Artykuł metodologiczny

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62295

⸱

31 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Streszczenie

Diagnoza trwającej pandemii SARS-CoV-2 jest priorytetem dla wszystkich krajów na całym świecie. Obecnie ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest złotym standardem w diagnostyce SARS-CoV-2, ponieważ nie jest dostępne żadne trwałe rozwiązanie. Niezależnie od tego, jak skuteczna może być ta technika, pojawiły się badania pokazujące jej ograniczenia w wykrywaniu i diagnozowaniu, zwłaszcza jeśli chodzi o cele o niskiej liczebności. Wykazano natomiast, że kropelkowy cyfrowy PCR (ddPCR), niedawno pojawiająca się technologia o większej przewadze nad qPCR, pokonuje wyzwania związane z RT-qPCR w diagnostyce SARS-CoV-2 z mało obfitych próbek docelowych. Perspektywicznie, w tym artykule, możliwości RT-ddPCR są dalej rozszerzane, pokazując kroki, jak opracowywać testy simplex, duplex, triplex probe mix i quadruplex przy użyciu dwukolorowego systemu detekcji. Wykazano, że przy użyciu starterów i sond ukierunkowanych na określone miejsca genomu SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 i RBD2) możliwe jest opracowanie tych testów. Dodatkowo krok po kroku dostarczane są szczegółowe protokoły, notatki i sugestie, jak usprawnić przepływ pracy testów i analizować dane. Dostosowanie tego przepływu pracy w przyszłych pracach zapewni, że maksymalna liczba obiektów będzie mogła być wykrywana z czułością w małej próbce, co znacznie poprawi koszty i przepustowość próbki.

Wprowadzenie

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), dobrze znana technika, przeszła kilka transformacji od czasu jej pojawienia się, stając się potężną techniką zdolną do dostarczania odpowiedzi na badania nad kwasami nukleinowymi. Przemiany te były ciągłym ulepszaniem starej techniki. Transformacje te można podsumować w trzech generacjach1. Pierwsza generacja to konwencjonalny PCR, który opiera się na elektroforezie żelowej w celu ilościowego określenia i wykrycia amplifikowanych celów. Druga generacja to ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), który może wykrywać próbki w czasie rzeczywistym i opierać się na krzywej standardowej w celu bezpośredniego ilościowego określenia celów w próbce. Trzecia generacja, cyfrowy PCR (dPCR), może wykonywać zarówno wykrywanie, jak i bezwzględną kwantyfikację celów kwasów nukleinowych bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej. dPCR został również ulepszony dzięki temu, że komory reakcyjne są rozdzielane przez studzienki ściany na emulsje oleju, wody i stabilizujących chemikaliów w tej samej studzience, jak to widać w cyfrowym PCR2. W cyfrowym PCR kropelkowym (ddPCR) próbka jest dzielona na tysiące kropelek o rozmiarach nanolitrów zawierających indywidualne cele, które później zostaną określone ilościowo za pomocą statystyk Poissona2,3,4. Technika ta daje ddPCR przewagę w ilościowym określaniu celów o niskiej liczebności w porównaniu z innymi generacjami PCR.

Ostatnio, wiele aplikacji podkreśliło wyższość ddPCR nad powszechnie używanym qPCR przy wykrywaniu i ilościowym określaniu celów o niskiej liczebności1,5,6. SARS-CoV-2 nie jest wyjątkiem od tych zastosowań7,8,9,10,11,12. Od wybuchu epidemii SARS-CoV-2 naukowcy pracują na wszystkich frontach, aby znaleźć rozwiązania w zakresie diagnozowania wirusa i skutecznego jego wykrywania. Obecnym standardem złota nadal pozostaje qPCR13. Wykazano jednak, że RT-ddPCR jest dokładniejszy w wykrywaniu celów SARS-CoV-2 o niskiej liczebności zarówno w próbkach środowiskowych, jak i klinicznych w porównaniu z RT-qPCR7,8,9,10,11,12. Większość opublikowanych prac ddPCR SARS-CoV-2 opiera się na testach sympleksowych, przy czym testy multipleksowe zależą od testów komercyjnych. W związku z tym należy zrobić więcej, aby wyjaśnić, jak opracowywać multipleksowe testy RT-dPCR do wykrywania SARS-CoV-2.

