Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62308

⸱

19 marca 2021

 , 
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Streszczenie

Odkrywanie mechanizmów, które tworzą rzeźby dendrytyczne, wymaga metod wizualizacji, obrazowania i analizy dendrytów podczas rozwoju. Siatkówka myszy jest potężnym systemem modelowym do badania specyficznych dla typu komórki mechanizmów morfogenezy i łączności neuronów. Organizacja i skład podtypów siatkówki są dobrze zdefiniowane, a narzędzia genetyczne są dostępne w celu uzyskania dostępu do określonych typów podczas rozwoju. Wiele typów komórek siatkówki ogranicza również swoje dendryty i/lub aksony do wąskich warstw, co ułatwia obrazowanie poklatkowe. Hodowle eksplantatów siatkówki myszy dobrze nadają się do obrazowania żywych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej, ale brakuje metod zoptymalizowanych pod kątem obrazowania dynamiki dendrytów z rozdzielczością czasową i strukturalną. Przedstawiono metodę rzadkiego znakowania i obrazowania rozwoju określonych populacji siatkówki oznaczonych przez system Cre-Lox. Stosowane tu komercyjnie dostępne wirusy związane z adenowirusami (AAV) wykazywały ekspresję białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na błonę w sposób zależny od Cre. Podanie AAV do gałki ocznej u nowonarodzonych myszy powoduje znakowanie fluorescencyjne docelowych typów komórek w ciągu 4-5 dni po wstrzyknięciu (dpi). Membranowe sygnały fluorescencyjne są wykrywalne za pomocą obrazowania konfokalnego i rozwiązują drobne struktury i dynamikę rozgałęzień. Wysokiej jakości filmy trwające 2-4 godziny są uzyskiwane z obrazowania płaskich mocowań siatkówki perfuzji natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF). Dostępny jest również potok przetwarzania końcowego obrazu do dekonwolucji i korekcji dryfu trójwymiarowego (3D). Protokół ten może być wykorzystany do uchwycenia kilku zachowań komórkowych w nienaruszonej siatkówce i do identyfikacji nowych czynników kontrolujących morfogenezę neurytów. Wiele strategii rozwojowych wyuczonych w siatkówce będzie istotnych dla zrozumienia powstawania obwodów nerwowych w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego.

Wprowadzenie

Dendryty neuronów siatkówki tworzą skomplikowane, ale specyficzne wzory, które wpływają na ich funkcjonowanie w obwodach neuronalnych. W siatkówce kręgowców różne typy komórek zwojowych siatkówki (RGC) i interneurony komórek amakrynowych mają unikalną morfologię dendrytyczną, która różni się wielkością trzpienia, lokalizacją, długością gałęzi i gęstością1. Podczas rozwoju pourodzeniowego RGC i komórki amakrynowe rozszerzają wybujałe procesy dendrytyczne do neuropilu zwanego wewnętrzną warstwą splotowatą (IPL), gdzie odbierają dwubiegunowe sygnały komórkowe przekazujące sygnały fotoreceptorów2. Jak uchwycono za pomocą obrazowania poklatkowego fluorescencyjnie znakowanych populacji siatkówki u larw piskląt lub danio pręgowanego, morfogeneza dendrytów jest bardzo dynamiczna3,4,5. W ciągu kilku dni altany dendrytyczne rozszerzają się, przebudowują i rozgałęziają do wąskich podwarstw IPL, gdzie synapsują się z wybranymi partnerami. Altany wykazują różną dynamikę strukturalną w trakcie rozwoju, ze zmianami we względnym tempie dodawania, wycofywania i stabilizacji gałęzi. Dendryty amakrynowe i RGC wykazują również różne zachowania związane z przerastaniem i przebudową, które mogą odzwierciedlać arboryzację specyficzną dla typu. Jednak badania te śledziły szerokie populacje amakrynowe lub RGC i koncentrowały się na celowaniu laminarnym, co jest tylko jednym z aspektów morfologii.

Mechanizmy, które powodują tak ogromną różnorodność morfologiczną obserwowaną w podtypach siatkówki, są słabo poznane. Celem tej grupy było opracowanie metody uchwycenia dynamiki dendrytów i przebudowy trzpienia zdefiniowanych podtypów siatkówki u myszy. Identyfikacja specyficznych dla typu komórek mechanizmów wzorcowania dendrytów wymaga metod wizualizacji i pomiaru zachowań dendrytów w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Organotypowe hodowle siatkówki myszy dobrze nadają się do badań obrazowania żywych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej. Rozwijające się siatkówki są preparowane i umieszczane w płaskim eksplantacie, który może być obrazowany przez kilka godzin w komorze rejestracyjnej lub hodowany przez kilka dni z ograniczonym wpływem na obwody6,7. Żywe neurony siatkówki mogą być znakowane różnymi technikami, w tym napełnianiem barwnikiem za pomocą elektrod, elektroporacją, biolistycznym dostarczaniem cząstek pokrytych barwnikami lipofilowymi lub plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne (np. Gene Gun), a także genetycznie kodowanymi etykietami komórek7,8,9,10. Jednak podejścia te są nieefektywne w obrazowaniu dynamiki dendrytów określonych podtypów siatkówki. Na przykład metody napełniania barwnikiem są niskoprzepustowe i wymagają aparatury elektrofizjologicznej oraz dodatkowych znaczników genetycznych, aby niezawodnie celować w komórki będące przedmiotem zainteresowania. Co więcej, silne sygnały fluorescencyjne w somie mogą przesłaniać pobliskie dendryty.

