Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

Summary

Tutaj opisujemy procedury opracowane w naszym laboratorium do przygotowywania proszków z małych kryształów molekularnych do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED).

Abstract

Opisano szczegółowy protokół przygotowania próbek małych cząsteczek do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED). MicroED został opracowany do rozwiązywania struktur białek i małych cząsteczek przy użyciu standardowego sprzętu do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM). W ten sposób małe cząsteczki, peptydy, rozpuszczalne białka i białka błonowe zostały ostatnio określone w wysokich rozdzielczościach. Przedstawiono tu protokoły przygotowania siatek farmaceutyków małocząsteczkowych na przykładzie leku karbamazepiny. Przedstawiono protokoły badań przesiewowych i zbierania danych. Dodatkowe kroki w całym procesie, takie jak integracja danych, określanie struktury i udoskonalanie, są przedstawione w innym miejscu. Szacuje się, że czas potrzebny do przygotowania siatek drobnocząsteczkowych wynosi mniej niż 30 minut.

Introduction

Dyfrakcja elektronów mikrokrystalicznych (MicroED) to metoda kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) służąca do określania struktur o rozdzielczości atomowej z kryształów o rozmiarach submikrometrowych^1,2. Kryształy są nakładane na standardowe siatki transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) i zamrażane przez zanurzenie w ciekłym etanie lub ciekłym azocie. Siatki są następnie ładowane do TEM pracującego w temperaturach kriogenicznych. Kryształy są umieszczane na siatce i przesiewane pod kątem początkowej jakości dyfrakcji. Dane MicroED o ciągłej rotacji są zbierane z podzbioru przesiewanych kryształów, gdzie dane są zapisywane za pomocą szybkiej kamery jako movie³. Filmy te są konwertowane do standardowego formatu krystalograficznego i przetwarzane prawie identycznie jak eksperyment z krystalografią rentgenowską⁴.

MicroED został pierwotnie opracowany do badania mikrokryształów białek^1,2. Wąskim gardłem w krystalografii białek jest hodowanie dużych, dobrze uporządkowanych kryształów do tradycyjnych eksperymentów dyfrakcji synchrotronowej promieniowania rentgenowskiego. Ponieważ elektrony oddziałują z materią o rzędy wielkości silniej niż promieniowanie rentgenowskie, ograniczenia rozmiaru kryształu potrzebnego do wytworzenia wykrywalnej dyfrakcji są znacznie mniejsze⁵. Dodatkowo, stosunek zdarzeń rozpraszania sprężystego do nieelastycznego jest korzystniejszy dla elektronów, co sugeruje, że można zebrać bardziej użyteczne dane przy mniejszej ogólnej ekspozycji⁵. Ciągły rozwój pozwolił na zbieranie danych MicroED z najtrudniejszych mikrokryształów^6,7,8,9.

Ostatnio okazało się, że MicroED jest potężnym narzędziem do określania struktur małocząsteczkowych farmaceutyków z pozornie amorficznych materiałów^10,11,12,13. Proszki te mogą pochodzić prosto z butelki zakupionego odczynnika, kolumny oczyszczającej, a nawet z rozdrobnienia pigułki na drobny proszek¹⁰. Proszki te wydają się amorficzne na oko, ale mogą być albo w całości złożone z nanokryształów, albo zawierać tylko śladowe ilości osadów nanokrystalicznych w większej niekrystalicznej, amorficznej frakcji. Nakładanie materiału na siatkę jest łatwe, a kolejne etapy identyfikacji kryształów, badań przesiewowych i zbierania danych mogą zostać nawet zautomatyzowane w niedalekiej przyszłości¹⁴. Podczas gdy inni mogą stosować różne metody przygotowania próbek i zbierania danych, tutaj szczegółowo opisano protokoły opracowane i stosowane w laboratorium Gonen do przygotowywania próbek małych cząsteczek do MicroED i do zbierania danych.

