Artykuł metodologiczny

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62296

⸱

5 kwietnia 2021

 , 
1Department of Biology, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Streszczenie

Rozwój oka kręgowców to złożony proces, który rozpoczyna się pod koniec gastrulacji zarodka i wymaga precyzyjnej koordynacji migracji, proliferacji i różnicowania komórek. Obrazowanie poklatkowe oferuje unikalny wgląd w zachowanie komórek podczas rozwoju oka, ponieważ pozwala nam uwidocznić okulogenezę in vivo. Danio pręgowany jest doskonałym modelem do wizualizacji tego procesu ze względu na ich wysoce konserwatywne oko kręgowców i zdolność do szybkiego i zewnętrznego rozwoju, pozostając jednocześnie optycznie przezroczystymi. Badania obrazowania poklatkowego rozwoju oka danio pręgowanego są znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu transgenicznej linii danio pręgowanego Tg(rx3:GFP). W rozwijającym się przodomózgowiu ekspresja rx3: GFP oznacza komórki pojedynczego pola oka, a GFP nadal ulega ekspresji, gdy pole oka evagina tworzy pęcherzyk wzrokowy, który następnie wnika w pochwę, tworząc miseczkę wzrokową. Obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości ekspresji rx3:GFP pozwala nam zatem śledzić zawiązki oka w czasie, gdy rozwija się ona w siatkówkę. Mikroskopia Lightsheet jest idealną metodą obrazowania morfogenezy oka w czasie ze względu na jej zdolność do penetracji grubszych próbek w celu obrazowania fluorescencyjnego, minimalizowania fotowybielania i fototoksyczności oraz obrazowania z dużą prędkością. W tym przypadku udostępniono protokół obrazowania poklatkowego morfogenezy oka przy użyciu dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Uzyskany w ten sposób zestaw danych może dostarczyć cennych informacji na temat procesu morfogenezy oka, a także zaburzeń tego procesu w wyniku mutacji genetycznej, ekspozycji na czynniki farmakologiczne lub innych manipulacji eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Rozwój embrionalny to złożony proces, który wymaga precyzyjnej koordynacji wielu różnych zdarzeń. Tworzenie oka kręgowców rozpoczyna się w rozwijającym się przodomózgowiu, gdzie część komórek jest określana jako pole oka. Komórki te będą ewagować w kierunku ektodermy powierzchniowej, powodując powstanie dwóch obustronnych pęcherzyków wzrokowych1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Kontakt z ektodermą powierzchniową powoduje następnie wgłębienie pęcherzyka wzrokowego w miseczce optycznej. Ektoderma powierzchniowa da początek przednim strukturom oka, takim jak soczewka i rogówka, podczas gdy miseczka optyczna da początek siatkówki nerwowej i pigmentowanemu nabłonkowi siatkówki1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12. Zakłócenia w tym procesie mogą prowadzić do wad wrodzonych, takich jak mikroftalmia, anoftalmia i coloboma (MAC). W tej chwili nie ma opcji poprawienia tych wad3,5,6,7,9,10,11,12. Dalsze badania nad mechanizmami morfogenezy oka i problemami, które mogą prowadzić do MAC, zapewnią podstawy wiedzy, która potencjalnie doprowadzi do leczenia. Jednym z potężnych narzędzi do badania dynamicznych zachowań komórek podczas rozwoju oka jest obrazowanie poklatkowe, które pozwala na wizualizację i scharakteryzowanie tego procesu in vivo i w czasie rzeczywistym.

Danio pręgowany (Danio rerio) to doskonały model do wizualizacji wczesnego rozwoju wzroku za pomocą obrazowania poklatkowego. Mają wysoce konserwatywne oko kręgowców i posiadają zdolność do szybkiego i zewnętrznego rozwoju, pozostając jednocześnie optycznie przezroczystymi1. Danio pręgowany stanowi doskonałe źródło do obrazowania poklatkowego ze względu na te cechy, których brakuje modelom ssaków. Badania obrazowania poklatkowego rozwoju oka danio pręgowanego są znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu transgenicznej linii danio pręgowanego Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) jest czynnikiem transkrypcyjnym niezbędnym do rozwoju oka14. Rx3 jest pierwszym z trzech genów rx u danio pręgowanego, który ulega ekspresji, rozpoczynając swoją ekspresję w połowie gastrulacji, około 8 godzin po zapłodnieniu (hpf)15,16. Transgen rx3:GFP można wizualizować w rozwijającym się przodomózgowiu, począwszy od etapu 1 somitu (ss), około 10 hpf15,17,18,19,20. W rozwijającym się przodomózgowiu ekspresja rx3:GFP oznacza komórki pola pojedynczego oka, a GFP (zielone białko fluorescencyjne) nadal ulega ekspresji przez pozostałą część morfogenezy oka. Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości ekspresji rx3:GFP pozwala nam zatem śledzić pole pojedynczego oka w czasie, gdy rozwija się w siatkówkę17,18,20.

