Bakteryjne kulki celulozowe, które zamykają materiały stałe

Summary

Ten protokół przedstawia łatwą i tanią metodę tworzenia kulek z celulozy bakteryjnej (BC). Ten biomateriał może funkcjonować jako medium hermetyzujące dla materiałów stałych, w tym biowęgla, kulek polimerowych i odpadów kopalnianych.

Abstract

Kulki z celulozy bakteryjnej (BC) są coraz częściej badane od czasu popularyzacji BC jako nowego materiału. Protokół ten przedstawia niedrogą i prostą metodę produkcji sfer BC. Oprócz wytwarzania tych kulek zidentyfikowano również metodę enkapsulacji cząstek stałych. Aby wyprodukować kulki BC, woda, herbata, cukier, ocet i kultura bakteryjna są łączone w przegrodzie i zawartość jest mieszana. Po określeniu odpowiednich warunków hodowli dla powstania sfery BC, przetestowano ich zdolność do kapsułkowania cząstek stałych przy użyciu biowęgla, kulek polimerowych i odpadów kopalnianych. Kule scharakteryzowano za pomocą oprogramowania ImageJ oraz analizy termograwimetrycznej (TGA). Wyniki wskazują, że kule o średnicy 7,5 mm można wykonać w ciągu 7 dni. Dodanie różnych cząstek zwiększa średni zakres rozmiarów kapsułek BC. Kule zawierały w sobie 10 - 20% swojej suchej masy. Metoda ta pokazuje tanią produkcję kuli i hermetyzację, która jest możliwa do uzyskania przy użyciu łatwo dostępnych materiałów. Kule BC mogą być stosowane w przyszłości jako środek wspomagający usuwanie zanieczyszczeń, powlekanie nawozem o kontrolowanym uwalnianiu lub wzbogacanie gleby.

Introduction

Celuloza bakteryjna (BC) została zauważona ze względu na swoje potencjalne zastosowanie w przemyśle ze względu na swoją wytrzymałość mechaniczną, wysoką czystość i krystaliczność, zdolność zatrzymywania wody i skomplikowaną strukturę włókien^1,2,3,4. Te cechy sprawiają, że BC jest korzystnym biomateriałem do różnych zastosowań, w tym w biomedycynie, przetwórstwie spożywczym i remediacji środowiska¹. Tworzenie filmu BC może odbywać się za pomocą kultur pojedynczych organizmów lub kultur mieszanych, takich jak te używane do kombucha⁵, sfermentowanego napoju herbacianego. Warzenie kombuchy opiera się na "symbiotycznej kulturze bakterii i drożdży", powszechnie znanej jako SCOBY. Wykorzystując tę symbiotyczną kulturę organizmów, podobną technikę stosuje się do tworzenia sfer BC. Ten biomateriał może być wykorzystany do izolowania zanieczyszczeń środowiska i zakotwiczenia zmian w rolnictwie, takich jak biowęgiel, w celu osiągnięcia bardziej wydajnej produkcji roślinnej.

Poprzednia literatura omawiała, jak cechy BC wytwarzanego w warunkach wzburzenia wypadają w porównaniu do BC wytwarzanego w kulturze stacjonarnej. Kultura stacjonarna powoduje powstanie filmu, który tworzy się na granicy faz ciecz-powietrze, podczas gdy kultura potrząsana powoduje zawieszenie różnych cząstek, nici i kulek BC w cieczy⁶. W wielu badaniach odniesiono się do twierdzenia, że komercyjna produkcja BC jest bardziej wykonalna w warunkach dynamicznych^6,7, dostarczając uzasadnienia dla zastosowania metody opisanej w tym artykule. Dodatkowo przeprowadzono różne badania nad budową i właściwościami sfer BC. Toyosaki et al.⁶ porównali kolby Erlenmeyera z przegrodami i gładkimi ściankami w ich wzburzonej produkcji BC. Badanie przeprowadzone przez Hu i Catchmark⁴ określiło warunki dla sfer BC, które zostały użyte jako wytyczne dla obecnego procesu produkcji sfery BC, a ich wyniki wskazują, że rozmiar kuli nie rośnie po 60 godzinach. Przegląd produkcji BC przeprowadzony przez Mohammada i wsp.¹ wskazuje, że wstrząsanie kulturą BC zapewnia równomierne dostarczanie i dystrybucję tlenu, co jest niezbędne do pomyślnego wzrostu BC. Holland et al.⁸ badali krystaliczność i strukturę chemiczną BC za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej i spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Zakłada się, że kapsułki BC będą wykazywały podobne cechy, a przyszłe badania będą dotyczyły właściwości strukturalnych. W ramach badań analizowano również korzystne skutki stosowania BC do produkcji ulepszonych biokompozytów. Wykorzystując żywicę epoksydową jako bazę, naukowcy wykazali, że dodatek BC poprawia właściwości materiału, takie jak trwałość zmęczeniowa, odporność na pękanie oraz wytrzymałość na rozciąganie i zginanie^9,10. Jak pokazują wcześniejsze i obecne badania, wiele osób jest zainteresowanych komercjalizacją stosowania BC.

