Tutaj opisujemy prosty protokół do generowania profili odcisków palców DNA poprzez amplifikację locus VNTR D1S80 z DNA komórki nabłonkowej.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie odcisków palców DNA przy użyciu locus D1S80 w klasach laboratoryjnych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W naukach biologicznych, odciski palców DNA są szeroko stosowane do testów na ojcostwo, zastosowań kryminalistycznych i badań filogenetycznych. W tym miejscu opisujemy wiarygodną i solidną metodę genotypowania osób za pomocą analizy zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) w kontekście zajęć laboratoryjnych na studiach licencjackich. Ludzki locus VNTR D1S80 jest używany w tym protokole jako wysoce polimorficzny marker oparty na zmienności liczby powtarzających się sekwencji.
Ten prosty protokół dostarcza użytecznych informacji dla nauczycieli i implementacji odcisków palców DNA w praktycznych zajęciach laboratoryjnych. W prezentowanym ćwiczeniu laboratoryjnym ekstrakcję DNA, a następnie amplifikację PCR stosuje się w celu określenia zmienności genetycznej w locus D1S80 VNTR. Różnice w wielkości fragmentów produktów PCR są uwidocznione za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Rozmiary fragmentów i liczby powtórzeń są obliczane na podstawie regresji liniowej wielkości i odległości migracji wzorca wielkości DNA.
Postępując zgodnie z tym przewodnikiem, uczniowie powinni być w stanie:
• Zbierz i wyekstrahuj DNA z komórek nabłonka błony śluzowej policzka
• Przeprowadzenie eksperymentu PCR i zrozumienie funkcji różnych składników reakcji
• Analiza amplikonów metodą elektroforezy w żelu agarozowym i interpretacja wyników
• Zrozumienie zastosowania VNTR w odciskach palców DNA i ich zastosowania w naukach biologicznych
Wprowadzenie
Molekularny odcisk palca, zwany również odciskiem palca DNA, został wprowadzony przez Sir Aleca Jeffreysa podczas pracy na Wydziale Genetyki Uniwersytetu w Leicester w 1984 roku1. Opiera się na 0,1% ludzkiego genomu, który różni się u poszczególnych osób i składa się z około trzech milionów wariantów. Te unikalne różnice w genotypie pozwalają na różnicowanie osobników i dlatego mogą funkcjonować jako genetyczny odcisk palca, z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych. W związku z tym odciski palców DNA są wykorzystywane do oceny pokrewieństwa różnych osób, co jest stosowane na przykład w testach na ojcostwo lub w badaniach różnorodności populacji. Na naszych zajęciach laboratoryjnych staraliśmy się przekazać koncepcję odcisków palców DNA i częstości alleli. Opisana tutaj metoda demonstruje wiarygodną i solidną metodę genetycznego odcisku palca poprzez analizę zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) w locus D1S80. Metoda polega na ekstrakcji DNA z komórek nabłonka błony śluzowej policzka, a następnie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu amplifikacji locus D1S80, a następnie wizualizacji różnic długości fragmentów na żelu agarozowym.
Locus minisatelity VNTR D1S80 jest bardzo zmienny i znajduje się w regionie telomerowym chromosomu 1 (1p36-p35). Został zidentyfikowany i opisany przez Karsai i współpracowników w 1990 roku jako locus z jednostką powtórzeń rdzenia wynoszącą 16 pz, co pozwala na rozdzielenie alleli różniących się tylko jedną jednostką2. Co więcej, D1S80 wykazuje wysoki stopień zmienności z częstością mutacji około 7,77 x 10-5 3. D1S80 ma wysoki stopień heterozygotyczności4,5 (np. 80,8% heterozygotyczności dla rasy kaukaskiej6 i do 87% heterozygotyczności dla Afroamerykanów7). Ponadto locus D1S80 jest polimorficzny w większości populacji, z zazwyczaj ponad 15 różnymi allelami niosącymi od 14 do 41 powtórzeń każdy. Częstość występowania alleli D1S80 różni się w zależności od populacji. Allel z 24 powtarzającymi się jednostkami (allel 24) występuje najczęściej w populacjach europejskich i azjatyckich, podczas gdy allel 21 występuje najczęściej w populacjach afrykańskich4,7,8,9,10. W związku z tym rozkłady częstości alleli są diagnostyczne dla różnych populacji ludzkich i muszą być brane pod uwagę przy szacowaniu pokrewieństwa (np. w testach na ojcostwo).
