Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62307

⸱

18 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Streszczenie

Trójwymiarowe (3D) modele in vitro mięśni szkieletowych są cennym postępem w badaniach biomedycznych, ponieważ dają możliwość badania przemiany i funkcji mięśni szkieletowych w skalowalnym formacie, który jest podatny na eksperymenty manipulations. 3D systemy hodowli mięśni są pożądane, ponieważ umożliwiają naukowcom badanie mięśni szkieletowych ex vivo w kontekście człowieka cells. 3D modele in vitro ściśle naśladują aspekty natywnej struktury tkankowej dorosłego osobnika mięśnie szkieletowe. Ich uniwersalne zastosowanie jest jednak ograniczone dostępnością platform, które są proste w wykonaniu, drogie i przyjazne dla użytkownika, a także dają stosunkowo duże ilości ludzkich tkanek mięśni szkieletowych. Ponadto, ponieważ mięśnie szkieletowe odgrywają ważną rolę funkcjonalną, która z czasem ulega upośledzeniu w wielu stanach chorobowych, platforma eksperymentalna do badań mikrotkanek jest najbardziej praktyczna, gdy minimalnie inwazyjne pomiary przejściowej i kurczliwej siły wapnia można przeprowadzić bezpośrednio na samej platformie. W tym protokole opisano wytwarzanie 96-wiertniczej platformy znanej jako "MyoTACTIC" oraz masową produkcję 3D ludzkich mikrotkanek mięśni szkieletowych (hMMT). Ponadto przedstawiono metody minimalnie inwazyjnego zastosowania stymulacji elektrycznej, która umożliwia wielokrotne pomiary siły mięśni szkieletowych i obchodzenia się z wapniem każdej mikrotkanki w czasie.

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe są jedną z najobficiej występujących tkanek w ludzkim ciele i wspierają kluczowe funkcje organizmu, takie jak lokomocja, homeostaza ciepła i metabolizm1. Historycznie rzecz biorąc, modele zwierzęce i dwuwymiarowe (2D) systemy hodowli komórkowych były wykorzystywane do badania procesów biologicznych i patogenezy chorób, a także do testowania związków farmakologicznych w leczeniu chorób mięśni szkieletowych2,3. Podczas gdy modele zwierzęce znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat mięśni szkieletowych w zdrowiu i chorobie, ich wpływ translacyjny był utrudniony przez wysokie koszty, względy etyczne i różnice międzygatunkowe2,4. Zwracając się do systemów opartych na komórkach ludzkich do badania mięśni szkieletowych, systemy hodowli komórkowych 2D są korzystne ze względu na swoją prostotę. Jest jednak pewne ograniczenie. Ten format często nie podsumowuje interakcji komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa, które zachodzą naturalnie w ciele5,6. W ciągu ostatnich kilku lat trójwymiarowe (3D) modele mięśni szkieletowych stały się potężną alternatywą dla całych modeli zwierzęcych i konwencjonalnych systemów hodowli 2D, umożliwiając modelowanie fizjologicznie i patologicznie istotnych procesów ex vivo7,8. Rzeczywiście, mnóstwo badań opisało strategie modelowania ludzkich mięśni szkieletowych w biosztucznej kulturze 3D format1. Jednym z ograniczeń dla wielu z tych badań jest to, że siła czynna jest określana ilościowo po usunięciu tkanek mięśniowych z platform hodowlanych i przyłączeniu do przetwornika siły, co jest destrukcyjne, a zatem ogranicza się do służenia jako test końcowy9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Inni zaprojektowali systemy hodowli, które pozwalają na nieinwazyjne metody pomiaru siły czynnej, ale nie wszystkie są podatne na testowanie cząsteczek o wysokiej zawartości7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28,29.

Ten protokół opisuje szczegółową metodę wytwarzania mikrotkanek mięśni ludzkich (hMMT) na platformie mikrotkankowej mięśni szkieletowych (Myo) do badania (MyoTACTIC); 96-dołkowe urządzenie do produkcji mikrotkanek mięśni szkieletowych 3D30. Metoda wytwarzania płytek MyoTACTIC umożliwia wytworzenie 96-dołkowej płytki hodowlanej z polidimetylosiloksanu (PDMS) i wszystkich odpowiadających jej cech dołka w jednym etapie odlewania, przy czym każda studzienka wymaga stosunkowo niewielkiej liczby komórek do wytworzenia mikrotkanek. Mikrotkanki utworzone w MyoTACTIC zawierają wyrównane, prążkowane i wielojądrowe rurki miotube, które są odtwarzalne od studni do studni urządzenia, a po dojrzewaniu mogą reagować na bodźce chemiczne i elektryczne in situ30. W niniejszym artykule przedstawiono i omówiono technikę wytwarzania płytki hodowlanej PDMS MyoTACTIC z repliki poliuretanu (PU), zoptymalizowaną metodę implementacji unieśmiertelnionych ludzkich miogennych komórek progenitorowych do wytwarzania hMMT oraz funkcjonalną ocenę zmodyfikowanego generowania siły hMMT i właściwości obchodzenia się z wapniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja płyt PDMS MyoTACTIC

UWAGA: Produkcja płyt PDMS MyoTACTIC wymaga formy z PU negatyw, która może być wykonana zgodnie z wcześniejszym opisem30. Plik SolidWorks do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) dla projektu płytki MyoTACTIC został udostępniony w serwisie GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

