Method Article

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

DOI:

10.3791/62308

⸱

March 19th, 2021

 , 
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrywanie mechanizmów, które tworzą rzeźby dendrytyczne, wymaga metod wizualizacji, obrazowania i analizy dendrytów podczas rozwoju. Siatkówka myszy jest potężnym systemem modelowym do badania specyficznych dla typu komórki mechanizmów morfogenezy i łączności neuronów. Organizacja i skład podtypów siatkówki są dobrze zdefiniowane, a narzędzia genetyczne są dostępne w celu uzyskania dostępu do określonych typów podczas rozwoju. Wiele typów komórek siatkówki ogranicza również swoje dendryty i/lub aksony do wąskich warstw, co ułatwia obrazowanie poklatkowe. Hodowle eksplantatów siatkówki myszy dobrze nadają się do obrazowania żywych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej, ale brakuje metod zoptymalizowanych pod kątem obrazowania dynamiki dendrytów z rozdzielczością czasową i strukturalną. Przedstawiono metodę rzadkiego znakowania i obrazowania rozwoju określonych populacji siatkówki oznaczonych przez system Cre-Lox. Stosowane tu komercyjnie dostępne wirusy związane z adenowirusami (AAV) wykazywały ekspresję białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na błonę w sposób zależny od Cre. Podanie AAV do gałki ocznej u nowonarodzonych myszy powoduje znakowanie fluorescencyjne docelowych typów komórek w ciągu 4-5 dni po wstrzyknięciu (dpi). Membranowe sygnały fluorescencyjne są wykrywalne za pomocą obrazowania konfokalnego i rozwiązują drobne struktury i dynamikę rozgałęzień. Wysokiej jakości filmy trwające 2-4 godziny są uzyskiwane z obrazowania płaskich mocowań siatkówki perfuzji natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF). Dostępny jest również potok przetwarzania końcowego obrazu do dekonwolucji i korekcji dryfu trójwymiarowego (3D). Protokół ten może być wykorzystany do uchwycenia kilku zachowań komórkowych w nienaruszonej siatkówce i do identyfikacji nowych czynników kontrolujących morfogenezę neurytów. Wiele strategii rozwojowych wyuczonych w siatkówce będzie istotnych dla zrozumienia powstawania obwodów nerwowych w innych częściach ośrodkowego układu nerwowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendryty neuronów siatkówki tworzą skomplikowane, ale specyficzne wzory, które wpływają na ich funkcjonowanie w obwodach neuronalnych. W siatkówce kręgowców różne typy komórek zwojowych siatkówki (RGC) i interneurony komórek amakrynowych mają unikalną morfologię dendrytyczną, która różni się wielkością trzpienia, lokalizacją, długością gałęzi i gęstością1. Podczas rozwoju pourodzeniowego RGC i komórki amakrynowe rozszerzają wybujałe procesy dendrytyczne do neuropilu zwanego wewnętrzną warstwą splotowatą (IPL), gdzie odbierają dwubiegunowe sygnały komórkowe przekazujące sygnały fotoreceptorów2. Jak uchwycono za pomocą obr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół obejmuje 2 dni z minimalnym okresem 4-5 dni na transdukcję wirusa między dniami eksperymentalnymi (Rysunek 1A). Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami w Laboratorium Usług dla Zwierząt w Szpitalu dla Chorych Dzieci (Toronto, Kanada).