Amplifikacja locus D1S80 VNTR oparta na PCR była bardzo przydatną metodą w kryminalistyce, testach na ojcostwo, analizie chorób i badaniach różnorodności populacji11,12,13,14. Podczas gdy obecnie w kryminalistyce użycie VNTR zostało zastąpione krótkimi powtórzeniami tandemowymi, locus VNTR D1S80 jest szeroko stosowany w określaniu pochodzenia i powiązań genetycznych między populacjami4,8,9,11. Ponadto jest często używany do nauczania odcisków palców DNA na praktycznych zajęciach laboratoryjnych15,16. Opisana tutaj metoda stanowi solidną, opłacalną i łatwą w użyciu metodę o bardzo wysokim wskaźniku sukcesu na zajęciach laboratoryjnych na studiach licencjackich. Celem tego artykułu jest przedstawienie przeglądu przepływu pracy w analizie molekularnej ludzkiego locus minisatelitarnego D1S80 z komórek nabłonka błony śluzowej policzka. Zawiera demonstrację technik, uproszczone protokoły i praktyczne sugestie opisane we wcześniej opublikowanych pracach2,17.
Protokół
UWAGA: Ten protokół może być używany tylko wtedy, gdy studenci lub odpowiedni opiekunowie prawni wyrazili zgodę na przeprowadzenie tego protokołu, ponieważ profile genotypowe dają wgląd w powiązania genetyczne. Odciski palców DNA są powszechną metodą biologii molekularnej stosowaną głównie w badaniach populacyjnych i sprawach kryminalistycznych. Dlatego należy zwrócić uwagę na to, aby ryzyko zanieczyszczenia było jak najniższe. Aby uniknąć zanieczyszczenia próbki DNA z zewnętrznego źródła lub DNaz, należy nosić rękawice, narzędzia należy dokładnie wyczyścić lub wysterylizować, a roztwory należy wysterylizować filtrem lub autoklawować przed użyciem.
1. Pobieranie komórek nabłonka błony śluzowej policzków
UWAGA: Praca ze śliną i komórkami nabłonkowymi może prowadzić do przenoszenia chorób zakaźnych. W związku z tym należy stosować standardowe środki ostrożności i środki ostrożności związane z przenoszeniem zakażenia (np. stosowanie odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej).
UWAGA: Dołącz kontrolę pozytywną, która jest dostarczana przez instruktora (np. DNA ekstrahowane przez instruktora) i włączana do dalszych etapów przetwarzania.
- Odczekaj co najmniej 1 godzinę po jedzeniu lub umyciu zębów przed pobraniem próbki.
- Oznacz pustą i sterylną probówkę do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml.
- Wyjmij jeden sterylny wacik policzkowy z opakowania i energicznie wcieraj w wewnętrzną stronę policzka przez 30-40 razy lub 30-40 sekund, aby pobrać komórki nabłonka błony śluzowej policzka.
- Umieść końcówkę wacika do pobierania w uprzednio oznaczonej sterylnej probówce do mikrowirówki i odłam kawałek plastiku, który wystaje poza krawędź, ręcznie lub za pomocą sterylnych nożyczek.
- Umieść nakrętkę bezpiecznie na probówce, uszczelniając wacik do środka.
2. Ekstrakcja genomowego DNA z komórek ludzkich
- Przed ekstrakcją należy ustawić mieszalnik termiczny lub blok grzewczy na 65 °C w celu lizy próbki.
UWAGA: Niektóre stosowane chemikalia są klasyfikowane jako niebezpieczne. Przeczytaj uważnie kartę charakterystyki i podejmij odpowiednie środki bezpieczeństwa przed obsługą.- Przygotować i wysterylizować przez filtrowanie lub autoklawowanie wszystkich wymaganych i roztworów (roztwór do lizy, 8 M octan potasu, 2-propanol, 70% etanol i bufor elucyjny).
UWAGA: Wszystkie etapy wirowania należy wykonywać w temperaturze pokojowej (20-30 °C), chyba że określono inaczej.
