Artykuł metodologiczny

Przygotowanie warstw nośnych próbek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu bloku flotacyjnego

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62321

⸱

8 kwietnia 2021

 ,  , 
1Section of Structural & Synthetic Biology, Department of Infectious Diseases, Faculty of Medicine, Imperial College London, South Kensington Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jest znaczącym wąskim gardłem w procesie określania struktury tej metody. W tym miejscu podajemy szczegółowe metody wykorzystania łatwego w użyciu, drukowanego trójwymiarowo bloku do przygotowania folii nośnych do stabilizacji próbek do transmisyjnych badań EM.

Streszczenie

Określanie struktury za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) gwałtownie wzrosło w ciągu ostatniej dekady; jednak przygotowanie próbek pozostaje znaczącym wąskim gardłem. Próbki makromolekularne są idealnie obrazowane bezpośrednio z przypadkowych orientacji w cienkiej warstwie szklistego lodu. Jednak wiele próbek jest na to opornych, a denaturacja białek na granicy faz powietrze-woda jest częstym problemem. Aby przezwyciężyć takie problemy, folie nośne - w tym węgiel amorficzny, grafen i tlenek grafenu - można nałożyć na siatkę, aby zapewnić powierzchnię, na której próbki mogą się zasiedlić, zmniejszając prawdopodobieństwo, że cząstki doświadczą szkodliwego wpływu granicy faz powietrze-woda. Zastosowanie tych delikatnych podpór do kratek wymaga jednak ostrożnego obchodzenia się, aby zapobiec pęknięciu, zanieczyszczeniu powietrza lub rozległym etapom mycia i czyszczenia. Niedawny raport opisuje opracowanie łatwego w użyciu bloku flotacyjnego, który ułatwia zwilżane przenoszenie folii nośnych bezpośrednio na próbkę. Zastosowanie bloku minimalizuje liczbę wymaganych czynności związanych z ręczną obsługą, zachowując fizyczną integralność folii nośnej oraz czas, w którym może dojść do zanieczyszczenia hydrofobowego, zapewniając, że nadal może powstać cienka warstwa lodu. Niniejszy artykuł zawiera protokoły krok po kroku dotyczące przygotowania nośników węgla, grafenu i tlenku grafenu do badań EM.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady, przełomowe odkrycia, głównie w technologii detektorów, ale także w innych dziedzinach technicznych, umożliwiły szereg znacznych wzrostów rozdzielczości, w której biologicznie istotne systemy mogą być obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)1,2. Pomimo faktu, że cryo-EM pozwala już na rozdzielczość struktur o wysokiej rozdzielczości już od 50 μg białka poprzez analizę pojedynczych cząstek (SPA), próbki cryo-EM i przygotowanie siatki pozostają głównymi wąskimi gardłami3,4,5. Próbki SPA składają się z makrocząsteczek rozmieszczonych w przybliżeniu losowo w warstwie szklistego lodu. Lód musi być tak cienki, jak to możliwe, aby zmaksymalizować różnicę kontrastu między cząstkami a rozpuszczalnikiem. Makrocząsteczki biologiczne są bardziej stabilne (tj. rzadziej tracą swoją naturalną strukturę) w grubszym lodzie, ponieważ pozostają lepiej solwatowane. Co więcej, często okazuje się, że cząstki są znacznie lepiej rozłożone w polu widzenia w lodzie znacznie grubszym niż rozmiar cząstek6 i często w ogóle nie można ich znaleźć w otworach w warstwach węglowych.

Dodatkowo, grubsze warstwy lodu zmniejszają prawdopodobieństwo znalezienia się cząsteczek blisko granicy faz powietrze-woda ze względu na wysoki stosunek powierzchni do objętości, a oszacowano, że użycie standardowych metod zamrażania wgłębnego do badań krio-EM powoduje adsorpcję ~90% cząstek na granicy faz powietrze-woda7. Grubszy lód powoduje niepożądanie wysokie tło ze względu na zwiększone rozpraszanie w rozpuszczalniku i jednoczesne tłumienie sygnału6,7. Dlatego konieczne jest uzyskanie jak najcieńszej warstwy lodu szklistego; Idealnie byłoby, gdyby warstwa była tylko nieznacznie grubsza od cząstki. Wyzwaniem dla badacza, które musi zostać pokonane dla każdej próbki nakładanej na siatkę, jest przygotowanie próbek wystarczająco cienkich do obrazowania o wysokim kontraście, przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej cząstek w próbce. Adsorpcji białek na granicy faz powietrze-woda towarzyszy kilka, zwykle szkodliwych efektów.