Biolistyczne metody dostarczania genów mogą jednocześnie oznaczać dziesiątki komórek, ale etapy obejmujące dostarczanie cząsteczek pod wysokim ciśnieniem i nocną inkubację izolowanej siatkówki mogą zagrozić fizjologii komórki i wyrastaniu dendrytycznemu. W artykule zaproponowano, że najnowsze narzędzia genetyczne mogą być wykorzystane do uchwycenia wczesnej dynamiki dendrytów z typem komórki i rozdzielczością strukturalną, biorąc pod uwagę następujące kryteria eksperymentalne. Po pierwsze, aby rozdzielić drobne gałęzie i filopodia, które dominują w rozwijających się altanach, metoda powinna oznaczyć neurony jasnymi, fluorescencyjnymi białkami, które wypełniają procesy w całej altance. Znakowanie fluorescencyjne nie powinno blaknąć z powodu fotowybielania w okresie obrazowania. Wygenerowano i porównano różne warianty białek fluorescencyjnych pod kątem przydatności do obrazowania in vivo/ex vivo11 w oparciu o jasność i fotostabilność. Po drugie, białka fluorescencyjne (XFP) muszą ulegać ekspresji na wystarczająco wysokim poziomie na najwcześniejszym etapie morfogenezy dendrytów, aby nie pominąć wąskiego okna rozwojowego. W analizach statycznych punktów czasowych w siatkówce myszy rozwój dendrytów następuje w pierwszym tygodniu po urodzeniu i obejmuje fazy wzrostu, przebudowy i stabilizacji10,12,13,14,15. Po trzecie, metoda powinna prowadzić do selektywnego znakowania lub do zwiększenia prawdopodobieństwa znakowania subpopulacji neuronalnej będącej przedmiotem zainteresowania. Po czwarte, znakowanie docelowej subpopulacji musi być wystarczająco rzadkie, aby można było zidentyfikować i prześledzić całą trzpień neuronalny. Chociaż podtypy RGC i amakrynowe można rozróżnić na podstawie ich dojrzałych cech morfologicznych i wzorców stratyfikacji IPL16, 17,18,19,20, wyzwaniem jest zidentyfikowanie podtypów podczas rozwoju na podstawie niedojrzałych struktur. Zadanie to jest ułatwione dzięki ekspansji narzędzi transgenicznych do znakowania określonych typów komórek siatkówki podczas rozwoju.

Transgeniczne i mysie linie typu knock-in, w których komórkowa i czasowa ekspresja białek fluorescencyjnych lub Cre jest determinowana przez elementy regulatorowe genów, są szeroko stosowane do badania typów komórek siatkówki13,21,22,23. Kluczowe obserwacje dotyczące specyficznych dla podtypów wzorców rozwoju dendrytów pochodzą z badań transgenicznych siatkówek myszy w statycznych punktach czasowych10,14,24,25. W szczególności system Cre-Lox umożliwia znakomitą manipulację genami i monitorowanie podtypów przy użyciu różnych zależnych od rekombinazy reporterów, czujników i aktywatorów optogenetycznych. Narzędzia te doprowadziły do odkrycia specyficznych dla podtypu programów molekularnych i właściwości funkcjonalnych, które leżą u podstaw zespołu obwodów siatkówki26,27,28,29,30. Jednak nie zostały one jeszcze wykorzystane do badania dynamiki dendrytów specyficznych dla podtypu w siatkówce myszy. Znakowanie o niskiej gęstości można osiągnąć poprzez połączenie linii myszy Cre z transgenami wprowadzonymi przez elektroporację lub rekombinowane AAV. Jeśli to możliwe, można również zastosować indukowane tamoksyfenem linie Cre lub intersekcjonalne strategie genetyczne. Na koniec komórka powinna być znakowana w sposób minimalnie inwazyjny i obrazowana przy użyciu parametrów akwizycji, aby nie naruszyć tkanki ani nie zakłócać funkcji komórkowej wymaganej do morfogenezy dendrytów.

Przedstawiona tutaj jest metoda zastosowania narzędzi transgenicznych i mikroskopii konfokalnej do zbadania dynamiki dendrytów w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Transgeniczne linie myszy Cre połączono z wektorami AAV, które wyrażają białka fluorescencyjne po rekombinacji Cre, co pozwala na rzadkie znakowanie komórek siatkówki będących przedmiotem zainteresowania. Dostępne na rynku AAV są dostarczane do siatkówki noworodka za pomocą zastrzyków doszklistkowych. W artykule tym wykazano, że AAV wytwarzają znacznie wysoką i specyficzną dla typu komórki ekspresję fluorescencyjną o 4 dpi, umożliwiając dostęp do postnatalnych punktów czasowych. Aby zilustrować to podejście, cholinergiczny interneuron amakrynowy "gwiazdotwórczy" został oznaczony poprzez dostarczenie Brainbow AAV u nowonarodzonych myszy eksprymujących transgen acetylotransferazy choliny (ChAT) - wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu (IRES) - Cre, który jest aktywny we wczesnym pourodzeniowym siatkówce < klasa sup = "xref">31,32. Komórki amakrynowe Starburst rozwijają stereotypową i promienistą morfologię altany, która jest kształtowana przez samounikanie dendrytów, w którym pośredniczą zgrupowane protokadheryny33,34. Praca ta pokazuje, że rozdzielczość dendrytów gwiazdotwórczych i filopodiów jest znacznie poprawiona przez XFP do błony plazmatycznej z dodatkiem motywu CAAX, który ulega farnezylacji, jak to jest używane dla Brainbow AAVs31. Na koniec określono protokoły obrazowania poklatkowego i przetwarzania końcowego, które zapewniają wysokiej jakości obrazy nadające się do rekonstrukcji dendrytów i kwantyfikacji morfometrycznej. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji czynników kontrolujących morfogenezę dendrytów i uchwycenia kilku zachowań komórkowych w nienaruszonej siatkówce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Protokół ten obejmuje 2 dni, z minimalnym okresem 4-5 dni na transdukcję wirusową pomiędzy dniami eksperymentalnymi (Rycina 1A). Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Canadian Council on Animal Care dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach oraz opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee w Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada).