Protocol

1. Przygotowanie próbek małych cząsteczek

1. Przenieść niewielką ilość (0,01 - 1 mg) proszku, płynu lub ciał stałych do małej fiolki lub probówki.
2. W przypadku próbek już w postaci proszku należy zamknąć probówkę za pomocą nakrętki do momentu, gdy próbka będzie potrzebna. Wysuszyć próbki cieczy na proszki przed próbami metody 1 (etap 3) lub 2 (etap 4).
   UWAGA: Próbki rozpuszczone w cieczy mogą być objęte metodą 3 (5.X) poniżej

2. Przygotowanie siatek TEM

UWAGA: Niektóre TEMy z systemami automatycznego ładowania wymagają, aby siatki były przycięte i umieszczone w kasecie przed załadowaniem do kolumny TEM. Clipping polega na fizycznym zamocowaniu siatki TEM 3 mm w metalowym pierścieniu, którym może manipulować automat ładujący. Ten krok i kolejne kroki można wykonać przy użyciu normalnych siatek TEM lub siatek TEM, które zostały przycięte. W przypadku tych eksperymentów często łatwiej jest manipulować siatkami, jeśli zostały one wcześniej przycięte.

1. Owiń folię z tworzywa sztucznego wokół jednego końca szkiełka podstawowego.
2. Umieść siatki TEM na folii na górze szkiełka pokrywy stroną z włókna węglowego skierowaną do góry. Zidentyfikuj dwie strony siatki pod światłem. Strona miedziana błyszczy i wydaje się metaliczna, podczas gdy strona węglowa ma szary, brązowy kolor (Rysunek 1C,D). W przypadku przyciętych siatek strona z włókna węglowego powinna być skierowana w stronę płaskiej powierzchni pierścienia zaciskowego.
3. Umieść szkiełko z kratkami w komorze wyładowczej jarzeniowej. Rozładowuj jarzenie przez pokrywę przez około 30 s przy ujemnym ustawieniu na 15 pA. Przechowywać kratki na szkiełku pokrywy wewnątrz szklanej szalki Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną przed dodaniem próbki do kratek.

3. Nakładanie próbki na siatki poprzez tworzenie jednorodnego drobnego proszku (Metoda 1)

1. Usuń rozżarzoną siatkę TEM z zakrytej szalki Petriego za pomocą pęsety. Umieść siatkę na okrągłej bibule filtracyjnej stroną węglową skierowaną do góry.
2. Za pomocą małej szpatułki wyjmij bardzo małą miarkę proszku (około 0,1 mg) i umieść ją na małym, kwadratowym, szklanym szkiełku nakrywkowym tuż obok siatki TEM na bibule filtracyjnej. Umieść kolejne małe kwadratowe szkiełko lub szkiełko nakrywkowe na wierzchu proszku.
3. Palcami delikatnie przetrzyj ze sobą dwa szklane szkiełka, aby uzyskać drobny proszek.
4. Ustaw szkiełka nakrywkowe pod kątem i umieść je tuż nad siatką TEM na bibule filtracyjnej i kontynuuj pocieranie szkiełek nakrywkowych, zaledwie kilka cm powyżej rozżarzonej siatki TEM (Rysunek 1).
5. Obserwuj, czy proszek spada w kierunku siatki. Odsłoń drobno zmielony proszek, usuwając jedno z dwóch szklanych szkiełek nakrywkowych. Delikatnie zetrzyj drobny proszek z szkiełka nakrywkowego za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej na siatkę TEM (Rysunek 1).

4. Nakładanie próbki na siatkę metodą "wstrząsania" (Metoda 2)

1. Chwyć siatkę za pomocą pęsety i wrzuć ją do fiolki lub probówki z próbką proszku. Zamknąć fiolkę za pomocą plastikowej nakrętki, aby upewnić się, że materiał nie wydostanie się na zewnątrz podczas wstrząsu.
2. Chwytając fiolkę w dłoń, potrząsnąć fiolką tak, aby proszek i siatka poruszały się przez około 10 - 30 sekund.
3. Opróżnij zawartość fiolki na okrągłą bibułę filtracyjną. Chwytając siatkę za krawędź, delikatnie postukaj krawędzią siatki o bibułę filtracyjną, aby usunąć nadmiar materiału z siatki.
   UWAGA: W zależności od rodzaju i wielkości fiolki można również użyć pęsety do usunięcia siatki TEM bez opróżniania zawartości.