- Przygotować i wysterylizować przez filtrowanie lub autoklawowanie wszystkich wymaganych i roztworów (roztwór do lizy, 8 M octan potasu, 2-propanol, 70% etanol i bufor elucyjny).
- Dodać 500 μl roztworu do lizy (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA); 2% dodecylosiarczanu sodu (SDS)) do wymazu z policzka, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze do lizy.
- Wiruj energicznie przez co najmniej 5 s.
- Próbki inkubować w temperaturze 65 °C w mieszalniku termicznym przez 10 minut.
- Mieszać próbkę 3-4 razy przez wirowanie impulsowe przez 5 s podczas inkubacji.
- Wyjmij wacik z buforu do lizy, dociśnij wacik do wnętrza probówki, aby uzyskać maksymalną objętość próbki.
- Dodać 100 μl 8 M octanu potasu do zlizowanych komórek.
- Dokładnie wymieszaj, odwracając probówkę, aż pojawi się biały osad.
- Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odwirować próbkę przez 5 minut przy 18 000 x g.
- Przenieść 450 μl supernatantu do czystej i sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Dodać 450 μl 2-propanolu i dokładnie wymieszać, odwracając probówkę (wytrącanie DNA).
- Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Wirować przez 5 minut przy 18 000 x g.
- Wyrzucić supernatant i odwrócić probówkę na czystym ręczniku papierowym, aby wysuszyć osad i uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
- Inkubować DNA przez 5 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym, aby całkowicie wysuszyć osad.
- Aby przepłukać DNA, dodaj 500 μl 70% etanolu.
- Wirować przez 1 minutę przy 18 000 x g.
- Wyrzuć supernatant i odwróć probówkę na czystym ręczniku papierowym, aby wysuszyć osad.
- Dodać 30 μl buforu do respensji (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) do osadu.
- Inkubować DNA przez 10 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym w celu inaktywacji DNaz.
3. Wzmacnianie locus VNTR D1S80 za pomocą PCR
UWAGA: Zapisz liczbę próbek, które zostaną użyte i przygotuj arkusz z wymaganymi odczynnikami i ich objętościami przed zebraniem niezbędnych tworzyw sztucznych i innych materiałów. Oznacz sterylne probówki/paski/płytki, które mają być użyte do PCR, numerami próbek. Pamiętaj, aby uwzględnić kontrolę ujemną przy użyciuH2Ozamiast DNA oraz kontrolę pozytywną (np. przy użyciu DNA dostarczonego przez instruktora) w celu walidacji PCR.
- Przygotować 1x główną mieszaninę PCR zawierającą 10 μL 5x buforu reakcyjnego PCR (zawierającego 15 mM MgCl2), 1 μL trifosforanu deoksyrybonukleotydu (dNTPs) (10 mM), 5 μL (10 pmol) każdego startera pMCT118-f i pMCT118-r (naprzód - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3', odwrotnie - 5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3') zgodnie z Kasai et al.2, 23,8 μl ultraczystegoH2Oi 0,2 μl polimerazy DNA Taq (5 U/μL).
UWAGA: Startery pMCT118-f/pMCT118-r zostały zaprojektowane w obszarach flankujących region VNTR D1S80, wzmacniając całe locus. - Oznacz probówki/paski/płytkę PCR numerami próbek, które mają być użyte.
- Porcję 45 μl mieszanki wzorcowej do każdej znakowanej probówki z próbką PCR lub studzienki.
- Dodać 5 μl matrycy DNA do mieszanki wzorcowej w każdej probówce/płytce PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl. Zmień końcówkę pipety dla każdej próbki DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
- Uwzględnij kontrolę bez matrycy (NTC) przy użyciu ultraczystegoH2Ozamiast DNA.
- Zamknij probówki/paski PCR lub płytkę uszczelniającą i wymieszaj.
- Odwiruj probówki/paski/płytki PCR przez 20 s za pomocą wirówki stołowej.
UWAGA: Warunki PCR podane w tym protokole zostały zoptymalizowane przy użyciu polimerazy DNA i zastosowanego termocyklera PCR. Ogólnie rzecz biorąc, warunki PCR muszą być dostosowane do polimerazy DNA. Standardowy czas przedłużenia dla polimerazy DNA Taq wynosi 1 min/kb. - Umieścić probówki/paski/płytkę z próbką w termocyklerze i inkubować reakcje w następujących warunkach (czas wydłużania polimerazy DNA): 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 2 minuty; 25 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 s, 60 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s; 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
- Po zakończeniu programu wyjmij produkty z termocyklera i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc lub -20 °C do elektroforezy.
