Artykuł metodologiczny

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62298

⸱

21 kwietnia 2021

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep komórek siatkówki jest obiecującym podejściem terapeutycznym, które mogłoby przywrócić architekturę siatkówki i ustabilizować lub nawet poprawić możliwości widzenia zdegenerowanej siatkówki. Niemniej jednak postęp w terapii zastępowania komórek stoi obecnie przed wyzwaniami związanymi z koniecznością posiadania gotowego źródła wysokiej jakości i standaryzowanych ludzkich siatkówk. Dlatego do eksperymentów potrzebny jest łatwy i stabilny protokół. Tutaj opracowujemy zoptymalizowany protokół, oparty na metodzie samoorganizacji z wykorzystaniem cząsteczek egzogennych i odczynnika A, a także ręcznym wycinaniu w celu wygenerowania trójwymiarowych organoidów ludzkiej siatkówki (RO). Ludzka RO pochodząca z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) wykazuje ekspresję specyficznych markerów dla fotoreceptorów. Dzięki dodatkowi COCO, wielofunkcyjnego antagonisty, znacznie zwiększa się skuteczność różnicowania prekursorów fotoreceptorów i czopków. Efektywne wykorzystanie tego systemu, który czerpie korzyści z linii komórkowych i komórek pierwotnych, bez problemów z zaopatrzeniem związanych z tymi ostatnimi, może wytworzyć zlewające się komórki siatkówki, zwłaszcza fotoreceptory. W związku z tym różnicowanie PSC do RO stanowi optymalną i biologicznie istotną platformę do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i przeszczepiania komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) charakteryzują się samoodnawianiem i zdolnością do różnicowania się we wszystkie rodzaje komórek somatycznych. W związku z tym organoidy pochodzące z PSC stały się ważnym zasobem w badaniach nad medycyną regeneracyjną. Zwyrodnienie siatkówki charakteryzuje się utratą fotoreceptorów (pręcików i czopków) oraz nabłonka barwnikowego siatkówki. Wymiana komórek siatkówki może być zachęcającym sposobem leczenia tej choroby. Nie jest jednak możliwe uzyskanie ludzkich siatkówk do badań i terapii chorób. Dlatego organoidy siatkówki (RO) pochodzące z PSC, które skutecznie i skutecznie rekapitulują wielowarstwowe natywne komórki siatkówki, są korzystne dla badań podstawowych i translacyjnych1,2,3. Nasze badania koncentrują się na różnicowaniu RO, aby zapewnić wystarczającą ilość i jakość komórek do badania zwyrodnienia siatkówki4.

Metody rozróżniania RO są ciągle rozwijane, z trójwymiarowym (3D) różnicowaniem zawieszenia zapoczątkowanym przez laboratorium Sasai w 2012 roku5. Wprowadziliśmy znacznik CRX-tdTomato w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC), aby specyficznie śledzić komórki prekursorowe fotoreceptorów i zmodyfikowaliśmy metodę o dodanie COCO, wielofunkcyjnego antagonisty szlaków Wnt, TGF-β i BMP6. Wykazano, że COCO skutecznie poprawia efektywność różnicowania prekursorów fotoreceptorów i czopków6,7.

Razem, modyfikując klasyczną metodę różnicowania, opracowaliśmy dostępny protokół do zbierania obfitych prekursorów fotoreceptorów i czopków od ludzkich RO w celu analizy choroby siatkówki związanej z fotoreceptorami poprzez badania laboratoryjne i do dalszego zastosowania klinicznego/transplantacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Tongren w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. H9 hESC uzyskano z Instytutu Badawczego WiCell i zmodyfikowano genetycznie do linii komórkowej znakowanej tdTomato.