Badania obrazowania poklatkowego rozwoju danio pręgowanego były głównie wykonywane przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub Lightsheet. Mikroskopia konfokalna jest korzystna, ponieważ pozwala na precyzyjne obrazowanie próbek wzdłuż osi z i redukuje fluorescencyjny sygnał tła. Jest jednak ograniczony ilością czasu potrzebnego na uzyskanie obrazu, sztywnością pozycji próbki oraz skłonnością do fotowybielania i fototoksyczności żywych próbek. Mikroskopia Lightsheet jest idealną metodą obrazowania morfogenezy oka w czasie ze względu na jej zdolność do penetracji grubszych próbek w celu obrazowania fluorescencyjnego, zwiększoną elastyczność orientacji próbki, zminimalizowane fotowybielanie i fototoksyczność oraz obrazowanie z dużą prędkością21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Rozdzielczość przestrzenna osiągalna przy użyciu obecnych systemów mikroskopii arkuszowej wynosi około 250-500 nanometrów (nm). Chociaż nie różni się to znacząco od tego, co można uzyskać za pomocą mikroskopii konfokalnej, próbka może być swobodnie obracana i obrazowana pod wieloma kątami, poprawiając zarówno głębię obrazowania, jak i rozdzielczość, a także oferując znacznie większą elastyczność w eksperymentach obrazowania poklatkowego in vivo niż platforma konfokalna27,32. Z tych powodów mikroskopia Lightsheet szybko staje się ulubioną metodą badań obrazowania poklatkowego rozwoju danio pręgowanego. Protokół ten opisuje etapy kwantyfikacji okulogenezy poprzez obrazowanie transgenicznego danio pręgowanego Rx3:GFP przy użyciu dostępnego na rynku mikroskopu Lightsheet33 i szczegółowo opisuje proces analizy obrazu przy użyciu platformy oprogramowania arivis.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z użyciem danio pręgowanego zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kentucky (IACUC).

1. Przygotowanie próbki

  1. Ustaw parę godową zebry Tg(Rx3:GFP) w zamkniętym zbiorniku krzyżowym na noc przed planowanym obrazowaniem. Następnego ranka pociągnij bramę, gdy zapalają się światła w obiekcie rybnym34,35.
    UWAGA: Wybrana para godowa ryb powinna być w wieku od 4 miesięcy do 2 lat i można ją łatwo odróżnić jako samca lub samicę na podstawie kształtu ciała i ubarwienia35.
  2. Sprawdzaj krzyżówki co pół godziny pod kątem zarodków i zwróć uwagę, o której godzinie zarodki są po raz pierwszy wizualizowane na dnie zbiornika krzyżowego. Przenieść zarodki na szalkę Petriego i utrzymywać je w temperaturze 28,5 °C przez około 10 godzin, aby rozwinęły się do stadium 1-2 somitów (ss). Rozpocznij obrazowanie w fazie 1-2 somitów (ss).
  3. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe na obecność somitów, obserwuj zarodki pod stereoskopem przy 10 hpf i policz liczbę somitów1.
    UWAGA: Wszelkie zarodki, które są poza stadium pojedynczego somitu, nie powinny być używane w tym eksperymencie.
  4. Spośród zarodków, które są w stadium pojedynczego somitu, należy przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem ekspresji GFP za pomocą adaptera fluorescencyjnego w połączeniu z mikroskopem stereoskopowym, aby potwierdzić obecność transgenu Rx3:GFP. Po zidentyfikowaniu 3-5 osób z dodatnim wynikiem GFP, użyj cienkich kleszczyków do dechorionacji zarodków i przenieś je na małą szalkę Petriego zawierającą bufor zarodków E3 za pomocą szklanej pipety35.
  5. Znieczulij zarodki, przenosząc je do 0,5 ml buforu zarodkowego E3 (pH 7) zawierającego 0,168 mg/ml trikainy (MS222) w probówce do mikrowirówki35,36. Spontaniczne ruchy mięśni zaczynają się już w wieku 17 lat hpf37. Upewnij się, że zarodki są znieczulone do obrazowania po upływie tego punktu czasowego.
  6. Osadź zarodki w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w 0,168 mg / ml Trikainy i E3,
    UWAGA: Jest to optymalne stężenie agarozy o niskiej temperaturze topnienia, które pozwala na utrzymanie zarodka w miejscu, ale pozostaje wystarczająco giętkie, aby umożliwić wzrost zarodka w czasie obrazowania30,31.
  7. Przygotować 10 ml roztworu 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze E3. Podgrzej go w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę w odstępach 15 sekund, aby zapobiec wykipieniu roztworu. Pozwól, aby roztwór ostygł na tyle, aby utrzymać go bez dyskomfortu, ale nie na tyle, aby zestalił się i nie zaszkodził zarodkom. Gdy agaroza wystarczająco ostygnie, dodaj 0,5 ml do zarodków w probówce Trikainy w E3 i delikatnie odpipetuj roztwór i zarodki do wymieszania.
  8. Za pomocą szklanej kapilary o średnicy 1 mm i tłoka z politetrafluoroetylenu (PTFE) wciągnąć zarodki w roztworze agarozy do kapilary. Upewnij się, że wciągnąłeś w sumie 3-5 zarodków (mnogich zarodków) do naczynia włosowatego, aby zwiększyć prawdopodobieństwo posiadania dobrze ustawionego zarodka.
    UWAGA: Ze względu na okrągły charakter zarodków w tym momencie, trudno jest zagwarantować określoną orientację w naczyniach włosowatych. Idealnie byłoby, gdyby ciało zarodka było umieszczone bocznie w naczyniach włosowatych, co pozwoliłoby na największą łatwość pozycjonowania w mikroskopie.
  9. Pozwól agarozie zestalić się w okresie 30-60 s w temperaturze pokojowej. Umieść kapilarnę w zlewce 0,168 mg/ml trikainy w buforze E3, aż będzie gotowa do obrazowania (Rysunek 1A).
    UWAGA: Nadmiar 2% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia można pozostawić do zestalenia, a następnie ponownie podgrzać w przyszłych eksperymentach.
  10. Umieść kapilarnę w uchwycie na próbkę ( Rysunek 1B-F) zgodnie z opisem w kroku 2.5.

