Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Summary

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Abstract

Przeszczep komórek siatkówki jest obiecującym podejściem terapeutycznym, które mogłoby przywrócić architekturę siatkówki i ustabilizować lub nawet poprawić możliwości widzenia zdegenerowanej siatkówki. Niemniej jednak postęp w terapii zastępowania komórek stoi obecnie przed wyzwaniami związanymi z koniecznością posiadania gotowego źródła wysokiej jakości i standaryzowanych ludzkich siatkówk. Dlatego do eksperymentów potrzebny jest łatwy i stabilny protokół. Tutaj opracowujemy zoptymalizowany protokół, oparty na metodzie samoorganizacji z wykorzystaniem cząsteczek egzogennych i odczynnika A, a także ręcznym wycinaniu w celu wygenerowania trójwymiarowych organoidów ludzkiej siatkówki (RO). Ludzka RO pochodząca z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) wykazuje ekspresję specyficznych markerów dla fotoreceptorów. Dzięki dodatkowi COCO, wielofunkcyjnego antagonisty, znacznie zwiększa się skuteczność różnicowania prekursorów fotoreceptorów i czopków. Efektywne wykorzystanie tego systemu, który czerpie korzyści z linii komórkowych i komórek pierwotnych, bez problemów z zaopatrzeniem związanych z tymi ostatnimi, może wytworzyć zlewające się komórki siatkówki, zwłaszcza fotoreceptory. W związku z tym różnicowanie PSC do RO stanowi optymalną i biologicznie istotną platformę do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i przeszczepiania komórek.

Introduction

Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) charakteryzują się samoodnawianiem i zdolnością do różnicowania się we wszystkie rodzaje komórek somatycznych. W związku z tym organoidy pochodzące z PSC stały się ważnym zasobem w badaniach nad medycyną regeneracyjną. Zwyrodnienie siatkówki charakteryzuje się utratą fotoreceptorów (pręcików i czopków) oraz nabłonka barwnikowego siatkówki. Wymiana komórek siatkówki może być zachęcającym sposobem leczenia tej choroby. Nie jest jednak możliwe uzyskanie ludzkich siatkówk do badań i terapii chorób. Dlatego organoidy siatkówki (RO) pochodzące z PSC, które skutecznie i skutecznie rekapitulują wielowarstwowe natywne komórki siatkówk....

Protocol

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Tongren w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. H9 hESC uzyskano z Instytutu Badawczego WiCell i zmodyfikowano genetycznie do linii komórkowej znakowanej tdTomato.

1. Generowanie ludzkich RO

1. Hodowla hESC w warunkach wolnych od karmienia.
   1. Pokryć jedno zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml odczynnika A o stężeniu 0,1 mg/ml (tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez co najmniej pół godziny, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Rozmrozić podwielokrotność 1x10⁶ hESC.
      UWAGA: Przygotuj 3 ml wstę....

Results

Schematyczna ilustracja przedstawia protokół różnicowania w celu ulepszenia komórek prekursorowych za pomocą COCO (Rysunek 1). Od PSC po RO, wiele szczegółów może powodować różnice w wynikach. Zaleca się rejestrowanie każdego kroku, a nawet numeru katalogowego i numeru partii każdego nośnika, aby śledzić całą procedurę.

Niniejszym udostępniamy obrazy jasnego pola dla dni 6, 12, 18 i 45 (Rysunek 2). W dniu 6 organoidy mają zwykle średn.......

Discussion

Różnicowanie organoidów siatkówki jest pożądaną metodą wytwarzania obszernych funkcjonalnych komórek siatkówki. RO jest złożeniem różnych komórek siatkówki, takich jak komórki zwojowe, komórki dwubiegunowe i fotoreceptory, generowanych przez pluripotencjalne komórki macierzyste w kierunku siatkówki nerwowej 4,5,8,9. Chociaż można zbierać zlewające się RO, jest to czasochłonne, co może wymagać d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Life Technologies	21985-023
COCO	R& D Systems	3047-CC-050	DAN Domena rodzina antagonistów BMP
DEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Płodowa surowica bydlęca (FBS), zakwalifikowana do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych	Przemysł biologiczny	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
Zamiennik surowicy KnockOut - wielogatunkowy	Gibco	A3181502
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100X)	sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Agregacja komórek w 1.2.7
Pirogronian	Sigma	S8636
Odczynnik A	BD	356231	Matrigel w 1.1.1
Odczynnik B	StemCell	5990	mTeSR-E8, pożywka podstawowa PSC w 1.1.2
Odczynnik C	Gibco	12563-011	TrypLE Express w 1.2
Odczynnik D	Roche	11284932001	DNaza I, w 1.2
Kwas retinowy	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Suplement 1	Life Technologies	17502-048	Suplement N-2 (100X), płyn, suplement w medum III
Tauryna	Sigma	T-8691-25G
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Gibco	25200056	dysocjacja organoidów w 2.1.3
Wnt Antagonista I, IWR-1-endo - Calbiochem	Inhibitor Sigma	681669	Wnt
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049