Po pierwsze, wiązanie białek z tym hydrofobowym interfejsem często wywołuje denaturację białka, która postępuje szybko i jest zazwyczaj nieodwracalna8,9. Badanie przeprowadzone przy użyciu syntazy kwasów tłuszczowych drożdży wykazało, że do 90% zaadsorbowanych cząstek jest denaturowanych10. Po drugie, dowody z badania porównującego rozkład orientacji zestawów danych rybosomów 80S zebranych na amorficznym węglu11 lub bez wsparcia12 wykazały, że interfejs powietrze-woda może powodować poważną preferencyjną orientację, zagrażając rekonstrukcji 3D objętości13. Metody mające na celu zmniejszenie interakcji cząstek z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda obejmują uzupełnianie buforu zamrażającego środkami powierzchniowo czynnymi (takimi jak detergenty), stosowanie folii nośnych, wychwytywanie powinowactwa lub rusztowanie substratów oraz przyspieszone czasy zanurzania. Stosowanie środków powierzchniowo czynnych wiąże się z własnymi problemami, ponieważ niektóre próbki białek mogą zachowywać się nieidealnie w ich obecności, podczas gdy podłoża wychwytujące powinowactwo i rusztowania na ogół wymagają inżynierii niestandardowych powierzchni siatki i strategii wychwytywania. Wreszcie, mimo że istnieje wiele badań nad rozwojem urządzeń do szybkiego zanurzania14,15,16, wymagają one aparatury, która na ogół nie jest powszechnie dostępna.

Chociaż standardowa siatka TEM dla biologicznego cryo-EM zawiera już perforowaną amorficzną folię węglową17, istnieje wiele dostępnych protokołów do generowania dodatkowych folii nośnych i ich transferu do siatek TEM. Stosowanie tych folii jest od dawna znaną metodą stabilizacji próbek18. Amorficzne nośniki węglowe są generowane przez parowanie i osadzanie na arkuszach miki krystalicznej19, z których warstwy mogą być unoszone na siatki, z użytecznością podpór flotacyjnych jako użytecznych narzędzi ustalonych we wcześniejszych raportach20. Płatki tlenku grafenu, zwykle przygotowywane przy użyciu zmodyfikowanej wersji metody Hummers21, były używane jako preferowana struktura nośna dla amorficznego węgla ze względu na ich zmniejszony sygnał tła, a także zdolność do immobilizacji i stabilizacji makrocząsteczek22. Ostatnio wzrosło zainteresowanie wykorzystaniem grafenu jako folii nośnej TEM ze względu na jego stabilność mechaniczną, wysoką przewodność, wyjątkowo niski wpływ na szum tła23, a także pojawienie się powtarzalnych metod generowania makroskopowo dużych obszarów monowarstwowego grafenu24 i przenoszenia go do siatek TEM25. W porównaniu z węglem amorficznym, który podlega ruchom wywołanym wiązką podobnie lub gorzej niż lód pozbawiony warstwy nośnej11,12,17, grafen wykazał znaczne zmniejszenie ruchu wywołanego wiązką obrazów cryo-EM12.

Jednakże, podczas gdy hydrofilizowany grafen chronił syntazę kwasów tłuszczowych przed międzyfazową denaturacją powietrze-woda, autorzy tego badania zauważyli, że grafen został zanieczyszczony podczas przygotowywania próbki, prawdopodobnie z powodu kombinacji zanieczyszczenia atmosferycznego węglowodorami i odczynnika używanego do hydrofilizacji siatek10. Rzeczywiście, pomimo wielu doskonałych właściwości grafenu, jego powszechne stosowanie jest nadal utrudnione przez derywatyzację wymaganą do zmniejszenia jego hydrofobowości12, co ostatecznie jest trudne chemicznie i wymaga specjalistycznego sprzętu. W tym artykule opisano protokoły przygotowania amorficznego węgla, tlenku grafenu i nośników próbek grafenu przy użyciu trójwymiarowo wydrukowanego (3D) bloku flotacji próbki27 w celu bezpośredniego przeniesienia folii nośnych z podłoży, na których zostały wygenerowane, do siatek TEM (Rysunek 1). Kluczową zaletą stosowania takiego urządzenia jest mokry transfer folii, minimalizacja zanieczyszczenia hydrofobowego podpór, a co za tym idzie konieczność dalszej obróbki, oraz zmniejszenie liczby potencjalnie szkodliwych etapów ręcznego przenoszenia. Podejścia te są niedrogie do wdrożenia, a zatem szeroko dostępne i mają zastosowanie w badaniach krio-EM, w których niezbędne są nośniki próbek.

