiony gen (rysunek uzupełniający 3).
    3. W przypadku endogennego genu kontrolnego należy użyć starterów ZmActS i ZmActA, które amplifikują fragment mRNA aktyny kukurydzianej (GRMZM2G126010) lub starterów ZmUbiF i ZmUbiR, które amplifikują fragment mRNA poliubikwityny kukurydzianej (GRMZM2G409726_T01).
  5. Wizualizuj produkt PCR na 1% żelu agarozowym zawierającym barwnik kwasu nukleinowego, aby określić obecność lub brak wirusa i genu lub fragmentu genu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było opracowanie prostego protokołu bezpośredniego wprowadzania rekombinowanych wirusów zaprojektowanych do wyciszania lub ekspresji genów do siewek kukurydzy (Rysunek 2). Wektory wirusowe przenoszące insercje są projektowane i klonowane przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Fragmenty genów do wyciszania są wprowadzane do MCS1* w FoMV-EV, a sekwencje kodujące do ekspresji są wprowadzane do FoMV-EV w MCS2 lub SCMV-EV w MCS. Powstałe plazmidy są przenoszone do szczepu Agrobacterium GV3101. Następnie sadzonki kukurydzy wstrzykuje się w ciągu tygodnia lub krócej po posadzeniu. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu rośliny można ocenić zarówno fenotypowo, jak i molekularnie pod kątem infekcji wirusowej, wyciszania genów i ekspresji genów.

Rośliny kukurydzy są uprawiane na podłożu torfowym przez 4-7 dni. Na tym etapie merystem wierzchołkowy pędu znajduje się tuż nad węzłem chrząskowym (Ryc. 3A). Po tym, jak chrząszcz rozszerzy się o 2-3 centymetry lub do 7 dni po siewie, rośliny wstrzykuje się 2-3 mm powyżej węzła chrząstki (Ryc. 3B-F). Po około 12 dniach od wstrzyknięcia rośliny zaczną wykazywać fenotypy wyciszające na swoich liściach, powszechnie obserwowane w pobliżu tkanki naczyniowej, a zmiany te są wizualnie różne od objawów mozaiki wirusowej FoMV (Ryc. 4). Zarówno obecność FoMV, jak i wyciszenie docelowych genów są wykrywalne w roślinach, którym wstrzyknięto (Ryc. 5). Ekspresję GFP można wykryć po 2 tygodniach od wstrzyknięcia pod mikroskopem fluorescencyjnym i jest najsilniejsza na liściach 5-7 (Ryc. 6). Obserwowana w systemie obrazowania fluorescencyjnego, ekspresja GFP z FoMV może być wizualizowana jako wiele małych, punktowych obszarów fluorescencji rozmieszczonych na liściach w pobliżu tkanki naczyniowej, podczas gdy ekspresja GFP z SCMV składa się z większych plam (Rysunek 6, Rysunek uzupełniający 1). Chociaż objawy mozaiki wirusowej są często widoczne na roślinach zakażonych konstruktami wyciszającymi FoMV, roślinom, którym wstrzyknięto konstrukty ekspresyjne GFP, które z powodzeniem wyrażają GFP, często nie mają tych objawów. W rezultacie, roślina bez widocznych objawów może nadal być pozytywna pod względem ekspresji wirusa i GFP. Ponadto należy unikać nakłuwania merystemu podczas procedury agroiniekcji, ponieważ może to spowodować wady morfologiczne, ale powstałe rośliny przeżywają i często są objawowe (Ryc. 7).