  1. Przygotuj ~ 110 g roztworu polimeru PDMS w jednorazowym plastikowym kubku w stosunku 1:15 monomeru do utwardzacza, używając składników w zestawie elastomeru silikonowego. Mieszać roztwór polimeru przez 2-3 minuty za pomocą jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aż do całkowitego wymieszania i uzyskania jednorodnej konsystencji.
    UWAGA: Unikać kontaktu roztworu polimeru PDMS ze skórą i oczami; i unikać wdychania. Zawsze noś fartuch laboratoryjny i jednorazowe rękawiczki podczas pracy z płynną mieszaniną PDMS i zapoznaj się z kartą charakterystyki (SDS), aby uzyskać szczegółowe protokoły bezpieczeństwa.
    UWAGA: Chroń powierzchnie sprzętu (np. wagę, blat stołu itp.) jednorazowym pokrowcem na wypadek rozlania roztworu polimeru PDMS.
  2. Odgazuj mieszaninę w temperaturze pokojowej, umieszczając kubek w stołowej komorze próżniowej podłączonej do standardowej pompy próżniowej na sucho na ~ 30 minut lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte. Przerywaj podciśnienie co 5-10 minut, aby pomóc w odgazowaniu. Użyj pustej beczki strzykawkowej o pojemności 50 ml, aby zanurzyć powietrze i w razie potrzeby wydmuchać wszelkie pozostałe pęcherzyki na powierzchni mieszaniny polimerów.
    UWAGA: Kawałek rurki o średnicy wewnętrznej 6,35 mm może być użyty do podłączenia końcówki pipety P1250 do cylindra w celu poprawy prędkości i dokładności strumienia powietrza.
  3. Podczas odgazowywania roztworu polimeru PDMS usuń wszelkie resztki PDMS przyklejone do formy PU negatyw, delikatnie wycierając krawędzie i powierzchnię suchym ręcznikiem papierowym. Użyj sprężonego powietrza o natężeniu 70-100 kPag, aby usunąć pozostałe drobne cząstki.
    UWAGA: Chroń formę ujemną PU przed uszkodzeniem i gromadzeniem się cząstek stałych, umieszczając ją w zamykanej plastikowej torbie i przechowując w szufladzie chronionej przed ruchem laboratoryjnym.
  4. Umieść formę PU w okapie chemicznym, który został zabezpieczony jednorazowym pokrowcem. Ustaw formę poziomo pod kątem ~75° i spryskaj powierzchnię czynną równomierną warstwą środka antyadhezyjnego. Spryskaj formę od góry do dołu, a następnie od lewej do prawej, trzymając puszkę 15-20 cm od formy i wykonując płynny ruch zamiatający w przód iw tył. Obróć formę o 180° i powtórz natryskiwanie, a następnie pozostaw formę PU w okapie chemicznym na 10-15 minut do wyschnięcia.
    UWAGA: Upewnij się, że środek antyadhezyjny jest używany w okapie oparów chemicznych, unikaj kontaktu ze skórą i oczami oraz zapoznaj się z kartą charakterystyki (SDS), aby uzyskać szczegółowe protokoły bezpieczeństwa
    UWAGA: Cienka warstwa musi całkowicie pokryć powierzchnię czynną, ale nadmierna powłoka może zostać przeniesiona do PDMS w następnym kroku, co z kolei może negatywnie wpłynąć na wysiew hMMT. Powierzchnia powinna być śliska w dotyku, ale nie mokra.
  5. Wlej równomiernie 100 g PDMS do formy PU i umieść w komorze próżniowej podłączonej do rotacyjnej łopatkowej pompy próżniowej. Odgazuj formę wypełnioną PDMS przez ~45 minut, zrywając uszczelnienie próżniowe co 5-10 minut przez pierwsze 20 minut, aby przyspieszyć proces. Pozostawić w komorze próżniowej, aż mieszanina PDMS zostanie całkowicie pozbawiona wszelkich pęcherzyków.
    UWAGA: Obrotowa łopatkowa pompa próżniowa służy do uzyskania niższego podciśnienia i skrócenia czasu wymaganego na ten etap. Odgazowanie formy wypełnionej PDMS można przeprowadzić za pomocą stołowej komory próżniowej i standardowej suchej pompy próżniowej, jednak czas opróżnienia mieszaniny wszystkich pęcherzyków będzie dłuższy. Niezbędne jest usunięcie wszystkich pęcherzyków z roztworu polimeru PDMS, szczególnie w tych obszarach, które mają stać się słupkami kotwiącymi hMMT. Bąbelki w tym regionie spowodują pęknięcie słupka kotwiącego, utratę studzienek hodowlanych, a to z kolei spowoduje, że mały kawałek PDMS pozostanie zaklinowany w formie.
  6. Przenieś odgazowaną formę PU wypełnioną PDMS do pieca o temperaturze 65 °C, inkubując przez noc w celu utwardzenia płynnej gumy.
  7. Wyjmij utwardzoną płytkę dodatnią PDMS z piekarnika i schłodzić płytę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
  8. Za pomocą skalpela bez ostrzy delikatnie odłącz utwardzony PDMS od formy PU, przesuwając tylną część rękojeści między PDMS a ściankami formy. Zacznij wzdłuż górnej krawędzi i oddziel wszystkie 4 boki, a następnie dociśnij do podstawy formy i odłącz tę porcję. Ten krok jest zakończony, gdy tylna część uchwytu przebiega płynnie między PDMS a wszystkimi 4 ściankami formy PU.
    UWAGA: Pracuj powoli i ostrożnie skalpelem bez ostrzy, aby zapobiec pękaniu formy PU lub rozerwaniu PDMS. Ten krok powinien zająć 15-20 minut.
  9. Zaczynając od jednego końca, użyj skalpela bez ostrza, aby podnieść krawędź PDMS i pracuj palcami między utwardzoną płytką hodowlaną PDMS a formą PU. Następnie obiema rękami wepchnij palce głębiej pod płytkę, powoli odklejając i wyjmując z formy PU.
    UWAGA: Pracuj powoli i obiema rękami równomiernie obierz talerz. Zminimalizuj zginanie, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo złamania słupka kotwiącego. Ten krok powinien zająć 5-10 minut.
  10. Użyj żyletki z pojedynczą krawędzią, aby pociąć płytkę na grupy po 6 ± 2 dołkach MyoTACTIC (Rysunek 1) w celu wysiewu tkanek. Umieść pełne płytki MyoTACTIC lub ich porcje w worku do sterylizacji narzędzi i autoklawie na 25-minutowy suchy cykl (20 minut sterylizacji i 5 minut czasu schnięcia) w temperaturze 120 °C i 100-140 kPag.