W prawidłowym projekcie testu, multipleksowanie może być użyte do zaoszczędzenia kosztów, zwiększenia przepustowości próbki i maksymalizacji liczby celów, które mogą być wykryte z czułością w małej próbce. Podczas multipleksowania za pomocą ddPCR należy wziąć pod uwagę, ile fluoroforów można wykryć w danym systemie. Niektóre platformy ddPCR mogą obsługiwać do trzech kanałów, podczas gdy inne obsługują tylko dwa kanały. W związku z tym, gdy multipleksujesz z dwoma kanałami, należy użyć różnych podejść, w tym multipleksowania wyższego rzędu, aby wykryć więcej niż dwa cele14,15,16. W tej pracy wykorzystano dwukolorowy system wykrywania ddPCR, aby pokazać kroki, jak opracować różne testy SARS-CoV-2 RT-ddPCR, które można dostosować do różnych zastosowań badawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne
Instytut Wirusologii w Wuhan (WHIOV) jest jednym z laboratoriów i instytutów zatwierdzonych przez China CDC w mieście Wuhan do prowadzenia badań nad SARS-CoV-2 i wykrywania COVID-19 w próbkach klinicznych. Badania nad opracowaniem nowych technik diagnostycznych COVID-19 z wykorzystaniem próbek klinicznych zostały również zatwierdzone przez komisję etyczną Instytutu Wirusologii w Wuhan (2020FCA001).

1. Przepływ pracy przetwarzania próbki (Rysunek 1A)

UWAGA: W całym protokole ważne jest, aby używać oddzielnych pomieszczeń z dedykowanymi pipetami do obsługi próbek (ekstrakcja i przechowywanie), przygotowywanie i przechowywanie odczynników/mastermixów, przygotowanie mieszanki reakcyjnej (próbka plus mastermix) oraz wykrywanie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Testy, które mają zostać opracowane, mogą być wykorzystywane do wykrywania próbek klinicznych lub próbek badawczych. Wszystkie próbki należy traktować tak, jakby mogły przenosić czynniki zakaźne, nawet przy zastosowaniu bezpiecznych procedur laboratoryjnych. Etapy przetwarzania próbek powinny być wykonywane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) zgodnie ze ścisłymi zasadami BSL-2, w tym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE).

  1. Inaktywacja próbki
    1. Zabierz 1 ml próbki SARS-CoV-2 do laboratorium BSL-2. Próbki inaktywowane termicznie w temperaturze 65 °C przez 30 min.
      UWAGA: Próbki mogą pochodzić z różnych źródeł, dlatego należy upewnić się, że objętość do inaktywacji jest wystarczająca, aby zapewnić późniejszą ekstrakcję RNA. Większość zestawów do ekstrakcji wymaga małej objętości próbki do 200 μl, stąd objętość próbki około 1 ml byłaby wystarczająca do inaktywacji. Środki powierzchniowo czynne, zestawy i do lizy mogą być również używane do bezpośredniej inaktywacji i ekstrakcji RNA zgodnie z własnymi procedurami SOP laboratoriów.
    2. Próbki należy przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby umożliwić osadzenie się potencjalnych aerozoli. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin, jeśli nie zostaną natychmiast przetworzone.
      UWAGA: Do przechowywania próbki nie jest wymagany żaden specjalny pojemnik. Próbki mogą być przechowywane w probówkach lub pojemnikach używanych podczas inaktywacji. Na potrzeby tej pracy większość próbek przechowywano w probówkach z pożywką do transportu wirusów (VTM) lub probówkach o pojemności 1,5 ml.
  2. Ekstrakcja RNA
    UWAGA: Wiele przyrządów i zestawów do ekstrakcji RNA z określonymi protokołami jest dostępnych do gotowego użycia. Tutaj przedstawiona jest zautomatyzowana procedura zgodna z instrukcjami producenta.
    1. Wyjmij wstępnie napełnioną kryzę studzienki o głębokości 96 cm; delikatnie odwróć ją do góry nogami, aby wymieszać kulki magnetyczne. Po wymieszaniu delikatnie potrząśnij płytką na płaskiej powierzchni, aby skoncentrować odczynnik i kulki magnetyczne, które mogą znajdować się na ściance, do dna płytki.
    2. Ostrożnie oderwij folię uszczelniającą z folii aluminiowej, aby uniknąć wibracji płyty i rozlania płynu. Dodać 20 μl proteinazy K i 200 μl próbki na basenik w rzędach 2 i 8 płytki 96-dołkowej. Następnie umieść 96-dołkową płytkę na podstawie 32-kanałowego automatycznego instrumentu do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
      UWAGA: Uruchom program na komputerze w ciągu 1 godziny od dodania próbki.
    3. Włóż tuleję pręta magnetycznego do gniazda karty 32-kanałowego automatycznego przyrządu do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Wybierz program GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (wersja szybka) i uruchom go.
    4. Po zakończeniu ekstrakcji wyjąć próbki kwasów nukleinowych w rzędach 6 i 12 (około 100 μl/próbkę) i rozprowadzić na czystej, wolnej od nukleaz 96-dołkowej płytce. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin do momentu użycia lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.
      UWAGA: Zaleca się użycie pipety wielokanałowej o pojemności 100 μl do przenoszenia próbek na nową płytkę o pojemności 100-200 μl, ponieważ może ona bezpośrednio pasować do kolumn płytki z próbką.
  3. Generacja cDNA
    UWAGA: W przypadku próbek przechowywanych przez długi czas należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania. Wykonaj generowanie cDNA za pomocą zestawu cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. W probówce PCR o pojemności 100 lub 200 μl umieszczonej na bloku lodowym/chłodzącym dodać 2 μl 5x głównej mieszanki RT (np. Perfect Real Time), 5 μl próbki RNA i 3 μl ddH2O wolnego od RNaz na reakcję (całkowita objętość 10 μL).
    2. Umieść probówkę PCR w termocyklerze ustawionym tak, aby działała w temperaturze 37 °C przez 15 minut (odwrotna transkrypcja), 85 °C przez 5 s (inaktywacja termiczna odwrotnej transkryptazy) i 4 °C przez nieskończony czas.
      UWAGA: Próbki należy przetworzyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin do momentu użycia lub w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.