1. Generowanie ludzkich RO

  1. Hodowla hESC w warunkach wolnych od karmienia.
    1. Pokryć jedno zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml odczynnika A o stężeniu 0,1 mg/ml (tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez co najmniej pół godziny, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Rozmrozić podwielokrotność 1x106 hESC.
      UWAGA: Przygotuj 3 ml wstępnie podgrzanego odczynnika B (tabela materiałów) i przenieś kriokonserwowane komórki (1 ml) do 3 ml świeżej pożywki. Nie należy pipetować komórek hESC do pojedynczych komórek.
    2. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
    3. Zasiać komórki na płytce pokrytej odczynnikiem A z 2 ml odczynnika B i zmieniać 2 ml odczynnika B dziennie. Komórki pasażowe po osiągnięciu około 80% zbiegu (zwykle około 4 dni).
  2. Dzień 0
    1. Dysocjację hESC do zawiesiny jednokomórkowej za pomocą pożywki I (Tabela 1). Przygotuj pożywkę I, mieszając następujące elementy: 20% (v/v) zamiennik surowicy KnockOut (KSR), 0,1 mM roztworu aminokwasów endogennych MEM (NEAA), 1 mM pirogronian, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/ml COCO, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny (PS), 0,1 mM β-merkaptoetanolu i minimalnej pożywki egzogennej Glasgow's Eagle (GMEM).
      UWAGA: Przed rozpoczęciem dysocjacji przygotować pożywkę I i przenieść 12 ml pożywki I z 20 μM Y-27632 na 10 cm szalkę Petriego, 500 μl odczynnika C (tabela materiałów) zawierającego 0,05 mg/ml odczynnika D (tabela materiałów) i 20 μM Y-27632 w probówce o pojemności 1,5 ml. Powyższe kroki należy wykonać w ciemności, ponieważ komponent IWR1e w medium I jest światłoczuły.
    2. Przemyć hESC wstępnie podgrzanym 1x buforem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
    3. Dodać przygotowany odczynnik o pojemności 500 μl (w probówce o pojemności 1,5 ml) i inkubować hESC przez 3,5 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Odłączyć komórki, przesuwając bok i spód płytki przez kilka sekund, a następnie dodać 500 μl przygotowanej pożywki I z płytki Petriego do płytki hESC.
      UWAGA: Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml z 900 μl 1x DPBS i użyj hemocytometru do zliczania komórek.
    5. Zbierz komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół, a następnie wyjmij 100 μl z probówki, a następnie dodaj do probówki z 900 μl DPBS w celu zliczenia komórek.
    6. Zawiesinę komórek o stężeniu 900 μl rozproszyć, a następnie rozcieńczyć komórki przygotowanym podłożem I na szalce Petriego do 9 x 104 komórek/ml.
      UWAGA: Cała objętość pożywki wynosi 12 ml; 1,08 x 10 W sumie potrzebnych jest6 komórek.
    7. Dodać 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z nieprzylegającym dnem w kształcie litery V (tabela materiałów).
      UWAGA: Użyj pipety wielokanałowej, aby skrócić czas i upewnić się, że każda studzienka zawiera równoważny numer komórek. Wstrząsaj szalką Petriego za każdym razem przed wyjęciem porcji 100 μl. Ważne jest, aby komórki były równomiernie rozmieszczone.
    8. Lekko odwirować 96-dołkową płytkę w wytrząsarce wolnoobrotowej przez 5 minut, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Trzymaj płytę w ciemności. Ustaw dzień jako dzień 0.
  3. Dzień 2
    1. Dodać 1% odczynnik A (tabela materiałów). Przygotować odczynnik A (stężenie białka 10 mg/ml) dodając 133,4 μl odczynnika A do 2 ml pożywki I.