Protokół

1. Ogólne przygotowanie do transferu wstępnego wsparcia siatek TEM

  1. Za pomocą czystej, cienkiej pęsety podnieś i zanurz kolejno siatki TEM w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O) lub wodzie ultraczystej na 10-15 s, a następnie octanie etylu przez 10-15 s.
    UWAGA: Tutaj użyto pęsety o działaniu negatywnym i skośnej.
  2. Umieść pęsetę, z siatką nadal w uchwycie, na bok, do wyschnięcia na powietrzu przez ~5 minut.
  3. Oczyść kratki plazmowo, aby usunąć z powierzchni wszelkie zanieczyszczenia nagromadzone przez powietrze lub etapy mycia.
    UWAGA: W tym przypadku czyszczenie plazmą odbywało się przez 10-15 s w powietrzu o mocy 25 W o częstotliwości radiowej.

2. Ogólne przygotowanie roztworów odczynników

  1. Roztwór octanu uranylu (UAc) (2% w/v)
    1. Zawiń probówkę o pojemności 50 ml w folię, napełnij 50 ml ultraczystej wody i dodaj 1 g proszku UAc.
      UWAGA: UAc jest wrażliwy na światło i wytrąca się z czasem po wystawieniu na działanie promieni słonecznych. Ponieważ UAc jest radioaktywny i toksyczny, utrzymuj wysoki poziom czystości. W przypadku najpoważniejszego zagrożenia wynikającego z wdychania lub spożycia należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec możliwości wdychania drobnych cząstek. Podczas obchodzenia się z solami uranu lub ich ważenia należy zawsze nosić rękawice. Maski i gogle wysoce zalecane. Sole uranu muszą być utylizowane zgodnie z wymogami prawnymi określonymi dla zagrożeń radioaktywnych w państwie.
    2. Pozostaw roztwór mieszając przez 1 godzinę, aby cały UAc się rozpuścił. Przechowywać w temperaturze 4°C.
    3. Przed użyciem przefiltrować 1 ml roztworu barwienia do małej fiolki za pomocą filtra 0,22 μm, aby usunąć wszelkie pozostałe kryształy octanu.
  2. Zawiesina tlenku grafenu (GrOx)
    1. Odpipetować 2,5 μl GrOx do probówki o pojemności 1,5 ml (1% stężenie końcowe). Odpipetować 2,5 μl 10% (w/v) detergentu n-dodecyl β-D-maltozydu (DDM) do GrOx i delikatnie wymieszać (0,1% (w/v) stężenie końcowe).
    2. Do mieszanki GrOx-DDM dodać 245 μl ultraczystej wody i natychmiast energicznie wirować przez 5 min. Zawiesinę GrOx należy stosować w ciągu 1 godziny od przygotowania, przed bezpośrednim użyciem energicznie wirować przez co najmniej 1 minutę.
  3. Roztwór chlorku żelaza(III) (FeCl3) (10% w/v)
    1. Ostrożnie zważyć 5 g FeCl3 w łódce wagowej. Przenieść do 100 ml cylindra miarowego zawierającego 35 mlddH2O i mieszadła magnetycznego.
    2. Umieścić na magnetycznej płytce mieszającej i rozpuścić FeCl3, dodając ddH2O do końcowej objętości 50 ml. Przefiltruj roztwór FeCl3 przez filtr strzykawkowy 0,8 μm do czystej butelki do przechowywania.
      UWAGA: FeCl3 jest i drażniący; Myj ręce i inne odsłonięte miejsca łagodnym mydłem i wodą przed jedzeniem, piciem lub paleniem oraz po wyjściu z pracy. Zapewnić dobrą wentylację w obszarze procesu, aby zapobiec tworzeniu się pary. Nie wdychać mgły, oparów, sprayu. Podczas obchodzenia się z solą lub ważenia soli należy zawsze nosić rękawice. Maski i gogle są wysoce zalecane zawsze, gdy są używane.

