Bakteryjne kulki celulozowe, które zamykają materiały stałe

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia łatwą i tanią metodę tworzenia kulek z celulozy bakteryjnej (BC). Ten biomateriał może funkcjonować jako medium hermetyzujące dla materiałów stałych, w tym biowęgla, kulek polimerowych i odpadów kopalnianych.

Streszczenie

Kulki z celulozy bakteryjnej (BC) są coraz częściej badane od czasu popularyzacji BC jako nowego materiału. Protokół ten przedstawia niedrogą i prostą metodę produkcji sfer BC. Oprócz wytwarzania tych kulek zidentyfikowano również metodę enkapsulacji cząstek stałych. Aby wyprodukować kulki BC, woda, herbata, cukier, ocet i kultura bakteryjna są łączone w przegrodzie i zawartość jest mieszana. Po określeniu odpowiednich warunków hodowli dla powstania sfery BC, przetestowano ich zdolność do kapsułkowania cząstek stałych przy użyciu biowęgla, kulek polimerowych i odpadów kopalnianych. Kule scharakteryzowano za pomocą oprogramowania ImageJ oraz analizy termograwimetrycznej (TGA). Wyniki wskazują, że kule o średnicy 7,5 mm można wykonać w ciągu 7 dni. Dodanie różnych cząstek zwiększa średni zakres rozmiarów kapsułek BC. Kule zawierały w sobie 10 - 20% swojej suchej masy. Metoda ta pokazuje tanią produkcję kuli i hermetyzację, która jest możliwa do uzyskania przy użyciu łatwo dostępnych materiałów. Kule BC mogą być stosowane w przyszłości jako środek wspomagający usuwanie zanieczyszczeń, powlekanie nawozem o kontrolowanym uwalnianiu lub wzbogacanie gleby.

Wprowadzenie

Celuloza bakteryjna (BC) została zauważona ze względu na swoje potencjalne zastosowanie w przemyśle ze względu na swoją wytrzymałość mechaniczną, wysoką czystość i krystaliczność, zdolność zatrzymywania wody i skomplikowaną strukturę włókien^1,2,3,4. Te cechy sprawiają, że BC jest korzystnym biomateriałem do różnych zastosowań, w tym w biomedycynie, przetwórstwie spożywczym i remediacji środowiska¹. Tworzenie filmu BC może odbywać się za pomocą kultur pojedynczych organizmów lub kultur mieszanych, takich jak te używane do kombucha⁵, sfermentowanego napoju herbacianego. Warzenie kombuchy opiera się na "symbiotycznej kulturze bakterii i drożdży", powszechnie znanej jako SCOBY. Wykorzystując tę symbiotyczną kulturę organizmów, podobną technikę stosuje się do tworzenia sfer BC. Ten biomateriał może być wykorzystany do izolowania zanieczyszczeń środowiska i zakotwiczenia zmian w rolnictwie, takich jak biowęgiel, w celu osiągnięcia bardziej wydajnej produkcji roślinnej.

Poprzednia literatura omawiała, jak cechy BC wytwarzanego w warunkach wzburzenia wypadają w porównaniu do BC wytwarzanego w kulturze stacjonarnej. Kultura stacjonarna powoduje powstanie filmu, który tworzy się na granicy faz ciecz-powietrze, podczas gdy kultura potrząsana powoduje zawieszenie różnych cząstek, nici i kulek BC w cieczy⁶. W wielu badaniach odniesiono się do twierdzenia, że komercyjna produkcja BC jest bardziej wykonalna w warunkach dynamicznych^6,7, dostarczając uzasadnienia dla zastosowania metody opisanej w tym artykule. Dodatkowo przeprowadzono różne badania nad budową i właściwościami sfer BC. Toyosaki et al.⁶ porównali kolby Erlenmeyera z przegrodami i gładkimi ściankami w ich wzburzonej produkcji BC. Badanie przeprowadzone przez Hu i Catchmark⁴ określiło warunki dla sfer BC, które zostały użyte jako wytyczne dla obecnego procesu produkcji sfery BC, a ich wyniki wskazują, że rozmiar kuli nie rośnie po 60 godzinach. Przegląd produkcji BC przeprowadzony przez Mohammada i wsp.¹ wskazuje, że wstrząsanie kulturą BC zapewnia równomierne dostarczanie i dystrybucję tlenu, co jest niezbędne do pomyślnego wzrostu BC. Holland et al.⁸ badali krystaliczność i strukturę chemiczną BC za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej i spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Zakłada się, że kapsułki BC będą wykazywały podobne cechy, a przyszłe badania będą dotyczyły właściwości strukturalnych. W ramach badań analizowano również korzystne skutki stosowania BC do produkcji ulepszonych biokompozytów. Wykorzystując żywicę epoksydową jako bazę, naukowcy wykazali, że dodatek BC poprawia właściwości materiału, takie jak trwałość zmęczeniowa, odporność na pękanie oraz wytrzymałość na rozciąganie i zginanie^9,10. Jak pokazują wcześniejsze i obecne badania, wiele osób jest zainteresowanych komercjalizacją stosowania BC.