      UWAGA: Przed użyciem należy utrzymywać odczynnik A w temperaturze 4 °C przez noc, aby uzyskać całkowite i równomierne stopienie. Proszę zwrócić uwagę na informacje o produkcie i wyszukać numer katalogowy oraz numer partii na oficjalnej stronie internetowej firmy, aby uzyskać stężenie białka odczynnika A, ponieważ każda butelka odczynnika A ma inne stężenie białka. Jeśli stężenie białka jest niskie, pomocna byłaby zwiększona objętość odczynnika A.
    2. Dodać 20 μl przygotowanego odczynnika A do każdej studzienki i dwukrotnie pipetować w środku, aby rozsypać martwe komórki.
      UWAGA: Utrzymuj odczynnik A i płytkę 96-dołkową w chłodnych warunkach i wykonaj wszystkie czynności na lodzie. Umieść talerz w ciemności.
  4. Dzień 2-12
    1. Oczyścić dno płytki 96-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do dnia 6. W dniu 6 zmień połowę pożywki, usuwając 58 μl pożywki z każdej studzienki i dodając 60 μl pożywki I.
      UWAGA: Użyj pipety wielokanałowej, aby zakończyć wymianę połowy pożywki. Wykonaj ten krok delikatnie, aby upewnić się, że żadne granulki komórek nie zostały usunięte ze studni. Odessać pożywkę do czystej, 10 cm szalki Petriego. Jeśli w środku znajdują się osadki komórek, dodaj je z powrotem do płytki 96-dołkowej.
  5. Dzień 12- 18
    1. Zmienić pożywkę na pożywkę II (Tabela 1) w 12 dniu. Przygotować pożywkę II przy użyciu 1% (v/v) odczynnika A, mieszając następujące elementy: 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM pirogronianu, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 100 nM dichlorowodorku SAG i GMEM. Przechowuj go w chłodnych i ciemnych warunkach.
    2. Zbierz granulki komórkowe w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z płytki 96-dołkowej i pozwól granulkom osiąść naturalnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Delikatnie usuń podłoże i granulki pod powierzchnią, aby uniknąć pęcherzyków.
    3. Usunąć supernatant, dbając o organoidy. Przenieść agregaty komórek do 10 cm naczynia do zawiesiny zawierającej 18 ml przygotowanej pożywki II z odczynnikiem A.
      UWAGA: Nie dodawaj wcześniej przygotowanej pożywki II do naczynia o średnicy 10 cm, ponieważ odczynnik A powinien mieć temperaturę 4 °C.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do 18 dnia.
  6. Od 18 dnia
    1. Zmień pożywkę na średnią III (Tabela 1). Przygotuj podłoże III w ciemnych warunkach, mieszając następujące elementy: 10% FBS, 1xsuplement 1, 0,5 μM kwasu retinowego (RA), 100 μM tauryny, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i mieszaninę 1:1 zmodyfikowanej pożywki Dulbecco (DMEM)/mieszanki składników odżywczych F-12.
    2. W 18 dniu, kiedy powstaje półprzezroczysty pęcherzyk wzrokowy, przeciąć organoidy za pomocą noża mikrochirurgicznego.
      UWAGA: Rozdrobnij organoid, zwykle na cztery części, na szalce Petriego z podłożem II. Każdy kawałek powinien wyrosnąć na nienaruszoną miseczkę optyczną w ciągu następnych tygodni.
    3. Zagreguj wszystkie granulki do środka naczynia. Zbierz komórki do stożkowej probówki sokoła o pojemności 15 ml i pozwól na naturalne osiadanie. Następnie delikatnie usunąć supernatant.
      UWAGA: Ze względu na swoje rozmiary, organoidy mogą być agregowane w środku, kilkakrotnie obracając szalkę Petriego w jednym kierunku o 90° w płaszczyźnie poziomej.
    4. Zawiesić i rozproszyć granulki na dwóch 10-centymetrowych szalkach Petriego, po 18 ml pożywki III na szalkę, a następnie delikatnie przenieść szalki do inkubatora, aby uniknąć agregacji komórek. Kontynuować hodowlę w pożywce III w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i zmieniać podłoże co tydzień. CRX ulegał ekspresji po 45 dniu i do 120 dnia mogliśmy wykryć zewnętrzny segment fotoreceptora.