3. Wymiana buforu na warstwy nośnika węglowego na mice w celu przygotowania próbek barwionych ujemnie za pomocą bloku flotacji nośnika

  1. Umyj i wyczyść plazmowo kratki TEM.
    UWAGA: W tym przypadku użyto 300 siatek z miedzi węglowo-węglowej, jak opisano powyżej w sekcji 1.
  2. Pobrać pipetą 10-12 μl próbki do studzienki wymiany buforowej (z małymi kanałkami) bloku flotacyjnego i 10-12 μl 2% roztworu UAc (patrz sekcja 2.1) w celu barwienia ujemnego do sąsiedniego dołka niebuforowego.
    UWAGA: Studnia ma objętość 10 μL; Należy jednak dostosować objętość próbki tak, aby na powierzchni cieczy utworzył się wypukły menisk, aby umożliwić prawidłowe unoszenie się filmu. Mała objętość próbki może spowodować pęknięcie filmu.
  3. Ostrożnie pokrój dwa małe kawałki miki z wstępnie osadzoną folią węglową na wierzchu. Upewnij się, że fragmenty miki są wystarczająco szerokie, aby zmieścić się w studzience (szerokość 3,4 mm) i dłuższe niż długość studzienki (3,45 mm), tak aby fragment siedział na studni, gdy węgiel unosił się na wodzie, i było wystarczająco dużo miejsca, aby poradzić sobie z fragmentem za pomocą pęsety.
    UWAGA: Aby poradzić sobie z węglem, użyj płaskiej pęsety z długą końcówką o działaniu ujemnym. Podczas cięcia fragmentów miki należy ciąć pojedynczymi ruchami, aby zachować integralność filmu węglowego.
  4. Zanurz mikę w studzience pod przybliżonym kątem 45°, aż mika usiądzie na rampie studzienki i na powierzchni próbki cieczy zaobserwuje się warstwę węgla.
  5. Po wstępnej inkubacji na próbce (zwykle od 20 s do 20 minut w zależności od przylegania próbki; zoptymalizuj ten okres w zależności od potrzeb eksperymentalnych), bardzo powoli wycofaj arkusz miki, aby odzyskać film węglowy i zminimalizować retencję resztkowej lepkiej próbki.
  6. Ostrożnie osuszyć mikę, stukając w dolną powierzchnię (stronę niewęglową) bibułą filtracyjną w celu usunięcia nadmiaru cieczy, a następnie wymienić węgiel zawierający próbkę na ujemne zabarwienie poprzez nałożenie na przeciwległą studzienkę (tj. zanurzyć mikę jak w kroku 3.4) zawierającą 2% roztwór UAc.
    UWAGA: W tym momencie należy zaobserwować, że na wierzchu roztworu bejcy unosi się warstwa węgla.
  7. Odzyskaj pływającą warstwę węgla za pomocą dziurawej, pokrytej węglem strony umytej i oczyszczonej plazmowo siatki EM. Pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu do czasu obrazowania na TEM. Najlepiej przykryć kratki podczas procesu suszenia, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.

4. Zastosowanie bloku flotacji nośnej do przygotowania siatek TEM pokrytych tlenkiem grafenu

  1. Umyj i wyczyść plazmowo kratki TEM za pomocą 300 siatek z dziurawej miedzi węglowej, jak opisano powyżej (sekcja 1).
  2. Odpipetować 10-12 μl zawiesiny GrOx (patrz sekcja 2.2) do 4 studzienek wymiany bez bufora wzdłuż bloku flotacyjnego. Odpipetować 10-12 μL ddH2O lub ultraczystą wodę do pozostałych 4 studzienek wymiany buforowej bloku.
    UWAGA: Ta objętość wody powinna być wystarczająca, aby utworzyć lekko wypukły menisk wznoszący się ponad wysokość bloku.
  3. Delikatnie upuść 4 siatki na zawiesinę GrOx w każdej studzience na 1 minutę, upewniając się, że dziurawa strona pokryta węglem styka się z roztworem. Po 1 minutach ostrożnie odzyskaj każdą siatkę, wsuwając pęsetę w rowek pęsety w każdej studzience wymiany bez bufora.
  4. Bardzo delikatnie i krótko przyłóż miedzianą, niepokrytą węglem stronę każdej kratki do ddH2O w sąsiedniej studni. Następnie ostrożnie i delikatnie przyłóż siatkę kroplą wody do dołu na kawałku bibuły filtracyjnej.
    UWAGA: Osuszenie wody spowoduje przeciągnięcie zawiesiny GrOx przez siatkę poprzez działanie kapilarne. Bardzo ważne jest, aby nie zanurzać siatki w ddH2O, dlatego kontakt powinien być bardzo krótki. Gdy kratka jest podniesiona, kropla wody powinna trzymać się spodu siatki. Uważaj, aby nie przesuwać siatki na bibule filtracyjnej, ponieważ może to zakłócić osadzanie się płatków GrOx.
  5. Pozostaw kratki w pęsetze do wyschnięcia na powietrzu do czasu przygotowania z próbką. Najlepiej przykryć kratki podczas procesu suszenia, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.