Chociaż ten protokół został pierwotnie opracowany przy użyciu kukurydzy cukrowej, kilka linii inbredu kukurydzianego można z powodzeniem zaszczepić konstruktami wyciszającymi geny FoMV za pomocą agroiniekcji. Na przykład FR1064 i B73 mają zazwyczaj wysokie wskaźniki infekcji wirusowych (Tabela 2). Warto zauważyć, że Mo17, linia o znanej genetycznej odporności na FoMV, miała 0% skuteczności infekcji zgodnie z oczekiwaniami36, 53. Dodatkowo zastosowany konstrukt wpływa na skuteczność infekcji (tab. 3). W przypadku FoMV, FoMV-EV i FoMV-LES22 mają zazwyczaj najwyższą skuteczność infekcji wynoszącą odpowiednio 53% i 54%. FoMV-PDS ma nieco niższą sprawność na poziomie 38%, a FoMV-GFP jest najniższą na poziomie 17%. SCMV-GFP ma skuteczność infekcji na poziomie 8%. Te wartości procentowe są średnimi z kilku eksperymentów; Poszczególne eksperymenty mogą mieć wyższą lub niższą skuteczność infekcji.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne reprezentacje klonów T-DNA FoMV i SCMV używanych do agroiniekcji w kukurydzy. Wektor FoMV zawiera dwa wielokrotne miejsca klonowania (MCS1* i MCS2). Pusty wektor, FoMV-EV, ma wartość 7 269 pz i nie zawiera żadnych wstawek w żadnym z MCS. (A) Wyciszanie genów za pomocą wektora FoMV można osiągnąć poprzez wstawienie fragmentów genu do MCS1*, oznaczonych jako sekwencja zainteresowania (SOI), zwykle w orientacji antysensownej. (B) Ekspresja genów za pomocą wektora FoMV może być osiągnięta poprzez wprowadzenie genów ORF do MCS2 w orientacji zmysłowej, oznaczonej jako SOI. (C) Wektor SCMV został zaprojektowany tak, aby zawierał jeden MCS między P1 a HCPro. Pusty wektor, SCMV-EV, ma wartość 11 015 pz i nie zawiera żadnych wstawek w MCS. Geny ORF wstawione do MCS, które znajdują się w ramce z poliproteiną SCMV, ulegną ekspresji jako białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczne podsumowanie protokołu agroiniekcji. (A) Klonowanie SOI, CDS lub fragmentu genu, do wektora wirusowego i przekształcanie się w szczep Agrobacterium GV3101. (B) Posadź kukurydzę i rosną przez 4-7 dni. (C) Hodować GV3101 w płynnej kulturze przez noc w temperaturze 28 °C. (D) Przygotować zawiesinę bakteryjną do wstrzykiwań. (E) Wstrzyknąć siewki 2-3 mm powyżej węzła koleoptylowego ze 100-200 μl zawiesiny. (F) Przesadzaj sadzonki w wieku 7 dni do większych doniczek i rosły przez 2-3 tygodnie, aż pojawi się 5liść. Fenotyp w razie potrzeby. (G) Próbka liścia 5 i ekstrahowany RNA. (H) Wykonaj cDNA i przeprowadź PCR w celu amplifikacji wirusa/SOI. (I) Uruchom na żelu w celu analizy jakościowej w celu określenia obecności/braku wirusa oraz skróconego lub nienaruszonego SOI. Ta figura została stworzona z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Metoda agroiniekcji polegająca na zaszczepieniu sadzonek tuż nad węzłem chrząszczu. (A) Rośliny 4-5-dniowe. Chrząszcz jest w pełni rozszerzony, a pierwszy prawdziwy liść może być częściowo widoczny, ale nie jest rozwinięty. (B) Rośliny 6-7-dniowe. Pierwszy liść może być rozszerzony, ale nie będą widoczne żadne kołnierze. Drugi liść również będzie widoczny i na tym etapie może zacząć się rozwijać. (C) Rozwarstwienie 6-7-dniowych roślin pokazujące położenie merystemu wierzchołkowego pędu w stosunku do węzła chrząszczowego. (D) Wstrzykiwanie 4-5-dniowych roślin. (E) Iniekcja 6-7-dniowych roślin. (F) Wstrzykiwanie 6-7-dniowych roślin za pomocą roztworu barwnika, pokazujące barwione inokulum wychodzące z okółka sadzonki. (G) Zbliżenie miejsca iniekcji roślin w wieku 6-7 dni w stosunku do węzła chrząszczowego. (H) Zbliżenie na 6-7-dniową roślinę po wstrzyknięciu, pokazujące barwione inokulum w okółku rośliny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Objawy genów kontroli wyciszania używanych w eksperymentach agroiniekcji. (A) Liść sfotografowany w rozdzielczości 17 DPI po wstrzyknięciu roślinie FoMV-LES22. FoMV-LES22 przenosi 329 pz insertu 3' CDS genu kukurydzy naśladującego zmianę 22 w orientacji antysensownej. Wyciszenie powoduje akumulację toksycznego metabolitu, który z kolei powoduje zmiany martwicze, które najpierw pojawiają się jako smugi wzdłuż naczyń krwionośnych i rosną w większe plamy, jak pokazano tutaj. (B) Liść sfotografowany w temperaturze 17 DPI po wstrzyknięciu roślinie FoMV-PDS. FoMV-PDS zawiera 313 par zasad insercji 3' CDS genu desaturazy fitoenu sorgo w orientacji antysensownej. Wyciszenie pds w kukurydzy powoduje ogólnoustrojowy fenotyp fotobielenia, który zaczyna się od małych, cienkich smug wzdłuż naczyń krwionośnych, które rozwijają się w dłuższe smugi wzdłuż liścia, jak pokazano tutaj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: qRT-PCR roślin, którym wstrzyknięto konstrukty wyciszające geny FoMV. Potwierdzenie ogólnoustrojowego zakażenia FoMV i wyciszenia genów indukowanego przez konstrukty FoMV-LES22 i FoMV-PDS dostarczane za pomocą agroiniekcji w roślinach kukurydzy cukrowej (Golden x Bantam). (A) Obrazy żelu pokazują analizy RT-PCR potwierdzające obecność pustego wektora FoMV-MCS1* (amplikon 315 pz) i FoMV-PDS (amplikon 625 pz) w liściu 6 pięciu pojedynczych roślin. Zastosowane startery PCR wytwarzają amplikon obejmujący MCS1*. Amplikon genu aktyny kukurydzy (Zm-aktyna) służy jako gen odniesienia. Wykres słupkowy przedstawia względne wartości wyrażenia qRT-PCR dla ekspresji pds w liściu 6 po 37 dniach od inokulacji (DPI) przez agroiniekcję z FoMV-MCS1* lub FoMV-PDS. Tłumienie pds jest wykrywalne w każdej z pięciu kontrprób biologicznych (p = 0,003; post hoc test Dunnetta; słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (SD) trzech kontrprób technicznych). (B) Obrazy żelu pokazują analizy RT-PCR potwierdzające obecność FoMV-MCS1* (amplikon 315 pz) w liściu 6 pięciu pojedynczych roślin. FoMV-LES22 (amplikon 625 pz) wykryto w tkance liścia 6 (próbki FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) i liściu 4 (próbki FoMV-LES22 6-10, 20 DPI) dla dziesięciu pojedynczych roślin. Amplikon Zm-aktyny służył jako gen odniesienia. Wykres słupkowy przedstawia względne wartości ekspresji les22 qRT-PCR w tkankach kukurydzy przez agroiniekcję konstruktów wirusa FoMV-MCS1* lub FoMV-LES22. Supresja Les22 występuje w 9 z 10 kontrprób biologicznych (p = <0,0001; test Dunnetta post hoc; słupki błędów wskazują SD dla trzech kontrprób technicznych). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Fenotypy różnych konstruktów używanych w eksperymentach agroiniekcji. Wszystkim zobrazowanym roślinom wstrzyknięto, gdy miały 6-7 dni, szczep Agrobacterium GV3101 przenoszący wskazane konstrukty. Zdjęcia zostały wykonane w rozdzielczości 16 DPI. (A) Objawy na liściach pCAMBIA1380 (pusty szkielet plazmidowy), FoMV-EV, FoMV-GFP i SCMV-GFP w świetle widzialnym, pod filtrem chlorofilowym FluorCam przy ekspozycji 250 μs i pod filtrem FluorCam GFP przy ekspozycji 10 ms. (B) Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej liści roślin poddanych próbie (wstrzykniętym tylko roztworowi MgSO4), FoMV-EV i FoMV-GFP. Pokazane są kanały DIC, DsRed i EGFP, z których każdy został wykonany przy ekspozycji 1500 ms. Podziałka wynosi 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Morfologiczne skutki iniekcji. Przykład poważniejszych skutków morfologicznych, które mogą wystąpić po bezpośrednim wstrzyknięciu do tkanki merystematycznej. Uraz ten może spowodować "strzępienie" liści i pękanie łodygi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