1. Przygotowania do wstrzyknięć AAV u noworodków oraz eksperymentów obrazowania

  1. Wybierz linię myszy Cre w celu oznakowania interesujących populacji komórek siatkówki. Potwierdź ekspresję rekombinazy Cre w czasie iniekcji AAV poprzez krzyżowanie z transgenicznym reporterem Cre lub za pomocą immunostainingu z przeciwciałami przeciwko Cre.
  2. Krzyżuj transgeniczne myszy Cre (w wieku 8-16 tygodni), aby uzyskać noworodki zwierząt Cre-dodatnie.
    UWAGA: W tej demonstracji użyto myszy knock-in ChAT-IRES-Cre w celu ukierunkowania na cholinergiczne komórki amacryne typu Starburst.
  3. Uzyskaj zależny od rekombinazy wirus AAV kodujący białko(białka) fluorescencyjne. Dla optymalnego oznakowania cienkich wypustek wybierz wektory wykazujące ekspresję zmodyfikowanych XFP celujących w błonę plazmatyczną.
    UWAGA: W tej badaniu wykorzystano wirusy Brainbow (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY oraz AAV9-EF1a-BbChT (patrz Tabela Materiałów), które umożliwiają wielokolorowe znakowanie (Rysunek 1B). Ekspresja farnesylowanego ulepszonego żółtego białka fluorescencyjnego (eYFP) oraz mCherry (monomeric Cherry) dawała najsilniejsze sygnały fluorescencyjne podczas obrazowania na żywo. Pojedynczy BBV może być użyty do obrazowania pojedynczych drzew wypustek, natomiast współiniekcja BBV może służyć do znakowania większej liczby komórek lub sąsiadujących drzew wypustek za pomocą różnych fluoroforów. W przypadku użycia wielu białek fluorescencyjnych należy zapewnić minimalne nakładanie się widm emisji (Rysunek 1C). Parametry akwizycji mikroskopowej muszą zostać dostosowane tak, aby zarejestrować odrębne sygnały XFP.
  4. Przygotuj alikwoty AAV o objętości ∼3-5 µL w oddzielnych probówkach o niskim stopniu wiązania (low-binding) jako zapasy jednorazowego użytku, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  5. Przygotuj mikropipety z borokrzemianowego szkła z bardzo cienkimi końcówkami, korzystając z wyciągarki do mikropipet.
    UWAGA: Ustawienia wyciągarki różnią się w zależności od używanego włókna i urządzenia; końcowy rozmiar i kształt końcówki przedstawiono na Rysunku 2A. Typowe średnice kropel wynoszą 600 µm.
  6. Przygotuj system do mikroiniekcji oraz odpowiednie przewody. Podłącz mikroinjektor do portu sprężonego powietrza.

Ilustracja systemu Cre-lox z konstruktami genowymi, schematem iniekcji wirusowej i widmami fluorescencji.
Rycina 1: Przegląd eksperymentalny. (A) Protokół ten obejmuje 2 dni eksperymentów z minimum 4-5-dniowym okresem infekcji pomiędzy dniami doświadczalnymi. Iniekcje doszkliste wykonuje się u noworodków myszy nie starszych niż 3. dzień po urodzeniu. Następnie siatkówki są wycinane, montowane na płasko i obrazowane na żywo, aby uchwycić pożądane okno rozwojowe. Oznakowane komórki można obrazować w dowolnym momencie po wymaganych 4-5 dniach niezbędnych do ekspresji wirusowej, ponieważ przedłużona ekspresja AAV nie wykazuje widocznego wpływu na morfologię dendrytów. (B) Wektory AAV Brainbow zależne od Cre (BBV) są wstrzykiwane zwierzętom wykazującym ekspresję Cre31. W niniejszym badaniu zastosowano myszy z knock-in ChAT-Cre, aby wywołać rekombinację Cre w komórkach amacrine starburst. Dwa BBV kodują zmodyfikowane eYFP lub tagBFP, bądź mCherry i mTFP, które kończą się motywem CAAX, podlegającym sekwencyjnej farnesylacji w celu lokalizacji błonowej. Miejsca lox przedstawiono w formie trójkątów. Wektory wykazują ekspresję sfarnesylowanych XFP w sposób stochastyczny i kombinatoryczny, zależny od rekombinacji Cre. Promotor EF1α zawiera elementy regulacyjne z genu czynnika elongacyjnego 1α. W reprezentuje elementy z posttranskrypcyjnego elementu regulacyjnego wirusa zapalenia wątroby świstaka, a pA oznacza sekwencję poliadenylacji. (C) Widma wzbudzenia i emisji mCherry oraz eYFP, fluoroforów BBV obrazowanych w tym badaniu. Podczas obrazowania na żywo wielu białek fluorescencyjnych, parametry detekcji muszą być tak ustawione, aby odpowiednio rozdzielić widma emisji na oddzielne kanały. Skróty: AAV = wirus towarzyszący adenowirusom; BBV = AAV Brainbow; ChAT = cholinoacetylotransferaza; iRES = wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu; eYFP = ulepszone żółte białko fluorescencyjne; iTR = odwrócone powtórzenia końcowe; tagBP = Tag-niebieskie białko fluorescencyjne; mCherry = monomeryczny Cherry; mTFP = turkusowe białko fluorescencyjne; XFP = dowolne białko fluorescencyjne; EF1α = czynnik elongacyjny 1 alfa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Iniekcje doszklistowate AAV u noworodków myszy