5. Zastosowanie bloku flotacji podporowej do przygotowania próbek na monowarstwowych foliach grafenowych

  1. Umyj kratki TEM zgodnie z powyższym opisem (sekcja 1), ale z pominięciem czyszczenia plazmowego.
    UWAGA: W tym przypadku użyto 300 siatek z dziurawym złotem węglowym, ale inne siatki inne niż miedziane lub siatki ze stopu miedzi są również praktyczne.
  2. Aby zdeponować siatki za pomocą grafenu, należy bezpośrednio przenieść grafen wyhodowany na podłożach miedzianych (Cu-grafen) do siatek cryo-EM, jak opisano wcześniej25.
    1. Umieść cztery przemyte siatki na arkuszu Cu-grafenu (10 mm × 10 mm) osadzonym na szkiełku podstawowym i przykryj każdą siatkę kroplą izopropanolu (5-10 μl), aby umożliwić bliski kontakt między grafenem monowarstwowym a siatką.
      UWAGA: Upewnij się, że dziurawa strona kratek pokryta węglem styka się z arkuszem grafenu.
    2. Gdy izopropanol zostanie całkowicie odparowany (zwykle 2 godziny), należy zawiesić arkusz Cu-grafenu z kratkami na 10% (m/v) roztworze FeCl3 (patrz sekcja 2.3) na szklanej szalce Petriego i pozostawić do wytrawienia w temperaturze pokojowej przez noc. Przykryj naczynie, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
      UWAGA: Po zakończeniu wytrawiania tylko monowarstwa grafenu pozostanie unosząca się na roztworze FeCl3 - powinno to być widoczne gołym okiem przy odpowiednim oświetleniu.
    3. Użyj pętli o średnicy większej niż rozmiar siatki TEM, aby złapać siatki unoszące się na monowarstwie grafenu i ostrożnie przenieś na szklaną szalkę Petriego zawierającą ddH2O do mycia.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas łowienia na rusztach, aby uniknąć uderzenia w ścianki szalki Petriego, co może spowodować pęknięcie lub wygięcie filmu grafenowego.
    4. Przemyć jeszcze dwa razy w wodzie za pomocą kratek wędkarskich i przenieść na czystą szalkę Petriego zawierającą ddH2O, aby usunąć wszystkie pozostałości FeCl3. Na koniec przenieść siatki na szalkę Petriego zawierającą bufor próbki do czasu przygotowania próbki i zamrożenia wgłębnego.
      UWAGA: Pokryta grafenem strona kratek musi być przez cały czas zwilżona, aby uniknąć narażenia ich na zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu.
  3. Pobrać pipetę próbki (10-12 μl) do studzienki wymiany bez buforu bloku flotacyjnego. Gdy próbka jest gotowa w bloku, należy pobrać siatkę pokrytą grafenem z roztworu buforowego za pomocą czystej pęsety i umieścić na powierzchni studzienki zawierającej próbkę.
  4. Po odpowiednim okresie inkubacji (1-5 minut w zależności od próbki; optymalizuj zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi), wybierz siatkę za pomocą czystej pęsety do zamrażania i przystąp do blottingu i witryfikacji.