wirusWarunki wzrostugenotyp# Zainfekowane roślinySuma # roślin% zakażeńŚredni % infekcji
FoMV-EVKomora wzrostukukurydza22 Rozdział 222396%97%
Zobacz materiał B73Rozdział 18Rozdział 18W 100%
Zobacz materiał B104202195%
Szklarniakukurydza202387%89%
Zobacz materiał B7317Rozdział 1894%
Zobacz materiał B10416Rozdział 1984%
SCMV-EVKomora wzrostukukurydza142167%47%
Zobacz materiał B735Rozdział 1828%
Zobacz materiał B104102148%
Szklarniakukurydza142361%49%
Zobacz materiał B730Rozdział 190%
Zobacz materiał B104Rozdział 1922 Rozdział 2286%

Tabela 1: Wpływ warunków panujących w szklarni i komorze wzrostu na skuteczność inokulacji agroiniekcyjnej. Nasiona kiełkowały w identycznych warunkach wzrostu. Kiełkujące sadzonki poddano agroiniekcji, a połowę z nich przeniesiono do komory wzrostu (25 °C 16 h światła dziennego / 22C 8 godzin nocy; 185 PAR), a drugą połowę przeniesiono do szklarni (22-25 °C 16 h światła dziennego / 22-25 °C 8 godzin nocy; 350-400 PAR). W tabeli tej przedstawiono wskaźnik infekcji w procentach, obliczony na podstawie liczby roślin, u których potwierdzono za pomocą RT-PCR zakażenie danym wirusem, podzielonej przez całkowitą liczbę roślin, którym poddano agroiniekcję. Nie ma statystycznej różnicy w skuteczności infekcji między warunkami w komorze wzrostu a warunkami szklarniowymi (dwustronny test t FoMV p = 0,08; Dwustronny test t SCMV p = 0,96).

powiedział: . . powiedział:
Genotyp kukurydzyFoMV-EVFoMV-LES22Łączna suma
zarażonyłączny% zakażonychzarażonyłączny% zakażonych% zakażonych
kukurydzaRozdział 182378%152365%72%
MO47722 Rozdział 2232%1215 proc.19%
Zobacz materiał K551157 proc31718%13%
Zobacz materiał W64A1022 Rozdział 2245%82040 proc43%
MO170160%0130%0%
Zobacz materiał B7310Rozdział 1856%71741%49%
Zobacz materiał B101122157%82433%44%
Zobacz materiał FR106444W 100%44W 100%W 100%
Zobacz materiał B1041022 Rozdział 2245%52124%35%
Zobacz materiał WCC22cyfra arabska729%4667%46%
Ciągnik siodłowy A188030%4667%44%

Tabela 2: Skuteczność infekcji konstruktów FoMV w różnych genotypach kukurydzy. FoMV-EV i FoMV-LES22 poddano agroiniekcji 11 genotypom kukurydzy. Po wstrzyknięciu sadzonki przeniesiono do szklarni. Poniższa tabela przedstawia wskaźnik infekcji w procentach, obliczony na podstawie liczby roślin zakażonych FoMV potwierdzonych przez RT-PCR podzielonych przez całkowitą liczbę roślin, którym poddano agroiniekcję. Łączny całkowity wskaźnik infekcji pokazuje średnie wskaźniki infekcji każdego genotypu dla obu badanych konstruktów FoMV.

