Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

Podsumowanie

Ten protokół opisuje konfigurację bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności zamkniętych komórek ludzkich przez okres do 72 godzin, po czym następuje czasowo-rozdzielcza akwizycja i analiza danych NMR w komórce. Metodologia ta jest stosowana do monitorowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-ligand w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

NMR w komórce to unikalne podejście do obserwacji strukturalnych i dynamicznych właściwości makrocząsteczek biologicznych w rozdzielczości atomowej bezpośrednio w żywych komórkach. Można zaobserwować fałdowanie białek, modyfikacje chemiczne i zmiany konformacyjne wywołane wiązaniem ligandów. W związku z tym metoda ta ma ogromny potencjał w kontekście opracowywania leków. Jednak krótka żywotność komórek ludzkich zamkniętych w spektrometrze NMR ogranicza zakres zastosowania NMR w komórce. Aby przezwyciężyć ten problem, stosuje się bioreaktory NMR, które mogą znacznie poprawić stabilność próbki komórki w czasie i, co ważne, umożliwić rejestrację widm NMR w czasie rzeczywistym. W ten sposób ewolucja procesów, takich jak penetracja ligandów i wiązanie się z wewnątrzkomórkowym celem białkowym, może być monitorowana w czasie rzeczywistym. Bioreaktory są często ograniczone przez niską żywotność komórek przy dużej liczbie komórek, co powoduje kompromis między ogólną czułością eksperymentu a żywotnością komórek. Niedawno informowaliśmy o bioreaktorze NMR, który utrzymuje dużą liczbę ludzkich komórek w stanie metabolicznym przez dłuższy czas, do 72 godzin. Układ ten zastosowano do monitorowania interakcji białko-ligand i modyfikacji chemicznej białek. Wprowadziliśmy również przepływ pracy do analizy ilościowej danych NMR w czasie rzeczywistym, w oparciu o rozdzielczość krzywych wielowymiarowych. Metoda dostarcza profile stężeń związków chemicznych obecnych w komórkach w funkcji czasu, które mogą być dalej analizowane w celu uzyskania odpowiednich parametrów kinetycznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis konfiguracji bioreaktora NMR i jego zastosowania do monitorowania interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich.

Wprowadzenie

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w komórce pojawiła się ostatnio jako potężne podejście do badania strukturalnych i dynamicznych właściwości makrocząsteczek w środowisku komórkowym^1,2^,3,4,5,6. In-cell NMR z powodzeniem zbadał funkcjonalnie istotne procesy, takie jak fałdowanie/nieprawidłowe fałdowanie białek^7,8,9, metal binding^7,10, tworzenie wiązań dwusiarczkowych^11,12, oraz białko-białko interakcja¹³, interakcja białko-ligand^14,15,16, and nucleic acid-ligand interaction^17,18 w żywych komórkach ludzkich. Jednym z czynników ograniczających zastosowania NMR w komórkach jest krótka żywotność komórek podczas eksperymentu. Rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie bioreaktorów NMR. W tych urządzeniach do komórek stosuje się stały przepływ pożywki wzrostowej, która jest utrzymywana w spektrometrze NMR, w celu dostarczenia tlenu i składników odżywczych oraz usunięcia toksycznych produktów ubocznych. Po pojawieniu się NMR w komórce, opracowano kilka projektów bioreaktorów NMR w celu poprawy żywotności komórek przez dłuższy czas, w których komórki bakterii lub ssaków są zamknięte w hydrożelu^19,20,21,22 lub przechowywane w zawiesinie i perfundowane za pomocą membrany do mikrodializy²³. Takie bioreaktory pozwoliły na przeprowadzenie dłuższych eksperymentów NMR ze zwiększonym stosunkiem sygnału do szumu (S/N)⁵ i, co ważniejsze, mogą być wykorzystywane do badania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym^22,23,24. Dzięki wysokiej czułości chemicznej i konformacyjnej NMR, to ostatnie zastosowanie może dostarczyć cennych informacji na temat kinetyki procesów funkcjonalnych w żywych komórkach w rozdzielczości atomowej.