Wielu badaczy badało celulozę bakteryjną w systemach kontrolowanego uwalniania, a opisana tutaj metoda generuje kapsułki, które mogą być wykorzystane jako systemy kontrolowanego uwalniania. Wiele z tych badań koncentruje się na kontrolowanym uwalnianiu w dziedzinie biomedycyny, a także na niektórych badaniach nad podawaniem nawozów o kontrolowanym uwalnianiu (CRF). Opierając się na sukcesie kontrolowanego uwalniania amoksycyliny przez BC¹¹, lidocaine¹² i ibuprofen¹³, BC może wykazywać podobne właściwości dostarczania z innymi substancjami, takimi jak nawóz granulowany. Przegląd CRF autorstwa Shaviva i Mikkelsena¹⁴ potwierdza, że CRF są bardziej wydajne, oszczędzają pracę i generalnie powodują mniejszą degradację środowiska niż konwencjonalne nawożenie. Celuloza bakteryjna może działać jako korzystny materiał kapsułkujący dla CRF. Nawozy mogą wypłukiwać się z membran BC lub uwalniać się w miarę biodegradacji BC^15,16. Wysoka zdolność BC do pęcznienia przez wodę może również działać jako korzystna poprawka do gleby^17,18,19, ponieważ zarówno składniki odżywcze nawozu, jak i wilgoć mogą uwalniać się do gleby poprzez zastosowanie kulek BC. Dzięki tym cechom CRF utworzony przez enkapsulację kuli BC może mieć przewagę nad innymi materiałami do powlekania nawozów, które mogą mieć negatywny wpływ na etapie ich produkcji i utylizacji. Adaptacja BC do powłoki nawozowej może jeszcze bardziej udoskonalić technologie CRF. Zmniejszając szybkość uwalniania nawozów, rośliny będą miały wystarczająco dużo czasu na pobranie nawozu i zapobiegnie nadmiernemu spływaniu do zbiorników wodnych, zmniejszając w ten sposób eutrofizację i strefy nienatlenione. Podobne nawozy o spowolnionym uwalnianiu zostały przygotowane i przetestowane przy użyciu powłok polimerowych²⁰.

W przeciwieństwie do protokołów opisanych w poprzednich badaniach, ten skupia się na jednolitej, spójnej produkcji sfer, a nie na wysokiej wydajności celulozy. Co więcej, enkapsulacja BC innych ciał stałych została zbadana za pomocą folii celulozowych, ale nie spheres²¹. Rozszerzając badania nad bakteryjnymi kulkami celulozowymi, można podjąć dalsze kroki w celu komercyjnej produkcji BC, co jest korzystne ze względu na bezpieczne dla środowiska właściwości BC. Ta metoda wytwarzania sfery BC wykorzystuje niedrogie, łatwo dostępne składniki kulinarne. Po wstępnym montażu kule BC zaczynają formować się w ciągu 2 dni bez zakłóceń. Produkcja kulek BC w ramach tej strategii zajmuje niewiele miejsca i ma jadalny produkt uboczny, sfermentowaną herbatę "kombucha". Techniki enkapsulacji wymienione w innych badaniach obejmują powłoki utworzone za pomocą techniki inwersji faz^22,23, tworzenie matrycy²⁴, suszenie rozpyłowe²⁵, oraz bezpośrednia enkapsulacja podczas syntezy²⁶. Metoda bezpośredniej enkapsulacji opisana w tym manuskrypcie jest przydatna dla tych, którzy pragną łatwego, niedrogiego procesu, który wykorzystuje łatwo dostępne materiały.

Dzięki tym badaniom stworzono udany protokół do produkcji i enkapsulacji sfer BC. Kule BC mogą zamykać stałe cząstki biowęgla, odpadów poflotacyjnych i mikrogranulek polistyrenu w swoich indywidualnych strukturach. Chociaż BC nie jest jeszcze powszechnie stosowany w przemyśle, jest praktycznym, wykonanym w sposób zrównoważony i naturalnie występującym materiałem, który może być wykorzystany w przyszłych zastosowaniach.