4. Elektroforeza w żelu agarozowym produktów PCR
- Przygotuj 1,5% żel agarozowy.
- Użyj 1,5 g proszku agarozy i wymieszaj go ze 100 ml 1x roztworu buforowego tris-octanu-EDTA (TAE) w kolbie.
- Podgrzewaj mieszaninę przez około 1,5-2 minuty w kuchence mikrofalowej (600 W). Zakręć zawartością i ponownie podgrzej, jeśli to konieczne, aby całkowicie rozpuścić agarozę. Lekko ostudzić i dodać 2 μl PeqGreen do agarozy.
- Wlać żel do formy za pomocą grzebienia z wystarczającą ilością dołków dla wszystkich próbek i dodać co najmniej jeden marker masy cząsteczkowej.
UWAGA: Może wystąpić opóźnienie wrzenia. Ostrożnie wstrząsnąć kolbą podczas ponownego zawieszania agarozy, która nie została jeszcze rozpuszczona.
UWAGA: PeqGreen to nietoksyczny barwnik do wykrywania kwasów nukleinowych. Ma zastosowanie do barwienia dwuniciowego DNA (dsDNA) i jednoniciowego DNA (ssDNA), a także RNA. Czułość jest porównywalna z bromkiem etydyny.
- Wyjąć produkty PCR z 4 °C i wirować przez około 10 sekund.
- Załadować dołki żelu próbką o objętości 10 μl. Nie przeciążaj żelu.
UWAGA: Bufor polimerazy DNA zawiera również związki, które zwiększają gęstość próbki, dzięki czemu próbki można ładować bezpośrednio do żeli bez konieczności stosowania barwnika ładującego. Dzięki temu próbka może zanurzyć się w studzience, a barwniki pomagają śledzić, jak daleko próbka DNA migrowała.- Dodać wzorzec masy cząsteczkowej do dołków bocznych (najlepiej wzorzec masy cząsteczkowej 50 pz).
UWAGA: Pozostałe próbki PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C na wypadek konieczności powtórzenia elektroforezy w żelu agarozowym.
- Dodać wzorzec masy cząsteczkowej do dołków bocznych (najlepiej wzorzec masy cząsteczkowej 50 pz).
- Uruchom żel w 1x buforze TAE przy napięciu 150 V (stałym) przez około 40 minut lub do momentu, gdy dolny żółty czoło barwnika, który przemieszcza się pod ciśnieniem około 50 pz, dotrze do dolnego końca żelu.
- Zobrazuj żel, gdy stosowane jest światło niebieskie lub światło ultrafioletowe (UV) i zapisz obraz do analizy długości fragmentu.
UWAGA: Światło UV może uszkodzić oczy i skórę. Zawsze noś odzież ochronną i okulary ochronne UV podczas korzystania z kasetonu UV. - Żel należy utylizować zgodnie z instytucjonalną polityką dotyczącą materiałów niebezpiecznych.
5. Analiza wyników długości fragmentów
UWAGA: Użyj analizy regresji liniowej, aby oszacować długość fragmentów.
- Aby zaformatować fragmenty PCR D1S80, umieść linijkę na zdjęciu żelu nad standardowym pasem o masie cząsteczkowej 50 pz, tak aby górna część linijki pokrywała się z dnem studzienki, do której załadowano próbkę (Rysunek 1).
UWAGA: Do obliczenia równania regresji liniowej dla wzorca masy cząsteczkowej (wzorca masy cząsteczkowej 50 pz) użyto programu arkusza kalkulacyjnego. - Zapisz odległość od dołka (np. w cm) dla każdego pasma wzorca masy cząsteczkowej 50 pz w tabeli za pomocą programu arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2).
- Określ logarytm (np. podstawę 10) każdego rozmiaru fragmentu wzorca masy cząsteczkowej 50 pz i wprowadź wartości logarytmu do tabeli (Rysunek 2).