2. Konfiguracja Zeiss Lightsheet Z.1

  1. Włącz każdy element mikroskopu i komputera w następującej kolejności: 1) System, 2) PC, a następnie 3) Inkubacja (Rysunek 2A).
  2. Umieść obiektyw do obrazowania 20x i obiektyw z oświetleniem 10x w komorze mikroskopu. Dopasuj ustawienia celu w interfejsie oprogramowania Zen w zakładce Utrzymanie.
  3. Wsuń komorę (Rysunek 2C) do obudowy na torze (Rysunek 2B) rurką skierowaną na zewnątrz. Rurka łączy się z odpowiednimi portami po prawej stronie, jak pokazano na Rysunek 2E.
  4. Przymocuj przedłużacz do strzykawki za pomocą mechanizmu luer-lock (Rysunek 2D); napełnij ją Trikainą w E3 i umieść w uchwycie przymocowanym po prawej stronie mikroskopu35. Podłącz przedłużkę dołączoną do strzykawki wypełnionej Trikainą w E3 w prawym dolnym rogu komory za pomocą mechanizmu luer-lock. Nacisnąć tłok, aby napełnić komorę buforem Tricaine/E3. Zamknij drzwi do komory.
  5. Umieścić kapilarę z próbką w kapilarnym uchwycie na próbkę. Kapilarny uchwyt na próbkę składa się z dwóch gumowych tulei, metalowego dysku uchwytu próbki, metalowego trzpienia i metalowej nasadki (Rysunek 1B). Zatrzaśnij metalową osłonę w środku metalowego dysku (Rysunek 1C). Umieść dwa gumowe korki w osłonie, tak aby szczeliny były skierowane w stronę końców osłony, a następnie kapilary. Wsuń kapilarę przez środek gumowych korków. Przymocuj go na miejscu za pomocą metalowej nasadki, gdy marker znajdzie się u podstawy metalowej osłony (Rysunek 1D).
  6. Umieść kapilarny uchwyt na próbkę na górze mikroskopu, tak aby białe znaki były wyrównane (Rysunek 1E,F). Zamknij pokrywę.
  7. Kliknij przycisk Zlokalizuj kapilarnę w interfejsie oprogramowania (Rysunek 3A). Użyj panelu sterowania ErgoDrive, ręcznego urządzenia, które steruje orientacją kapilary (Rysunek 3E), aby przesunąć kapilarnę i ustawić ją tuż nad obiektywem (Rysunek 3B).
  8. Otwórz pokrywkę i delikatnie naciskaj tłok, aż część agarozy zawierająca zarodek zwisa poniżej dna naczynia włosowatego i znajdzie się przed obiektywem (Rysunek 3C).
  9. Wyłącz opcję Zlokalizuj kapilarnę i kliknij przycisk Zlokalizuj próbkę (Rysunek 3A). Spowoduje to przełączenie widoku z kamery internetowej komory na obiektyw mikroskopu (Rysunek 3D). Użyj tego widoku, aby dokładniej dostosować położenie próbki. Wyłącz opcję Zlokalizuj próbkę (Rysunek 3A).
  10. Przełącz się na kartę Pozyskiwanie. Zaznacz pola wyboru Z-Stack i Time Series (Szeregi czasowe).
  11. W oknie Parametry trybu akwizycji wybierz ustawienie Dual Side Lightsheet (Dwustronny arkusz świetlny) i zaznacz pola wyboru Online Dual Side Fusion (Łączenie dwustronne online) i Pivot Scanning (Skanowanie przestawne).
  12. W oknie Kanały wybierz kanał 488, ustaw moc lasera na 1, a czas ekspozycji na 7,5 ms.
  13. Następnie kliknij przycisk Ciągły, aby uzyskać podgląd zarodka na żywo. Za pomocą panelu sterowania ErgoDrive można dostosować położenie zarodka do momentu, gdy pole gałki ocznej będzie skierowane bezpośrednio w stronę kamery. Kontynuuj regulację lewego i prawego arkusza świetlnego w parametrach kanałów, aż pole oka będzie wystarczająco ostre.
  14. Ustaw parametry Z-Stack za pomocą panelu sterowania ErgoDrive, aby poruszać się po płaszczyźnie Z. Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję Z około 500 μm poza ostatnim wykrywalnym sygnałem fluorescencyjnym. Pozostawia to miejsce na to, aby pole oka pozostało w kadrze, gdy zarodek rośnie przez całą sesję obrazowania poklatkowego. Po ustawieniu zakresu Z-Stack kliknij przycisk Optymalny, aby ustawić rozmiar kroku na 0,477 μm, ustawienie optymalne.
  15. Ustaw parametry inkubacji, zaznaczając pole dla jednostki Peltiera, aby utrzymać temperaturę na poziomie 28 °C. W oknie Szeregi czasowe wybierz częstotliwość i interwał czasu, z których mają być pobierane obrazy. W tym protokole parametry zostały ustawione na obraz co 5 minut, co daje łącznie 166 interwałów.
  16. Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać zestaw obrazów. Ustaw prefiks obrazu i naciśnij Zapisz, aby rozpocząć obrazowanie.
    UWAGA: Mikroskop będzie teraz przeglądał każdy zestaw obrazów w określonych odstępach czasu.
  17. Po zakończeniu sesji obrazowania poklatkowego wyślij stolik do pozycji obciążenia i wyjmij uchwyt na kapilarne próbki. Rozebrać kapilarny uchwyt próbki w odwrotnej kolejności, w jakiej został złożony, i użyć tłoka, aby usunąć próbkę i nadmiar agarozy z kapilary. Otwórz drzwi komory. Za pomocą strzykawki usuń płyn z komory z komory, odłącz i wyjmij komorę, a następnie spłucz wodą i wysusz na powietrzu.