szt. Rozdział powiedział: . Rozdział Rozdział
Etap instalacji4-5 dniowe rośliny6-7 dniowe roślinyŁączna suma
ObjawowyŁączna liczba zakładów% zakażonychObjawowyŁączna liczba zakładów% zakażonych% zakażonych
FoMV-EV42 Rozdział 4272 Rozdział 7258%Rozdział 8017047%53% (za)
FoMV-PDS65Rozdział 15741%Rozdział 66184 Rozdział 18436%39% (B C)
FoMV-LES22Rozdział 115Rozdział 19559 proc14429249%54% (A B)
FoMV-GFP16Rozdział 10316%37Rozdział 21717%16% (C)
SCMV-GFP (Certyfikat Finansowy SCMV)1095 Rozdział 9511%5Rozdział 826%8% (C)

Tabela 3: Podsumowanie eksperymentów z iniekcjami. Poniższa tabela stanowi podsumowanie eksperymentów z iniekcją przeprowadzonych od sierpnia 2017 r. do sierpnia 2018 r. na siewkach kukurydzy cukrowej Golden Bantam. Rośliny oceniano pod kątem objawów wirusowych (FoMV-EV), objawów wyciszających (pds i les22) lub fluorescencji GFP (GFP) poprzez wizualne (FoMV-EV, FoMV-PDS i FoMV-LES22) lub FluorCam (FoMV-GFP i SCMV-GFP). Wyniki są prezentowane indywidualnie dla roślin 4-5-dniowych i 6-7-dniowych, a także zawierają podsumowanie dla wszystkich grup wiekowych. Nie stwierdzono istotnej różnicy między roślinami 4-5 dniowymi a 6-7-dniowymi (jednokierunkowa ANOVA, F = 0,6513). Stwierdzono różnicę między konstruktem wirusowym (Onaway ANOVA, F=<0,0001) a literami reprezentującymi raport o literach łączących HSD Tukeya-Kramera.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela zawierająca listę wszystkich nazw starterów i sekwencji używanych w tym protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Test acetosyringonu. (A) Wstępny test acetosyringonu, porównujący częstość występowania objawów roślin z wstrzyknięciem imitacji, FoMV-EV i FoMV-LES22 między zawiesinami inokulacyjnymi z acetosyringonem (+) 200 μM lub bez acetosyringonu (-). (B) Porównanie częstości zakażeń FoMV-LES22 określonych metodą RT-PCR między zawiesinami inokulacyjnymi bez acetosyringonu (-), z 200 μM acetosyringonem (+) i dodaniem 20 μM acetosyringonu do kultury bakteryjnej na 4 godziny przed ponownym zawieszeniem w buforze wraz z dodaniem 200 μM acetosyringonu do końcowej zawiesiny (++). Ogólnie rzecz biorąc, nie stwierdzono istotnej różnicy między leczeniem aceotysyringonem (jednokierunkowa ANOVA, f=0,5452). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Obrazowanie fluorescencyjne i walidacja molekularna agroiniekcji SCMV i ekspresja heterologicznych białek w kukurydzy. Kukurydzy poddano agroiniekcji zmodyfikowanym konstruktem SCMV zawierającym zarówno CDS GFP, jak i nanolucyferazy (NLuc). (A) Obrazowanie metodą Fluorcam wykorzystano do badań przesiewowych i wykrywania GFP. Lewa strona to pozorowana roślina z wtryskiem, a prawa to roślina z wtryskiem SCMV-NLucGFP. (B) Ekstrakty z białek liści oddzielono za pomocą SDS-PAGE i oceniono pod kątem obecności NLuc, GFP i białka płaszcza SCMV (CP) za pomocą testu lucyferazy w żelu lub immunoblot, jak wskazano. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agrobacterium jest niezbędnym narzędziem, które ułatwia stosowanie wielu technik biologii molekularnej w badaniach związanych z roślinami. Badanie to dostarcza protokół agroiniekcji do inokulacji wektorów wirusowych FoMV i SCMV bezpośrednio w tkankach kukurydzy do zastosowań VIGS i VOX. Głównym celem jest zwiększenie łatwości i użyteczności technologii opartych na wirusach w badaniach nad roślinami jednoliściennymi. Chociaż w przypadku kilku wirusów odnotowano bezpośrednie agroinokulowanie kukurydzy, autorzy nie znają szczegółowego protokołu i nie ma przykładów zastosowań VIGS i VOX w tych badaniach19,22.

Doniesiono i potwierdzono podczas opracowywania tego protokołu, że miejsce wstrzyknięcia jest kluczowym czynnikiem skutecznego uruchomienia ogólnoustrojowej infekcji wirusowej za pomocą agroiniekcji19. Zakłada się, że konsekwentne wstrzykiwanie zalecanego miejsca na roślinie jest największą zmienną, ponieważ dokładne położenie merystemu w siewkach kukurydzy jest praktycznie niewykrywalne gołym okiem. Aby zminimalizować zmienność interpersonalną, zaleca się wypreparowanie kilku siewek kukurydzy aż do merystemu, aby lepiej zobrazować jej lokalizację (ryc. 3C). Położenie merystemu w stosunku do węzła chrząszczy powinno być mniej więcej takie samo dla roślin w wieku 4-7 dni. Dodatkowo, ćwiczenie wstrzykiwania barwioną cieczą zapewnia łatwo widoczną demonstrację, w jaki sposób "inokulum" wypełnia okółek liścia, a ponieważ miejsce wstrzyknięcia jest oznaczone barwnikiem, dokładność miejsca wstrzyknięcia może być potwierdzona (ryc. 3G, H). Tkanki merystematyczne są najbardziej podatne na agroiniekcję, ale wstrzykiwanie zawiesin Agrobacterium bezpośrednio do tej tkanki powoduje niepożądane efekty morfologiczne (ryc. 6)19. Rośliny z uszkodzonymi merystemami przeżywają, ale powstałe wady są niepożądane, dlatego należy unikać bezpośredniego wstrzykiwania tej tkanki.