2. Kultura unieśmiertelnionych ludzkich komórek progenitorowych mioblastów

UWAGA: Unieśmiertelnione mioblasty użyte w tym protokole zostały uzyskane z Institut de Myologie (Paryż, Francja)31.

  1. Pobrać jedną fiolkę z zamrożonymi komórkami z ciekłego azotu Dewara i szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (w czasie krótszym niż 1 minuta). Komórki zamraża się w gęstości 7,5 x 105 komórek na 1 ml pożywki do zamrażania składającej się z 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO).
  2. Delikatnie przenieść zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml wstępnie podgrzanego środka myjącego składającego się z 89% DMEM 1x, 10% FBS i 1% Pen/Strep w celu rozcieńczenia DMSO. Obracaj stożkową probówkę o pojemności 15 ml o wymiarach 400 x g przez 10 minut, a następnie odessaj pożywkę, uważając, aby uniknąć osadzania się komórek.
  3. Zawiesić osad w 1 ml pożywki wzrostowej składającej się z 84% podłoża bazowego komórek mięśni szkieletowych z mieszanką suplementów pożywki do wzrostu komórek mięśni szkieletowych, 15% FBS i 1% pióra/paciorkowca, a następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 29 ml pożywki wzrostowej.
  4. Przenieść 10 ml pożywki zawierającej około 2,5 x 105 komórek do naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 100 mm x 20 mm. Powtórz ten krok z pozostałymi 20 ml roztworu komórkowego. Następnie przenieść szalki do hodowli komórkowych do nawilżonego inkubatora do hodowli komórkowych ustawionego na 37 °C i 5% CO2 .
  5. Pożywkę hodowlaną należy odświeżać co drugi dzień. Hoduj komórki, aż osiągną ~ 70%-80% konfluencji (zwykle 4-5 dni), w którym to momencie komórki są przygotowane do wysiewu. 1,5 x 105 komórek jest wymaganych do wygenerowania każdego hMMT. Dlatego należy przechodzić przez komórki zgodnie z potrzebami, aby osiągnąć wymaganą liczbę komórek.
    UWAGA: Unieśmiertelnione linie komórkowe progenitorów mioblastów nigdy nie powinny przekraczać 80% zbiegu przed wysiewem komórek do studzienek MyoTACTIC, pasowaniem komórek lub przygotowaniem zapasów do zamrażania. hMMT wytworzone z komórek, które przekroczyły 80% konfluencji, często nie osiągają dojrzałości skurczowej. Procedury pasażowania są identyczne z metodami opisanymi poniżej w kroku 3.