Wyniki

Siatki TEM przygotowane z nośnikami z amorficznego węgla są zazwyczaj pokryte na całej powierzchni siatki. Chociaż w niektórych przypadkach dochodzi do pękania filmu węglowego wraz z pewnym pofalowaniem (Rysunek 2A), znaczna liczba pól siatki pozostaje nienaruszona i tym samym szeroko nadaje się do celów barwienia negatywowego. Głównym czynnikiem wpływającym na integralność nośnika jest grubość węgla, która jest określana podczas naparowania węgla. Podobnie, stosując niniejszy protokół GrOx, rutynowo uzyskuje się dobre pokrycie całej siatki (Rysunek 2B). Pojedyncza aplikacja zawiesiny GrOx przez 1 min jest wystarczająca, aby zapewnić niewielką liczbę obszarów z wieloma warstwami, które są łatwo dostrzegalne dzięki krawiąziom płatków. Siatki GrOx można szybko przygotować z surowców i zapewniają one wysoką ochronę próbki. Jednakże krawędzie płatków, niepełne pokrycie i pofalowania są częściej widoczne przy siatkach GrOx niż w przypadku innych technik, co wynika z natury płatków GrOx.

Chociaż integralność grafenowej folii wspierającej, podobnie jak w przypadku węgla amorficznego, zależy od procesu nanoszenia, obszary dobrze pokryte wykazują charakterystyczny obraz dyfrakcyjny grafenu jednowarstwowego. Co istotne, dzięki utrzymywaniu folii wspierających z grafenu w stanie zwilżenia, próbki mogą zostać odzyskane z bloku wypornościowego po okresie inkubacji, a dane mogą być gromadzone w sposób umożliwiający analizę pojedynczych cząsteczek. Metoda ta nie wymaga żadnej dodatkowej obróbki grafenu w celu jego zwilżenia, co eliminuje potrzebę stosowania kosztownego sprzętu do nadawania grafenowi właściwości hydrofilowych; zaleca się przygotowanie folii wspierających krótko przed przygotowaniem próbek i zamrażaniem siatek (Rysunek 2C).

Schemat i konfiguracja systemu wymiany buforu; urządzenie mikroprzepływowe do analizy biochemicznej; widok studni.
Rycina 1: Konstrukcja bloku do flotacji próbek i jego zastosowanie podczas przygotowania filmu wspierającego. (A) Schemat widoku z góry, z perspektywy studni oraz z boku bloku do flotacji, zawierający pomiary kształtu, głębokości i nachylenia. Wskazano rowek do odkładania końcówek pęsety oraz kanały do wprowadzania igieł. (B) Warstwy amorficznego węgla można łatwo nanieść metodą flotacji na powierzchnię buforu znajdującego się w studniach bloku do flotacji przy użyciu rampy, t.j. podczas przygotowania siatek do TEM z barwieniem negatywowym. (C) Szerokość studni jest dostosowana do pomieszczenia jednej siatki TEM, natomiast rowki na pęsetę ograniczają konieczność niepotrzebnego puszczania i podnoszenia siatek podczas etapów przygotowania, zapewniając jednocześnie określoną ścieżkę odzyskiwania siatek bez ryzyka ich wygięcia w przypadku ich puszczenia. Obrazy w sekcji B zostały zmodyfikowane na podstawie 27. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza siatki Cryo-EM, cząsteczki białek na siatce, wyniki mikroskopii elektronowej, obserwacja nanostruktury.
Rycina 2: Typowe przykłady folii wspierających próbkę przygotowanych przy użyciu bloku flotacyjnego. Przedstawiono widoki pola siatki (lewo) oraz obrazy (prawo) dla (A) węgla amorficznego, (B) tlenku grafenu oraz (C) folii wspierających z grafenu przygotowanych przy użyciu bloku flotacyjnego. Podłoże z węgla amorficznego zastosowano w przygotowaniu rybosomów 70S do barwienia negatywowego, natomiast podłoża z tlenku grafenu i grafenu wykorzystano w przygotowaniu rybosomów 70S do cryo-EM. Obrazy w A i C zostały zmodyfikowane na podstawie 27. Pasek skali dla pola siatki A = 10 µm; paski skali dla pól siatek B i C = 5 µm; paski skali dla widoków obrazów A-C = 50 nm. Skrót: cryo-EM = krio-mikroskopia elektronowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W artykule przedstawiono protokoły postępowania zarówno z amorficznymi warstwami węgla, jak i grafenu do przygotowania próbek krio-EM przy użyciu bloku flotacji próbki27. Plik STL dla bloku nośnego jest swobodnie dostępny w publicznym repozytorium Thingiverse [www.thingiverse.com/thing:3440684] i może być wydrukowany w 3D za pomocą dowolnej odpowiedniej drukarki stereolitograficznej z odpowiedniej żywicy. Stosowanie folii węglowych pokrywających siatkę TEM zwykle wiąże się z flotacją węgla na próbce28. Takie podejście do przygotowania siatek barwienia ujemnego minimalizuje narażenie na powietrze podczas obsługi podpory, zmniejszając w ten sposób zanieczyszczenie i denaturację białek. Przygotowanie siatek z wykorzystaniem węgla pływającego w małych studniach jest korzystne w stosunku do pływania na większej powierzchni, tj. w łaźni wodnej lub na szalce Petriego, w którym to przypadku mechaniczne ścinanie węgla następuje znacznie łatwiej.