Wielu badaczy badało celulozę bakteryjną w systemach kontrolowanego uwalniania, a opisana tutaj metoda generuje kapsułki, które mogą być wykorzystane jako systemy kontrolowanego uwalniania. Wiele z tych badań koncentruje się na kontrolowanym uwalnianiu w dziedzinie biomedycyny, a także na niektórych badaniach nad podawaniem nawozów o kontrolowanym uwalnianiu (CRF). Opierając się na sukcesie kontrolowanego uwalniania amoksycyliny przez BC¹¹, lidocaine¹² i ibuprofen¹³, BC może wykazywać podobne właściwości dostarczania z innymi substancjami, takimi jak nawóz granulowany. Przegląd CRF autorstwa Shaviva i Mikkelsena¹⁴ potwierdza, że CRF są bardziej wydajne, oszczędzają pracę i generalnie powodują mniejszą degradację środowiska niż konwencjonalne nawożenie. Celuloza bakteryjna może działać jako korzystny materiał kapsułkujący dla CRF. Nawozy mogą wypłukiwać się z membran BC lub uwalniać się w miarę biodegradacji BC^15,16. Wysoka zdolność BC do pęcznienia przez wodę może również działać jako korzystna poprawka do gleby^17,18,19, ponieważ zarówno składniki odżywcze nawozu, jak i wilgoć mogą uwalniać się do gleby poprzez zastosowanie kulek BC. Dzięki tym cechom CRF utworzony przez enkapsulację kuli BC może mieć przewagę nad innymi materiałami do powlekania nawozów, które mogą mieć negatywny wpływ na etapie ich produkcji i utylizacji. Adaptacja BC do powłoki nawozowej może jeszcze bardziej udoskonalić technologie CRF. Zmniejszając szybkość uwalniania nawozów, rośliny będą miały wystarczająco dużo czasu na pobranie nawozu i zapobiegnie nadmiernemu spływaniu do zbiorników wodnych, zmniejszając w ten sposób eutrofizację i strefy nienatlenione. Podobne nawozy o spowolnionym uwalnianiu zostały przygotowane i przetestowane przy użyciu powłok polimerowych²⁰.

W przeciwieństwie do protokołów opisanych w poprzednich badaniach, ten skupia się na jednolitej, spójnej produkcji sfer, a nie na wysokiej wydajności celulozy. Co więcej, enkapsulacja BC innych ciał stałych została zbadana za pomocą folii celulozowych, ale nie spheres²¹. Rozszerzając badania nad bakteryjnymi kulkami celulozowymi, można podjąć dalsze kroki w celu komercyjnej produkcji BC, co jest korzystne ze względu na bezpieczne dla środowiska właściwości BC. Ta metoda wytwarzania sfery BC wykorzystuje niedrogie, łatwo dostępne składniki kulinarne. Po wstępnym montażu kule BC zaczynają formować się w ciągu 2 dni bez zakłóceń. Produkcja kulek BC w ramach tej strategii zajmuje niewiele miejsca i ma jadalny produkt uboczny, sfermentowaną herbatę "kombucha". Techniki enkapsulacji wymienione w innych badaniach obejmują powłoki utworzone za pomocą techniki inwersji faz^22,23, tworzenie matrycy²⁴, suszenie rozpyłowe²⁵, oraz bezpośrednia enkapsulacja podczas syntezy²⁶. Metoda bezpośredniej enkapsulacji opisana w tym manuskrypcie jest przydatna dla tych, którzy pragną łatwego, niedrogiego procesu, który wykorzystuje łatwo dostępne materiały.

Dzięki tym badaniom stworzono udany protokół do produkcji i enkapsulacji sfer BC. Kule BC mogą zamykać stałe cząstki biowęgla, odpadów poflotacyjnych i mikrogranulek polistyrenu w swoich indywidualnych strukturach. Chociaż BC nie jest jeszcze powszechnie stosowany w przemyśle, jest praktycznym, wykonanym w sposób zrównoważony i naturalnie występującym materiałem, który może być wykorzystany w przyszłych zastosowaniach.