3. Analiza obrazu

  1. Otwórz oprogramowanie arivis Vision4D.
  2. Kliknij Plik, a następnie wybierz Importuj plik. Wybierz wszystkie pliki .czi z sesji obrazowania poklatkowego i otwórz. Otworzy się następne okno z opcjami importowania plików; wybierz Z-stacks jako Frames, aby uporządkować z-stacki w uzyskanej kolejności. Po zaimportowaniu plików oprogramowanie zapisuje się jako pojedynczy plik .sis. Aby określić lokalizację pliku, który ma zostać zapisany, wybierz folder przed kliknięciem przycisku Importuj.
  3. Po zaimportowaniu pliku arivis jest teraz gotowy do renderowania wideo z obrazami poklatkowymi. Kliknij na 4D Viewer Cube w lewym dolnym rogu i ikonę Scale Bar (Rysunek 4D-E). Kliknij ikonę wideo, aby przenieść pasek zadań serii ujęć na dół ekranu (Rysunek 4C).
  4. Na pasku zadań serii ujęć wybierz pozycję Dodaj sekwencję klatek kluczowych (Rysunek 4F). Określ czas trwania filmu w sekundach, odznacz pole Utwórz obrót i zaznacz opcję Użyj postępu w czasie, aby uwzględnić określone punkty czasowe w filmie. Oprogramowanie wyświetla te parametry po prawej stronie paska zadań serii ujęć w celu wprowadzenia zmian w dowolnym momencie. Zapisz scenorys, aby zastosować te same parametry do wielu zestawów obrazów (Rysunek 4F).
  5. Kliknij na Eksportuj film, aby zapisać film z obrazowania poklatkowego (Rysunek 4F). Określ ustawienia eksportu filmu, w tym nazwę i lokalizację pliku, format wideo (.mp4), rozdzielczość wideo (1 080 p), liczbę klatek na sekundę (60 kl./s) i rozdzielczość danych (1 297 x 1 297 x 784). W razie potrzeby dodaj tutaj znaczniki czasu. Po ustawieniu tych parametrów wybierz pozycję Rekord (Rysunek 4F).
  6. Kroki 3.4 i 3.5 można powtórzyć z modyfikacją kroku 3.4, aby utworzyć filmy z rotacją w określonych punktach czasowych. Podczas dodawania sekwencji klatek kluczowych do serii ujęć zaznacz pole Utwórz obrót i usuń zaznaczenie opcji Użyj progresji w czasie. Następnie postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami, co w kroku 3.5.
  7. Aby wyrenderować obraz o wysokiej rozdzielczości w dowolnej orientacji i dowolnym punkcie czasowym, wybierz ikonę Kamera w przeglądarce 4D, aby uzyskać obraz w wysokiej rozdzielczości (Rysunek 4C).
  8. Aby utworzyć potok do analizy, wybierz ikonę kolby w celu uzyskania dostępu do panelu Analiza (Rysunek 4B). W panelu Analiza kliknij menu rozwijane Operacje analizy. Na przykład protokół przedstawia poniżej sekwencję operacji dla potoku analizy woluminu. Uruchom lub cofnij każdy krok potoku indywidualnie, aby dostosować każdy parametr (tabela 1).
  9. Kliknij niebieski trójkąt w górnej części rurociągu, aby zezwolić na uruchomienie potoku.