UAc może być trudny do zakupu ze względu na obowiązujące przepisy BHP w momencie publikacji. Dostępnych jest wiele innych powszechnie stosowanych, nieradioaktywnych, ujemnych odczynników barwiących, a protokoły ich przygotowania zostały opisane wcześniej29. Chociaż alternatywne barwienia nie zostały użyte z tym blokiem flotacji podporowej, jest mało prawdopodobne, aby wystąpiły jakiekolwiek różnice w tych protokołach poza optymalizacją czasu inkubacji z próbką (krok 3.5), który jest już z natury zależny od próbki. Kluczowym krokiem w tym protokole przygotowania podpór GrOx jest krok 4.4, podkreślony uwagą, aby zapobiec kontaktowi wody i roztworu GrOx wokół krawędzi siatki. Niewłaściwe wymieszanie wody i roztworów GrOx zapobiega jednokierunkowemu osadzaniu się płatków GrOx przez działanie kapilarne. Posiadanie płatków GrOx po obu stronach folii węglowej skutkuje grubymi warstwami, negując w ten sposób zalety stosowania GrOx jako podpory prawie jednowarstwowej, a także zatrzymywania wody między płatkami, co powoduje zanieczyszczenie obszarów użytkowych dodatkowymi warstwami lodu. Przygotowanie nośnika tlenku grafenu jest stosunkowo łatwe do uzyskania przy użyciu kropelek roztworu na elastycznej folii poliolefinowej. Jednak w ten sposób łatwiej jest przypadkowo zanieczyścić miedzianą stronę siatki przez błędy niewłaściwej obsługi; Zastosowanie bloku flotacyjnego zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia takiej ewentualności.

Wreszcie, w niniejszym artykule przedstawiono protokół przygotowania siatek pokrytych grafenem, który pozwala uniknąć wszelkiego rodzaju wstępnej obróbki grafenu w celu nadania mu hydrofilowości, zmniejszając w ten sposób jego koszt i zwiększając jego dostępność. Utrzymanie zwilżonej warstwy przez cały okres przygotowywania próbki i nanoszenie próbki in situ w bloku tuż przed zamrożeniem jest wystarczające, aby umożliwić wytworzenie odpowiednich warstw lodu dla krio-EM o jednorodnym rozkładzie próbki. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj protokoły minimalizują kontakt próbki z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda, zmniejszając w ten sposób denaturację próbki i zanieczyszczenie nośnika. W przypadku trzech folii nośnych stosowanych w tych podejściach można było uzyskać jednorodny rozkład próbek w siatkach wraz z obrazowaniem nienaruszonych, dobrze zachowanych pojedynczych cząstek.