3. Siew inżynieryjnych hMMT za pomocą MyoTACTIC

  1. Przygotowanie dołków hodowlanych MyoTACTIC i odczynników do wysiewu hMMT.
    UWAGA: Ten protokół zawiera szczegółowe informacje dotyczące produkcji 6 hMMT.
    1. Na 2-3 godziny przed wysiewem komórek umieść 6-dołkową porcję płytki MyoTACTIC w 10 cm naczyniu do hodowli komórkowych. Dobrze przygotuj każdą pojedynczą kulturę MyoTACTIC, dodając 100 μl 5% roztworu Pluronic F-127 do każdej studzienki. Przykryj pokrywką naczynie hodowlane o średnicy 10 cm, nałóż parafinę, aby uszczelnić przestrzeń między naczyniem o średnicy 10 cm a pokrywką, a następnie umieść 10-centymetrową płytkę zawierającą porcję MyoTACTIC w wirówce wyposażonej w adapter do obracania płytek.
      UWAGA: Jeśli adapter wirówki do płytek wirówek nie jest dostępny, można użyć końcówki do pipety p20, aby ostrożnie usunąć pęcherzyki zza wkładek, zapewniając w ten sposób, że cała powierzchnia hodowli jest równomiernie pokryta.
    2. Wirować przy 1 550 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki z dołków hodowlanych, zwłaszcza za słupkami. Przechowywać 10 cm naczynie do hodowli komórkowych zawierające porcję płytki MyoTACTIC zawierającą roztwór Pluronic F-127 w temperaturze 4 °C, aż komórki będą przygotowane do wysiewu.
      UWAGA: Powłokę Pluronic F-127 można nakładać już od 2 h do nawet 24 h. Na przykład studnie można napełnić roztworem Pluronic F-127 pod koniec dnia do użycia następnego dnia. Nie należy przekraczać 24 godzin, ponieważ wpłynie to negatywnie na przebudowę hMMT i nie utworzy zdrowych tkanek, które osiągną dojrzałość skurczową.
    3. Powoli rozmrozić jedną podwielokrotność 50 μl ekstraktu z błony podstawnej i jedną 10 μl podwielokrotności trombiny (100 U/ml roztworu podstawowego) na lodzie w kapturze hodowlanym.
      UWAGA: Nie zamrażaj ponownie podwielokrotności ekstraktu z błony podstawnej. Są jednorazowego użytku. Podwielokrotności trombiny są wielokrotnego użytku, dlatego po użyciu należy je ponownie zamrozić do 5 razy.
    4. Zważyć ~ 7 mg sproszkowanego fibrynogenu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, a następnie przenieść do kaptura do hodowli komórkowej. Dodać 700 μl 0,9% (wag./obj.) roztworu NaCl do wody (lub roztworu soli fizjologicznej), aby otrzymać roztwór o stężeniu końcowym 10 mg/mL. Nie należy wirować fibrynogenu w celu rozpuszczenia, zamiast tego umieścić probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 3-5 minut.
    5. Wyjmij probówkę i delikatnie nią przetrząśnij, a następnie pulsacyjnie odwiruj rozpuszczony roztwór w mini wirówce stołowej (mikrofuge) i wróć do okapu hodowlanego. Przefiltrować roztwór fibrynogenu za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w filtr strzykawkowy 0,22 μm. Przenieść rozpuszczony roztwór fibrynogenu do lodu wraz z ekstraktem z błony podstawnej i podwielokrotnościami trombiny.
    6. Na koniec przygotuj pożywkę wysiewającą hMMT, która zostanie wprowadzona do dołków hodowlanych po wysianiu tkanek. Pożywka ta zawiera podłoże podstawowe komórek mięśni szkieletowych uzupełnione 20% FBS, 1% P/S i 3% kwasem 6-aminokapronowym (ACA; końcowe stężenie 1,5 mg/ml uzyskuje się przez rozcieńczenie z roztworu podstawowego o stężeniu 50 mg/ml; % wyraża się jako v/v). Przed użyciem podgrzej podłoże w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotowanie komórek do wysiewu hMMT.
    1. Zebrać płytki do hodowli komórkowych z inkubatora hodowlanego. Odessać pożywkę z każdej płytki, a następnie przemyć komórki raz za pomocą D-PBS, dodając 5 ml D-PBS do każdej płytki hodowlanej. Następnie odessać D-PBS i odłączyć komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do każdej płytki hodowlanej. Umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych na 3 minuty.
    2. Zatrzymaj trypsynę, dodając 3 ml pożywki do płukania (89% 1x DMEM + 10% FBS + 1% Pen/Strep) do naczynia hodowlanego. Przenieś roztwór komórek do stożkowej probówki o odpowiedniej wielkości, a następnie osadzaj komórki, odwirowując przy 400 x g przez 10 minut. Zassać pożywkę, uważając, aby uniknąć osadu komórkowego. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki myjącej.
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i niebieskiego barwnika trypanowego pod mikroskopią w jasnym polu.
      W przypadku użycia wielu płytek komórkowych, ta zawiesina komórek będzie bardzo skoncentrowana. W razie potrzeby rozcieńczyć zawiesiny komórek przed liczeniem.
    4. Ponieważ każda tkanka wymaga 150 000 komórek zawieszonych w 15 μl mieszaniny macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), 900 000 komórek w 90 μl mieszaniny ECM jest wymagane na 6 tkanek. Aby uwzględnić utratę roztworu komórka-ECM, która występuje podczas procesu przygotowania z powodu tworzenia się pęcherzyków lub utraty pipety, należy przygotować dodatkową mieszaninę komórka-ECM (tj. 8 tkanek lub 1 200 000 komórek w 120 μl ECM). Przenieś objętość zawiesiny komórek zawierającej 1 200 000 komórek do nowej stożkowej probówki. Zwiększyć objętość do 10 ml za pomocą środka myjącego i wirować w temperaturze 400 x g przez 10 minut.
    5. Podczas gdy komórki wirują, przygotuj 150 μl mieszaniny ECM w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, postępując zgodnie z następującym przepisem. Najpierw dodaj 60 μl DMEM (40% objętości), następnie dodaj 60 μl roztworu fibrynogenu 10 mg / ml (40% objętości), a na koniec dodaj 30 μl ekstraktu z błony podstawnej (20% objętości). Mieszaninę ECM należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