Protocol

1. Tworzenie i utrzymywanie bakteryjnej kultury starterowej celulozy

1. Otrzymać kulturę starterową z celulozy bakteryjnej, około 50 g, w postaci SCOBY. Można go kupić komercyjnie (np. w Cultures for Health). Umieść SCOBY w zlewce o pojemności 1 l, przykrytej ręcznikiem papierowym.
2. Zagotuj 700 ml wody dejonizowanej, przenieś ją do naczynia innego niż to, w którym znajduje się SCOBY, i dodaj 85 g sacharozy.
3. Gdy sacharoza się rozpuści, dodaj 2 torebki czarnej herbaty (4,87 g). Zaparzaj herbatę przez 1 godzinę, a następnie ostrożnie wyjmij torebki herbaty za pomocą mieszadła.
4. Do herbaty dodaj 200 ml destylowanego białego octu. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury 25 °C. Po schłodzeniu dodać 700 ml herbaty o temperaturze pokojowej do zlewki zawierającej SCOBY.
   UWAGA: Dodanie kwaśnej herbaty, gdy jest zbyt gorąca, może zaszkodzić organizmom w SCOBY.
5. Przykryj zlewkę ręcznikiem papierowym i zabezpiecz ją elastyczną opaską, a następnie umieść zlewkę w miejscu do przechowywania, w którym utrzymuje się temperaturę 25 °C. Ten statek jest powszechnie określany jako hodowla bydła lub hotel.
6. Aby utrzymać SCOBY w dobrym stanie, wymagana jest konserwacja około 2 razy w miesiącu.
   1. Używając rąk w rękawiczkach do przytrzymywania mat SCOBY, spuść płyn z hotelu do osobnej zlewki. W pojemniku z płynem dodaj tyle kwaśnej herbaty, aby uzyskać łącznie 700 ml roztworu.
   2. Rozpuść 65 g sacharozy w pojemniku z kwaśną herbatą. Czekając, aż sacharoza się rozpuści, ostrożnie opłucz maty SCOBY w wodzie DI.
   3. Gdy sacharoza zostanie całkowicie rozpuszczona, płyn można dodać do zlewki zawierającej wypłukane maty SCOBY. Przykryj zlewkę i umieść ją z powrotem w obszarze inkubacji.

2. Produkcja bakteryjnych kulek celulozowych

UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pracy z wrzącą wodą. Upewnij się, że szkło wytrzymuje temperaturę wrzącej wody, jest wolne od wad i ma odpowiedni rozmiar. Schemat opisujący produkcję kul BC znajduje się w Rysunek 1.

1. Zagotuj 350 ml wody dejonizowanej w czajniku. Przelej gorącą wodę do zlewki o pojemności 500 ml. Rozpuścić 42,5 g granulowanej sacharozy w gorącej wodzie za pomocą mieszadła.
2. Gdy sacharoza całkowicie się rozpuści, zaparzać 1 torebkę czarnej herbaty (2,54 g) w kolbie zawierającej sacharozę i wodę przez 1 godzinę. Następnie wyjmij torebkę herbaty za pomocą pręta do mieszania, uważając, aby nie otworzyć torebki herbaty, a następnie wyrzuć ją do kosza.
3. Dodaj 100 ml destylowanego białego octu do zlewki, a następnie dokładnie wymieszaj mieszaninę. Przenieść 80 ml kwaśnej mieszanki herbaty do kolby z przegrodami o pojemności 250 ml. Pozostaw mieszankę herbaty do ostygnięcia do temperatury pokojowej 20 - 25 °C.
   UWAGA: W tym momencie mieszaninę można pozostawić do ostygnięcia na noc lub do momentu przygotowania do następnego kroku.
4. Gdy temperatura cieczy osiągnie temperaturę pokojową (20 - 25 °C), dodać 20 ml mikrobiologicznego płynu do kultur starterowych do przegrody z przegrodą. Płyn ten można dostać w hotelu SCOBY. Przykryj kolbę parafilmem.
5. Umieść kolbę z przegrodą na orbitalnym stole wstrząsowym i ustaw prędkość na 125 obrotów na minutę (rpm). Pozostawić mieszaninę do wstrząsania przez 3 dni w pomieszczeniu lub inkubatorze o temperaturze od 20 do 25 °C, aby uzyskać kulki BC.
   UWAGA: Jeśli w zawartości kolby tworzą się nieregularne kształty lub jeśli grudki celulozy przyklejają się do ścianek kolby, należy je usunąć, aby zapobiec tworzeniu się dalszych nieregularnych mas BC. Użyj pęsety, aby usunąć niechciane masy BC, w tym cienkie sznurki, pierścienie, kształty rurkowe i inne wyraźnie niekuliste kształty.
6. Gdy kule się uformują, delikatnie wylej je z kolby i przeanalizuj, wyrzuć lub użyj w sposób, który nie został opisany w tym artykule.