  1. Rozmrozić alikwot AAV na lodzie. Przygotować rozcieńczenie AAV w stosunku ok. 1:4, używając sterylnej soli fizjologicznej lub buforu fosforanowego (PBS). Przygotować ok. 0,5 µL rozcieńczenia AAV na zwierzę (ok. 0,25 µL na oko) na wypadek pęknięcia mikropipety i konieczności napełnienia nowej. Pozostały nierozcieńczony AAV przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni.
    UWAGA: W tym eksperymencie stężenie AAV od dostawcy wynosiło ok. 1-2 × 1013 kopii genomu (GC)/mL i zostało rozcieńczone do stężenia końcowego 4 × 1012 GC/mL. Należy zoptymalizować stężenie wirusa, aby uzyskać pożądaną gęstość znakowania.
  2. Aby umożliwić wizualizację iniekcji, dodać około 1 µL 0,02% roztworu barwnika Fast Green FCF na każde 15 µL rozcieńczenia AAV, aby zabarwić roztwór na niebiesko.
  3. Przenieść klatkę z matką i noworodkami (dzień postnatalny (P) 0,5-3) do pomieszczenia zabiegowego z wyposażeniem do mikroiniekcji. Zwierzęta należy trzymać w tej samej klatce z gniazdami i ściółką, aby zminimalizować stres matki i ryzyko odrzucenia młodych.
  4. Zdezynfekować obszar iniekcji 70% etanolem i wyłożyć powierzchnie blatu sterylnymi podkładami chłonnymi. Przygotować ciepłą platformę (np. podkładkę grzewczą) do rekonwalescencji po znieczuleniu wywołanym hipotermią.
  5. Napełnić mikropipetę od tyłu rozcieńczeniem AAV za pomocą mikroszydrzyki. Pod stereomikroskopem ułamać końcówkę mikropipety za pomocą igły 30 G, aby ją odblokować.
    UWAGA: Rysunek 2A przedstawia napełnioną końcówkę – zarówno zablokowaną (góra), jak i odblokowaną (środek).
  6. Zznieczulić noworodki myszy poprzez hipotermię, kładąc 1-2 zwierzęta na lodzie. Zwierzęta należy umieścić na lateksowej rękawiczce, aby chronić skórę przed bezpośrednim kontaktem z lodem. Gdy zwierzę przestanie reagować na uciśnięcie łapy (~2 min), umieścić je pod stereomikroskopem. W razie potrzeby można oznakować poduszeczki łap tuszem do tatuażu i igłą 30 G oraz pobrać wycinki ogona do izolacji DNA w celu identyfikacji zwierząt poprzez genotypowanie.
    UWAGA: Przez cały czas trwania procedury należy odpowiednio monitorować głębokość znieczulenia.
  7. Przetrzeć skórę nad oczami 70% etanolem. Użyć igły 30 G, aby rozciąć zrośnięte powieki (Rysunek 2B). Delikatnie rozsunąć powieki palcami i zrobić mały otwór w rogówce na połączeniu rogówki z twardówką (Rysunek 2C).
  8. Wprowadzić szklaną mikropipetę do otworu i nacisnąć pedał mikroinjektora 2-4 razy, aby wstrzyknąć AAV do przestrzeni witreoidalnej. Powoli wycofać mikropipetę i potwierdzić iniekcję AAV, wizualizując niebieski barwnik przez źrenicę (Rysunek 2D).
    UWAGA: Przy ciśnieniu wyrzutu 6-8 psi i czasie impulsu 600-800 ms wyrzucana jest kropelka o średnicy 600 µm (Rysunek 2A, dół). Do każdego oka wstrzykuje się około 0,23-0,45 µL roztworu AAV. Obecność niebieskiego roztworu na zewnątrz oka wskazuje, że AAV nie został wstrzyknięty do wnętrza oka. Wyciek niebieskiego roztworu z miejsca iniekcji wskazuje, że AAV mógł wyciec na zewnątrz, co obniża wydajność transfekcji.
  9. Delikatnie docisnąć powieki, aby je ponownie zamknąć, i położyć noworodka na podkładce grzewczej. Gdy zwierzęta odzyskają różowy kolor i zaczną reagować, delikatnie przenieść je z powrotem do klatki.
    UWAGA: Należy zachować odpowiednie środki ostrożności, aby uniknąć zbyt gwałtownego ogrzania młodych.
  10. Powtórzyć procedurę iniekcji dla pozostałych zwierząt w miocie. Odczekać minimum 4-5 dni na transdukcję wirusową przed obrazowaniem siatkówki.

