Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta

Podsumowanie

Komórki macierzyste glejaka (GSC) to niewielka część komórek nowotworowych, które odgrywają kluczową rolę w inicjacji nowotworu, angiogenezie i oporności na leki w glejaku (GBM), najbardziej rozpowszechnionym i wyniszczającym pierwotnym guzie mózgu. Obecność GSC sprawia, że GBM jest bardzo oporny na większość pojedynczych leków docelowych, dlatego potrzebne są wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnie skutecznych terapii skojarzonych. Protokół opisuje prosty przebieg pracy, aby umożliwić szybkie badania przesiewowe pod kątem potencjalnej terapii skojarzonej z synergiczną interakcją. Ogólne etapy tego przepływu pracy polegają na ustaleniu GSC znakowanych lucyferazy, przygotowaniu płytek pokrytych matryżelem, skojarzonym badaniu przesiewowym leków, analizie i walidacji wyników.

Streszczenie

Komórki macierzyste glejaka (GSC) to niewielka część komórek nowotworowych, które odgrywają kluczową rolę w inicjacji nowotworu, angiogenezie i oporności na leki w glejaku (GBM), najbardziej rozpowszechnionym i wyniszczającym pierwotnym guzie mózgu. Obecność GSC sprawia, że GBM jest bardzo oporny na większość pojedynczych leków docelowych, dlatego potrzebne są wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnie skutecznych terapii skojarzonych. Protokół opisuje prosty przebieg pracy, aby umożliwić szybkie badania przesiewowe pod kątem potencjalnej terapii skojarzonej z synergiczną interakcją. Ogólne etapy tego przepływu pracy polegają na ustaleniu GSC znakowanych lucyferazy, przygotowaniu płytek pokrytych matryżelem, skojarzonym badaniu przesiewowym leków, analizie i walidacji wyników.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym i najbardziej agresywnym typem pierwotnego guza mózgu. Obecnie całkowite przeżycie pacjentów z GBM, którzy otrzymali maksymalne leczenie (połączenie operacji, chemioterapii i radioterapii) jest nadal krótsze niż 15 miesięcy; dlatego pilnie potrzebne są nowatorskie i skuteczne terapie GBM.

Obecność komórek macierzystych glejaka (GSC) w GBM stanowi poważne wyzwanie dla konwencjonalnego leczenia, ponieważ te komórki macierzyste odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu mikrośrodowiska guza, oporności na leki i nawrotu nowotworu¹. W związku z tym celowanie w GSC może być obiecującą strategią leczenia GBM². Niemniej jednak główną wadą skuteczności leku w GBM jest jego heterogenetyczny charakter, w tym między innymi różnica w mutacjach genetycznych, mieszanych podtypach, regulacji epigenetycznej i mikrośrodowisku guza, co czyni je bardzo opornymi na leczenie. Po wielu nieudanych próbach klinicznych naukowcy i badacze kliniczni zdali sobie sprawę, że terapia celowana jednolekowa prawdopodobnie nie jest w stanie w pełni kontrolować progresji wysoce niejednorodnych nowotworów, takich jak GBM. Natomiast starannie dobrane kombinacje leków zostały zatwierdzone ze względu na ich skuteczność poprzez synergistyczne wzmacnianie wzajemnego działania, zapewniając w ten sposób obiecujące rozwiązanie w leczeniu GBM.