3. Używanie kulek z celulozy bakteryjnej do hermetyzacji cząsteczek lub zanieczyszczeń

1. Wykonaj kroki 2.1-2.5 powyżej.
2. Po wytrząsaniu przez 3 dni, dodać około 0,01 g drobno zmielonych cząstek stałych do przegrody kolby. Odpowiednie substancje stałe obejmują biowęgiel (260 ± 140 μm), odpady kopalniane (350 ± 140 μm) oraz mikrogranulki polistyrenu (3 μm). Dane dotyczące tych materiałów są przedstawione w sekcji Reprezentatywne wyniki. Prosimy o zapoznanie się z załączoną tabelą materiałów w celu uzyskania dalszych opisów biowęgla, odpadów kopalnianych i mikrogranulek.
3. Przykryć kolbę ponownie parafilmem i umieścić ją z powrotem na wytrząsarce orbitalnej, używając tej samej prędkości i temperatury otoczenia (20 - 25 °C) przez kolejne 3 dni. Usuń cząstki zamknięte w BC do analizy, utylizacji lub innych zastosowań.

Rysunek 1. Wytwarzanie bakteryjnych kulek celulozowych i kapsułkowanie cząstek stałych. Krok 1 polega na połączeniu podstawowej kultury bakteryjnej z pożywką z czarnej herbaty, cukru i octu w przegrodzie z przegrodą. Dyski w kulturze podstawowej reprezentują maty BC. Następnie przegrodowaną kolbę umieszcza się na orbitalnym stole wibracyjnym na 3 dni. Środkowy krok pokazuje ciała stałe dodawane do kolby po uformowaniu się kulek BC. Kolbę wstrząsa się jeszcze przez 3 dni. W końcowym etapie kule BC nadal zwiększały swoje rozmiary i zamknęły cząstki stałe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

sfery p.n.e. mają najszybsze tempo wzrostu podczas pierwszych 48 godzin hodowli (Rysunek 2). Rysunek 2 pokazuje również, jak kule mają tendencję do osiągania maksymalnych średnich rozmiarów, a następnie pozostają stałe. W tym eksperymencie kule osiągnęły średnią średnicę 7,5 ± 0,2 mm. Chociaż sfery BC nigdy nie uległy całkowitemu zniszczeniu w ciągu 10-dniowego okresu wzrostu, zaczęły formować wąsy, które rozciągają się od głównego korpusu kuli około ósmego dnia. Można t...

Discussion

Protokół ten określa metody produkcji i enkapsulacji sfer BC, które są łatwe do przeprowadzenia i opłacalne. Dzięki różnym dostosowaniom do pierwotnego protokołu udało się określić odpowiedni proces. Należy podjąć krytyczne kroki, aby zapewnić opłacalne sfery. Wszystkie składniki biorące udział w tworzeniu BC odgrywają kluczową rolę w zdrowiu i trwałości kulek. Sacharoza odżywia organizmy, herbata dostarcza azot, a ocet obniża pH do optymalnych warunków, aby zapobiec niepożądanym zanieczyszczeniom²⁸

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			miarowa 100 ml
Zlewka
Butla miarowa 25 ml Kolba
przegrodą 250 ml Erlenmeyer	Chemglass	CLS-2040-02
Zlewka
Biowęgiel Balance
			Sosna Ponderosa poddana obróbce cieplnej w argonie, podgrzana w temperaturze 15 &; C na minutę do 800 ° C
herbata
Woda
Destylowany biały ocet
Elastyczna taśma
Mikrobiologiczne kultury starterowe	Kultury dla zdrowia
Odpady kopalniane			Odebrane z Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Odpady kopalniane zawierają glebę i metale pochodzące z dawnego wydobycia miedzi. Mn, Si, Ca, Al i Fe były pięcioma najbardziej rozpowszechnionymi pierwiastkami mierzonymi w odpadach kopalnianych za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego.
Moździerz i tłuczek
Wytrząsarka			Używane różne marki
Ręcznik papierowy
Mikrogranulki polistyrenowe	Polybead	17138	Średnica 3 mikronów
Pręt
Sacharoza
Czajnik
do herbatyTGA	TA Instrumenty	TA Q500	400 ° C/min do 800 ° C, 100 mL/min N2
Termometr
Analizator XRF	ThermoFisher Scientific	10131166