2. Optymalizacja testu ddPCR i przepływu pracy

UWAGA: Zoptymalizuj testy przed/po odczytaniu kropel. W zależności od wyników, mogą być one optymalizowane w dowolnym momencie pracy, aby osiągnąć lepsze wyniki. Poniżej znajduje się kilka typowych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas optymalizacji eksperymentów ddPCR.

  1. Zwaliduj startery i sondy ddPCR (Tabela 1).
    UWAGA: Startery ORF1ab i N zostały zaadaptowane z China CDC17, ludzkiego endogennego genu kontrolnego (RPP30) z Lu et al.18 i RBD2 z Nyaruaba et al.13. Wszystkie startery i sondy z wyjątkiem RBD2 zostały już przetestowane i zoptymalizowane pod kątem ddPCR7,8,18.
  2. Przeprowadzić kontrolę próbki testowej ddPCR obejmującą kontrolę pozytywną (próbka ze wszystkimi czterema celami), kontrolę bez szablonu (NTC; Woda wolna od nukleaz lub próbka bez celów) oraz ekstrakcja/kontrola ujemna (całkowity kwas nukleinowy ekstrahowany z niezakaźnej hodowli ludzkiej komórki lub próbki zbiorcze od ochotników zdrowotnych).
    UWAGA: Preferowane są standardowe próbki kontrolne ze znanymi kopiami genów docelowych. Jednak w przypadku braku norm należy użyć dostępnych próbek do zdefiniowania ich kontroli lub matrycy próbki. Uruchom kontrolki razem z próbkami testowymi.
  3. Zoptymalizuj temperaturę wyżarzania (Rysunek 2D), wprowadzając gradient temperatury od 55 °C do 65 °C na etapie wyżarzania PCR (krok 3.2).
    UWAGA: Optymalizacja temperatury wyżarzania pomaga znaleźć najlepszą temperaturę, w której separacja kropel jest maksymalna (łatwa identyfikacja celu) przy minimalnym deszczu. Po uzyskaniu wyników zawęź zakres temperatur dla lepszej optymalizacji, np. od 55 °C do 60 °C.
  4. Zoptymalizuj stężenia startera i sondy. Jeśli w testach nie zostanie osiągnięta optymalna separacja między kroplami dodatnimi i ujemnymi, należy zmienić stężenia startera (300-900 nM) i/lub sond>
  5. Przetestuj czułość analityczną, biorąc pod uwagę różne parametry, w tym granicę ślepej próby (LoB), granicę wykrywalności (LoD), swoistość i czułość, używając zarówno próbek wzorcowych, jak i testowych, zgodnie z preferencjami.