Chociaż istnieje wiele sposobów oceny interakcji lek-lek w kombinacji leków, takich jak CI (Indeks Kombinacji), HSA (Najwyższy Pojedynczy Agent), wartości Bliss, itd.^3,4, te metody obliczeniowe są zwykle oparte na wielu kombinacjach stężeń. Rzeczywiście, metody te mogą zapewnić pozytywną ocenę interakcji między lekami, ale mogą być bardzo pracochłonne, jeśli są stosowane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych. Aby uprościć ten proces, opracowano proces badań przesiewowych w celu szybkiej identyfikacji potencjalnych kombinacji leków, które hamują wzrost GSC pochodzących z biopsji chirurgicznej pacjenta GBM. Wskaźnik wrażliwości (SI), który odzwierciedla różnicę między oczekiwanym łącznym efektem a obserwowanym połączonym efektem, został wprowadzony do tej metody w celu ilościowego określenia efektu synergicznego każdego leku, dzięki czemu potencjalni kandydaci mogą być łatwo zidentyfikowani przez ranking SI. Tymczasem protokół ten przedstawia przykładowy ekran przesiewowy w celu zidentyfikowania potencjalnego kandydata (kandydatów), który może synergizować efekt przeciwglejakowy z temozolomidem, chemioterapią pierwszego rzutu w leczeniu GBM, spośród 20 inhibitorów małocząsteczkowych.

Protokół

Próbka GBM została pobrana od pacjenta podczas rutynowej operacji po uzyskaniu w pełni świadomej zgody komisji etycznej ds. badań na ludziach Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.

1. Izolacja i hodowla GSC pochodzących od pacjentów

1. Umieść świeżą, chirurgicznie wyciętą tkankę glejaka w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wypełnionej sterylnym PBS i przechowuj tkankę na lodzie do czasu dalszej operacji.
2. Zmiel tkankę GBM na kawałki o średnicy około 0,5 do 1 mm za pomocą nożyczek preparacyjnych i umyj próbki tkanek neuronalnym podłożem podstawnym, aby usunąć resztki komórkowe w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Trawić fragmenty tkanek za pomocą 1 mg/ml kolagenazy A w temperaturze 37 °C przez 30 minut i odwirowywać przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
4. Usunąć supernatant i zawiesić osad na ślepym neuronalnym podłożu podstawowym i mechanicznie rozdzielić osad poprzez powtarzalne pipetowanie na lodzie.
5. Hodować mieszaninę na 6-dołkowych płytkach hodowlanych o bardzo niskim przyłączu, wypełnionych pożywką hodowlaną GSC (patrz tabela 1 dla receptury) w sterylnym inkubatorze komórkowym z 5% CO₂ i wilgotnością 90% w temperaturze 37 °C, aż do powstania neurosfery.
6. Po utworzeniu się wystarczającej neurosfery zbierz je za pomocą pipety w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Zawiesić osad i podzielić go na kilka kolb wypełnionych powyższą pożywką hodowlaną w celu utrzymania pierwotnych GSC.
   UWAGA: GSC pochodzące od pacjenta użyte w przykładzie pochodziły z biopsji chirurgicznej 34-letniego pacjenta płci męskiej z nawracającym GBM IV stopnia wg WHO. Na potrzeby przyszłych eksperymentów GSC zostały nazwane XG387. Testy na obecność mykoplazmy oparte na PCR zostały przeprowadzone dla powyższych GSC, aby potwierdzić, że nie ma zanieczyszczenia mykoplazmą. Wszystkie eksperymenty z udziałem GSC użyte w tym protokole zostały przeprowadzone <15 fragmentów.

2. Przygotowanie GSC oznaczonych lucyferazą

1. Zebrać GSC z pożywki i odwirować je przy 70 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
2. Usunąć supernatant, trawić komórki za pomocą akutazy przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Kilkakrotnie użyć końcówki o pojemności 200 μl i pipety, aby oddzielić i ponownie zawiesić osad komórkowy.
3. Rozcieńczyć komórki do 2 x 10⁵ komórek na studzienkę na 12-dołkowej płytce hodowlanej i hodować komórki przez noc.
4. Dodać 30 μl supernatantu wirusa lucyferazy-EGFP (miano >^10,8 j./ml) do każdego dołka na płytce, a następnie odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Hodować komórki przez noc.
5. Odśwież pożywkę następnego dnia i hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.
6. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić pojawienie się komórek GFP dodatnich.
7. Użyj sortera komórek przepływowych, aby posortować i wybrać GSC o wysokiej fluorescencji GFP w celu dalszej hodowli komórek.