5. Nakładanie próbki na siatki metodą odparowywania (Metoda 3)

1. Umieść siatkę (przypiętą lub nie) na środku okrągłego kawałka bibuły filtracyjnej stroną węglową skierowaną do góry, a miedzianą stroną skierowaną w dół.
2. Za pomocą gazoszczelnej strzykawki o pojemności 10 μl nanieść niewielką kroplę (około 1 - 3 μl) rozpuszczonego związku na węglową stronę siatki.
3. Delikatnie przenieś bibułę filtracyjną z kratkami do próżniowej komory osuszającej. Przykryj komorę i włącz próżnię. Pozostaw kratki pod odkurzaczem do wyschnięcia na okres do jednego dnia.
4. Wyłącz próżnię i pozwól komorze odpocząć przez 5 minut. Odpowietrzenie komory zapobiega przesuwaniu się lub odlatywaniu kratek, gdy jest odkryta.

6. Zamrażanie i wczytywanie siatek do TEM

1. Chwyć krawędź siatki TEM za pomocą zestawu pęsety, upewniając się, że końcówki nie przebijają żadnego z kwadratów siatki. Podnieś siatkę 1-2 cm nad bibułę filtracyjną i ustaw ją pod kątem 90° w stosunku do bibuły poniżej. Delikatnie postukaj w pęsetę, trzymając siatkę mocno napiętą, aby usunąć luźny proszek.
2. Zamroź siatkę, przesuwając ręcznie końcówkę pęsety z siatką bezpośrednio do pojemnika na ciekły azot. Ten pojemnik jest zazwyczaj stacją załadunku siatki dla TEM, ale może to być dowolny bezpieczny pojemnik, taki jak bezpieczny termos z ciekłym azotem, który jest dopuszczalny do przenoszenia lub przechowywania. Ciekły azot ma temperaturę -196 °C.
3. Poczekaj, aż siatka i pęseta przestaną wrzeć przed dalszymi manipulacjami.
4. Pod ciekłym azotem lub w oparach azotu umieścić siatkę w uchwycie próbki stroną z włókna węglowego zorientowaną w taki sposób, aby próbka została uderzona przez wiązkę przed folią nośną z węgla.
5. Załadować uchwyt próbki do TEM, upewniając się, że siatka jest przez cały czas utrzymywana w temperaturze ciekłego azotu.
   1. W przypadku systemów automatycznego ładowania należy umieścić przycięte kratki w kasecie w pojemniku chłodzonym ciekłym azotem. Kaseta ta jest przenoszona do kontenera wahadłowego, co pozwala robotom automatycznego podajnika na przyjęcie kasety, jednocześnie zapewniając bezpieczeństwo próbek do transportu między automatycznym podajnikiem a kolumną.
   2. W przypadku konfiguracji TEM z bocznym wejściem przymocuj siatkę do komercyjnego uchwytu TEM z bocznym wejściem. Uchwyty te są wyposażone w pojemnik do przygotowania próbki, który jest wypełniony ciekłym azotem, aby umożliwić przeniesienie siatki do uchwytu bez podgrzewania próbki. Uchwyt z bocznym wejściem wkłada się do TEM bezpośrednio, a próbka jest zabezpieczona na końcu.