    UWAGA: Zajmie to trochę czasu w zależności od szybkości komputera. Po zoptymalizowaniu potoku można go z łatwością eksportować i importować do arivis oraz stosować do wielu zestawów danych w analizie wsadowej.
  10. Aby uzyskać dostęp do analizy wsadowej, kliknij pozycję Analiza wsadowa na karcie Analiza.
  11. Po uruchomieniu potoku zostanie wyświetlone okno ze wszystkimi znalezionymi obiektami. Uzyskaj dostęp do niego ręcznie za pomocą ikony tabeli (Rysunek 4B). W górnej części tego okna kliknij pole oznaczone Kolumny funkcji, aby wyświetlić listę funkcji, które mogą dostarczyć informacji o interesującym Cię obiekcie. W przypadku analizy objętości pola oka te cechy obejmują powierzchnię, objętość (objętość, liczba wokseli), intensywność #1 (średnia), atrybuty (id, typ) i punkt czasowy (pierwszy). Kliknij Eksportuj, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego.

Wyniki

Zestaw danych przedstawiony tutaj został obrazowany zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Zarodek Tg(Rx3:GFP) obrazowano począwszy od stadium 1 somytu (ss) aż do 24 hpf, przez całkowity okres 14 h, a obrazy pozyskiwano w odstępach 5 min. Obrazowanie time-lapse umożliwia łatwy wybór i porównanie dowolnego punktu czasowego wykazującego interesujący fenotyp. Rysunek 5 prezentuje zestaw obrazów o wysokiej rozdzielczości, wyrenderowanych z perspektywy grzbietowej w wybranych punktach czasowych rozwoju. Proces uruchomiony w programie arivis Vision4D tworzy maskę reprezentującą rozwijające się oko, zidentyfikowane na podstawie sygnału fluorescencyjnego. Na Rysunku 5 oraz w Filmach 1-6 maskę można zwizualizować w porównaniu z renderowaniem fluorescencyjnym rozwijającego się oka. Dodatkowo Tabela 2 przedstawia dane dotyczące objętości rozwijającego się oka w każdym punkcie obrazowania. Zestaw danych ten obejmuje nazwę segmentu, identyfikator, objętość wyrażoną zarówno w µm3, jak i w liczbie wokseli, średnią intensywność fluorescencji obiektu, punkt czasowy identyfikacji obiektu oraz powierzchnię obiektu w µm2. Należy zauważyć, że gdy pole oczne rozdziela się na dwa pęcherzyki optyczne (począwszy od punktu czasowego 64), w przedmózgowiu pozostaje trzeci region dodatni pod względem Rx3:GFP, który będzie przyczyniał się do powstania podwzgórza38,39,40 (Rysunek 5D-M). Jest to widoczne w danych objętościowych przedstawionych w Tabeli 2 (zaznaczonych na żółto począwszy od punktu czasowego 71) i można go łatwo oddzielić od pęcherzyków optycznych, ponieważ jego objętość jest znacznie mniejsza niż któregokolwiek z pęcherzyków optycznych.