- Wykreślić każdy punkt danych na wykresie z logarytmem rozmiarów pasm na osi pionowej (oś y) i zmierzoną odległością biegu od góry żelu do każdego pasma wzorca masy cząsteczkowej na osi poziomej (oś x) za pomocą wykresu rozrzutu (Rysunek 3).
- Dopasuj linię trendu (linię regresji liniowej) i pokaż równanie regresji (y = ax + b) oraz wartość R2 na wykresie (Rysunek 4).
- Zmierz przebytą odległość (np. w cm) dla każdego amplikonu D1S80 (Rysunek 5).
- Oszacuj rozmiar każdego amplikonu D1S80 za pomocą równania regresji: y = ax + b
gdzie y = logarytm rozmiaru fragmentu
a = nachylenie linii (obliczone w pkt 5)
x = odległość od studni (w cm)
b = punkt, w którym linia regresji przecina oś y (obliczona w punkcie 5)
UWAGA: Ponieważ wartość y reprezentuje logarytm rozmiaru fragmentu, antylog (10y) musi zostać obliczony, aby uzyskać rozmiar fragmentu w bp amplikonów D1S80.
6. Oszacowanie liczby powtarzających się jednostek w allelach badanych osób
UWAGA: Jednostka powtórzeniowa D1S80 ma długość 16 punktów bazowych. Najmniejszy znany allel dla D1S80 ma 14 powtórzeń. Opisany tutaj schemat amplikonów tworzy amplikony z obszarami flankującymi, które dodają dodatkowe 145 pz do ostatecznego rozmiaru.
- Skorzystaj z tabeli 1, aby oszacować, ile powtarzających się jednostek jest zawartych w każdym fragmencie PCR. Wielkość ekstrapolowana za pomocą regresji liniowej powinna mieścić się w granicach 8 pz od dowolnego konkretnego allelu.
- Zapisz genotyp każdego badanego osobnika jako kombinację liczb powtórzeń alleli .
Wyniki
Zgodnie z opisanym protokołem przeprowadzono analizę markera VNTR D1S80 w ludzkim DNA genomicznym wyizolowanym z komórek nabłonka błony śluzowej policzków pobranych za pomocą wymazu (Rysunek 6). Po amplifikacji metodą PCR, typowy obraz żelu agarozowego zawierającego amplikony D1S80 przedstawiono na Rynku 1. Ścieżka 1 przedstawia marker masy cząsteczkowej 50 bp. Obok markera masy cząsteczkowej widoczne są produkty PCR z ośmiu próbek studenckich. Ścieżka 10 przedstawia NTC, w której zamiast matrycy DNA użyto wody. Większość analizowanych próbek wyraźnie wykazuje dwa prążki, co reprezentuje osoby heterozygotyczne dla locus D1S80. Ścieżka 2 i ścieżka 9 wykazują pojedynczy prążek, co reprezentuje osoby homozygotyczne dla locus D1S80. Ścieżka 5 wykazuje niejednoznaczny pojedynczy prążek, który jest znacznie szerszy w porównaniu z pozostałymi prążkami. Może to być wynik obecności dwóch alleli D1S80 różniących się tylko jedną jednostką powtórzenia. W dalszej analizie próbka w ścieżce 5 zostanie uznana za pojedynczy prążek, reprezentujący osobę homozygotyczną.
Do określenia wielkości fragmentów locus VNTR D1S80 w próbkach pochodzących od różnych studentów wykorzystano analizę fragmentów produktów PCR za pomocą elektroforezy żelowej. Interpretacja wielkości amplikonów uzyskanych w analizie PCR opiera się na zastosowanym standardzie masy cząsteczkowej. Zmierzono (Rycina 1) i odnotowano (Rycina 2) odległość od studzienki dla każdego prążka standardu masy cząsteczkowej. Na podstawie wielkości i dystansu migracji można obliczyć wielkość poszczególnych prążków, stosując analizę regresji liniowej. Dla każdego prążka w próbkach studentów wyznaczono logarytm (dziesiętny) (Rycina 5), a odpowiadający mu antylogarytm reprezentuje liczbę bp dla każdego amplikonu. Liczbę jednostek powtórzeń można obliczyć na podstawie uzyskanej wielkości amplikonu (Tabela 2).