      UWAGA: Zawsze używaj końcówek wstępnie schłodzonych w temperaturze -20 °C podczas pracy z roztworami zawierającymi ekstrakt z błony podstawnej. Mieszanina ECM zawiera 4 mg/ml fibrynogenu.
  3. Wysiew hMMT
    1. Zebrać stożkową rurkę zawierającą odwirowane komórki i zassać pożywkę, uważając, aby uniknąć osadzania się komórek. Energicznie przesuń koniec rurki palcem w rękawiczce, aby usunąć granulkę i kontynuuj trzepanie, aż granulka pojawi się jako zawiesina komórkowa.
      UWAGA: Ważne jest, aby zassać jak najwięcej pożywki myjącej, aby upewnić się, że zawiesina komórka-ECM jest w pożądanym rozcieńczeniu. W razie potrzeby użyj pipety, aby usunąć resztki środka myjącego.
    2. Przenieść 120 μl roztworu ECM do probówki zawierającej osad komórkowy. Pipetować w górę i w dół, aby dokładnie zawiesić komórki w ECM w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. Pipetować powoli i ostrożnie, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków, które zmniejszyłyby objętość roboczą. Następnie umieść roztwór cell-ECM na lodzie do czasu użycia.
    3. Pobrać porcje płytki MyoTACTIC zawierające studzienki MyoTACTIC pokryte Pluronic F-127 z lodówki o temperaturze 4 °C i umieścić 10-centymetrowe naczynie zawierające studzienki MyoTACTIC na opakowaniu z lodem wewnątrz okapu do hodowli komórkowych.
    4. Odessać roztwór Pluronic F-127 z każdej studzienki. PDMS jest porowaty i wchłania roztwór Pluronic F-127, zwłaszcza jeśli płytki zostały odwirowane za pomocą wirówki. Poczekaj, aż resztki roztworu Pluronic F-127 uwolnią się i osiądą na dnie studzienki, pozostawiając studzienki na 5 minut, a następnie ponownie zassać.
      UWAGA: Podczas zasysania roztworu Pluronic F-127 należy użyć pipety Pasteura z końcówką p1250 przymocowaną na końcu i końcówką p200 nad końcówką p1250. Poprawi to precyzję, aby zapobiec przypadkowemu zatarciu konstrukcji słupków. Należy unikać skrobania pipetą owalnego obszaru wysiewu komórek w kształcie basenu na dnie studzienki, ponieważ zakłóca to powlekanie Pluronic F-127 i zakłóca proces samoorganizacji hMMT. Prawidłowa technika polega na uniesieniu końcówki pipety tuż nad owalną pulą podczas zasysania roztworu Pluronic F-127.
    5. Ostrożnie odpipetować zawiesinę ECM, aby ponownie zawiesić wszelkie komórki, które mogły opaść na dno probówki. Następnie przenieś 105 μl zawiesiny cell-ECM do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Uważaj, aby chwycić rurkę blisko góry, aby zapobiec nagrzewaniu się roztworu.
    6. Dodać 0,84 μl 100 U/ml roztworu podstawowego trombiny do 105 μl zawiesiny komórka-ECM, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 U/mg fibrynogenu. Pipetować szybko, ostrożnie i dokładnie, aby wymieszać, unikając wprowadzania pęcherzyków.
      UWAGA: Trombina inicjuje szybką przemianę fibrynogenu w skrzep fibrynowy. W związku z tym czas na wysiew tkanek po dodaniu trombiny jest ograniczony. Aby uniknąć przedwczesnego krzepnięcia przed przeniesieniem mieszaniny komórka-ECM do dołków hodowlanych, przed dodaniem trombiny należy ustawić pipetę p20 na 15 μl. Użyj wstępnie schłodzonych końcówek lub zanurz końcówkę pipety w lodowatym DMEM na kilka sekund przed zebraniem i przeniesieniem 15 μl mieszaniny komórka-ECM do każdej studzienki. Najlepszą praktyką jest przygotowanie podwielokrotności mieszaniny komórka-ECM w taki sposób, aby nie więcej niż 6 hMMT było wysiewanych jednocześnie.
    7. Aby wysiać tkanki, dodaj 15 μl mieszaniny komórka-ECM (tj. 150 000 komórek) do każdego dołka. Ostrożnie dodaj mieszaninę komórka-ECM do środka owalnego basenu i unikaj wciskania końcówki pipety w dno studzienki. Następnie, dwoma lekkimi ruchami, rozprowadź zawiesinę komórek za każdym słupkiem w studni. Gdy powierzchnia zostanie równomiernie pokryta zawiesiną komórka-ECM, przejdź do następnego dołka.
      UWAGA: Pracuj wydajnie, aby uniknąć przedwczesnego żelowania mieszaniny komórka-ECM w probówce, zanim wszystkie tkanki zostaną wysiane. Podczas wysiewania studzienek niezwykle ważne jest, aby unikać przenoszenia pęcherzyków, ponieważ pęcherzyk będzie przeszkadzał w przebudowie hMMT, czyniąc hMMT bezużytecznym.
    8. Umieścić pokrywkę na 10 cm płytce hodowlanej zawierającej dołki z nasionami i przenieść do inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na około 5 minut
      UWAGA: Umieścić probówkę mikrowirówki z resztkową mieszaniną komórek-ECM w inkubatorze jako potwierdzenie procesu polimeryzacji żelu.
    9. Po polimeryzacji mieszaniny komórka-ECM dodaj 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki wysiewającej hMMT do każdej studzienki MyoTACTIC. Załóż pokrywkę na 10-centymetrową naczynie i włóż porcje płytki MyoTACTIC z 10 cm naczynia do inkubatora. Ten punkt czasowy jest określany jako Dzień -2. Nie naruszaj tkanek do następnego kroku.
  4. Różnicowanie hMMT
    1. Po 2 dniach inkubacji ostrożnie usunąć pożywkę wysiewającą hMMT za pomocą pipety i zastąpić 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej zawierającej 2% surowicy końskiej, 1% Pen/Strep, 4% ACA (tj. 2 mg/ml stężenia końcowego ze stężenia podstawowego 50 mg/ml; % wyrażono jako v/v) i 10 μg/ml ludzkiej rekombinowanej insuliny w DMEM. Ten punkt czasowy jest określany jako Dzień 0 zróżnicowania.
    2. Następnie co drugi dzień wymieniaj połowę pożywek na świeże podłoża różnicujące, aż do 12 dnia różnicowania, ostatniego dnia hodowli (Rysunek 2a).
      UWAGA: Szczegóły protokołu wytwarzania hMMT przy użyciu pierwotnych ludzkich mioblastów zostały opublikowane gdzie indziej30. Jeśli istnieją obawy co do żywotności komórek po wysiewie, należy inkubować hMMT z kalceiną i jodkiem propidyny, aby określić ilościowo żywotność.