7. Zbieranie danych MicroED

1. Lokalizowanie i badania przesiewowe nanokryształów
   1. Otwórz zawory kolumny TEM. Dostosuj powiększenie za pomocą paneli dłoni do najniższego możliwego powiększenia. Znajdź wiązkę, regulując pokrętło intensywności na panelach dłoni tak, aby na ekranie fluorescencyjnym widoczny był okrągły, jasny obszar.
   2. Wykonaj atlas całej siatki w małym powiększeniu (50 - 300x) za pomocą odpowiedniego oprogramowania^14,15,16 (Rysunek 2). Upewnij się, że mikroskop jest dobrze ustawiony zarówno do obrazowania w małym, jak i dużym powiększeniu przed zebraniem danych MicroED o wysokiej rozdzielczości.
   3. Zidentyfikuj kwadraty siatki bez połamanego węgla i z widocznym czarnym lub ciemnym materiałem/ziarnami na folii (Rysunek 2). Poruszaj się po siatce, fizycznie za pomocą joysticka na panelach dłoni lub wirtualnie na zebranym Atlasie, aby wyszukać kwadraty siatki, które nie są złamane i zawierają mikrokryształy.
   4. Dodaj środek każdego z tych kwadratów do listy lokalizacji siatki do zbadania. Lokalizacje te można dodać do notebooka, w interfejsie użytkownika mikroskopu lub w oprogramowaniu do automatyzacji mikroskopu.
   5. Zwiększ powiększenie do 500-1,300x i dostosuj wysokość eucentryczną w każdym zapisanym miejscu siatki i zaktualizuj zapisaną wartość Z do pozycji zanotowanych w 7.1.4.
   6. Szukaj na ekranie fluorescencyjnym lub w szybkim aparacie przy tym większym powiększeniu małych czarnych punktów/ziaren na siatce. Dobra próbka często ma ostre krawędzie przy dużym powiększeniu, co sugeruje porządek krystaliczny.
   7. Przesuń zlokalizowany kryształ potencjału na środek ekranu i zwiększ powiększenie tak, aby TEM przeszedł w tryb dużego powiększenia.
      UWAGA: Jest to określane jako tryb dużego powiększenia, Zoom2 lub SA w różnych instrumentach i zazwyczaj odpowiada powiększeniom 3,000x lub wyższym.
   8. Wstawianie otworu zaznaczonego obszaru. Zmień przysłonę na większy lub mniejszy, aby upewnić się, że wybrany obszar jest po prostu większy niż kryształ (Rysunek 3).
   9. Przełącz się w tryb dyfrakcji, naciskając przycisk dyfrakcji na panelach ręcznych TEM, upewniając się, że ekran fluorescencyjny jest włożony. Dostosuj długość kamery za pomocą pokrętła powiększenia tak, aby krawędź miała rozdzielczość co najmniej 1 A.
      UWAGA: Kalibracja długości dyfrakcji powinna być wykonana przez inżyniera serwisu przy użyciu złotej kraty waflowej lub znanej próbki przed przystąpieniem do eksperymentów MicroED.
   10. Dostosuj ostrość dyfrakcyjną tak, aby centralny punkt był jak najbardziej ostry i mały. Za pomocą pokręteł zmiany biegów dyfrakcyjnych przesuń wiązkę środkową do środka ekranu fluorescencyjnego
   11. Włóż ogranicznik belki i upewnij się, że belka znajduje się za nim. Podnieś ekran fluorescencyjny. Wykonaj krótką (około 1 s) ekspozycję na kamerze (Rysunek 4).
   12. Sprawdź odpowiedni wzór dyfrakcyjny. Dobry kandydat do zebrania pełnego zbioru danych będzie miał ostre punkty, które są regularnie ułożone w kolumnach i rzędach, a dyfrakcja będzie rozciągać się poza 2 A, najlepiej co najmniej do 1 A (Rysunek 4). Zapisz współrzędne kryształu w interfejsie użytkownika TEM lub zapisując je.
   13. Powtórz badanie dyfrakcyjne dla wszystkich potencjalnych kryształów będących przedmiotem zainteresowania na bieżącym kwadracie siatki.
2. Gromadzenie danych
   1. Wyśrodkuj ekranowany kryształ na ekranie przy dużym powiększeniu (> 1,000x). Dostosuj eucentryczną wysokość kryształu za pomocą procedury automatycznej lub ręcznie.
   2. Wstaw otwór wybranego obszaru, który najlepiej pasuje do rozmiaru i kształtu kryształu, jak określono w 7.1.8 (Rysunek 3). Przechyl stolik w kierunku ujemnym i dodatnim, aż obraz zostanie zasłonięty przez paski siatki (Rysunek 3). Zanotuj te kąty w celu zbierania danych.
   3. Określ liczbę klatek, które będą wymagane do rozciągnięcia całkowitego klina kątowego zestawu danych. Typowe jest użycie klinów 0,5 - 1,0° dla każdej klatki, przy czym klatki są odczytywane co 1 do 5 sekund, w zależności od czułości kamery. Na przykład klin o rozpiętości od -30° do +30°, obracający się ze stałą prędkością 1° ^s-1 z klatką odczytywaną co 1 s, wymagałby łącznie 60 klatek.
   4. Biorąc pod uwagę maksymalny całkowity zakres pochylenia od -72° do +72°, rozpocznij obracanie stolika ze stałą szybkością 1° ^s-1, a następnie zacznij odczytywać dane co 1 s w nowoczesnym aparacie z trybem odczytu rolling shutter (Film 1). Proces ten można wykonać ręcznie lub za pomocą specjalnego oprogramowania TEM.
      1. Ustaw prędkość obrotową, określając % maksymalnej prędkości pochylenia i czas zatrzymania w interfejsie użytkownika mikroskopu lub dedykowanym oprogramowaniu. W tym badaniu zmierzono wartość 0,3° ^s-1 na każdy % prędkości maksymalnej, ale będzie to musiało zostać niezależnie zweryfikowane dla każdego mikroskopu.
         UWAGA: Przechylanie i zbieranie danych z kamery są tutaj konfigurowane niezależnie, ale programy¹⁴ mogą to koordynować, aby uprościć proces.
      2. Odrzuć około 1° z każdej strony określonego klina w większości przypadków jako czas martwy, w którym stage albo rośnie, albo zwalnia do żądanej prędkości obrotowej.
   5. Zapisuj dane w różnych formatach jako pojedyncze klatki lub jako stos obrazów (Film 1).
   6. Przekształć te ramki dyfrakcyjne do typowego formatu krystalograficznego za pomocą narzędzi MicroED - dostępnych tutaj (https://cryoem.ucla.edu). Obrazy dyfrakcyjne zapisane w formacie SMV są łatwo przetwarzane za pomocą udokumentowanego oprogramowania krystalograficznego^17,18.