3. przebieg pracy ddPCR (Rysunek 1B) i rozwój testu (Tabela 2)

UWAGA: Podobnie jak inne systemy wykrywania ddPCR, ten przepływ pracy również składa się z czterech etapów (Rysunek 1B), w tym przygotowania mieszaniny reakcyjnej, generowania kropel, amplifikacji PCR i odczytu kropel.

  1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
    UWAGA: Przygotuj wszystkie testy w czystym, oddzielnym pomieszczeniu i wewnątrz BSC. Przestrzegaj standardowych środków ostrożności, w tym używania czystych rękawiczek, czystych pipet, wody wolnej od nukleaz i środków dezynfekujących. Podwielokrotne odczynniki należy umieścić w oddzielnych probówkach i przechowywać w temperaturze -20 oC, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Przygotować testy, jak pokazano w tabeli 2. Roztwory podstawowe podkładu i sondy należy przechowywać w wysokich stężeniach 100 μM. Roztwory robocze można przechowywać w podwielokrotnościach 20-40 μM (rozcieńczonych w wodzie wolnej od nukleaz).
    1. Wspólne etapy we wszystkich testach
      UWAGA: Przed przygotowaniem testów należy obliczyć całkowitą potrzebną objętość mieszanki wzorcowej na podstawie liczby próbek. W tym przypadku objętość każdego składnika mastermix została pomnożona przez 1,05, aby uwzględnić ewentualne błędy pipetowania.
      1. Rozmrozić i zrównoważyć materiały reakcyjne do temperatury pokojowej. Krótko (30 s) wirować składniki reakcji, aby zapewnić jednorodność, i krótko odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
      2. Przygotować mieszaninę starter-sonda (PP) na test, mieszając określone objętości reakcji, jak wyszczególniono w tabeli 2, z roztworów roboczych.
      3. Przygotować mastermix, mieszając 11 μl (1x) 2x ddPCR supermix dla sond (bez dUTP), mieszanki PP (w zależności od oznaczenia, jak pokazano w tabeli 2 z roztworu roboczego) i wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości 19,8 μl na studzienkę. Rozprowadzić mastermix do dołków 96-dołkowej płytki ddPCR bez nukleaz w oparciu o liczbę próbek.
        UWAGA: W przypadku płytki próbnej upewnij się, że we wszystkich 8 studzienkach w jednej kolumnie znajduje się roztwór. Jeśli używanych jest tylko kilka studzienek, np. 5 próbek, należy napełnić pozostałe 3 studzienki 22 μl wody wolnej od nukleaz lub buforem kontrolnym każdy.
      4. Aby uzyskać końcową objętość mieszaniny reakcyjnej (22 μl), dodaj 2,2 μl próbki cDNA na studzienkę zawierającą mieszankę główną. Uszczelnij płytkę jednorazowym uszczelniaczem do płytek PCR.
        UWAGA: Wykonaj dodawanie próbek w wyznaczonym pomieszczeniu. Uwzględnij kontrolki, tj. dodatni, NTC i ekstrakcję. Dodatkowo, jeśli próbki RNA mają niskie stężenie, należy zmniejszyć objętość wody w mieszance głównej i odpowiednio zwiększyć objętość próbki do 5,5 μL.
      5. Po rozprowadzeniu mieszaniny reakcyjnej w dołku, krótko wirować (15-30 s) i odwirować (10-15 s), aby zebrać zawartość na dnie płytki. Kontynuuj wytwarzanie kropel.
  2. Automatyczne generowanie kropel (rysunek uzupełniający 1)
    UWAGA: Można stosować różne generatory kropel; jednak badanie to zostało przeprowadzone przy użyciu automatycznego generatora kropel (AutoDG). Aby uniknąć zanieczyszczenia amplikonem, upewnij się, że generator kropel i czytniki mają wydzielone miejsce w oddzielnych obszarach. Podczas ładowania materiałów eksploatacyjnych zaleca się rozpoczęcie ładowania od tyłu przyrządu, kierując się do przodu, aby uniknąć przesuwania rąk po materiałach eksploatacyjnych i uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego.
    1. Zaopatrz się we wszystkie materiały eksploatacyjne potrzebne do skonfigurowania AutoDG, w tym olej AutoDG do sond, wkłady DG32, końcówki do pipet, blok chłodzący, płytkę na próbkę, płytkę kropelkową (nową, czystą płytkę ddPCR) i kosz na śmieci.