Proces mikrochirurgiczny, wprowadzanie igły, zamknięcie skóry; eksperyment w zbliżeniu, szczegóły krok po kroku.
Rycina 2Wewnątrzgałkowe iniekcje noworodkowe. (A) Mikropipeta wypełniona wstecznie pokazuje kształt końcówki pipety po uszczelnieniu (góra) oraz po oduszczelnieniu końcówki (dół, lewo). Ciśnienie piko-wstrzyknięcia wynoszące 6-8 psi i czas impulsu od 600-800 ms pozwala uzyskać 600 µm średnica kropli (na dole, po prawej). Pasek skali = 1 mm.(B) Zestresowana pupila w dniu P0 pod powiększeniem 16x. Zrośnięte miejsce styku powiek (białe) zostaje rozcięte za pomocą ostrej igły 30 G. Pasek skali = 2 mm. (C) Lekki nacisk wyparty na oko odsłania rogówkę; skala = 2 mm. Powiększony fragment (czerwony) pokazuje mały otwór w miejscu połączenia rogówki i twardówki (żółty), wykonany igłą 30 G; skala = 0,5 mm. (D) Wycofanie końcówki pipety po wstrzyknięciu (lewo). Barwnik Fast Green w roztworze AAV widoczny jest jako niebieskoszary przez źrenicę (środek), w porównaniu do jasnego koloru źrenicy przed wstrzyknięciem (prawo). Pasek skali = 1 mm. (E) Po 4 dniach powieka uległa zagojeniu i zrosła się (lewo); pasek skali = 2 mm. Po enukleacji widoczne jest zagojone miejsce wstrzyknięcia (żółto); pasek skali = 1 mm. Zwróć uwagę na położenie miejsca wstrzyknięcia na granicy rogówki i twardówki. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Wycinanie siatkówki do eksperymentu obrazowania

  1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do siatkówki (retinal aCSF: 119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2·6H2O, 2.5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glukozy oraz 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES free acid)35. W razie potrzeby przygotować i zamrozić roztwór 10x; rozmrażać i rozcieńczać do stężenia 1x w miarę potrzeb.
  2. Utlenić retinal aCSF poprzez napowietrzanie karbogenem (95% O2, 5% CO2) przez minimum 15 min. Dostosować pH do wartości 7.4. Przechowywać w szczelnym pojemniku do momentu użycia, aby zapewnić stałe utlenienie aCSF.
    UWAGA: Siatkówki wymagają wysokiego stężenia O2. Ważne jest, aby aCSF pozostawał utleniony przez cały czas trwania eksperymentu.
  3. Umieścić szalkę Petriego o średnicy 60 mm w uchwycie z lodu (wykonać uchwyt z plastiku laboratoryjnego, np. z pokrywki pudełka na pipety) i ustawić pod stereomikroskopem. Napełnić szalkę Petriego utlenionym retinal aCSF.
  4. Eutanazować myszy w wieku P9 i młodsze poprzez dekapitację. Eutanazować myszy w wieku P10 i starsze poprzez indukcję izofluranem lub inną metodą zatwierdzoną w protokole dotyczącym zwierząt, a następnie przeprowadzić dekapitację.
  5. Jeśli powieki są zamknięte, naciąć powiekę, aby odsłonić oko. Za pomocą pęsety przeprowadzić enukleację gałek ocznych i przenieść je do zimnego retinal aCSF przygotowanego w punkcie 3.3.
  6. Aby wypreparować kielich siatkówki, pod stereomikroskopem (powiększenie 25x) ustabilizować oko, chwytając nerw wzrokowy za pomocą pęsety Dumont #5 (Rycina 3A).
  7. Nakłuć igłą 30 G otwór w centrum rogówki, a następnie włożyć jeden koniec mikronożyczek do otworu, aby wykonać nacięcie od otworu do brzegu rogówki. Powtórzyć czynność, wykonując 4 nacięcia w kierunkach kardynalnych, tworząc 4 „płatki” (Rycina 3A).
  8. Dwiema pęsetami Dumont #5 uchwycić i rozsunąć dwa sąsiednie płatki, delikatnie oddzielając twardówkę od siatkówki. Powtórzyć czynność z pozostałymi płatkami rogówki i usunąć twardówkę z siatkówki (Rycina 3B).
  9. Usunąć soczewkę z kielicha siatkówki za pomocą pęsety. Za pomocą mikronożyczek wykonać 4 nacięcia radialne od brzegu siatkówki w stronę nerwu wzrokowego, tworząc 4 równe płatki (Rycina 3B). Powtórzyć kroki 3.4-3.7 dla drugiego oka.

4. Przygotowanie preparatu siatkówki w metodzie flat-mount

  1. Przygotować szare dyski filtracyjne z mieszanego estru celulozy (MCE) do montażu. W przypadku stosowania filtrów MCE o dużej średnicy, należy pociąć dysk na ćwiartki (o szerokości około 1 cm). Umieścić dysk MCE na środku większego białego papieru filtracyjnego (Rysunek 3D).
    UWAGA: Filtry MCE są również dostępne w formie dysków o średnicy 1 cm. Dysk filtra MCE musi być wystarczająco duży, aby pomieścić 1-2 siatkówki, ale jednocześnie na tyle mały, by zmieścić się w komorze obrazowania. Ponieważ membrany MCE utrzymują ładunek statyczny, należy zminimalizować kontakt i manipulowanie membraną MCE.
  2. Używając dwóch pędzli malarskich w rozmiarze 3/0, odwrócić jedną czarę siatkówki na pędzel stroną komórek zwojowych siatkówki do dołu. Delikatnie unieść siatkówkę z aCSF, upewniając się, że napięcie powierzchniowe wody nie rozerwie siatkówki (Rysunek 3C).
  3. Trzymając pędzel z siatkówką, użyć pipety transferowej, aby umieścić kroplę aCSF na środku papieru filtracyjnego MCE (Rysunek 3C, prawa strona). Położyć siatkówkę na powierzchni kropli aCSF utworzonej przez napięcie powierzchniowe. Użyć pędzli, aby ustawić siatkówkę stroną RGC do góry wewnątrz kropli i rozłożyć cztery płatki.
  4. Po ustawieniu utworzyć mostek wodny między pędzlem a białym papierem filtracyjnym, aby przerwać napięcie powierzchniowe kropli.
    UWAGA: Po odprowadzeniu aCSF siatkówka przylgnie do papieru filtracyjnego MCE (Rysunek 3D,E). Z zamontowanymi na płasko siatkówkami można operować, chwytając dysk MCE pęsetą. Jeśli kropla aCSF szybko wsiąknie przed utworzeniem mostka wodnego, może to wskazywać na brak ładunku membrany MCE. Należy użyć nowej membrany MCE oraz zminimalizować czas między enukleacją a obrazowaniem, preparując i montując siatkówki na płasko bezpośrednio przed przeniesieniem ich do komory obrazowania.