Results

MicroED to metoda cryoEM, która wykorzystuje silne oddziaływania między elektronami a materią, co pozwala na badanie znikomo małych kryształów^12,13. Po tych krokach oczekuje się, że z mikrokryształów zostanie pobrany film dyfrakcyjny w formacie krystalograficznym (film 1). Tutaj technika jest demonstrowana przy użyciu carbamazepine¹². Wyniki pokazują ciągły rotacyjny zestaw danych MicroED z mikrokryształu karbamazepiny zid...

Discussion

Przygotowanie próbki jest zazwyczaj procesem iteracyjnym, w którym optymalizacje są dokonywane po sesjach badań przesiewowych i zbierania danych. W przypadku próbek małocząsteczkowych często rozsądnie jest najpierw podjąć próbę przygotowania siatki bez rozładowania jarzeniowego, ponieważ wiele farmaceutyków ma tendencję do hydrofobowości^10,11. Jeśli siatki mają zbyt mało nanokrystalicznych osadów, dobrym pomysłem jest ponowienie próby po pierwszym rozładowaniu ja...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1-1,5 ml probówki Eppendorf	Fisher Scientific	14-282-300	Każda fiolka lub probówka będzie odpowiednia.
Klipsy z automatyczną siatką	Thermo-Fisher	1036173	Siatki przycięte nie są wymagane w przypadku MicroED. Są one wymagane w przypadku maszyn TEM Thermo-Fisher wyposażonych w system automatycznego ładowania.
Pierścienie C z automatyczną siatką	Thermo-Fisher	1036171
Carbamazapine	Sigma	C4024-1G	Do tych eksperymentów wystarczy dowolna ilość
Detektor oparty na CMOS	Thermo-Fisher	CetaD 16M	Użyliśmy CetaD 16M, ale każdy detektor z trybem rolling shutter lub wystarczająco szybkim odczytem jest dopuszczalny.
Oprogramowanie Delphi	Thermo-Fisher	N/A	Oprogramowanie w systemach TEM Thermo-Fisher, które pozwala na ręczne obracanie stolika na próbkę
Oprogramowanie EPU-D	Thermo-Fisher	N/A	Komercyjne oprogramowanie do pozyskiwania danych MicroED
Szkiełka szklane	Hampton	HR3-231
Wyładowarka żarowa	Pelco	easiGlow
High PrecisionPęseta	EMS	78325-AC	Każda precyzyjna pęseta zrobi to
: Naczynie z ciekłym azotem	Spear Lab	FD-800	Standardowe naczynie piankowe do przenoszenia próbek pod ciekłym azotem - 800 ml
Oprogramowanie SerialEM	UC Boulder	N/A	Darmowe oprogramowanie dystrybuowane przez D. Mastronarde. Zakład Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwoju Siatki
TEM	Quantifoil/EMS	Q310CMA	Multi-A 300 mesh, ale wszelkie cienkie siatki węglowe będą działać. W przypadku tych małych cząsteczek sugerujemy rozpoczęcie od węgla ciągłego.
transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)	Bibuła filtracyjna okrągła Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman	Millipore-Sigma	WHA1001090	90 mm lub większa