Oświadczenia

Autorzy nie są świadomi istnienia jakiegokolwiek konfliktu interesów w odniesieniu do tej pracy.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom Sekcji Biologii Strukturalnej i Syntetycznej w Imperial College London, którzy pomogli przetestować te techniki, a także Harry'emu Barnettowi z Imperial College Advanced Hackspace i Paulowi Simpsonowi z Centrum Biologii Strukturalnej. CHSA jest wspierana przez stypendium Sir Henry Dale Fellowship wspólnie ufundowane przez Wellcome Trust i Royal Society (206212/Z/17/Z).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podstawowy środek do czyszczenia plazmy (230 V)Pęseta Harrick PlasmaPDC-32G-2
Dumont N5A INOX.Pęseta Dumont Swissmade0302-N5A-PO
Dumont NGG INOX.Dumont Swissmade0102-NGG-PO
EhtyacetateSigma-Aldrich270989-250ML
Pętle wędkarskie 10 μ LVWR612-9353
Tlenek grafenu 2 mg / mlSigma-Aldrich763705-25ML
Chlorek żelaza (III)Sigma-Aldrich31232-250MG
Arkusze miki 75 mm x 25 mm x 0,15 mmAgar ScientificAGG250-1Zwykle powlekamy mikę z docelową grubością warstwy węglowej 2 nm
Jednowarstwowy grafen na CuGrapheneaN/A10 mm x 10 mm, opakowanie z 4
n-dodecyl β-D-maltozydu (DDM)GLYCON Biochemicals GmbHD97002-C
Quantifoil R1.2/1.3 Siatki miedziane o siatce 300Enzo Life SciencesJBS-X-101-Cu300
Quantifoil R2/1 Siatki miedziane o siatce 300Enzo Life SciencesJBS-X-102-Cu300
Quantifoil R2/1 Siatki złote o siatce 300 Mikroskopiaelektronowa Q350AR1
NożyczkiAgar ScientificAGT577
Octan uranyluTAAB Sprzęt laboratoryjnyU001
Vitrobot Mark IVFEIN/A
Whatman 55 mmGE Healthcare Life Sciences1441-055
Bibuła filtracyjna Whatman 70 mmGE Healthcare Nauki Przyrodnicze1441-070
Bibuła filtracyjna

Bibliografia

  1. Frank, J. Advances in the field of single-particle cryo-electron microscopy over the last decade. Nature Protocols. 12 (2), 209-212 (2017).
  2. Lyumkis, D. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  3. Elmlund, D., Elmlund, H. Cryogenic Electron Microscopy and Single-Particle Analysis. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 499-517 (2015).
  4. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  5. Arnold, S. A., et al. Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics". Proteomics. 18 (5-6), 1700176(2018).
  6. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy. 65 (1), Oxford, England. 35-41 (2016).
  7. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 34257(2018).
  8. Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M., Baumeister, W. Determination of the inelastic mean free path in ice by examination of tilted vesicles and automated most probable loss imaging. Ultramicroscopy. 63 (3-4), 169-179 (1996).
  9. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-EM grids. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 1-8 (2018).
  10. D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein denaturation at the water-air interface and how to prevent it. eLife. 8, 400432(2019).
  11. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. W. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2013 (2), 00461(2013).
  12. Russo, C. J., Passmore, L. A. Controlling protein adsorption on graphene for cryo-EM using low-energy hydrogen plasmas. Nature Methods. 11 (6), 649-652 (2014).
  13. Naydenova, K., Russo, C. J. Measuring the effects of particle orientation to improve the efficiency of electron cryomicroscopy. Nature Communications. 8 (1), 8-12 (2017).
  14. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  15. Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  16. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  17. Ermantraut, E., Wohlfart, K., Tichelaar, W. Perforated support foils with pre-defined hole size, shape and arrangement. Ultramicroscopy. 74 (1-2), 75-81 (1998).
  18. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).
  19. Fujiyoshi, Y. The structural study of membrane proteins by electron crystallography. Advances in Biophysics. 35, 25-80 (1998).
  20. Koning, R. I., Oostergetel, G. T., Brisson, A. Preparation of flat carbon support films. Ultramicroscopy. 94 (34), 183(2003).
  21. Hummers, W. S., Offeman, R. E. Preparation of Graphitic Oxide. Journal of the American Chemical Society. 80 (6), 1339(1958).
  22. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  23. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  24. Li, X., et al. Large-area synthesis of high-quality and uniform graphene films on copper foils. Science. 324 (5932), 1312-1314 (2009).
  25. Regan, W., et al. A direct transfer of layer-area graphene. Applied Physics Letters. 96 (11), 2008-2011 (2010).
  26. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  27. de Martín Garrido, N., et al. Direct transfer of electron microscopy samples to wetted carbon and graphene films via a support floatation block. Journal of Structural Biology. 213 (1), 107677(2021).
  28. Valentine, R. C., Shapiro, B. M., Stadtman, E. R. Regulation of Glutamine Synthetase. XII. Electron Microscopy of the Enzyme from Escherichia coli. Biochemistry. 7 (6), 2143-2152 (1968).
  29. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriomikroskopia elektronowasiatki z tlenkiem grafenub ona z w gla amorficznegoczyszczenie plazmowebarwienie negatywoweprzygotowanie siatkidenaturacja bia ek
Przygotowanie warstw nośnych próbek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu bloku flotacyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.