Method Article

Specyfikacja CIPK14 Analiza funkcji genów w celu wyjaśnienia wydajnego systemu transgenicznego korzeni

DOI:

10.3791/62304

⸱

September 23rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Forestry, Beijing Forestry University, 2Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy jako przykład wydajny i stabilny system transformacji do analizy funkcjonalnej genu CcCIPK14, stanowiący techniczną podstawę do badania metabolizmu roślin niemodelowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydajny i stabilny system transformacji ma fundamentalne znaczenie dla badania funkcji genów i hodowli molekularnej roślin. W tym miejscu opisujemy zastosowanie systemu transformacji, w którym pośredniczy Agrobacterium rhizogenes, na grochu gołębim. Łodyga jest zakażona A. rhizogenes przenoszącym wektor binarny, który wywołał kalus po 7 dniach, a korzenie przybyszowe 14 dni później. Wygenerowany transgeniczny korzeń włochaty zidentyfikowano za pomocą analizy morfologicznej i genu reporterowego GFP. Aby jeszcze bardziej zilustrować zakres zastosowań tego systemu, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) przekształcono w groch gołębi przy użyciu tej metody transformacji. Rośliny transgeniczne potraktowano odpowiednio kwasem jasmonowym (JA) i kwasem abscysynowym (ABA) w celu zbadania, czy CcCIPK14 reaguje na te hormony. Wyniki wykazały, że (1) hormony egzogenne mogą znacznie zwiększać poziom ekspresjiCcCIPK14, zwłaszcza w roślinach z nadekspresją CcCIPK14 (OE); (2) zawartość genisteiny w liniach CcCIPK14-OE była istotnie wyższa niż w kontroli; (3) poziom ekspresji dwóch dalszych kluczowych genów syntazy flawonoidów, CcHIDH1 i CcHIDH2, był regulowany w górę w liniach CcCIPK14-OE; oraz (4) system transgeniczny owłosionych korzeni może być wykorzystany do badania metabolicznie funkcjonalnych genów w roślinach niemodelowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transformacja to podstawowe narzędzie do oceny ekspresji genów egzogennych1,2. Wiele biologicznych aspektów roślin zasobowych jest wspólnych dla wszystkich roślin; w związku z tym badania funkcjonalne niektórych genów można przeprowadzić w roślinach modelowych (takich jak Arabidopsis)3. Jednak wiele genów w roślinach jest unikalnych pod względem funkcji i wzorców ekspresji, co wymaga badań na ich własnych lub blisko spokrewnionych gatunkach, zwłaszcza w przypadku roślin zasobowych3,4. Komórki roślinne mogą wyczuwać różn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Groch gołębi to diploidalna roślina strączkowa należąca do rodziny bobowatych (Fabaceae). Nasiona grochu gołębiego użyte w tym eksperymencie pochodzą z Północno-Wschodniego Uniwersytetu Leśnictwa w Chinach i są oznaczone kodem 87119. Podstawowe kroki tego protokołu są zilustrowane w Rysunek 1A. Inkubację sadzonek przeprowadzono w środowisku o wysokiej wilgotności w temperaturze 25 °C pod lampami fluorescencyjnymi przy 50 μmol fotonów na m-2 s-1 w fotoperiodze trwającym 16 godzin. W laboratorium zachowały się szczepy A. rhizogenes K599 (NCPPB2659). Przechowywano je w pożywce drożdżowo-mannitol....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. rhizogenes -pośredniczyła przemiana owłosionego korzenia na grochu gołębi
W badaniu tym opisano krok po kroku protokoły transformacji genetycznej owłosionych korzeni, w której pośredniczy A. rhizogenes, co ma znaczenie w dziedzinie cząsteczek roślinnych. Potrzeba było około 5 tygodni, aby uzyskać owłosione korzenie z korzeni grochu gołębiego zainfekowanego przez A. rhizogenes. Rysunek 1A pokazuje przegląd ca.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybka charakterystyka funkcji genów jest wspólnym celem w badaniu większości gatunków i jest szczególnie ważna dla rozwoju roślin zasobowych. Transformacja, w której pośredniczy A. rhizogenes, jest szeroko stosowana w kulturach owłosionych korzeni. Kultura owłosionych korzeni (HRC), jako unikalne źródło produkcji metabolitów, odgrywa kluczową rolę w inżynierii metabolicznej 18,28. Zastosowanie tej technologii ogranicza się głównie do funkcji genów i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31800509, 31922058), Outstanding Young Talent Fund in Beijing Forestry University" (2019JQ03009), Funduszy Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (2021ZY16), Beijing Municipal Natural Science Foundation (6212023) oraz National Key R&D Program of China (2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) oraz Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Projekt molekularny. Pragnę podziękować Zhengyang Hou za jego wskazówki podczas pisania artykułu oraz profesorowi Meng Dong za wskazówki dotyczące idei artykułu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka qPCR 0,1 ml z 8 paskami (z nasadkami optycznymi)KIRGEN, Szanghaj, ChinyKJ2541
ABASolarbio Life Science, Pekin, ChinyA8060
Agar w proszkuSolarbio Life Science, Pekin, ChinyA8190
WirówkaOsterode am Harz, Niemcyd37520
Moduł optyczny CFX Connect TWBio-rad, USA1855200
inkubator stałotemperaturowySzanghaj Boxun Przemysł i Commerce Co., Ltd, Szanghaj, ChinyBPX-82
Jednorazowa szalka PetriegoCorning, amerykańska
sucha kąpielGingko Bioscience Company/Coyote bioscience, ChinyH2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50Promega, Pekin, ChinyLS1030
Waga elektronicznaTianjin, ChinyTD50020
PapafiltracyjnaHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, Chiny
FiveEasy PlusMettler Toledo, Szanghaj, Chińska Republika Ludowa30254105
Doniczka 9*9Chiny
JASolarbio Life Science, Pekin, ChinyJ8070
KanSolarbio Life Science, Pekin, ChinyK8020
MagicSYBR MixtureCWBIO, Pekin, Chiny
Mini mikrowirówkaScilogex, Pekin, ChinyS1010E
NaClSolarbio Life Science, Pekin, ChinyS8210
NanPhotometer N50 TouchIMPLEN GMBH, NiemcyT51082
Purelab untra
RifampicinSolarbio Life Science, Pekin, ChinyR8010
Skrzynka na sadzonki 30*200China
Thermal  Rowerzysta  PCRBio-rad, oscylatorT100
Donglian Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd, ChinyDLHE-Q200
Tomy AutoclaveTomy, JaponiaSX-500
TryptoneSolarbio Life Science, Pekin, ChinyLP0042
UEIris II RT-PCR System do syntezy pierwszej nici cDNA (z dsDNazą)US Everbright INC, Jiangsu, ChinyR2028
Ekstrakt drożdżowy w proszkuSolarbio Life Science, Pekin, ChinyLP0021
CW3008M termostatyczny US

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poland, J. A., Rife, T. W. Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. The Plant Genome. 5 (3), (2012).
  2. Barabaschi, D., et al. Next generation breeding. Plant Science. 242, 3-13 (2016).
  3. Petri, C., Webb, K., Hily, J. -M., Dardick, C., Scorza, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CcCIPK14 GeneHairy Root TransformationAgrobacterium RhizogenesPigeon PeaTransgenic Hairy RootGene Function AnalysisJasmonic Acid TreatmentAbscisic Acid ResponseFlavonoid Synthase GenesGenistein Content
Video Coming Soon

Related Articles