3. Pomiar żywotności komórek oparty na bioluminescencji

1. Powlekanie płytek mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (np. Matrigel): Dodać 40 μl mieszaniny ECM o stężeniu 0,15 mg/ml do każdego dołka i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar mieszaniny ECM i delikatnie spłukać raz PBS.
2. Dodać 100 μl pożywki hodowlanej zawierającej 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 i 500 komórek XG387-Luc wraz ze 100 μl pożywki ślepej jako kontrolę do każdej studzienki dla 6 powtórzeń na 96-dołkowej optycznej płytce dolnej i hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Usunąć supernatant, dodać 50 μl pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
4. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania (ROI) i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.

4. Leczenie temozolomidem i skojarzone badania przesiewowe

1. Przed zabiegiem należy wstępnie pokryć cztery 96-dołkowe płytki, jak opisano powyżej.
2. Umieść komórki XG387-Luc o gęstości 1,000 komórek w 100 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej i hoduj komórki przez noc.
3. Należy wcześniej przygotować temozolomid i docelowe środki z roztworu podstawowego. Przygotować serię stężeń składającą się z 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM i 50 μM temozolomidu w pożywce do leczenia pojedynczym środkiem. Rozcieńczyć temozolomid i środki docelowe w roztworze podstawowym w pożywce, odpowiednio, w celu uzyskania końcowych stężeń 200 μM i 2 μM do badań przesiewowych leków złożonych (Tabela 2).
4. Usunąć pożywkę hodowlaną, gdy większość GSC przylega do dna płytek; dodać wyżej przygotowaną pożywkę zawierającą temozolomid do każdej studzienki w celu uzyskania trzech powtórzeń technicznych na zabieg.
5. W celu poddania działaniu temozolomidu i przeprowadzenia badań przesiewowych kombinacji leków, należy usunąć pożywkę ślepą i dodać powyżej przygotowaną pożywkę zawierającą 200 μM temozolomidu lub 2 μM czynnika docelowego, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania trzech kontrprób technicznych na zabieg.
6. Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni.
7. Usunąć pożywkę zawierającą lek, dodać 50 μl ślepej pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
8. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele cyklicznych zwrotów z inwestycji i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.

5. Leczenie skojarzone temozolomidu i UMI-77 w liniach komórkowych XG387-Luc i XG328-Luc

1. Przed zabiegiem należy wstępnie pokryć trzy 96-dołkowe płytki, jak opisano powyżej.
2. Zasiać komórki XG387-Luc i XG328-Luc o gęstości odpowiednio 1,000 komórek w 100 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej i hodować komórki przez noc.
3. Przygotować serię stężeń składającą się z 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM i 0 μM temozolomidu oraz serię stężeń składającą się z 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM i 0 μM UMI-77 w pożywce do leczenia matrycą miareczkowania sześć na sześć.
4. Usunąć ślepą pożywkę, gdy większość SGC przylega do dna płytki; dodać wyżej przygotowaną pożywkę do każdej studzienki w celu uzyskania trzech powtórzeń technicznych na zabieg.
5. Inkubować te płytki przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
6. Usunąć pożywkę zawierającą lek; dodać 50 μl ślepej pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdego dołka i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu pomiaru bioluminescencji.