Układ chromatograficzny: schemat montażu komponentów do analizy spektroskopowej absorpcji UV-Vis.
Rysunek 1: Przygotowanie próbki. (A) Pozycjonowanie embrionów w kapilarze szklanym. Strzałka wskazuje embrion w kapilarze. (B) Części kapilary szklanej i uchwytu kapilary. (C) Częściowo złożony uchwyt kapilary. (D) Całkowicie złożony uchwyt kapilary. (E) Komora montażowa arkusza światła (Lightsheet). Strzałka wskazuje białą linię służącą do orientacji uchwytu kapilary. (F) Uchwyt kapilary prawidłowo zamontowany w układzie Lightsheet. Strzałka pokazuje dopasowane białe linie, wskazujące prawidłową orientację uchwytu kapilary. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ustawienie równowagi statycznej; komponenty optyczne; schemat pomiaru fotonicznego; sprzęt spektroskopowy.
Rysunek 2: Układ obrazowania arkuszowego światła (Lightsheet). (A) Panel przełączników do włączania źródła światła Lightsheet, komputera i jednostki inkubacyjnej. Numery wskazują kolejność operacji. (B) Komora obiektywu Lightsheet. (C) Komora obrazowania. (D) Strzykawka i rurki, które zostaną podłączone do komory obrazowania. (E) Komora obrazowania prawidłowo umieszczona w komorze obiektywu, ze wszystkimi rurkami podłączonymi do odpowiednich portów po prawej stronie. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu mikroskopii; manipulacja preparatem w kapilarze; konfiguracja i analiza obrazowania neuronaukowego.
Rycina 3: Pozycjonowanie próbki. (A) Przyciski Locate Capillary oraz Locate Sample w oprogramowaniu Zen, wskazane strzałkami. (B) Pozycjonowanie na szklanej kapilarze. Strzałka wskazuje krawędź szklanej kapilary umieszczonej tuż nad soczewką obiektywu. (C) Zawiesina zarodka poza szklaną kapilarą. Strzałka wskazuje zarodek zawieszony w agarozie pod szklaną kapilarą przed soczewką obiektywu. (D) Widok zarodka przez obiektyw. (E) Panel sterowania ErgoDrive. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ikony interfejsu oprogramowania naukowego do przetwarzania i wizualizacji danych; przyciski paska narzędzi oznaczone literami A-F.
Rysunek 4: Ważne ikony służące do nawigacji w programie arivis Vison4D. Na każdym panelu funkcje ikon są opisane od lewej do prawej. (A) Otwórz, Zapisz, Zamknij. (B) Panel analizy, Pokaż tabelę obiektów, Otwórz edytor śledzenia. (C) Kopiuj zawartość bieżącego widoku jako obraz do schowka, Przełącz zakładki, Utwórz obraz o wysokiej rozdzielczości dla bieżącego widoku, Przełącz storyboard. (D) Pokaż pole pomiarowe, Pokaż krzyż orientacyjny, Pokaż legendę, Pokaż pasek skali. (E) Pokaż jako widok 2D, Pokaż jako widok galerii, Pokaż jako widok 4D, Pokaż jako widok informacji, Pokaż jako widok projekcji. F) Odśwież wszystkie klatki kluczowe, Dodaj klatkę kluczową, Dodaj sekwencję klatek kluczowych, Wstaw klatkę kluczową, Usuń wszystkie klatki kluczowe, Eksportuj film, Wczytaj storyboard, Zapisz storyboard, Dostosuj czas docelowy całego filmu, Pierwsza klatka kluczowa, Odtwórz, Pauza, Stop, Ostatnia klatka kluczowa. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Sekwencja mikroskopowa rozwoju zarodka; 3D rekonstrukcja neuroanatomiczna; obrazowanie fluorescencyjne.
Rysunek 5: Obrazy o wysokiej rozdzielczości i maski pola oka. (A-M) Zestaw obrazów o wysokiej rozdzielczości wyrenderowanych z punktów widzenia grzbietowego; (A'-M') maski pola oka dla każdego odpowiadającego punktu czasowego. Każdy zestaw obrazów jest oznaczony czasem ich pozyskania od momentu rozpoczęcia obrazowania oraz odpowiadającym etapem rozwoju, określonym w stadium somytów (ss) lub godzinach po zapłodnieniu (hpf). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo 1: Film poklatkowy embrionu rybki zebrafish Tg(rx3:GFP) od 1 ss-24 hpf. Kliknij prawym przyciskiem myszy tutaj, aby pobrać wideo (zapisz łącze jako).

Wideo 2: Film poklatkowy zarodka danio przebrzuchałego Tg(rx3:GFP) od 1 ss-24 hpf z obszarem pola widzenia oka zidentyfikowanym przez potok przetwarzania arivis Vision4D. Kliknij prawym przyciskiem myszy tutaj, aby pobrać wideo (zapisz łącze jako).