W tym protokole pokazujemy, jak skonfigurować i obsługiwać niedawno zgłoszony ulepszony bioreaktor^{25, który uzyskano} poprzez połączenie istniejącego projektu modułowego bioreaktora²³ z podejściem opartym na enkapsulacji komórek w hydrożelu, które zostało zapoczątkowane przez inne grupy^{19,20,21,22,26,27}. Opisujemy zastosowanie bioreaktora do badań NMR w czasie rzeczywistym w komórce wewnątrzkomórkowych ligandów obserwujących białko w komórkach HEK293T. W bioreaktorze komórki są zamknięte w dużych gęstościach w nitkach żelu agarozowego i utrzymują wysoką żywotność i aktywność metaboliczną przez okres do 72 godzin, podczas których rejestrowane są eksperymenty NMR w czasie rzeczywistym. Bioreaktor składa się ze szklanej rurki, która pasuje do standardowych sond NMR 5 mm, która jest wodoszczelna i połączona z uchwytem probówki, dzięki czemu wewnętrzna komora próbki ma średnicę wewnętrzną 4,2 mm, wysokość 38 mm i objętość 526 μl. Wlot to kapilara PEEK o długości 7 metrów (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm) umieszczona w komorze próbki do ~6 mm od dołu, natomiast wylot to kapilara z PTFE o długości 7 metrów (o.d. = 1/32", ID = 0,5 mm) przymocowana w górnej części uchwytu rurki (Rysunek 1). Rurka jest współosiowo wprowadzana do przewodu o kontrolowanej temperaturze połączonego z łaźnią wodną. Wlot i wylot są połączone rurką PEEK z 4-drogowym, 2-pozycyjnym zaworem podłączonym do pompy FPLC do sterowania przepływem medium i pojemnika na odpady.

Bioreaktor jest stosowany do badania kinetyki interakcji, wcześniej zgłoszonej^14,25, pomiędzy dwoma lekami, acetazolamidem (AAZ) i metazolamidem (MZA), w komórkach ludzkich z drugą izoformą ludzkiej anhydrazy węglanowej (CA II), farmakologicznie istotnym celem^28,29,30oraz kinetykę powstawania wewnątrzcząsteczkowego wiązania dwusiarczkowego, promowanego przez małą cząsteczkę ebselen^25,31, niezawierającej miedzi, związanej z formy ludzkiej miedzi, dysmutazy ponadtlenkowej (SOD1), enzymu przeciwutleniającego biorącego udział w wystąpieniu stwardnienia zanikowego bocznego^7,8,32. Na koniec w MATLABie przeprowadzana jest analiza ilościowa danych NMR w czasie rzeczywistym przy użyciu algorytmu MCR-ALS (Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares)³³, za pomocą którego uzyskuje się czyste składowe widmowe i profile stężeń w funkcji czasu dla obserwowanych gatunków, które można dalej analizować w celu uzyskania odpowiednich parametrów kinetycznych.

Protokół zaczyna się od kolby T75 składającej się z komórek HEK293T (~3 x 10,⁷ komórek na kolbę) przejściowo nadekspresjonujących albo ludzki CA II (nieznakowany), albo ludzki SOD1 (¹⁵N-znakowany). Komórki hodowano i utrzymywano w kolbach T75 z wysokim poziomem glukozy DMEM przez 1:10 pasaży co 3-4 dni i transfekowano cDNA kodującym białko będące przedmiotem zainteresowania 48 godzin przed eksperymentem. Kroki związane z tą fazą są szczegółowo opisane w innym miejscu³⁴.