2. Analiza ludzkich RO

  1. Analiza FACS
    1. Złóż trzy organoidy CRX-tdTomato i trzy organoidy pochodzące z H9 ES z szalek, używając naciętych końcówek o pojemności 1 ml. Umyj organoidy 1 ml wstępnie podgrzanego (w temperaturze pokojowej) DPBS.
    2. Przygotować bufor wytrawiający przez zmieszanie 0,25% roztworu trypsyny-EDTA z 0,05 mg/ml odczynnika D.
    3. Przeprowadzić dysocjację organoidów na pojedyncze komórki, stosując przygotowany bufor do wytrawiania przez 8 minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj tę samą objętość DPBS z 10% FBS i 0,05 mg/ml odczynnika D, aby dezaktywować reakcję.
    4. Lekko zawiesić i rozproszyć komórki, a następnie przefiltrować za pomocą sitka do komórek 100 μm i użyć systemu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) na linii lasera wzbudzającego 561 nm i filtrze 780/60 do analizy dodatnich sygnałów CRX-tdTomato.
      UWAGA: CRX początkowo ulega ekspresji w 45 dniu i zwiększa się wraz z dojrzewaniem organoidów. Do każdego testu używa się dziesięciu tysięcy komórek, dla każdego punktu czasowego wykonywane są co najmniej trzy powtórzenia.
  2. Kwantyfikacja intensywności fluorescencji RO
    1. Przygotuj żywotne organoidy losowo do obrazowania.
      UWAGA: Ustaw parametry i używaj tych samych filtrów i parametrów dla wszystkich monitorów intensywności fluorescencji.
    2. Przechwytuj obrazy i analizuj średnią intensywność fluorescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ).
    3. Zaimportuj obrazy, a następnie przekonwertuj je na 8-bitowe za pomocą opcji Obraz | Rodzaj.
    4. Dostosuj próg, używając domyślnych parametrów według opcji Obraz | Dostosuj | Próg.
    5. Określ mierzony obszar, a następnie oceń wartość szarości za pomocą polecenia Analizuj | Środek.
      UWAGA: Średnie wartości w panelu wyników są średnią intensywnością fluorescencji mierzonego obszaru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczna ilustracja przedstawia protokół różnicowania w celu ulepszenia komórek prekursorowych za pomocą COCO (Rysunek 1). Od PSC po RO, wiele szczegółów może powodować różnice w wynikach. Zaleca się rejestrowanie każdego kroku, a nawet numeru katalogowego i numeru partii każdego nośnika, aby śledzić całą procedurę.

Niniejszym udostępniamy obrazy jasnego pola dla dni 6, 12, 18 i 45 (Rysunek 2). W dniu 6 organoidy mają zwykle średn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie organoidów siatkówki jest pożądaną metodą wytwarzania obszernych funkcjonalnych komórek siatkówki. RO jest złożeniem różnych komórek siatkówki, takich jak komórki zwojowe, komórki dwubiegunowe i fotoreceptory, generowanych przez pluripotencjalne komórki macierzyste w kierunku siatkówki nerwowej 4,5,8,9. Chociaż można zbierać zlewające się RO, jest to czasochłonne, co może wymagać d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium 502 za wsparcie techniczne i pomocne komentarze dotyczące manuskryptu. Prace te były częściowo wspierane przez Miejską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (Z200014) oraz Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFA0105300).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolLife Technologies21985-023
COCOR& D Systems3047-CC-050DAN Domena rodzina antagonistów BMP
DEM/F-12Gibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
Płodowa surowica bydlęca (FBS), zakwalifikowana do ludzkich embrionalnych komórek macierzystychPrzemysł biologiczny04-002-1A
GMEMGibco11710-035
Zamiennik surowicy KnockOut - wielogatunkowyGibcoA3181502
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100X)sigmaM7145
Pen StrepGibco15140-122
Primesurface 96 V-plateSbioMS9096SZAgregacja komórek w 1.2.7
PirogronianSigmaS8636
Odczynnik ABD356231Matrigel w 1.1.1
Odczynnik BStemCell5990mTeSR-E8, pożywka podstawowa PSC w 1.1.2
Odczynnik CGibco12563-011TrypLE Express w 1.2
Odczynnik DRoche11284932001DNaza I, w 1.2
Kwas retinowySigmaR2625-100MG
SAGEnzo Life ScienceALX-270-426-M001
Suplement 1Life Technologies17502-048Suplement N-2 (100X), płyn, suplement w medum III
TaurynaSigmaT-8691-25G
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200056dysocjacja organoidów w 2.1.3
Wnt Antagonista I, IWR-1-endo - CalbiochemInhibitor Sigma681669Wnt
Y-27632 2HClSelleckS1049

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
  2. Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
  3. Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  4. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  5. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  6. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).
  7. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  8. Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  9. Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  10. Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczepianie kom rek siatk wkiprekursory fotoreceptor wr nicowanie organoid wp cherzyk optycznyagregacja kom rekmodelowanie chor bprzesiew lek wekspresja CRX

Powiązane artykuły