4. Stymulacja elektryczna i analiza ugięcia po wywołaniu hMMT

  1. Ustaw przezroczyste dolne szkło lub plastikowy uchwyt sceniczny na odwróconym mikroskopie i przymocuj kamerę smartfona do okularu mikroskopu za pomocą mocowania kamery mikroskopu. Zostanie użyta mikroskopia z kontrastem fazowym przy 10-krotnym powiększeniu (Rysunek 3a).
    UWAGA: Każdy mikroskop z odwróconą fazą kontrastu wyposażony w obiektyw o 10-krotnym powiększeniu będzie odpowiedni. Konstrukcje studni PDMS zostaną wyjęte z 10-centymetrowej czaszy i umieszczone bezpośrednio na przezroczystym dolnym uchwycie stopnia, a tym samym otwarte na powietrze. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie i sprzęt za pomocą 70% etanolu i zminimalizuj ruch w okolicy podczas eksperymentów.
  2. Aby przygotować elektrody do stymulacji elektrycznej, należy przeciąć ~30 cm drutu miedzianego pokrytego cyną. Następnie, zaczynając od piasty zwykłej igły skośnej o gramaturze 25 G, owiń szczelnie ~10 cm drutu wokół górnej połowy, pozostawiając ~20 cm nadmiaru drutu. Powtórz dla drugiej igły, a następnie odetnij piastę od każdej igły.
    UWAGA: Drut musi być ciasno owinięty wokół igły, aby się nie poruszał, a owinięta drutem część elektrody nie może dotykać PDMS, ponieważ może to utrudniać wytwarzanie pola elektrycznego.
  3. Podłącz połączeniowy BNC do zacisku krokodylkowego do kanału wyjściowego w generatorze przebiegów i ustaw kanał na impulsy prostokątne o cyklu pracy 20%, amplitudzie 5 V (natężenie pola elektrycznego 10 V/cm). Częstotliwość będzie się zmieniać w zakresie od 0,5 Hz do 20 Hz odpowiednio dla skurczów skurczowych i tężcowych.
    UWAGA: Ustawienia generatora przebiegów mogą wymagać optymalizacji specyficznej dla eksperymentu
  4. Umieść porcję płytki MyoTACTIC zawierającą hMMT na stoliku mikroskopu i delikatnie włóż każdy koniec skośny elektrody do PDMS bezpośrednio za każdym słupkiem w owalnym basenie. Ostrożnie przyklej taśmą 20 cm odcinki nadmiaru drutu do stolika mikroskopu, tak aby igły pozostały pionowe, a ~10 cm każdego drutu pozostało wolne do połączenia (Rysunek 3a).
    UWAGA: Nigdy nie kładź gołego palca na żadnym końcu elektrody. Upewnij się, że naparstek jest założony na palec wskazujący, aby wywierać lekki nacisk na elektrodę po włożeniu do PDMS.
  5. Ustaw ostrość pole widzenia mikroskopu na jednym z dwóch słupków, tak aby ostrość była ostra na krawędzi słupka znajdującej się najbliżej elektrody. Następnie zablokuj ostrość aparatu smartfona w najbardziej wyraźnym obszarze słupka. Jest to ważne dla dalszej analizy, ponieważ zmiana ostrości podczas nagrywania będzie zakłócać analizę.
  6. Podłącz wolne końce zaklejonych taśmą przewodów do generatora przebiegów za pomocą zacisków krokodylkowych ( Rysunek 3a).
  7. Rozpocznij nagrywanie wideo w aparacie smartfona, a następnie włącz wyjście kanału, aby zainicjować stymulację. Nakłoń hMMT do poddania się 3 skurczom skurczowym i 3 skurczom tężcowym, z 2 minutami odpoczynku między seriami drgawek i stymulacji tężca.
  8. Wyłącz wyjście kanału, odłącz zaciski krokodylkowe od drutów miedzianych pokrytych cyną, usuń taśmę z przewodów i przetrzyj każdą elektrodę 70% etanolem przed włożeniem do kolejnych studzienek hMMT. Powtórz procedurę od kroku 4.5 dla wszystkich hMMTs.
    UWAGA: Ogranicz czas, jaki hMMT spędzają poza inkubatorem, stymulując nie więcej niż 3 tkanki na raz. Jeśli do analizy pozostają dodatkowe hMMT w części płytki MyoTACTIC, należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby umożliwić powrót hMMT do 37 °C.
  9. Aby przeanalizować ugięcie po obliczeniu generowania siły hMMT, użyj niestandardowego skryptu, który został udostępniony na GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Postępuj zgodnie z instrukcjami w README.md, aby skonfigurować i uruchomić skrypt, a następnie otwórz każdy film śledzący post, aby przeprowadzić analizę siły.
  10. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) wzdłuż krawędzi słupka, który ma być śledzony pod kątem przemieszczenia słupka. Naciśnij Enter, aby potwierdzić zwrot z inwestycji, a następnie ponownie naciśnij Enter, aby uruchomić skrypt (Dodatkowe wideo 1).
    UWAGA: Duże ugięcia powodują awarię trackera. Jeśli tracker ulegnie awarii podczas skurczu, rozmiar ROI można zwiększyć, aby śledzenie było mniej czułe, ale umożliwiało śledzenie dużych ugięć. W kodzie znajdują się trzy rozmiary, które można dostosować, dostosowując komentarze skryptu.
  11. Skrypt kończy się dwoma wymaganiami wejściowymi. Najpierw wpisz y, aby potwierdzić, że film zawierał wiele skurczów. Po drugie, wprowadź y (tak) lub n (nie), aby wyeksportować wyniki do pliku . Plik CSV (Dodatkowy film 1).
  12. Upewnij się, że wyniki po ugięciu są raportowane jako przemieszczenie w pikselach dla każdego skurczu. Zamień piksele na wartości μm dla ustawienia 10-krotnego powiększenia mikroskopu. Następnie przelicz liczby po przemieszczeniu na bezwzględne siły skurczu (μN), mnożąc wartości (μm) przez współczynnik konwersji siła-przemieszczenie wynoszący 2,36 μN / μm, co odpowiada stosunkowi utwardzacza do monomeru 1:15 PDMS stosowanego w MyoTACTIC fabrication30.

5. Analiza stanów przejściowych wapnia za pomocą stymulacji elektrycznej

UWAGA: W eksperymentach z wapniem, unieśmiertelnione mioblasty były stabilnie transdukowane za pomocą reportera MHCK7-GCAMP6, jak wcześniej opisano11,12. Transdukowane komórki posortowano metodą FACS pod kątem GFP w celu uzyskania populacji dodatniej, a następnie wykorzystano do wytworzenia hMMT. Alternatywne metody obrazowania wapnia, takie jak użycie barwników ratiometrycznych, takich jak Fura-2 AM i Indo-1 lub obrazowanie fluorescencji wskaźników wapnia (np. Fluo-4 lub Oregon Green BAPTA1) mogą być dostępne dla naszego systemu.