Dla każdej próbki studenckiej rozmiary amplikonów obliczono za pomocą regresji liniowej, a każdą prążek można było łatwo przypisać do konkretnego allelu, jak pokazano w Tabeli 2. Informacje o rozmiarach alleli D1S80 można następnie wykorzystać do określenia częstości występowania alleli w małej podgrupie populacji studentów studiów licencjackich. Allel z 28 powtórzeniami jest najczęstszy wśród studentów ze względu na dwie osoby homozygotyczne pod kątem tego allelu powtórzeń (osoby 1 i 4). Drugim najczęstszym allelem jest allel z 18 powtórzeniami, który jest noszony przez homozygotyczną osobę 8 oraz heterozygotyczną osobę 6. Allelami o niskiej częstości są allele z 21, 26 i 30 powtórzeniami, znalezione odpowiednio tylko raz u osób 6, 5 i 3. Wzorce częstości alleli loci VNTR D1S80 małej populacji studentów można następnie porównać z częstością alleli w większych populacjach ludzkich, na przykład w populacjach pochodzących z różnych kontynentów4,7,8,9,10.
Wśród studentów osoby 2 i 3 posiadają wspólny allel z 24 powtórzeniami, osoby 2 i 7 wspólny allel z 20 powtórzeniami, a osoby 5 i 7 wspólny allel z 23 powtórzeniami. Co ciekawe, dwie osoby homozygotyczne pod lokusem D1S80 (osoba 1 i 4) posiadają wspólny allel z 28 powtórzeniami. Dopasowanie alleli między dwiema osobami może wskazywać na potencywne pokrewieństwo. Jednak wspólne allele mogą wystąpić również przypadkowo. Dlatego kluczowe jest określenie prawdopodobieństwa dopasowania alleli między dwiema osobami. Prawdopodobieństwo to zależy od częstości występowania poszczególnych alleli w populacji ogólnej, a do nadania wagi statystycznej analizie markerów VNTR należy zastosować podejścia statystyczne, takie jak podejście bayesowskie. Podsumowując, zaprezentowana metoda tworzenia odcisków genetycznych może być wykorzystana w praktycznych zajęciach dydaktycznych do nauki wykorzystania VNTR w analizie DNA oraz ich zastosowań w naukach biologicznych.
Rycina 1: Przedstawienie żelu agarozowego po elektroforezie produktów amplifikacji D1S80 z linijką umieszczoną obok ścieżki ze standardem masy cząsteczkowej 50 bp. Ścieżka 1 zawiera standard masy cząsteczkowej 50 bp, natomiast ścieżki 2-9 zawierają produkty reakcji PCR. Ścieżka 10 zawiera kontrolę bez matrycy (NTC). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Wyznaczenie dystansu migracji fragmentów DNA oraz logarytmu wielkości każdego fragmentu standardu mas cząsteczkowych 50 bp. Odległość od studzienki (w cm) dla każdego prążka standardu mas cząsteczkowych 50 bp zostaje zapisana, a następnie oblicza się logarytm (podstawą 10) dla każdego fragmentu. Wartości wprowadza się do tabeli w programie arkusza kalkulacyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Wykres punktowy przedstawiający zależność odległości migracji fragmentów DNA standardu masy cząsteczkowej na osi x od logarytmu (podstawa 10) wielkości każdego fragmentu na osi y. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Wykorzystanie linii regresji liniowej i równania regresji, a także wartości R2 dla danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Wyznaczanie wielkości amplikonów D1S80. Odległość od dołka dla każdego fragmentu jest wprowadzana do równania regresji. Antylogarytm wartości y reprezentuje wielkość fragmentu w bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Sugerowany harmonogram i przebieg analizy VNTR D1S80. Cała procedura analizy VNTR D1S80 przedstawiona w niniejszym opracowaniu, od pobrania komórek nabłonka policzka po ocenę długości fragmentów, może zostać wykonana w ciągu jednego dnia roboczego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Wielkość allelu (w bp) | Liczba powtórzeń |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabela 1: Wielkość amplikonu dla każdego locus VNTR D1S80.
| Osobnik | Allele | Odległość (w cm) | Rozmiar (w bp) | Liczba jednostek powtórzeń |
| 1 | homozygota | 5 | 600 | 28 |
| 2 | heterozygota | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | heterozygota | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homozygota | 5 | 600 | 28 |
| 5 | heterozygota | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | heterozygota | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | heterozygota | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homozygota | 5.6 | 435 | 18 |
Tabela 2: Skład alleliczny badanych osobników. Liczbę jednostek powtórzeń można przybliżyć na podstawie wielkości amplikonu uzyskanej za pomocą analizy regresji liniowej.