Proces sekcji oka i ekstrakcji soczewki; metoda krok po kroku; obrazy z demonstracji edukacyjnej.
Rysunek 3: Sekcja siatkówki i montaż na płasko na membranach filtracyjnych z mieszanych estrów celulozy. (A) Po lewej, enukleowane oko jest stabilizowane poprzez uchwycenie nerwu wzrokowego pęsetą Dumont #5 (lewo). W centrum rogówki wykonuje się mały otwór za pomocą igły 30 G (środek). Nożyczki do mikrosekcji służą do przecięcia rogówki na 4 równe płaty (prawo). Pasek skali = 1 mm. (B) Wysekowana siatkówka z odwarstwioną twardówką przy użyciu dwóch pęset Dumont #5 (lewo) oraz po usunięciu soczewki (środek). Siatkówka z 4 równymi nacięciami wykonanymi do połowy grubości siatkówki (prawo). Pasek skali = 1 mm. (C) Manipulacja siatkówką za pomocą dwóch cienkich pędzli (rozmiar 3/0, lewo). Siatkówka odwrócona warstwą komórek zwojowych do dołu na pędzel (środek) i podnoszona z aCSF, z dbałością o to, aby napięcie powierzchniowe wody nie przerwało siatkówki (prawo). Pasek skali = 2 mm. (D) Szary dysk membrany MCE umieszczony na białym papierze filtracyjnym (lewo). Kropla aCSF na dysku MCE (prawo). Pasek skali = 1 cm. (E) Po wprowadzeniu siatkówek do kropli i ich upozycjonowaniu, tworzy się mostek wodny z białego papieru filtracyjnego w celu odprowadzenia aCSF i przyciągnięcia siatkówki do naładowanego papieru MCE (lewo); pasek skali = 1 cm. Powiększony obraz membrany MCE (czerwień) przedstawia 2 zamontowane siatkówki warstwą komórek zwojowych do góry (prawo); pasek skali = 2 mm. Jedna siatkówka jest obrysowana na biało. Skróty: MCE = mieszane estry celulozy; aCSF = sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

5. Obrazowanie konfokalne time-lapse całych preparatów siatkówki in vivo

  1. Zmontować komorę inkubacyjną do obrazowania na żywo dla mikroskopu konfokalnego w układzie pionowym, zgodnie z rysunkami 4.
    UWAGA: W przypadku systemów konfokalnych w układzie odwróconym, preparaty siatkówki w montażu płaskim (flat-mount) umieszcza się stroną RGC skierowaną w dół, bezpośrednio na szklanym dnie komory inkubacyjnej. Po zetknięciu się siatkówek z szkiełkiem przedmiotowym nie można ich już przemieścić.
  2. Napełnić komorę natlenionym aCSF, a następnie włączyć pompę i kontroler temperatury (temperatura 32-34 °C, szybkość przepływu 1 mL/min). Nie dopuścić do wzrostu temperatury powyżej 34 °C.
  3. Aby przenieść preparat siatkówki w montażu płaskim do komory perfuzyjnej, należy zatrzymać pompę i usunąć aCSF znajdujący się w komorze. Umieścić dysk MCE z preparatem siatkówki w (pustej) komorze inkubacyjnej.
  4. Położyć obciążnik dla próbki na preparacie; należy uprzednio zwilżyć obciążnik, aby przełamać napięcie powierzchniowe. Ponownie napełnić komorę ogrzanym aCSF i uruchomić cyrkulację aCSF z prędkością ~1 mL/min.
  5. Umieścić rewolwer z obiektywem zanurzowym 25x (apertura numeryczna 0,95) w komorze obrazowania. Wyszukać interesujące, znakowane komórki, wykorzystując światło epifluorescencyjne (rysunek 4C).
  6. Dobrać objętość obrazowania tak, aby uchwycić interesujące cechy dendrytów.
    UWAGA: W niniejszym badaniu zarejestrowano pełne drzewo dendrytyczne przy rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli na klatkę, kroku z wynoszącym 1 µm i odstępach 2 min między kolejnymi stosami z (z-stacks). Końcowe rozmiary obrazów wynoszą ~100 µm x 100 µm x 20 µm.
  7. Aby dobrać optymalną moc lasera, należy użyć tabeli wyszukiwania (LUT) identyfikującej piksele przesycone i niedosycone. Podczas skanowania należy regulować moc lasera tak, aby żadne piksele nie były przesycone (tj. nie osiągały intensywności 255 lub więcej). Kontynuować obrazowanie tak długo, jak jest to wymagane, lub do momentu wystąpienia znaczącego i wykrywalnego spadku sygnału fluorescencyjnego oraz wzrostu szumów (zazwyczaj 2-4 h).
    UWAGA: Zaleca się stosowanie mniejszej mocy lasera, ponieważ algorytmy dekonwolucji działają optymalnie, gdy piksele są rozłożone w pełnym zakresie dynamicznym. Intensywność pikseli nie powinna przekraczać 254; analizy empiryczne neurytów wykazały, że wartości pikseli poniżej 170 są idealne do dekonwolucji. Szybkie prędkości skanowania (400-600 Hz) z uśrednianiem linii (2-3) są preferowane nad pojedynczymi, wolniejszymi skanami o tym samym całkowitym czasie przebywania wiązki na pikselu. Obszar przedłużanego obrazowania często ulega fotobieleniu, jednak inne sekcje eksplantu pozostają żywe. Można obrazować wiele regionów w jednym montażu płaskim, każdy przez 2-4 h, przy całkowitym czasie inkubacji wynoszącym 6 godzin. Sesje obrazowania trwające powyżej 6 h nie były systematycznie testowane. Degradacja neurytów i powstawanie pęcherzyków (blebbing) są oznakami spadku żywotności eksplantu.
  8. Po obrazowaniu utrwalić preparaty siatkówki w montażu płaskim oraz filtr membranowy w zimnej 4% parafomaldehydzie przez 1-2 h w temperaturze 4 °C. W celu dalszych analiz wzmocnić znaczniki fluorescencyjne w utrwalonych siatkówkach za pomocą immunohistochemii.
    UWAGA: Utrwalanie po obrazowaniu nie jest możliwe przy użyciu mikroskopu konfokalnego w układzie odwróconym; siatkówki nie można usunąć bez zniszczenia tkanki.