    2. Na ekranie dotykowym AutoDG dotknij opcji Konfiguruj płytkę próbki i wybierz kolumny, w których znajdują się próbki na płytce próbki, a następnie naciśnij przycisk OK.
      UWAGA: Ekran zmieni kolor na żółty, wskazując ŁADUNEK, w którym powinny być załadowane materiały eksploatacyjne.
    3. Otwórz drzwiczki AutoDG i załaduj materiały eksploatacyjne w odpowiednie miejsca.
      UWAGA: Odpowiednie miejsca, w których należy załadować materiały eksploatacyjne, będą oznaczone żółtym wskaźnikiem, który później zmieni kolor na zielony, jeśli materiały eksploatacyjne zostaną załadowane. Jest to podobne do ekranu dotykowego.
    4. Załaduj płytkę próbkującą i płytkę do generowania kropel.
      UWAGA: Płytkę do generowania kropel należy umieścić na bloku chłodzącym. Upewnij się, że blok chłodzący jest fioletowy (gotowy do użycia), a nie różowy (należy go przechowywać w zamrażarce, aż kolor zmieni się z powrotem na fioletowy).
    5. Zamknij drzwiczki AutoDG, upewnij się, że ekran jest zielony (załadowane materiały eksploatacyjne) i wybierz/upewnij się, że typ oleju to Olej do sond przed naciśnięciem przycisku Rozpocznij generowanie kropel.
    6. Poczekaj, aż wygenerują się kropelki. Otwórz drzwiczki, gdy na ekranie pojawi się komunikat Droplets Ready i wyjmij płytkę zawierającą kropelki.
    7. Uszczelnić płytkę przebijalną uszczelką foliową za pomocą zgrzewarki do płyt ustawionej na pracę w temperaturze 185 oC przez 5 s. Przejdź do amplifikacji PCR.
      UWAGA: Amplifikację PCR należy rozpocząć w ciągu 30 minut po wytworzeniu kropli.
  3. Amplifikacja PCR
    1. Włożyć szczelnie zamkniętą płytkę kropelkową do termocyklera o głębokości 96 cm, ustawić objętość próbki na 40 μl, a temperaturę pokrywy na 105 °C.
    2. PCR amplifikuje kropelki za pomocą programu: 95 °C przez 10 minut (aktywacja enzymatyczna), 40 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s i 1 minuta wyżarzania/przedłużania w temperaturze 57 °C, dezaktywacja enzymów w temperaturze 98 °C przez 10 minut i etap utrzymywania w temperaturze 4 °C w nieskończoność. Po PCR odczytać kropelki lub przechowywać w temperaturze 4 °C do 24 godzin < br /> UWAGA: Stosuj szybkość narastania 2 °C /s na wszystkich etapach, ponieważ szybkości narastania mogą się różnić dla różnych termocyklerów. Trzymać płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić ustabilizowanie się kropli przed odczytaniem kropel.
  4. Odczyt kropelkowy
    1. Przenieś 96-dołkową płytkę z cyklami termicznymi do czytnika kropelk, a następnie na komputerze podłączonym do czytnika kropel otwórz/uruchom dołączone oprogramowanie.
    2. W trybie instalacji wybierz opcję Nowy, a następnie kliknij dwukrotnie dowolny dołek, aby otworzyć okno dialogowe Edytor studni. Wybierz studzienki do odczytania i wybierz Eksperyment: ABS, Supermix: ddPCR Supermix dla sond (bez dUTP), Cel 1 Typ: Ch1 Nieznany, Cel 2 Typ: Ch2 Nieznany.
      UWAGA: Ujemny, ślepy, NTC lub dodatni można wybrać z menu rozwijanego docelowego typu 1/2 dla próbek kontrolnych.
    3. Przypisz nazwy obiektu docelowego lub próbki na podstawie układu blachy i wybierz opcję Zastosuj. Po zakończeniu wybierz przycisk OK i zapisz utworzony szablon. Kliknij Uruchom i po wyświetleniu monitu wybierz odpowiedni kolor (FAM/HEX).
      UWAGA: Zaleca się zalanie systemu przed uruchomieniem przed pierwszym uruchomieniem w ciągu dnia. Sprawdź również, czy wszystkie kontrolki w czytniku świecą na zielono, a jeśli nie, postępuj zgodnie z zalecaną aplikacją w stanie podpowiedzi.
    4. Po zakończeniu zbierania danych wyjmij tabliczkę z czytnika. Analizuj dane zgodnie z wymaganiami.
      UWAGA: Ponieważ wstępne wyniki można zobaczyć na ekranie, badanie dodatnich próbek w pierwszych dołkach można wykorzystać do kontroli jakości w czasie rzeczywistym.