Dyskusja
W tym miejscu opisaliśmy prostą i opłacalną metodę wdrażania odcisków palców molekularnych na zajęciach praktycznych na studiach licencjackich.
Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem zmienności genetycznej w locus D1S80 , wymagane jest pobranie próbki biologicznej człowieka wraz z ekstrakcją i analizą DNA. Istotne jest, aby w całym procesie zapewnione było etyczne wykorzystanie ludzkich próbek biologicznych. Zarządzanie próbkami jest kontrolowane w ramach kompleksowych ram regulacyjnych, które zapewniają prawidłowe wykorzystanie próbek i związanych z nimi danych18 (np. zgoda na wykorzystanie ludzkiego materiału biologicznego). Uczestnicy muszą być odpowiednio poinformowani o wykorzystaniu ich próbek, ryzyku wykrycia nieprawidłowości w relacjach genetycznych (np. w odniesieniu do osób spokrewnionych), ochronie prywatności oraz zamiarach dotyczących przyszłego przechowywania próbek i danych biologicznych. Wszyscy darczyńcy (studenci lub współpracownicy) muszą dobrowolnie wyrazić zgodę i rozumieją prawo do wycofania się bez podania przyczyny. Ogólnie rzecz biorąc, przed przeprowadzeniem tych zajęć laboratoryjnych konieczne jest zapoznanie się z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi zarządzania próbkami pobranymi od ludzi.
W przypadku pobierania komórek nabłonka błony śluzowej błony śluzowej policzków na studiach laboratoryjnych na studiach licencjackich należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek DNA DNA DNA od operatora lub DNazami. Zaleca się, aby zawsze używać fartuchów laboratoryjnych, rękawic i okularów ochronnych, a także sterylnych wacików i probówek do mikrowirówek. Pobieranie komórek z wymazu z policzka jest uważane za wygodną i opłacalną metodę pobierania materiału genetycznego odpowiedniego do analizy VNTR opartej na PCR, ponieważ jest stosunkowo niedrogie i nieinwazyjne. Oprócz wymazów z policzków, ślina jest najczęstszą metodą pobierania próbek doustnych w badaniach medycznych. Wykazano, że wymazy z policzków zawierają większą ilość komórek nabłonkowych niż ślina, co czyni je bardziej wiarygodnymi w dostarczaniu wystarczającej ilości i jakości DNA do analizy VNTR D1S80 opartej na PCR19,20. Dodatkowo, wymazy z policzków mogą być wysyłane pocztą po samodzielnym pobraniu, pokonując przeszkody geograficzne, gdy są stosowane, na przykład, w badaniach różnorodności populacji21.
Ekstrakcja DNA stała się stosunkowo łatwa dzięki rozwojowi zestawów do ekstrakcji różnych firm. Niemniej jednak korzystanie z tych zestawów może nie być odpowiednie na zajęciach laboratoryjnych ze względu na ograniczone środki finansowe. W tym miejscu przedstawiliśmy łatwą, szybką i ekonomiczną metodę ekstrakcji DNA z próbek ludzkich bez konieczności korzystania z dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA. Opisana metoda ekstrakcji DNA nie wykorzystuje rozpuszczalników organicznych, zamiast tego białka komórkowe są usuwane poprzez zwiększenie stężenia soli za pomocą 8 M roztworu octanu potasu. Metoda ta pozwala również na przetwarzanie kilku próbek jednocześnie i pozwala uzyskać wystarczającą ilość DNA do przeprowadzenia kilku analiz genotypu dla każdej próbki.