Schemat układu mikroskopowego z obiektywem zanurzanym w wodzie, przedstawiający obrazowanie neuronów; wyniki fluorescencji.
Rycina 4: Konfiguracja komory inkubacyjnej do obrazowania żywych komórek. (A) Aparatura inkubacyjna do obrazowania na żywo, przedstawiająca komponenty grzewcze, systemy roztworów oraz elementy obrazujące. Podwójny podgrzewacz obejmuje platformę podgrzewanej komory inkubacyjnej (tylny okrąg z niebieskimi elektrodami złączy) oraz przepływowy podgrzewacz roztworu. (B) Schematyczny rysunek do 4A. Preparat siatkówki w układzie płaskim (czerwony) na membranie MCE (szara) umieszczony w komorze inkubacyjnej. Przepływowy podgrzewacz roztworu jest połączony z pompą roztworu (niewidoczna na 4A). Wymiary komory obrazowania zapewniają odpowiedni obszar roboczy dla nosa obiektywu zanurzanego. (C) Widok 25x eksplantu siatkówki po wstrzyknięciu 0,23-0,45 µL rozcieńczenia AAV o stężeniu 4 × 1012 GC/mL; pasek skali = 100 µm. Gęste znakowanie komórek często otacza głowę nerwu wzrokowego (linia przerywana, prawy dolny róg); pasek skali = 50 µm. Skróty: MCE = mieszany ester celulozy; GC = kopie genomu; mCherry = monomeric Cherry; eYFP = enhanced yellow fluorescent protein. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

6. Dekonwolucja obrazu i postprocessing w programie ImageJ

  1. Zaimportuj serię obrazów, podziel serię według czasu oraz koloru, jeśli jest to obraz wielokolorowy. Upewnij się, że wszystkie punkty czasowe dla jednego koloru znajdują się w tym samym folderze.
    UWAGA: Zaimportuj Bio-formats, jeśli korzystasz z ImageJ (Bio-formats jest automatycznie dołączony do FIJI).
  2. Utwórz teoretyczną funkcję rozproszenia punktu (PSF), korzystając z wtyczki ImageJ Diffraction PSF 3D.
    UWAGA: Każdy kanał obrazowania wymaga oddzielnej PSF, ponieważ długość fali emisji białka fluorescencyjnego wpływa na PSF.
  3. Użyj Plugins | Macros | Run, aby przeprowadzić seryjną Parallel Iterative Deconvolution (równoległą iteracyjną dekonwolucję) dla wszystkich punktów czasowych, korzystając z dostarczonego makra (Supplementary File 1).
    UWAGA: To makro wykonuje 25 iteracji algorytmu iteracyjnego Wiener Filter Preconditioned Landweber (WPL). Każdy kanał kolorystyczny musi być dekonwolwowany osobno.
  4. Połącz kanały kolorystyczne i skompiluj wszystkie punkty czasowe w Hyperstack (Image | Hyperstacks | Stacks to Hyperstack). Skoryguj dryft 3D za pomocą Plugins | Registration | Correct 3D Drift.
  5. Przywróć obraz do zwykłego stosu (Image | Hyperstacks | Hyperstack to Stack) i podziel punkty czasowe (Image | Stacks | Tools | Stack Splitter). Użyj przetwarzania seryjnego, aby utworzyć projekcję maksymalną dla wszystkich punktów czasowych (Process | Batch | Macro | run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]"); ).
  6. Zaimportuj sekwencję obrazów time-lapse (File | Import | Image Sequence). Użyj standardowych narzędzi ImageJ do pożądanej analizy dekonwolwowanego i poprocesowanego dwuwymiarowego (2D) wideo.
    UWAGA: Czterowymiarowe (3D + czas) wideo dekonwolwowane i skorygowane pod kątem dryftu można przeglądać jako hyperstack. Pomiń poprzedni krok, aby zachować trójwymiarowe punkty czasowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie powyższego protokołu pozwoliło na uzyskanie wysokorozdzielczzego wideo 3D rozwijających się dendrytów komórek gwiaździstych, a następnie na przeprowadzenie dekonwolucji i korekcję dryfu 3D. Wykonano projekcje maksymalne płaszczyzny Z w celu stworzenia dwuwymiarowych filmów do analizy (Wideo uzupełniające 1, Rysunek 5A). Dekonwolucja 3D dla każdego punktu czasowego zwiększyła rozdzielczość drobnych projekcji filopodialnych (Rysunek 5B