1. Przygotowania do iniekcji AAV u noworodków i eksperymenty obrazowe

  1. Wybierz linię myszy Cre, aby ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z powyższego protokołu, uzyskano film 3D o wysokiej rozdzielczości, przedstawiający rozwój dendrytów komórek gwiazdotwórczych, zdekonwoluowany i skorygowany pod kątem dryfu 3D. Maksymalne projekcje w płaszczyźnie Z zostały stworzone w celu nakręcenia filmów 2D do analizy (Dodatkowy film 1, Rysunek 5A). Dekonwolucja 3D każdego punktu czasowego zwiększyła rozdzielczość drobnych projekcji filopodiów (Rysunek 5B,C). Drobne wypukłości filopo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten film przedstawia eksperymentalny potok, który wykorzystuje istniejące narzędzia genetyczne do obrazowania dynamiki dendrytów rozwijających się neuronów siatkówki za pomocą konfokalnego obrazowania na żywo. Zademonstrowano również wstrzyknięcia do gałki ocznej zależnych od Cre AAV kodujących białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę u nowonarodzonych myszy. Pojedyncze komórki w populacjach genetycznie celowanych są znakowane już od 4 do 5 dpi. Płaskie mocowania siatkówki przygotowano dla standardowych komór obrazo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Madison Gray za pomocną mi rękę, kiedy jej nie miałem. Badania te były wspierane przez NSERC Discovery Grant (RGPIN-2016-06128), stypendium Sloan Fellowship w dziedzinie neuronauki oraz Canada Research Chair Tier 2 (dla J.L.L.). S. Ing-Esteves był wspierany przez Vision Science Research Program i NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Preparat wirusowy Addgene #45185-AAV9
Preparat wirusowy Addgene #45186-AAV9
Narzędzia do preparacji
Bibuła filtracyjna z celulozyWhatman1001-070
Kleszczyki drobnoziarniste Dumont #5FST11252-20Do mikrorozwarstwienia siatkówki potrzebne są dwa kleszcze Dumont #5
Kleszcze DumontVWR82027-426
Drobne nożyczkiFST14058-09
Bibuły filtracyjne z membraną z mieszanych estrów celulozy (MCE), hydrofilowe, 0,45 i mikro; m wielkość porówMilliporeHABG01 300
Szalka Petriego, 50 & razy; 15 mmVWR470313-352
Jednorazowa pipeta transferowa z polietylenuVWR470225-034
Pędzel z okrągłą końcówką, rozmiar 3/0Konwencjonalny sklepDo płaskiego montażu siatkówki Do płaskiego montażu siatkówki wymagane są dwa pędzle malarskie o rozmiarze 3/0 (lub mniejszym)
14007-14
Nożyczki sprężynowe Vannas - 2,5 mm Cutting EdgeFST15000-08
System inkubacji do obrazowania na żywo
komorowy rurka polietylenowa, PE-160 10'WarnerInstruments64-0755
Dwukanałowy sterownik grzałki, model TC-344CWarner Instruments64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W Obiektyw zanurzeniowy VISIRgrzałki Leica
WarnerInstrumentsCC-28
Duża komora inkubacyjna do kąpieli z podparciem dla plastrówWarner InstrumentsRC-27L
MPIIAparat Harvard70-2027
PM-6D Magnetyczna platforma podgrzewana (grzałka komory inkubacyjnej)Warner InstrumentsPM-6D
Rurki głowicy pompy do minipompy perystaltycznej MPIIAparatura Harvard55-4148
Kotwica do próbki (harfy)Warner Instruments64-0260Kotwica próbki musi być kompatybilna z komorą inkubacyjną
Podgrzewacz roztworu Sloflo In-lineWarner InstrumentsSF-28
Noworodki do iniekcji
10 &mikro; L Strzykawka mikrolitrowa seria 700, wyjmowana igłaHamilton Company80314
30 G Igły podskórne (0,5 cala)BD PrecisionGlide305106
4-calowa cienkościenna szklana kapilara, bez włókna (średnica zewnętrzna 1,0 mm / 0,75 mm) WPI World Precision InstrumentsTW100-4
Etanol 99,8% (do rozcieńczenia do 70% wodą podwójnie destylowaną [ddH2O])Sigma-AldrichV001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYFRdzeń wektorowy PennAV-9-PV2453Addgene Plazmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF		Penn Vector CoreAV-9-PV2454Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgeniczna linia myszyJackson Laboratory6410
Fast Green FCF Zawartość barwnika ≥ 85Sigma-AldrichF7252-25G
Flaming/brązowy ściągacz do mikropipet, model P-97Sutter Instrument Co.P-97
Zielona pasta do tatuażuKetchum MFG Co329A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4, płynna, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowychSigma-Aldrich806552
Pneumatyczna pompa PicoPumpWPI World Precision InstrumentsPV-820
Odczynniki natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)AirGasX02OX95C2003102może się różnić w zależności od regionu
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG7021
- HEPES, Free AcidBio BasicHB0264
Roztwór kwasu solnego, 1 NSigma-AldrichH9892
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2· 6H2O)Paski testowe pH-55 6HM2670
paski testowe pH (6,0-7,7)VWRBDH35317.604
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541
Chlorek sodu (NaCl)Bio BasicDB0483
Fosforan sodu jednozasadowy (NaHsub>2PO4)Sigma-AldrichRDD007
Software
ImageJNational Institutes of Health (NIH)Otwarty kod
z artykułami plastycznymi sterownika 15506374 Minipompa perystaltyczna % źródłowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synapt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuronal ArborizationTime Lapse ImagingRetinal Cell PopulationsAdeno Associated VirusSparse LabelingConfocal MicroscopyCre Lox SystemDendrite DynamicsRetinal Flat Mount3D Deconvolution

Related Articles