Wideo 3: Obrót o 360° zarodka ryby danio prążkowanego Tg(rx3:GFP) w 1 ss. Kliknij tutaj prawym przyciskiem myszy, aby pobrać wideo (zapisz link jako).

Wideo 4: Obrót o 360° maski pola oka zarodka rybki danio w linii Tg(rx3:GFP) przy 1 ss. Kliknij prawym przyciskiem myszy tutaj, aby pobrać wideo (zapisz link jako).

Wideo 5: Obrót o 360° zarodka danio pręgowanego Tg(rx3:GFP) w 24 hpf. Kliknij prawym przyciskiem myszy tutaj, aby pobrać wideo (zapisz link jako).

Wideo 6: Obrót 360° maski pola oka zarodka danio pręgowanego Tg(rx3:GFP) w 24 hpf. Kliknij prawym przyciskiem myszy tutaj, aby pobrać wideo (zapisz link jako).

Tabela 1: schemat analizy arivis Vision4D dla oceny objętości rozwijającego się pola oka. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

Tabela 2: Objętość i powierzchnia rozwijającego się pola oka uzyskane za pomocą arivis Vision4D. Wiersze dotyczące domniemanego podwzgórza są wyróżnione kolorem żółtym, aby odróżnić je od pęcherzyków optycznych. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W tym protokole mikroskop Lightsheet został wykorzystany do wykonania obrazowania poklatkowego rozwoju oka, a uzyskane dane zostały przeanalizowane. Uzyskany w ten sposób zestaw danych może dostarczyć cennych informacji na temat procesu morfogenezy oka, a także zaburzeń tego procesu w wyniku mutacji genetycznej, ekspozycji na środki farmakologiczne lub innych parametrów eksperymentalnych. W tym miejscu protokół zademonstrował, w jaki sposób można uzyskać ten zestaw danych i dostarczył przykładu, jak analizować objętość pola ocznego na wczesnym etapie rozwoju. Stwierdzono, że dane te są powtarzalne i spójne (mniej niż 10% odchylenia w objętości) we wszystkich kontrpróbach biologicznych, mając na uwadze, że niewielkie różnice w stopniu zaawansowania zarodka przed rozpoczęciem serii mogą prowadzić do pewnych różnic w końcowych pomiarach objętości.

Należy zachować ostrożność przy początkowym ustawieniu zarodka w naczyniach włosowatych oraz przy ustawianiu osadzonego zarodka przed obiektywem. Orientacja odgrywa ważną rolę w zapobieganiu wzrostowi zarodka i oddalaniu się od pola widzenia celu. Zarodki mają okrągły kształt przy 10 hpf, co sprawia, że trudno jest zagwarantować określoną orientację w naczyniach włosowatych. Idealnie byłoby, gdyby ciało zarodka było umieszczone bocznie w naczyniach włosowatych. Umieszczenie wielu zarodków w kapilarze zwiększy prawdopodobieństwo posiadania dobrze ustawionego zarodka.

W tej procedurze zarodek jest zanurzany w agarozie w celu zawieszenia go przed obiektywami obrazowania i oświetlenia. Wybór odpowiedniego stężenia agarozy o niskiej temperaturze topnienia ma kluczowe znaczenie. Zbyt wysokie stężenie spowoduje zwężenie zarodka i uniemożliwi jego prawidłowy rozwój; Zbyt niskie stężenie spowoduje, że agaroza rozpadnie się i nie utrzyma zarodka. Stężenie optymalne dla tego protokołu to końcowe stężenie 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia30,31.

Kolejnym elementem, który należy wziąć pod uwagę, jest poziom nasycenia. Wraz ze wzrostem i różnicowaniem się pola widzenia, siła sygnału Rx3:GFP nasila się. Dlatego przy ustawianiu początkowych parametrów obrazowania należy zmniejszyć ekspozycję i moc lasera, aby nie nasycić obrazu. Zapobiegnie to przesyceniu obrazu, ponieważ Rx3:GFP z czasem staje się jaśniejszy. Można dokonać modyfikacji w celu skorygowania niepełnego nasycenia w przetwarzaniu obrazu, ale przesycenia nie można skorygować po uzyskaniu obrazów.

Istnieje kilka dodatkowych modyfikacji, które można wprowadzić do tego protokołu, a które mogą być korzystne dla niektórych projektów, które nie są opisane w tym artykule. Na przykład możliwe jest skonfigurowanie obrazowania Multiview w konfiguracji akwizycji obrazu. Ten parametr pozwoliłby na sekwencyjne obrazowanie wielu zarodków w różnych pozycjach wzdłuż osi y w każdym przedziale czasowym. Zwiększając złożoność zbioru danych, zwiększyłoby to szybkość gromadzenia danych. Dodatkowo, jeśli chodzi o przetwarzanie obrazu, możliwe jest ilościowe określenie pola widzenia za pomocą innych parametrów. W tym miejscu opisaliśmy, jak określić ilościowo dane pod względem objętości pola ocznego. Alternatywnie można wykonać rurociąg do ilościowego określania i śledzenia pojedynczych komórek lub określenia szybkości pochwy pęcherzyków wzrokowych.