Istnieje kilka zmiennych, które mogą mieć wpływ na pomyślne wprowadzenie ogólnoustrojowej infekcji wirusowej za pomocą agroiniekcji, ponieważ trzy złożone systemy biologiczne (roślina, wirus i szczep Agrobacterium ) muszą współdziałać w koordynacji. Ta złożona interakcja może być wspomagana przez szybko dzielące się komórki obszaru merystematycznego, co czyni go idealnym miejscem do agroinokulacji19. Szczep Agrobacterium musi być zdolny do infekowania komórek tkanek roślinnych w celu dostarczenia T-DNA przenoszącego genom wirusa, a roślina musi być podatna na wirusa, aby zainicjować replikację wirusa i infekcję ogólnoustrojową. Genotypy kukurydzy różnią się podatnością na wirusy (np. Mo17 jest odporny na FoMV) lub szczepy Agrobacterium , ale większość, które zostały przebadane, wydaje się być podatna zarówno na FoMV, jak i SCMV (Tabela 1 i Tabela 2)53. Na przykład linia wsobna FR1064 i odmiana kukurydzy cukrowej Golden Bantam mogą być szczególnie podatne zarówno na wektory GV3101 Agrobacterium , jak i na bazie FoMV.

Liczba liści, z których pobrano próbki, oraz czas pobierania próbek do RT-PCR mają kluczowe znaczenie dla dokładnej oceny infekcji wirusowej. W pokazanych tutaj przykładach numer liścia został określony poprzez rozpoczęcie od pierwszego zaokrąglonego liścia (powszechnie znanego jako "liść kciuka") i liczenie w górę. Próbki liści pobierano po ich rozszerzeniu i rozpoczęciu pojawiania się następnego liścia. Jednak to, które liście są optymalne do pobierania próbek, może się różnić w zależności od użytego gatunku wirusa, warunków wzrostu i genotypu kukurydzy. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie wstępnego eksperymentu z przebiegiem czasowym przy stosowaniu tego protokołu do nowego systemu wirusowego w celu optymalizacji strategii pobierania próbek w odniesieniu do liści i czasu.

Zastosowana specyficzna konstrukcja znacząco wpływa na skuteczność tego protokołu. Na przykład puste wektory, FoMV-EV i SCMV-EV oraz FoMV-PDS i FoMV-LES22, które zawierają małe insercje (odpowiednio 313 pz i 329 pz), zazwyczaj wytwarzają najwyższy odsetek roślin z objawami wirusowymi w tych eksperymentach (tabele 1 i tabela 2). Jednak rekombinowane wirusy przenoszące większe insercje GFP ORF (720 pz) w FoMV-GFP i SCMV-GFP miały znacznie niższe wskaźniki infekcji w porównaniu z roślinami, którym wstrzyknięto pusty wektor lub konstrukty wyciszające geny. Tendencja ta może wynikać z negatywnego wpływu na sprawność wirusa spowodowanego rosnącą ilością egzogennego materiału genetycznego w genomie wirusa. Kilka badań wykazało, że stabilność wstawienia roślinnych wektorów wirusowych jest w dużej mierze zależna od wielkości i sekwencjiinsertów 36,54,55,56,57. Ponadto stwierdzono zauważalną różnicę w odsetku roślin, które zostają zainfekowane po zaszczepieniu pustym wektorem FoMV lub SCMV, co sugeruje, że potrzebne są dodatkowe prace w celu optymalizacji tego protokołu dla SCMV (Tabela 1). Wyniki te wskazują, że podczas opracowywania konstrukcji może być konieczne rozwiązywanie problemów, ponieważ sekwencja i długość fragmentu mogą wpływać na wydajność.

Ogólnie rzecz biorąc, badanie to wykazało, że agroiniekcja sadzonek kukurydzy jest skuteczną metodą inokulacji dwóch różnych wirusów roślinnych RNA, wielu konfiguracji wektorów i 11 genotypów kukurydzy. Ta praca z FoMV i SCMV, w połączeniu z wcześniejszymi pracami wykorzystującymi wstrzykiwanie wirusem chlorotycznej pstrości kukurydzy (MCMV) lub MSV, wskazuje, że agroiniekcja jest odpowiednia do inokulacji siewek kukurydzy zakaźnymi klonami wirusów zarówno RNA, jak i DNA 19,20,21,22. Ponadto praca ta pokazuje, że agroiniekcja jest opłacalną metodą dla wektorów VIGS i VOX i może być stosowana do roślin w wieku zaledwie czterech dni (tabela 3). Oczekuje się, że przedstawiony tutaj protokół zostanie łatwo zaadaptowany przez biologów zajmujących się kukurydzą, aby ułatwić badania w zakresie genomiki funkcjonalnej obejmującej przejściowe wyciszanie genów (VIGS) i nadekspresję (VOX). Agroiniekcja ma również zdolność do ułatwiania metod edycji genów opartych na wirusach (VEdGE), które w przeciwnym razie byłyby ograniczone przez zależność od transformacji roślin, potencjalnie poprawiając wydajność edycji, a także dostępność 58,59,60. Biorąc pod uwagę odpowiednie połączenie szczepu Agrobacterium, genotypów kukurydzy i wektorów wirusowych, oczekuje się, że inokulacja metodą agroiniekcji stanie się cennym narzędziem do analizy przejściowej funkcji genów w kukurydzy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badacze nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uniwersytet Stanowy Iowa jest częścią zespołu wspierającego program DARPA Insect Allies HR0011-17-2-0053. Prace te były również wspierane przez Instytut Nauk o Roślinach Uniwersytetu Stanowego Iowa, Centrum Bioinżynierii Upraw Uniwersytetu Stanowego Iowa, projekt USDA NIFA Hatch numer 3808 oraz Fundusze Stanu Iowa. K.L.H. był również częściowo wspierany przez program szkoleniowy dla absolwentów Iowa State University Predictive Plant Phenomics finansowany przez National Science Foundation (DGE #1545453) oraz przez grant Agricultural and Food Research Initiative nr 2019-07318 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań i gromadzeniu, analizie i interpretacji danych oraz w pisaniu manuskryptu. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy fundatorów.