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten film przedstawia eksperymentalny potok, który wykorzystuje istniejące narzędzia genetyczne do obrazowania dynamiki dendrytów rozwijających się neuronów siatkówki za pomocą konfokalnego obrazowania na żywo. Zademonstrowano również wstrzyknięcia do gałki ocznej zależnych od Cre AAV kodujących białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę u nowonarodzonych myszy. Pojedyncze komórki w populacjach genetycznie celowanych są znakowane już od 4 do 5 dpi. Płaskie mocowania siatkówki przygotowano dla standardowych komór obrazo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Madison Gray za pomocną mi rękę, kiedy jej nie miałem. Badania te były wspierane przez NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), stypendium Sloan Fellowship w dziedzinie neuronauki oraz Canada Research Chair Tier 2 (dla J.L.L.). S. Ing-Esteves był wspierany przez Vision Science Research Program i NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Preparat wirusowy Addgene #45185-AAV9
Preparat wirusowy Addgene #45186-AAV9
Narzędzia do preparacji
Bibuła filtracyjna z celulozyWhatman1001-070
Kleszczyki drobnoziarniste Dumont #5FST11252-20Do mikrorozwarstwienia siatkówki potrzebne są dwa kleszcze Dumont #5
Kleszcze DumontVWR82027-426
Drobne nożyczkiFST14058-09
Bibuły filtracyjne z membraną z mieszanych estrów celulozy (MCE), hydrofilowe, 0,45 i mikro; m wielkość porówMilliporeHABG01 300
Szalka Petriego, 50 & razy; 15 mmVWR470313-352
Jednorazowa pipeta transferowa z polietylenuVWR470225-034
Pędzel z okrągłą końcówką, rozmiar 3/0Konwencjonalny sklepDo płaskiego montażu siatkówki Do płaskiego montażu siatkówki wymagane są dwa pędzle malarskie o rozmiarze 3/0 (lub mniejszym)
14007-14
Nożyczki sprężynowe Vannas - 2,5 mm Cutting EdgeFST15000-08
System inkubacji do obrazowania na żywo
komorowy rurka polietylenowa, PE-160 10'WarnerInstruments64-0755
Dwukanałowy sterownik grzałki, model TC-344CWarner Instruments64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W Obiektyw zanurzeniowy VISIRgrzałki Leica
WarnerInstrumentsCC-28
Duża komora inkubacyjna do kąpieli z podparciem dla plastrówWarner InstrumentsRC-27L
MPIIAparat Harvard70-2027
PM-6D Magnetyczna platforma podgrzewana (grzałka komory inkubacyjnej)Warner InstrumentsPM-6D
Rurki głowicy pompy do minipompy perystaltycznej MPIIAparatura Harvard55-4148
Kotwica do próbki (harfy)Warner Instruments64-0260Kotwica próbki musi być kompatybilna z komorą inkubacyjną
Podgrzewacz roztworu Sloflo In-lineWarner InstrumentsSF-28
Noworodki do iniekcji
10 &mikro; L Strzykawka mikrolitrowa seria 700, wyjmowana igłaHamilton Company80314
30 G Igły podskórne (0,5 cala)BD PrecisionGlide305106
4-calowa cienkościenna szklana kapilara, bez włókna (średnica zewnętrzna 1,0 mm / 0,75 mm) WPI World Precision InstrumentsTW100-4
Etanol 99,8% (do rozcieńczenia do 70% wodą podwójnie destylowaną [ddH2O])Sigma-AldrichV001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYFRdzeń wektorowy PennAV-9-PV2453Addgene Plazmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF		Penn Vector CoreAV-9-PV2454Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgeniczna linia myszyJackson Laboratory6410
Fast Green FCF Zawartość barwnika ≥ 85Sigma-AldrichF7252-25G
Flaming/brązowy ściągacz do mikropipet, model P-97Sutter Instrument Co.P-97
Zielona pasta do tatuażuKetchum MFG Co329A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4, płynna, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowychSigma-Aldrich806552
Pneumatyczna pompa PicoPumpWPI World Precision InstrumentsPV-820
Odczynniki natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)AirGasX02OX95C2003102może się różnić w zależności od regionu
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG7021
- HEPES, Free AcidBio BasicHB0264
Roztwór kwasu solnego, 1 NSigma-AldrichH9892
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2· 6H2O)Paski testowe pH-55 6HM2670
paski testowe pH (6,0-7,7)VWRBDH35317.604
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541
Chlorek sodu (NaCl)Bio BasicDB0483
Fosforan sodu jednozasadowy (NaHsub>2PO4)Sigma-AldrichRDD007
Software
ImageJNational Institutes of Health (NIH)Otwarty kod
z artykułami plastycznymi sterownika 15506374 Minipompa perystaltyczna % źródłowy

Bibliografia

  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379(2021).
  3. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  4. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  5. Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
  6. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  7. Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
  8. Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24(2013).
  9. Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
  10. Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
  11. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  12. Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
  13. Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
  14. Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
  15. Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
  16. Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
  17. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  18. Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512(2014).
  19. Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
  20. Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
  21. Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
  22. Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66(2018).
  23. Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
  24. Kim, I. -J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
  25. Peng, Y. -R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
  26. Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
  27. Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241(2018).
  28. Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
  29. Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
  30. Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8(2019).
  31. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
  32. Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
  33. Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
  34. Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
  35. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
  36. Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
  37. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  38. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  39. Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877(2010).
  40. Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
  41. Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207(2018).
  42. Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
  43. Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
  44. Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
  45. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  46. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333(2009).
  47. Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190(2007).
  48. Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
  49. Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
  50. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rzadkie znakowaniemikroskopia konfokalnasystem Cre-Loxdynamika dendrytówpreparat płaski siatkówkidekonwolucja 3D
Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.