Jak wspomniano wcześniej, zarówno mikroskopia konfokalna, jak i Lightsheet zostały wykorzystane do przeprowadzenia badań obrazowania poklatkowego danio pręgowanego. Lightsheet został specjalnie wybrany do tego projektu ze względu na jego doskonałą zdolność do obrazowania przez grubą (>1 mm) próbkę, ponieważ jest wyposażony w jednostkę inkubacyjną w celu utrzymania idealnego środowiska temperaturowego dla zarodka danio pręgowanego, a także dlatego, że jego zdolność do obrazowania w szybszym tempie niż mikroskopia konfokalna pozwala na akwizycję obrazu w licznych odstępach czasu wymaganych dla tego protokołu, bez towarzyszącego uszkodzenia lub fotowybielania zarodka21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Należy również zauważyć, że mikroskop Lightsheet jest wyposażony w obrazowanie sygnału z wielu fluoroforów. Mikroskop Lightsheet użyty w tym badaniu ma linie wzbudzenia laserem w stanie stałym o długości fali 405, 445, 488, 515, 561 i 638 nm, które mogą być przydatne do obrazowania transgenicznych zarodków wykazujących ekspresję więcej niż jednego fluorescencyjnego transgenu reporterowego.

Chociaż protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące analizy akwizycji obrazu przy użyciu systemu mikroskopu podwójnego oświetlenia Lightsheet Z.1 i oprogramowania analitycznego arivis Vision4D, istnieją inne dostępne na rynku mikroskopy Lightsheet firmy Leica, Olympus i Luxendo, a także oprogramowanie do analizy obrazu firmy Imaris, które można wykorzystać do osiągnięcia podobnych wyników. O doborze sprzętu i oprogramowania do tego protokołu zadecydowała dostępność w naszej placówce.

Podsumowując, oczekuje się, że protokół ten będzie stanowił solidny punkt wyjścia do przeprowadzenia obrazowania poklatkowego za pomocą mikroskopii Lightsheet oraz do ilościowego określenia obrazu wczesnego rozwoju oka u danio pręgowanego.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) pod numerem nagrody S10OD020067 oraz przez nagrodę NIH R01EY021769 (do A.C.M.). Jesteśmy wdzięczni za pomoc Dougowi Harrisonowi i Jimowi Begleyowi z Arts & Sciences Imaging Center na Uniwersytecie Kentucky, a także Lucasowi Vieirze Francisco i Evelyn M. Turnbaugh za fachową opiekę nad danio pręgowanym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
60 ml strzykawka Luer-Lok TipBD309653
agaroza, niska temperatura topnieniaPromegaV2111
arivis Vision4D Softwarearivishttps://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Kleszcze Dumoxel N3CDumont0203-N3C-PO
Bufor rybny E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)
Szklana kapilata – Rozmiar 2 (~1mm)ZeissBlack/701904
Heidelberger Przedłużacz 100cmB. Braun4097262
Light & Zestaw filtrów – SzalkaBlue Night SeaSFA-LFS-RB
(100 x 15 mm)VWR25384-302
Adapter fluorescencyjny do mikroskopu stereoskopowegoNocny
tłok z końcówką teflonową – Rozmiar 2Zeiss#701997
Tg(rx3:GFP) danioTa linia została założona przez Rembold et al.13
Tricaine (MS222)SigmaA-5040
Z.1 LightsheetZeiss
Zen SoftwareZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
Petriego Royal pręgowany

Bibliografia

  1. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  2. Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
  3. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  4. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Developmental Cell. 6 (2), 167-181 (2004).
  5. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214(2009).
  6. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  7. Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  8. Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216(2015).
  9. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
  10. Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
  11. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689(2017).
  12. Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
  13. Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
  14. Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
  15. Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
  16. Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
  17. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  18. Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
  19. Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
  20. Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  23. Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
  24. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966(2016).
  25. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  26. Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
  27. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
  28. Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
  29. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  30. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  31. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  32. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  33. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
  34. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  35. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2007).
  36. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210(2017).
  37. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
  38. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
  39. Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
  40. Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozw j oka rybki zebrafishrybka zebrafish Rx3 GFPobrazowanie poklatkowetworzenie si p cherzyka optycznegozatapianie embrion wobrazowanie fluorescencyjneoprogramowanie do analizy obrazumigracja kom rek
Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.