Dziękujemy Nickowi Lauterowi (USDA-ARS, Ames, IA) za nasiona kukurydzy w liniach wsobnych, Christianowi F. Montes-Sereyowi (Iowa State University) za stworzenie klonu FoMV-GFP oraz Tylerowi Austinowi (Iowa State University) za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 1 mlFisher Scientific14955450alternatywnie, BD 309659
15 ml Falcon TubesCorning Science352059
1kb+ LadderThermoFisher Scientific10787018Do oceny rozmiarów produktów PCR
Igły PrecisionGlide 25G x 5/8"Becton, Dickinson and Company (BD)305122
28° C Inkubatordla Agrobacterium
37° C Inkubatordo E. coli
AcetosyringoneMilliporeSigmaD134406Opcjonalny
agarMilliporeSigmaA4800
AgarozaGeneMateE-3120Do wytwarzania żeli sprawdzających stabilność wirusa/wkładki
Agrobacterium tumefaciens Szczep GV3101Przenosi maszynerię transferu T-DNA kodującą plazmid vir, RifR, GmR, z magazynu laboratoryjnego
Bsu36INew England BiolabsR0524
Zestaw cDNAThermoFisher ScientificK1672Maxima Zestaw do syntezy cDNA z pierwszej nici z chloroformem Dnazy
Fisher ScientificC298do kuwet do ekstrakcji RNA
Fisher Scientific149551271,5 ml
miliporówD-(+)-glukozySigmaG7528Liza alkaliczna
DH5alpha Kompetentna E. Komórki emNew England BiolabsC2987
Ligaza DNAThermoFisher ScientificK1422Zestaw do szybkiej ligacji DNA
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodiana)Fisher ScientificS311Alkaliczny
do lizy
NawózPeters Nawóz 15-15-15 Koncentrat
Płaskie wkładkiT.O. Plastics715357CDo kiełkowania nasion w tacach
FlatsT.O. Plastics710245CDo kiełkowania nasion w tacach
FluorCamPhoton Systemy InstrumentyDo oceny roślin kukurydzy pod kątem ekspresji GFP przed mikroskopem
fluorescencyjny
Żel Elektroforeza Pudełko
Siarczan gentamycynyFisher ScientificBP918
Octan lodowcowyFisher ScientificA38Alkaliczna liza
GlicerolFisher ScientificG33-500Do oszczędzania zamrożonych zapasów bakterii
Go-Taq, 2XPromegaM7123
Kwas solnyFisher ScientificA144do roztworów pH
IzopropanolSigma-Aldrich109827Do ekstrakcji RNA
Kanamycyna, MonosiarczanFisher ScientificBP906
Duże garnkiKordlokSQL05505x5x4" lub większa.  Do przesadzania sadzonek.
Luria Bertani (LB) Rosół, MillerHimediaM1245
Siarczan magnezu SiedmiowodnyAmresco662
Kukurydza Golden Bantam Nasiona kukurydzy cukrowejAmerican Meadows, Zachodnie Wybrzeże Nasiona
Kukurydzy Nasiona wsobneNasze nasiona pochodzą z naszej instytucji, ale jesteśmy nie w stanie zapewnić tego innym badaczom.
Maxima H Minus Odwrotna transkryptazaThermoFisherScientific EP0753
MilliQElgaPurelab Ultra
Monarch PCR & Zestaw do czyszczenia DNANew England BiolabsT1030
PacINew England BiolabsR0547
Peters Excel 15-5-15 NawózICL Nawozy specjalistyczneG99140
Szalka Petriego, 95 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875714G
pH-metr
Octan potasuFisher ScientificP171Podkłady alkalicznelizy
Nasze startery zostały zsyntetyzowane przez nasz instytucjonalny ośrodek DNA lub za pośrednictwem IDT
12091021Alkaline Lysis
SbfINew England BiolabsR0642
WagaDo ważenia chemikaliów do pożywek lub
SDS (dodecylosiarczan sodu)Fisher ScientificBP166Alkaliczna liza
wodorotlenku soduFisher ScientificS318Alkaliczne
podłoże gleboweSunGro HorticultureSS # 1-F1PSunshine Mix # 1 / Fafard-1P, wystarczy każda mieszanka gleby, w której kukurydza dobrze rośnie
SpektrofotometrDo pomiaru OD600
Sybr Safe, 10 000XInvitrogenS33102Do robienia żeli w celu sprawdzenia stabilności wirusa/wkładki
Termocyklerdo PCR
Tris BaseFisher ScientificBP154Alkaliczna liza
TrizolAmbion15596018Do ekstrakcji RNA
Papier wagowy Doważenia chemikaliów do pożywek lub
XbaINew England BiolabsR0145
etanol do ekstrakcji RNAMikroskop do PspOMI New England Biolabs R0653 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 Ryfampicyna EMD Millipore Corp 557303 Rnase A ThermoFisher Scientific do lizy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaidi, S. E. A., Mansoor, S. Viral vectors for plant genome engineering. Frontiers in Plant Science. 8, 539(2017).
  2. Kant, R., Dasgupta, I. Gene silencing approaches through virus-based vectors: speeding up functional genomics in monocots. Plant Molecular Biology. 100, 3-18 (2019).
  3. Hu, J., et al. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize. Molecular Plant Pathology. 20 (10), 1463-1474 (2019).
  4. Pasin, F., Menzel, W., Daròs, J. A. Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses. Plant Biotechnology Journal. 17 (6), 1010-1026 (2019).
  5. Cody, W. B., Scholthof, H. B. Plant virus vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Phytopathology. 57 (1), 211-230 (2019).
  6. Mei, Y., et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors. Plant Direct. 3 (11), 00181(2019).