Protokół

1. Konfiguracja odczynnika i roztworu

1. Aby przygotować kompletny DMEM, dodaj 5 ml L-glutaminy 200 mM, 5 ml penicyliny-streptomycyny 100x i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, końcowe stężenie 10% obj.) do 440 ml DMEM.
   UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
2. Przygotować roztwór agarozy, rozpuszczając 150 mg agarozy o niskiej żelowości w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 85 °C w celu uzyskania 1,5% (w/v) roztworu. Sterylizuj przez filtrację za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotować 1 ml podwielokrotności roztworu agarozy w 1,5 ml zakorkowanych probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować pożywkę bioreaktora.
   1. Rozpuścić 13,4 g proszku DMEM w 1 l ultraczystego H₂O.
      UWAGA: W zależności od zastosowania wymagana objętość końcowa może się różnić (np. dla pożywki o pojemności 500 ml rozpuścić 6,7 g proszku w 500 ml H₂O).
   2. Dodać 2% FBS, 10 mM NaHCO₃, 1x penicylina-streptomycyna (100x) i 2% D₂O (np. na 500 ml pożywki dodać 10 ml FBS, 0,4 g NaHCO₃, 5 ml penicyliny-streptomycyny 100x i 10 ml D₂O).
   3. Zmierzyć pH za pomocą pH-metru i w razie potrzeby dostosować do 7,4, dodając HCl.
      UWAGA: Zazwyczaj początkowe pH jest bardzo zbliżone do 7,4.
   4. Przefiltruj pożywkę bioreaktora za pomocą sterylnego filtra próżniowego w sterylnej szklanej butelce o pojemności 250 ml lub 500 ml.
   5. W kapturze z przepływem laminarnym uszczelnij butelkę sterylną stalową głowicą z dwiema dyszami węża i podłącz je do rurki FEP (o.d. = 1/8", ID = 1.6 mm), która zostanie podłączona do pompy i do filtra strzykawkowego PTFE 0.22 μm do wlotu powietrza.

2. Konfiguracja bioreaktora

1. Zmontuj jednostkę przepływu za pomocą drugiej rurki NMR jednostki przepływu, która zostanie później zastąpiona tą zawierającą komórki. Zapoznaj się z instrukcją obsługi jednostki przepływowej, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego montażu.
   UWAGA: W tym momencie jednostka przepływu powinna być już wyczyszczona (jeśli nie, wykonaj krok 4.2).
2. Ustawić łaźnię wodną podłączoną do regulatora temperatury jednostki przepływowej na 37 °C. Umieścić butelkę z biustem w łaźni wodnej.
3. Podłącz rurkę FEP butelki ze zbiornikiem do pompy.
4. Przekręć zawór bioreaktora w położenie "obejście" i wstępnie napełnij pompę medium.
5. Przekręć zawór bioreaktora na "przepływ" i wstępnie napełnij bioreaktor medium z prędkością 0,1 ml/min.