Protokół

1. Tworzenie i utrzymywanie kultury startowej celulozy bakteryjnej

1. Należy pozyskać kulturę startową celulozy bakteryjnej, około 50 g, w formie SCOBY. Można ją nabyć w drodze zakupu komercyjnego (np. od Cultures for Health). SCOBY należy umieścić w zlewce o pojemności 1 L i przykryć ręcznikiem papierowym.
2. Należy zagotować 700 mL wody dejonizowanej, przelać ją do naczynia innego niż to, w którym znajduje się SCOBY, i dodać 85 g sacharozy.
3. Po rozpuszczeniu sacharozy należy dodać 2 torebki czarnej herbaty (4,87 g). Herbatę należy parzyć przez 1 h, a następnie ostrożnie usunąć torebki za pomocą pręta szklanego.
4. Do herbaty należy dodać 200 mL destylowanego octu białego. Mieszaninę należy schłodzić do 25 °C. Po ochłodzeniu należy przelać 700 mL herbaty o temperaturze pokojowej do zlewki zawierającej SCOBY.
   ​OSTRZEŻENIE: Dodanie kwaśnej herbaty, gdy jest zbyt gorąca, może uszkodzić organizmy w SCOBY.
5. Zlewkę należy przykryć ręcznikiem papierowym, zabezpieczyć gumką recepturką i umieścić w miejscu przechowywania, w którym utrzymywana jest temperatura 25 °C. Naczynie to jest powszechnie nazywane kulturą zapasową lub „hotelem”.
6. Aby utrzymać SCOBY w dobrej kondycji, konserwacja jest wymagana około 2 razy w miesiącu.
   1. Przytrzymując maty SCOBY dłońmi w rękawiczkach, należy zlać ciecz z „hotelu” do osobnej zlewki. Do naczynia z cieczą należy dodać odpowiednią ilość kwaśnej herbaty, aby uzyskać łącznie 700 mL roztworu.
   2. W naczyniu z kwaśną herbatą należy rozpuścić 65 g sacharozy. W czasie oczekiwania na rozpuszczenie sacharozy należy ostrożnie wypłukać maty SCOBY w wodzie dejonizowanej.
   3. Po całkowitym rozpuszczeniu sacharozy ciecz można przelać do zlewki zawierającej wypłukane maty SCOBY. Należy przykryć zlewkę i zwrócić ją do miejsca inkubacji.

2. Produkcja sfer bakteryjnej celulozy

UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas pracy z wrzącą wodą. Należy upewnić się, że szkło laboratoryjne jest odporne na temperatury wrzącej wody, nie posiada defektów i ma odpowiedni rozmiar. Schemat przedstawiający produkcję sfer BC znajduje się na Rysunku 1.

1. Zagotować 350 mL wody dejonizowanej w czajniku. Przenieść gorącą wodę do zlewki o pojemności 500 mL. Rozpuścić 42,5 g sacharozy sypkiej w gorącej wodzie, mieszając prętem szklanym.
2. Po całkowitym rozpuszczeniu sacharozy zaparzyć 1 torebkę czarnej herbaty (2,54 g) w kolbie zawierającej sacharozę i wodę przez 1 h. Następnie wyjąć torebkę herbaty prętem szklanym, uważając, aby jej nie przerwać, i wyrzucić ją do kosza.
3. Dodać 100 mL destylowanego białego octu do zlewki, a następnie dokładnie wymieszać zawiesinę. Przenieść 80 mL zakwaszonej mieszaniny herbaty do kolby z przegrodami o pojemności 250 mL. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, 20 - 25 °C.
   UWAGA: Na tym etapie mieszaninę można pozostawić do ostygnięcia na noc lub do czasu przygotowania kolejnego kroku.
4. Gdy ciecz osiągnie temperaturę pokojową (20 - 25 °C), dodać 20 mL płynnej kultury startowej mikroorganizmów do kolby z przegrodami. Płyn ten można pozyskać z tzw. hotelu SCOBY. Przykryć kolbę parafilmem.
5. Umieścić kolbę z przegrodami na inkubatorze orbitalnym i ustawić prędkość na 125 obrotów na minutę (rpm). Pozostawić mieszaninę w wytrząsaniu przez 3 dni w pomieszczeniu lub inkubatorze o temperaturze od 20 - 25 °C w celu wytworzenia sfer BC.
   UWAGA: Jeśli w zawartości kolby utworzą się nieregularne kształty lub jeśli grudki celulozy przykleją się do ścianek kolby, należy je usunąć, aby zapobiec tworzeniu się dalszych nieregularnych mas BC. Użyć pęsety do usunięcia niepożądanych mas BC, w tym cienkich nici, pierścieni, kształtów rurkowatych i innych wyraźnie niesferycznych form.
6. Po uformowaniu się sfer, delikatnie przelać je z kolby, a następnie poddać analizie, zutylizować lub wykorzystać w sposób niewymieniony w niniejszej pracy.

