Method Article

Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy procedury opracowane w naszym laboratorium do przygotowywania proszków z małych kryształów molekularnych do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano szczegółowy protokół przygotowania próbek małych cząsteczek do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED). MicroED został opracowany do rozwiązywania struktur białek i małych cząsteczek przy użyciu standardowego sprzętu do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM). W ten sposób małe cząsteczki, peptydy, rozpuszczalne białka i białka błonowe zostały ostatnio określone w wysokich rozdzielczościach. Przedstawiono tu protokoły przygotowania siatek farmaceutyków małocząsteczkowych na przykładzie leku karbamazepiny. Przedstawiono protokoły badań przesiewowych i zbierania danych. Dodatkowe kroki w całym procesie, takie jak integracja danych, określanie struktury i udoskonalanie, są przedstawione w innym miejscu. Szacuje się, że czas potrzebny do przygotowania siatek drobnocząsteczkowych wynosi mniej niż 30 minut.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dyfrakcja elektronów mikrokrystalicznych (MicroED) to metoda kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) służąca do określania struktur o rozdzielczości atomowej z kryształów o rozmiarach submikrometrowych1,2. Kryształy są nakładane na standardowe siatki transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) i zamrażane przez zanurzenie w ciekłym etanie lub ciekłym azocie. Siatki są następnie ładowane do TEM pracującego w temperaturach kriogenicznych. Kryształy są umieszczane na siatce i przesiewane pod kątem początkowej jakości dyfrakcji. Dane MicroED o ciągłej rotacji są zbierane z podzbioru przesiewanych kryształów, gdzi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek małych cząsteczek

  1. Przenieść niewielką ilość (0,01 - 1 mg) proszku, płynu lub ciał stałych do małej fiolki lub probówki.
  2. W przypadku próbek już w postaci proszku należy zamknąć probówkę za pomocą nakrętki do momentu, gdy próbka będzie potrzebna. Wysuszyć próbki cieczy na proszki przed próbami metody 1 (etap 3) lub 2 (etap 4).
    UWAGA: Próbki rozpuszczone w cieczy mogą być objęte metodą 3 (5.X) poniżej

2. Przygotowanie siatek TEM

UWAGA: Niektóre TEMy z systemami automatycznego ładowania wymagają, aby siatki były przycięte i umieszczone w kasecie przed załadowa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroED to metoda cryoEM, która wykorzystuje silne oddziaływania między elektronami a materią, co pozwala na badanie znikomo małych kryształów12,13. Po tych krokach oczekuje się, że z mikrokryształów zostanie pobrany film dyfrakcyjny w formacie krystalograficznym (film 1). Tutaj technika jest demonstrowana przy użyciu carbamazepine12. Wyniki pokazują ciągły rotacyjny zestaw danych MicroED z mikrokryształu karbamazepiny zid.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie próbki jest zazwyczaj procesem iteracyjnym, w którym optymalizacje są dokonywane po sesjach badań przesiewowych i zbierania danych. W przypadku próbek małocząsteczkowych często rozsądnie jest najpierw podjąć próbę przygotowania siatki bez rozładowania jarzeniowego, ponieważ wiele farmaceutyków ma tendencję do hydrofobowości10,11. Jeśli siatki mają zbyt mało nanokrystalicznych osadów, dobrym pomysłem jest ponowienie próby po pierwszym rozładowaniu ja.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium Gonen jest wspierane przez fundusze z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health P41GM136508.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-1,5 ml probówki EppendorfFisher Scientific14-282-300Każda fiolka lub probówka będzie odpowiednia.
Klipsy z automatyczną siatkąThermo-Fisher1036173Siatki przycięte nie są wymagane w przypadku MicroED. Są one wymagane w przypadku maszyn TEM Thermo-Fisher wyposażonych w system automatycznego ładowania.
Pierścienie C z automatyczną siatkąThermo-Fisher1036171
CarbamazapineSigmaC4024-1GDo tych eksperymentów wystarczy dowolna ilość
Detektor oparty na CMOSThermo-FisherCetaD 16MUżyliśmy CetaD 16M, ale każdy detektor z trybem rolling shutter lub wystarczająco szybkim odczytem jest dopuszczalny. 
Oprogramowanie DelphiThermo-FisherN/AOprogramowanie w systemach TEM Thermo-Fisher, które pozwala na ręczne obracanie stolika na próbkę
Oprogramowanie EPU-DThermo-FisherN/AKomercyjne oprogramowanie do pozyskiwania danych MicroED
Szkiełka szklaneHamptonHR3-231
Wyładowarka żarowaPelcoeasiGlow
High PrecisionPęsetaEMS78325-ACKażda precyzyjna pęseta zrobi to
: Naczynie z ciekłym azotemSpear LabFD-800Standardowe naczynie piankowe do przenoszenia próbek pod ciekłym azotem - 800 ml
Oprogramowanie SerialEMUC BoulderN/ADarmowe oprogramowanie dystrybuowane przez D. Mastronarde. Zakład Biologii Molekularnej, Komórkowej i Rozwoju Siatki
TEMQuantifoil/EMSQ310CMAMulti-A 300 mesh, ale wszelkie cienkie siatki węglowe będą działać. W przypadku tych małych cząsteczek sugerujemy rozpoczęcie od węgla ciągłego. 
transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)Bibuła filtracyjna okrągła Thermo-FisherTalos Arctica
WhatmanMillipore-SigmaWHA100109090 mm lub większa
, Zastosowano tutaj siatki

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microcrystal Electron DiffractionSmall Molecule StructureMicroED ProtocolElectron Cryo MicroscopyTEM Grid PreparationHigh Resolution StructureDiffraction Data CollectionCrystallographic SoftwareSample PreparationAtomic Resolution

Related Articles