4. Analiza danych (Rysunki uzupełniające 2 i 3)

  1. Sprawdź dane ze wszystkich studzienek pod kątem całkowitej liczby kropel. Jeśli liczba kropelek wynosi <10 000, odrzuć wyniki i powtórz test. Ustaw wartość graniczną, aby akceptować wyniki dodatnie i negatywne. Np. liczba kropel do 3 lub więcej dodatnich kropel może być uważana za granicę dla wyników pozytywnych.
    UWAGA: Dane dla wszystkich testów, w tym testów simplex, duplex, triplex prob mix i quadruplex są generowane przy użyciu dołączonego oprogramowania. Jednak to oprogramowanie nadaje się tylko do testów simplex i duplex. W przypadku testów multipleksowych wysokiego rzędu (>3 cele) potrzebne jest zewnętrzne oprogramowanie.
  2. Testy jednostronne i dwustronne
    UWAGA: Oprogramowanie zewnętrzne może również analizować dane jednostronne i dwustronne. Jednak korzystanie z dołączonego oprogramowania jest łatwiejsze w przypadku tych testów, stąd używane w tym artykule.
    1. Kliknij dwukrotnie plik .qlp, który ma zostać przeanalizowany, aby go otworzyć i wybierz opcję Analizuj.
    2. Użyj narzędzi progowych w amplitudzie 1D i amplitudzie 2D, aby rozróżnić dodatnie i ujemne kropelki dla każdej studzienki we właściwym kanale. NTC i dodatnie próbki kontrolne mogą być wykorzystywane jako wytyczne przy ustalaniu progów.
      UWAGA: Wyniki FAM są widoczne w kanale 1, a HEX/VIC w kanale 2.
    3. Po ustawieniu progu wyniki można wyeksportować jako plik .csv i dalej analizować w Excelu lub rejestrować poprzez odczyt bezpośrednio w oknie wyników.
  3. Mieszanie sond Triplex (rysunek uzupełniający 2) i testy poczwórne (rysunek uzupełniający 2)
    UWAGA: Przed analizą mieszanki sondy triplex i testu quadruplex pobierz oprogramowanie zewnętrzne. Przed instalacją zapoznaj się z minimalnymi wymaganiami systemowymi.
    1. Otwórz plik .qlp, klikając go prawym przyciskiem myszy i wybierając Otwórz za pomocą zewnętrznego oprogramowania lub otwierając zewnętrzne oprogramowanie i klikając opcję Przeglądaj, aby zlokalizować plik .qlp w swoim folderze, lub po prostu przeciągając plik .qlp i upuszczając go na już otwarte oprogramowanie zewnętrzne.
    2. W zakładce edytor blach wybierz studnie do analizy po prawej stronie zakładki.
      1. W przypadku mieszanki sond triplex wybierz Bezpośrednia kwantyfikacja (DQ) jako typ eksperymentu, wybierz Probe Mix Triplex jako informacje o teście i wprowadź odpowiednie nazwy celów, a następnie kliknij Zastosuj.
      2. W przypadku quadruplexu wybierz Bezpośrednia kwantyfikacja (DQ) jako typ eksperymentu, wybierz Multipleks amplitudy jako informacje o teście i wprowadź odpowiednie nazwy celów, a następnie kliknij Zastosuj.
    3. Po lewej stronie karty Amplituda 2D użyj narzędzi wykresu, aby przypisać określone kolory do różnych klastrów docelowych, postępując zgodnie z sugestiami pop-up okna Wybierz do przypisania klastra.
      UWAGA: Preferowany tryb klastra może być stosowany w zależności od preferencji użytkowników.
    4. Po przypisaniu kolorów docelowych dane kwantyfikacyjne można odczytać w oknie danych odwiertu w prawym dolnym rogu. Eksportuj dane do Excela/csv w celu dalszej analizy za pomocą ikony z trzema paskami w prawym górnym rogu tabeli danych odwiertu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W badaniu potwierdzającym słuszność koncepcji, wydajność analityczna testów multipleksowych została przetestowana na próbkach klinicznych i badawczych19. Wydajność testów multipleksowych była lepsza niż w przypadku RT-PCR19. Ponieważ mała liczba kropel może wskazywać na problem podczas wytwarzania kropel, w tym artykule ustalono granicę 10 000 kropel na studzienkę na podstawie danych empirycznych.