3. Wykorzystanie sfer z celulozy bakteryjnej do enkapsulacji cząsteczek lub zanieczyszczeń

1. Należy wykonać kroki 2.1-2.5 opisane powyżej.
2. Po 3 dniach wytrząsania do kolby z przegrodami należy dodać około 0,01 g drobno zmielonej materii cząsteczkowej. Odpowiednie ciało stałe obejmuje biochar (260 ± 140 µm), odpady kopalniane (350 ± 140 µm) oraz polistyrenowe mikrokulki (3 µm). Dane dla tych materiałów przedstawiono w sekcji Reprezentatywne wyniki. Szczegółowe opisy biocharu, odpadów kopalnianych i mikrokulek znajdują się w załączonej Tabeli materiałów.
3. Kolbę należy ponownie zakryć parafimem i umieścić na wytrząsarce orbitalnej, stosując tę samą prędkość i temperaturę otoczenia (20 - 25 °C) przez kolejne 3 dni. Następnie należy usunąć cząsteczki enkapsulowane w BC w celu przeprowadzenia analizy, utylizacji lub innych zastosowań.

Rysunek 1. Wytwarzanie sfer z celulozy bakteryjnej i enkapsulacja cząstek stałych. Krok 1 obejmuje połączenie kultury startowej bakterii z pożywką składającą się z czarnej herbaty, cukru i octu w kolbie z przegrodami. Dyski w kulturze startowej reprezentują maty BC. Następnie kolbę z przegrodami umieszcza się na inkubatorze wytrząsowym na 3 dni. Środkowy krok pokazuje dodawanie ciał stałych do kolby po uformowaniu się sfer BC. Kolbę wytrząsa się przez kolejne 3 dni. W ostatnim kroku sfery BC nadal zwiększają swój rozmiar, enkapsulując cząstki stałe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Sfery BC wykazują najszybsze tempo wzrostu podczas pierwszych 48 h hodowli (Rycina 2). Rycina 2 pokazuje również, że sfery mają tendencję do osiągania maksymalnego średniego rozmiaru, po czym ich wielkość pozostaje stała. W tym doświadczeniu sfery osiągnęły średnicę średnią 7,5 ± 0,2 mm. Chociaż sfery BC nigdy nie uległy całkowitej degradacji w ciągu 10-dniowego okresu wzrostu, około ósmego dnia zaczęły tworzyć wypustki rozciągające się poza główny korpus sfery....

Dyskusja

Protokół ten określa metody produkcji i enkapsulacji sfer BC, które są łatwe do przeprowadzenia i opłacalne. Dzięki różnym dostosowaniom do pierwotnego protokołu udało się określić odpowiedni proces. Należy podjąć krytyczne kroki, aby zapewnić opłacalne sfery. Wszystkie składniki biorące udział w tworzeniu BC odgrywają kluczową rolę w zdrowiu i trwałości kulek. Sacharoza odżywia organizmy, herbata dostarcza azot, a ocet obniża pH do optymalnych warunków, aby zapobiec niepożądanym zanieczyszczeniom²⁸

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
			miarowa 100 ml
Zlewka
Butla miarowa 25 ml Kolba
przegrodą 250 ml Erlenmeyer	Chemglass	CLS-2040-02
Zlewka
Biowęgiel Balance
			Sosna Ponderosa poddana obróbce cieplnej w argonie, podgrzana w temperaturze 15 &; C na minutę do 800 ° C
herbata
Woda
Destylowany biały ocet
Elastyczna taśma
Mikrobiologiczne kultury starterowe	Kultury dla zdrowia
Odpady kopalniane			Odebrane z Butte, MT: 46.001978,-112.582465. Odpady kopalniane zawierają glebę i metale pochodzące z dawnego wydobycia miedzi. Mn, Si, Ca, Al i Fe były pięcioma najbardziej rozpowszechnionymi pierwiastkami mierzonymi w odpadach kopalnianych za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego.
Moździerz i tłuczek
Wytrząsarka			Używane różne marki
Ręcznik papierowy
Mikrogranulki polistyrenowe	Polybead	17138	Średnica 3 mikronów
Pręt
Sacharoza
Czajnik
do herbatyTGA	TA Instrumenty	TA Q500	400 ° C/min do 800 ° C, 100 mL/min N2
Termometr
Analizator XRF	ThermoFisher Scientific	10131166

Butla 1000 mlz500 mldejonizowana orbitalna do mieszania