  1. Ustaw stolik mikroskopu i sprzęt do stymulacji (elektrody, generator przebiegów itp.) zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4. W tym eksperymencie użyj 4-krotnego powiększenia.
    UWAGA: Potrzebna będzie ciemnia i mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w kamerę CCD.
  2. Uruchom oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego, wybierz kanał filtra FITC (niebieskie światło) i wybierz funkcję nagrywania filmu. Ustawiono ekspozycję 500 ms i rozdzielczość 680 x 510 (Binning 2x2).
    UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania może się różnić, a ekspozycja jest ustawiana ręcznie przez użytkownika. Należy uważać, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na hMMT przed stymulacją. W spoczynku ciemny kontur/cień tkanki ze spontaniczną fluorescencją jest normalny, podczas gdy wyraźny obraz tkanki jest prześwietlony (Dodatkowe wideo 2). Upewnij się, że ekspozycja jest spójna dla wszystkich hMMT w eksperymencie.
  3. Zamknij migawkę mikroskopu i nie wyłączaj kanału FITC, aż będzie gotowy do zarejestrowania obchodzenia się z wapniem.
  4. Po skonfigurowaniu całego sprzętu i oprogramowania należy pobrać część płytki MyoTACTIC zawierającą hMMT do analizy i umieścić ją bezpośrednio na stoliku mikroskopu. Następnie włóż i podłącz elektrody zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4.
  5. Użyj jasnego pola, aby ustawić ostrość pola widzenia na środku wybranego hMMT. Następnie wyłącz lampę.
  6. Otwórz migawkę kanału FITC mikroskopu, upewnij się, że niebieskie światło jest włączone, a następnie wybierz opcję Nagrywanie filmu w oprogramowaniu.
  7. Włącz wyjście w generatorze przebiegów, aby zainicjować stymulację elektryczną. Wywołaj hMMT do przejścia 8 skurczów drgawkowych i 8 skurczów tężca. Pozwól na 2 minuty odpoczynku między seriami stymulacji drgawek i tężca, w tym czasie migawka FITC jest w pozycji zamkniętej.
    UWAGA: Pozwól na 10 s spontanicznej aktywności przed i po stymulacji elektrycznej, aby zarejestrować minimalną fluorescencję do celów obliczeń i analizy danych.
  8. Wyłącz wyjście kanału, odłącz zaciski krokodylkowe od drutów miedzianych pokrytych cyną, usuń taśmę z przewodów i wytrzyj każdą elektrodę 70% etanolem przed włożeniem do kolejnych studzienek hMMT. Powtórz procedurę stymulacji i rejestracji dla wszystkich hMMT.
  9. Zapisywanie filmów w formacie TIFF do analizy w programie ImageJ lub alternatywnym oprogramowaniu do obrazowania.
    UWAGA: Ogranicz czas, jaki hMMT spędzają poza inkubatorem, stymulując nie więcej niż 3 tkanki na raz. Jeżeli do analizy pozostaje dodatkowa ilość hMMT w części płytki MyoTACTIC, należy umieścić urządzenie z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby umożliwić powrót hMMT do temperatury 37 °C.
  10. Aby przeanalizować dane przejściowe dotyczące wapnia, najpierw otwórz ImageJ. Wybierz opcję Analizuj, następnie Ustaw pomiary, a następnie wybierz średnią wartość szarości i odznacz wszystkie inne opcje. Po zakończeniu otwórz film o wapniu (.tiff) (Dodatkowy film 2).
  11. Obrysuj granicę mikrotkanki za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów i zapisz ten obszar jako ROI (Dodatkowe wideo 2). W obszarze Więcej w oknie Menedżer zwrotu z inwestycji wybierz opcję Multi Measure (Pomiar wielowymiarowy) i zmierz intensywność fluorescencji dla wszystkich plasterków pliku w jednym wierszu na plasterek (Dodatkowe wideo 2).
  12. Skopiuj wszystkie pomiary, w tym numer plasterka (ramkę), do arkusza kalkulacyjnego i porównaj intensywność fluorescencji każdego wycinka z minimalną intensywnością spontanicznej fluorescencji z pliku przy użyciu ΔF/F0 = (F natychmiastowe -F minimum)/F minimum (Dodatkowe wideo 2).
  13. Oblicz czas dla każdej klatki, mnożąc szybkość nagrywanej klatki filmu przez numer wycinka (klatki) i wykreśl ΔF/F0 w funkcji czasu dla przejściowej odpowiedzi wapnia hMMT na stymulację (Dodatkowe wideo 2).
  14. Wybierz szczytowy sygnał przejściowy wapnia dla każdego z 6 kolejnych skurczów i wartości średnich, aby obliczyć względną średnią zmianę piku intensywności fluorescencji każdego hMMT (Dodatkowe wideo 2).
    UWAGA: Zawsze wykluczaj dane wynikające z pierwszego skurczu drgań z ogólnej analizy. Arkusz kalkulacyjny zatytułowany "Calcium Handling Template.xlsx" został udostępniony na GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) w celu ułatwienia analizy stanów przejściowych wapnia hMMT. Komórki, które można wypełnić, w których mają zostać wprowadzone wartości i dane wejściowe, są podświetlone na szaro. Upewnij się, że dostosowałeś numery wyboru szczytów, ponieważ jest to tylko wskazówka, która ma pomóc w wyborze szczytów (Dodatkowe wideo 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy opisano metody odlewania 96-dołkowej platformy hodowlanej MyoTACTIC opartej na PDMS z formy z PU, wytwarzania macierzy replik tkanek hMMT oraz analizy dwóch aspektów funkcji hMMT w urządzeniu hodowlanym – generowania siły oraz gospodarki wapniowej. Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd przygotowania dołków hodowlanych MyoTACTIC przed wysianiem hMMT. PDMS jest powszechnie stosowanym polimerem na bazie silikonu, który można łatwo formować w celu tworzenia złożonych urz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym manuskrypcie opisano metody wytwarzania i analizy modelu hodowli 3D hMMT, który można zastosować do badań nad podstawową biologią mięśni, modelowania chorób lub do testowania cząsteczek kandydujących. Platforma MyoTACTIC jest tańsza, łatwa w produkcji i wymaga stosunkowo niewielkiej liczby komórek do produkcji mikrotkanek mięśni szkieletowych. hMMT powstające na platformie hodowlanej MyoTACTIC składają się z wyrównanych, wielojądrowych i prążkowanych miotub i reagują na bodźce elektryczne poprzez inicjowanie stanów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Mohammadowi Afsharowi, Haben Abraha, Mohsenowi Afshar-Bakooshliemu i Sadeghowi Davoudi za przyczynienie się do wynalezienia platformy kulturowej MyoTACTIC oraz ustanowienia metod produkcji i analizy opisanych w niniejszym dokumencie. HL otrzymał dofinansowanie z programu szkoleniowego Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) w zakresie stypendium w zakresie inżynierii i przedsiębiorczości organ-on-a-chip oraz stypendiów dla absolwentów University of Toronto Wildcat. PMG jest Kanadyjską Katedrą Badań nad Naprawą Endogenną i otrzymała wsparcie dla tego badania od Ontario Institute for Regenerative Medicine, Stem Cell Network oraz od Medicine by Design, Canada First Research Excellence Program. Schematy ideowe zostały stworzone za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% roztwór soli fizjologicznej, sterylnyprodukt marki101010 ml porcje roztworu są wytwarzane i przechowywane w temperaturze 4& Igła C