Dobra separacja między dodatnimi i ujemnymi kropl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dostępnych jest niewiele zasobów na temat opracowywania testów RT-ddPCR do wykrywania SARS-CoV-2. Chociaż nie są one używane w tym artykule, standardowe próbki ze znanymi kopiami mogą być wykorzystywane do opracowywania i optymalizacji testów. Jednak w tej pracy próbki SARS-CoV-2 wyhodowane w komórkach Vero-E6 zostały wzbogacone w tło ludzkiego genomowego RNA i wykorzystane jako próbki standardowe do opracowania testów. Właściwe sekwencje starterów i sond są niezbędne podczas opracowywania testów. Ponieważ większość wstę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Megaproject of Infectious Disease Control z Ministerstwa Zdrowia Chin, numer grantu 2017ZX10302301-005 oraz Sino-Africa Joint Research Center, grant numer SAJC201605.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
32-kanałowy, w pełni automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych Oczyszczacz 32Genfine BiotechFHT101-32Automatyczny ekstraktor do RNA
AutoDG Olej do sondBioRad12003017QX200 AutoDG Materiały eksploatacyjne
ddPCR 96-dołkowe BioRad12003185
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)BioRad1863024Wytwarzanie mastermixu do testów ddPCR
Wkłady DG32 AutoDG BioRad1864108QX200 Materiały eksploatacyjne AutoDG
Elektroniczny termostatyczny garnek do kąpieli wodnejPekin Changfeng Instrument and Meter CompanyXMTD-8000Inaktywacja termiczna próbek
FineMag Rapid Bead Virus Zestaw do ekstrakcji DNA/RNAGenfine BiotechFMY502T5Magnetyczna ekstrakcja kulkowa inaktywowanych próbek RNA
Zgrzewy termiczne z folii przebijalnejKońcówki1814040
do AutoDGBioRad1864120QX200 AutoDG
Pojemniki na odpady do AutoDGBioRad1864125 QX200 AutoDG
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TaKaRaRR036AZgrzewarka do płytek PCR generacji
PX1BioRad1814000Uszczelnij płytkę kropelkową od AutoDG
QuantaSoft 1.7 OprogramowanieBioRad10026368Akwizycja i analiza danych
QuantaSoft Analysis Pro 1.0BioRadN/A Analizadanych
QX200 Automatyczny gererator kropelkowy QX200 (AutoDG)BioRad1864101QX200 Materiał eksploatacyjny AutoDG
Czytnik kropelBioRad1864003Odczyt kropel i akwizycja danych
T100 TermocyklerBioRad1861096Amplifikacja docelowa kropelki (PCR) i generowanie cDNA
do pipet BioRad Materiały eksploatacyjne Materiały eksploatacyjne

Bibliografia

  1. Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
  2. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
  3. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), Basel, Switzerland. 1271(2018).
  4. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236(1999).
  5. Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621(2017).
  6. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  7. Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
  8. Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
  9. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
  10. Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370(2020).
  11. Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
  12. Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302(2020).
  13. Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
  14. Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
  15. Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451(2016).
  16. Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701(2020).
  17. VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
  18. Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
  19. Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RT PCRwielokrotny test ddPCRdwuetapowy RT ddPCRkwantyfikacja wirusowatest dupleksowymieszanina sond tripleksowychtest quadrupleksowykwantyfikacja absolutna

Powiązane artykuły