PCR jest powszechną techniką w wielu laboratoriach molekularnych. Chociaż na ogół przebiega bezproblemowo, istnieją pułapki, które mogą skomplikować reakcję, powodując fałszywe wyniki, które zostały omówione w innym miejscu22. Przedstawione tutaj warunki PCR wydawały się bardzo odporne w obliczu niskiej jakości matrycowego DNA, ale mimo to czasami obserwowano brak amplifikacji PCR w przypadku stosowania matryc o wyjątkowo niskich stężeniach DNA z powodu słabego pobierania komórek nabłonka policzkowego. Startery DNA użyte w tym badaniu można zamówić w różnych firmach, takich jak te wymienione w tabeli materiałów na końcu tego artykułu. Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy ze starterami DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia DNazami lub DNA przez operatora. Produkty PCR powinny być również przechowywane w niskiej temperaturze, gdy nie są używane.
Kolejnym krytycznym etapem jest elektroforeza w żelu agarozowym. Fragmenty różniące się tylko o jedną powtarzającą się jednostkę 16 pz mogą nie zostać rozdzielone w elektroforezie żelowej i dlatego pojawiają się jako pojedyncze pasmo. W takim przypadku nie można zapewnić prawidłowego określenia liczby powtarzających się jednostek badanych alleli D1S80 . Dlatego czas pracy żelu powinien zostać zwiększony, podczas gdy napięcie musi zostać zmniejszone, a stężenie żelu może zostać zwiększone, aby zapewnić lepszą rozdzielczość i separację pojedynczych pasm.
Warto wspomnieć, że nie wszystkie allele locus VNTR zawierają pełne jednostki powtórzeń. Niezgodne allele (mikrowarianty), które zawierają niekompletne jednostki powtórzeń, są powszechne w większości loci VNTR, a ich rozmiary mieszczą się pomiędzy rozmiarami alleli z pełnymi jednostkami powtórzeń. Te mikrowarianty są ledwo wykrywalne przez elektroforezę w żelu agarozowym. W przeciwieństwie do tego, techniki takie jak żele poliakryloamidowe lub elektroforeza kapilarna mogą rozdzielić allele, które różnią się od jednej do kilku powtarzających się jednostek lub mikrowariantów 12,23,24,25,26. Jednak te ostatnie techniki są mniej odpowiednie dla zajęć laboratoryjnych na studiach licencjackich, ponieważ mają wiele wad, w tym stosowanie niebezpiecznych związków, skomplikowane przygotowanie i brak sprzętu. W celu określenia wielkości fragmentu należy zachować szczególną ostrożność podczas pomiaru odległości migrowanych fragmentów DNA. Jeśli prążki są zbyt rozproszone, aby można je było dokładnie zmierzyć, obliczenie wielkości fragmentu allelu D1S80 za pomocą regresji liniowej może być nieprawidłowe, co skutkuje nieprawidłowym oszacowaniem powtarzających się liczb jednostek. W takim przypadku wskazane jest ponowne przeprowadzenie elektroforezy w żelu agarozowym po zoptymalizowaniu warunków żelu, jak wcześniej opisali Lorenz i współpracownicy22.
Cała procedura analizy VNTR D1S80 przedstawiona tutaj, od pobrania komórek nabłonka policzków po ocenę długości fragmentów, może zostać zakończona w ciągu jednego dnia roboczego. Protokół ten jest solidną, ekonomiczną i łatwą w użyciu metodą odpowiednią dla praktycznych zajęć laboratoryjnych na studiach licencjackich.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Kevinowi Grahamowi za jego podkład głosowy oraz wszystkim uczestnikom, którzy przekazali próbki do tej pracy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml probówka do mikrowirówek | Sarstedt | 72,706 | autoklawizowana |
| probówka do mikrowirówek 2 ml | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoklawowana |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x Bufor PCR | Promega | M7845 | |
| Kwas octowy | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agaroza | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Wymazówki z policzków | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5430 | |
| Grzebienie | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Etanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Odlew żelowy | BioRad | ||
| Komora żelowa | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polimeraza | Promega | M7845 | |
| Blok | grzewczyEppendorf | Thermomixer | 1,5 ml i 2 ml |
| do kuchenki mikrofalowej | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipety | Gilson | 1000 µ L, 200 i mikro; L, 20 i mikro; L, 2 i mikro; L | |
| Octan potasu | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac zasilacz | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Podkłady | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2,5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Wirówka stołowa | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Mieszalnik wirowy | LMS | VTX-3000L |
Bibliografia
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137(1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774(2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232(2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
Przedruki i uprawnienia