  7. Ruiz, M. T., Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell. 10 (6), 937-946 (1998).
  8. Bekele, D., Tesfaye, K., Fikre, A. Applications of virus induced gene silencing (VIGS) in plant functional genomics studies. Journal of Plant Biochemistry & Physiology. 07 (01), 1000229(2019).
  9. Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Jackson, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 34 (1), 299-323 (1996).
  10. Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C., Pogue, G. P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant Journal. 30 (3), 315-327 (2002).
  11. Wang, R., et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research. Plant Journal. 86 (1), 102-115 (2016).
  12. Redinbaugh, M. G., et al. Transmission of viral RNA and DNA to maize kernels by vascular puncture inoculation. Journal of Virological Methods. 98 (2), 135-143 (2001).
  13. Scholthof, H. B. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6 (3), 309(1993).
  14. Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Kikkert, M., Jackson, A. O. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology. 213 (2), 425-438 (1995).
  15. Scholthof, H. B. Rapid delivery of foreign genes into plants by direct rub-inoculation with intact plasmid dna of a tomato bushy stunt virus gene vector. Journal of Virology. 73 (9), 7823-7829 (1999).
  16. Zhang, J., et al. Vacuum and co-cultivation agroinfiltration of (germinated) seeds results in tobacco rattle virus (TRV) mediated whole-plant virus-induced gene silencing (VIGS) in wheat and maize. Frontiers in Plant Science. 8, 393(2017).
  17. Vaghchhipawala, Z., Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses. Methods in Molecular Biology. 678, Clifton, N.J. 65-76 (2011).
  18. Grimsley, N., Hohn, B., Hohn, T., Walden, R. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83 (10), 3282-3286 (1986).
  19. Grimsley, N. H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B. Merisfematic tissues of maize plants are most suscepnsle to agroinfection with maize streak virus. Bio/Technology. 6 (2), 185-189 (1988).
  20. Martin, D. P., Rybicki, E. P. Improved efficiency of Zea mays agroinoculation with Maize streak virus. Plant Disease. 84 (10), 1096(2000).
  21. Martin, D. P., Willment, J. A., Rybicki, E. P. Evaluation of maize streak virus pathogenicity in differentially resistant Zea mays genotypes. Phytopathology. 89 (8), 695-700 (1999).
  22. Wang, Q., et al. Further characterization of Maize chlorotic mottle virus and its synergistic interaction with Sugarcane mosaic virus in maize. Scientific Reports. 7, 39960(2017).
  23. Hsieh, M. H., et al. Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower. Plant Science. 201-202 (1), 25-41 (2013).
  24. Hsieh, M. H., et al. Virus-induced gene silencing unravels multiple transcription factors involved in floral growth and development in Phalaenopsis orchids. Journal of Experimental Botany. 64 (12), 3869-3884 (2013).
  25. Zenna, N. S., et al. Genetic analysis of tolerance to rice tungro bacilliform virus in rice (Oryza sativa L.) through agroinoculation. Journal of Phytopathology. 154 (4), 197-203 (2006).
  26. Marks, M. S., Kemp, J. M., Woolston, C. J., Dale, P. J. Agroinfection of wheat: A comparison of Agrobacterium strains. Plant Science. 63 (2), 247-256 (1989).
  27. Dasgupta, I., et al. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer. Journal of General Virology. 72 (6), 1215-1221 (1991).
  28. Boulton, M. I., Buchholz, W. G., Marks, M. S., Markham, P. G., Davies, J. W. Specificity of Agrobacterium-mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Gramineae. Plant Molecular Biology. 12 (1), 31-40 (1989).
  29. Paulsen, A. Q. Purification and properties of foxtail mosaic virus. Phytopathology. 77 (11), 1346(1977).
  30. Bancroft, J. B., Rouleau, M., Johnston, R., Prins, L., Mackie, G. A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Journal of General Virology. 72 (9), 2173-2181 (1991).
  31. Bruun-Rasmussen, M., Madsen, C. T., Johansen, E., Albrechtsen, M. Revised sequence of foxtail mosaic virus reveals a triple gene block structure similar to potato virus X. Archives of Virology. 153 (1), 223-226 (2008).
  32. Rouleau, M., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Partial purification and characterization of foxtail mosaic potexvirus RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 197 (2), 695-703 (1993).
  33. Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265 (1994).
  34. Samuels, T. D., et al. Subcellular targeting and interactions among the potato virus X TGB proteins. Virology. 367 (2), 375-389 (2007).