25GBD, Medstore, Uniwersytet w Toronto2548-CABD305127
Kwas 6-aminokapronowy, ≥ 99% (miareczkowanie), proszekSigma - AldrichA2504-100GRoztwór podstawowy o stężeniu 50 mg / ml powstaje przez rozpuszczenie 5 mg proszku kwasu 6-aminokapronowego w 100 ml autoklawowanej wody destylowanej. Roztwór jest filtrowany próżniowo, a 10 ml porcji jest przechowywanych w temperaturze 4°
C 6,35 mm ID Rurka VWR60985-528
AB1167 Myoblast Cell LineInstitut de Myologie (Paryż, Francja)
Generator przebiegów arbitralnychRigolDG1022Z
Ekstrakt z błony podstawnej (Geltrex)Thermo Fisher ScientificA14132-02Przechowywany jako podwielokrotności 50 &mikro; L lub 100 &mikro; L przy -80°
C Stołowa komora próżniowaSigma - AldrichD2672
zamówiony w Amazon
Culture PlasticsSarstedtZawiera płytki hodowlane, pipety serologiczne itp
DimetylosulfotlenekSigma - AldrichD8418-250ML
DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065Jest to DMEM o wysokiej zawartości glukozy z L-glutaminą i pirogronianem sodu
Surowica bydlęcapłodu Fisher Scientific10437028
Fibrynogen z osocza bydlęcegoSigma - AldrichF8630-5GPodwielokrotności w zakresie od 7 do 10 mg proszku fibrynogenu są wytwarzane i przechowywane w temperaturze -20° C
Filtr strzykawkowy Filtropur, 0,22um Wielkośćporów Sarstedt83.1826.001
Surowica końskaGibco16050-122
Ludzka rekombinowana insulinaSigma - Aldrich91077CRoztwór podstawowy wynosi 100X i jest wytwarzany przez rozpuszczenie 1 mg ludzkiej rekombinowanej insuliny w 1 ml DMEM i 1 &mikro; L z NaOH 10N. Roztwór jest filtrowany i przechowywany w postaci 1 ml podwielokrotności w temperaturze 4& Oprogramowanie do
akwizycji obrazówOlympuscellSens Dimension
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuNational Institutes of HealthImageJ
Piekarnik izotempowyMikroskop Thermo Fisher Scientific201
Mikroskop OlympusIX83
- Uchwyt do kameryLabcamLabcam dla iPhone'aZamówiony w Amazon
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140-122
Plastikowe jednorazowe strzykawki, 1ccBD2606-309659
Plastikowe jednorazowe strzykawki, 50ccBD2612-309653
Pluronic F-127, proszek, BioodczynnikSigma - AldrichP2443-250G5% roztwór podstawowy kwasu pluronowego sporządza się przez rozpuszczenie 5 g proszku kwasu pluronowego w 100 ml schłodzonej, autoklawowanej wody destylowanej. Roztwór jest filtrowany próżniowo, a 10 ml porcji jest przechowywanych w temperaturze 4° C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)Zestawy Dow4019862są również dostępne w Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich itp.
Poliuretanowa forma ujemnaWewnętrzny
środek antyadhezyjnyMann Release Technologies200
Rotacyjna łopatkowa pompa próżniowaEdwardsA65401906
ScalpelAlmedic, Medstore, University of Toronto2586-M36-0100
Żyletka z pojedynczą krawędziąVWR55411-050
Podstawa komórek mięśni szkieletowych PodłożePromocellC-2326030 mL porcje, które są generowane i przechowywane w temperaturze 4& stopni C.
Pożywka do wzrostu komórek mięśni szkieletowych (gotowa do użycia)PromocellC-2306042 mL porcje są generowane i przechowywane w temperaturze 4& stopni C.
Smartfon (iPhone)Pompa
Standard Duty Dry VacuumWelch2546B-01
Worek do sterylizacjiAlliance211-SCM2
NaparstekIgege Zamówionyw Amazon
Trombina z ludzkiego osoczaSigma - AldrichT6884-250UN100 jednostek trombiny rozpuszcza się w 1 ml 0,1% roztworu BSA. 10 &mikro; Podwielokrotności L są przygotowywane i przechowywane w temperaturze -20°C.
Drut miedziany pokryty cynąArcoB8871K48Zamówiony w Amazon
Trypan Blue Solution, 0,4%Thermo Scientific15250061
Trypsin-EDTA, 0,25%Thermo FIsher Scientific25200072
Komora próżniowa 2SP Bel-ArtF42027-0000
zaciskowy BNC do Aligator . 21600069 C próżniowa Apple SE

Bibliografia

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
  3. Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
  4. DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  7. Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  8. Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
  9. Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307(2018).
  10. Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  11. Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
  12. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
  13. Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).
  14. Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
  15. Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
  16. Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).
  17. Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  18. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847(2018).
  19. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  20. Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
  21. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  22. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
  23. Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121(2020).
  24. Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
  25. Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
  26. Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).
  27. Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
  28. Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
  29. Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
  30. Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918(2020).
  31. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).
  32. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  33. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  34. Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545(2018).
  35. Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
  36. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  37. Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa hodowla mięśnipomiar siły skurczuanaliza przejściowego stężenia wapniastymulacja elektrycznaludzkie miotubymodelowanie choróbfunkcja tkanki mięśniowejróżnicowanie miotubimmunobarwienie
Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.