6. Analiza danych

1. Oblicz wynik wskaźnika czułości (SI) temozolomidu i środka docelowego zgodnie ze wzorem w Rysunek 2A.
   UWAGA: Wynik SI służy do ilościowego określenia wpływu dodania innego leku. Wahał się od -1 do +1, przy czym wartości dodatnie wskazywały na synergiczne działanie temozolomidu.
2. Oblicz wartości indeksu kombinacji (CI) między temozolomidem a UMI-77 za pomocą oprogramowania CompuSyn w celu analizy ich połączonych interakcji. Wartość CI <1 wskazuje na synergię; Wartość CI >1 wskazuje na antagonizm.
3. Oblicz wysokie wartości pojedynczego czynnika (HSA) między temozolomidem a UMI-77 za pomocą oprogramowania Combenefit. Wartość HSA wskazuje na połączone działanie hamujące. Wartość HSA >0 oznacza synergię, a wartość HSA <0 wskazuje na antagonizm.

Wyniki

Komórki XG387 utworzyły neurosfery w pożywce hodowlanej opisanej w Tabeli 1 na 6-dołkowej płytce hodowlanej o bardzo niskim nakładzie lub na płytce niepowlekanej⁵ (Rysunek 1A). Najpierw przeprowadzono test, aby sprawdzić, czy intensywność bioluminescencji z komórek XG387-Luc była proporcjonalna do liczby komórek. Jak pokazano w Rysunek 1B, intensywność bioluminescencji wzrastała proporcjonalnie do gęstości komórek i powodowała lini...

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisano protokół, który można zastosować do identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu GSC pochodzących od pacjenta. W przeciwieństwie do standardowego modelu metrycznego synergii/addytywności, takiego jak metody Loewe, BLISS lub HSA, zastosowano prosty i szybki przepływ pracy, który nie wymaga łączenia pary leków w wielu stężeniach w sposób w pełni silniowy, jak to ma miejsce w przypadku metod tradycyjnych. W tym przepływie pracy wprowadzono SI (wskaźnik wrażliwości), który pocho...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Hyklon penicyliny-streptomycyny		SV30010	P: 10 000 jednostek/ml        S:  10 000 ug/ml
Pirogronian sodu	Gibco	2088876	100 mM
Tabela 1. Ten  Formulacja  Sekretariatu Generalnego  Kompletna pożywka hodowlana.
ABT-737	MCE		Selektywny i mimetyczny BH3  Bcl-2,  Bcl-xL  oraz  Bcl-w  inhibitor
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1  inhibitor
Aksytynib	MCE		Wielokierunkowy inhibitor kinazy tyrozynowej
AZD5991	MCE		Mcl-1  inhibitor
A 83-01	MCE		Silny inhibitor receptora TGF-&beta typu I  Kinaza ALK5
CGP57380	Selleck		Potent  MNK1  inhibitor
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-konkurencyjny  PI3K  oraz  mTOR  inhibitor
Dazatynib	MCE		Dual  Kinaza tyrozynowa rodziny Bcr-Abl i Src  inhibitor
Erlotinib	MCE		EGFR  inhibitor kinazy tyrozynowej
Gefitynib	MCE		EGFR kinaza tyrozynowa  inhibitor
Linifanib	MCE		Multi-target inhibitor  VEGFR  oraz  PDGFR  rodzina
Masytynib	MCE		Inhibitor  c-Kit
ML141	Selleck		Niekonkurencyjny inhibitor  Cdc42 GTPaza
OSI-930	MCE		Multi-target inhibitor Kit, KDR i CSF-1R
Palbociclib	MCE		selektywny  CDK4  oraz  CDK6  inhibitor
SB 202190	MCE		Selektywny  Kinaza p38 MAP  inhibitor
bromku sepantronium (YM-155)	MCE		Survivin  inhibitor
TCS 359	Selleck		Silny inhibitor FLT3
UMI-77	MCE		Selektywny  Mcl-1  inhibitor
4-hydroksytamoksyfenu(afimoksyfen)	Selleck		Selektywny  receptor estrogenowy (ER)  modulator
Tabela 2. Informacje o 20 docelowych agentach używanych na ekranie testowym. Wszystkie te inhibitory są selektywnymi inhibitorami małocząsteczkowymi. Dostawca, nazwa i cele zostały podane w tabeli.