  35. Cho, S. Y., Kim, K. H. Identification of the capsid protein-binding region of the SL1(+) RNA located at the 5' region of the potato virus X genome. Plant Pathology Journal. 28 (1), 75-80 (2012).
  36. Mei, Y., Zhang, C., Kernodle, B. M., Hill, J. H., Whitham, S. A. A foxtail mosaic virus vector for virus-induced gene silencing in maize. Plant Physiology. 171 (2), 760-772 (2016).
  37. Bouton, C., et al. Foxtail mosaic virus: A viral vector for protein expression in cereals. Plant Physiology. 177 (4), 1352-1367 (2018).
  38. Mei, Y., Liu, G., Zhang, C., Hill, J. H., Whitham, S. A. A sugarcane mosaic virus vector for gene expression in maize. Plant Direct. 3 (8), 00158(2019).
  39. Gal-On, A., Meiri, E., Huet, H., Hua, W. J., Raccah, B., Gaba, V. Particle bombardment drastically increases the infectivity of cloned DNA of zucchini yellow mosaic potyvirus. Journal of General Virology. 76 (12), (1995).
  40. Gao, R., et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus (genus Potyvirus). Virus Research. 169 (1), 276-281 (2012).
  41. López-Moya, J. J., García, J. A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment. Virus Research. 68 (2), (2000).
  42. Choi, I. R., French, R., Hein, G. L., Stenger, D. C. Fully biologically active in vitro transcripts of the eriophyid mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Phytopathology. 89 (12), (1999).
  43. Kim, K. S., et al. Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Archives of Virology. 148 (3), 563-574 (2003).
  44. Stewart, L. R., Bouchard, R., Redinbaugh, M. G., Meulia, T. Complete sequence and development of a full-length infectious clone of an Ohio isolate of Maize dwarf mosaic virus (MDMV). Virus Research. 165 (2), 219-224 (2012).
  45. Wylie, S. J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology. 98 (3), 352-354 (2017).
  46. Shukla, D. D. taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and the United States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology. 79 (2), 223(1989).
  47. Shukla, D. D., Ward, C. W. Amino Acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group. Journal of General Virology. 69 (11), 2703-2710 (1988).
  48. Chung, B. Y. W., Miller, W. A., Atkins, J. F., Firth, A. E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (15), 5897-5902 (2008).
  49. Jarchow, E., Grimsley, N. H., Hohn, B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (23), 10426-10430 (1991).
  50. Hu, G., Yalpani, N., Briggs, S. P., Johal, G. S. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize. The Plant Cell. 10 (7), 1095(2007).
  51. Qin, G., et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Research. 17 (5), 471-482 (2007).
  52. Jones, P. Isolation of plasmid DNA from E. coli. Encyclopedia of Life Sciences. , (2003).
  53. Ji, Q., Yang, B., Lee, M., Chen, Y., Lübberstedt, T. Mapping of quantitative trait loci/locus conferring resistance to foxtail mosaic virus in maize using the intermated B73-×-Mo17 population. Plant Breeding. 129 (6), 721-723 (2010).
  54. Pacak, A., et al. The brome mosaic virus-based recombination vector triggers a limited gene silencing response depending on the orientation of the inserted sequence. Archives of Virology. 155 (2), 169-179 (2010).
  55. Miché, L., Battistoni, F., Gemmer, S., Belghazi, M., Reinhold-Hurek, B. Host-dependent expression of Rhizobium leguminosarum bv. viciae hydrogenase is controlled at transcriptional and post-transcriptional levels in legume nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (5), 1323-1331 (2018).
  56. Yamagishi, M., Masuta, C., Suzuki, M., Netsu, O. Peanut stunt virus-induced gene silencing in white lupin (lupinus albus). Plant Biotechnology. 32 (3), 181-191 (2015).
  57. Avesani, L., et al. Stability of Potato virus X expression vectors is related to insert size: Implications for replication models and risk assessment. Transgenic Research. 16 (5), 587-597 (2007).
  58. Ali, Z., et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (8), 1288-1291 (2015).
  59. Cody, W. B., Scholthof, H. B., Mirkov, T. E. Multiplexed gene editing and protein overexpression using a tobacco mosaic virus viral vector. Plant Physiology. 175 (1), 23-35 (2017).
  60. Ali, Z., Eid, A., Ali, S., Mahfouz, M. M. Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. Virus Research. 244, 333-337 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Agroinokulacja kukurydzywstrzykiwanie wektora wirusowegoAgrobacterium Tumefacienswyciszanie gen w u kukurydzyekspresja gen w u kukurydzymikroskopia fluorescencyjnadetekcja RT PCRwstrzykiwanie do siewek kukurydzy

Powiązane artykuły