3. Przygotowanie próbki komórki

1. Pobrać komórki z inkubatora emisji_CO2.
   1. Pobrać kolbę T75 z transfekowanymi komórkami HEK293T z inkubatora CO₂ i usunąć zużytą pożywkę.
   2. Umyj komórki dwukrotnie 7 ml (każda) PBS w temperaturze pokojowej (~20 °C).
   3. Użyj 2 ml trypsyny/EDTA, aby odłączyć komórki. Po dodaniu roztworu inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu odłączenia komórek.
      UWAGA: Odklejenie się transfekowanych komórek może zająć nieco więcej czasu. W razie potrzeby inkubować komórki w temperaturze 37 °C.
   4. Dezaktywować trypsynę za pomocą 20 ml kompletnego DMEM; dokładnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   5. Odwirować komórki o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   6. Umyj komórki 10 ml PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałą pożywkę.
   7. Odwirować komórki o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   8. Przenieś osad komórkowy do zaślepionej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Osadź komórki w niciach agarozy.
   1. Stopić jedną podwielokrotność zestalonej agarozy w temperaturze 85 °C w łaźni wodnej, a następnie przechowywać ją w roztworze w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.
   2. Za pomocą pipety Pasteura napełnij dno rurki NMR jednostki przepływowej 60-70 μl 1,5% żelu agarozowego i umieść ją w lodzie. Spowoduje to utworzenie dolnego korka o wysokości ~5 mm, który umożliwia umieszczenie próbki komórki w aktywnej objętości cewki ¹H NMR.
   3. Podgrzać osad komórek otrzymany w kroku 3.1.8 w temperaturze 37 °C przez 15−20 s w termobloku.
   4. Zawieś komórki w 450 μl roztworu agarozy. Uważaj, aby nie tworzyć się pęcherzyków.
   5. Odessać zawiesinę komórkowo-agarozową do rurki chromatograficznej PEEK o długości ~30 cm (średnica wewnętrzna = 0,75 mm) podłączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Przed aspiracją rurkę i martwą objętość strzykawki należy wstępnie napełnić PBS w temperaturze pokojowej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Długość rurki nie jest krytyczna.
   6. Pozwól rurki ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
   7. Napełnij rurkę NMR jednostki przepływowej 100 μl PBS w temperaturze pokojowej.
   8. Odlewać nici komórek osadzonych w agarozie do rurki NMR jednostki przepływowej, delikatnie popychając strzykawkę.
      UWAGA: Aby równomiernie napełnić rurkę NMR, zacznij od umieszczenia końca rurki PEEK na dole rurki NMR i idź w kierunku góry, powoli obracając się w lewo i w prawo.
   9. Powtarzać kroki 3.2.5, 3.2.6 i 3.2.8, aż cała zawiesina agarozy komórkowej zostanie odlana.
3. Wprowadzić komórki do bioreaktora.
   1. Wyjmij pustą rurkę NMR z jednostki przepływowej i zwiększ natężenie przepływu do 2 ml/min na kilka minut, aby usunąć resztki pęcherzyków gazu z rurki doprowadzającej.
   2. Ustaw natężenie przepływu na 0,2 ml/min i włóż rurkę NMR zawierającą komórki, popychając ją powoli, ale stabilnie do góry.
      UWAGA: Aktywny przepływ medium pozwala uniknąć cofania się zawartości rurki przez wlot, co w przeciwnym razie miałoby miejsce podczas wkładania.

4. Eksploatacja i czyszczenie bioreaktora

1. Praca bioreaktora podczas eksperymentu NMR.
   1. Ustaw temperaturę w spektrometrze NMR na 310 K.
   2. Włożyć jednostkę przepływu do spektrometru.
   3. Zasilaj pożywkę bioreaktora z natężeniem przepływu 0,1 ml/min przez cały czas trwania eksperymentów NMR w komórce.
   4. W pożądanym czasie podczas eksperymentu wstrzyknąć stężony roztwór cząsteczki zewnętrznej do butelki ze zbiornikiem pożywki, przekłuwając silikonową rurkę sterylną strzykawką z długą igłą.
      UWAGA: Końcowe stężenie cząsteczki w pożywce powinno być wybrane na podstawie wcześniejszej wiedzy na temat toksyczności komórkowej oraz, jeśli jest to możliwe, na przewidywanej/szacowanej szybkości dyfuzji przez błonę komórkową.
   5. Pod koniec eksperymentu NMR zastąp probówkę zawierającą komórki pustą probówką i przepłucz jednostkę przepływową wodą.
2. Czyszczenie bioreaktora na miejscu.
   1. Oczyścić jednostkę przepływu, przepuszczając następujące roztwory o stężeniu 1 ml/min: 0,2 M wodorotlenku sodu (NaOH), 3 M kwasu cytrynowego, 0,2 M NaOH przez co najmniej 30 minut każdy, a następnie sterylnie przefiltrowaną ultraczystą wodą przez >2 godziny.
   2. Wyczyść i autoklawuj zbiornik, butelkę i zespół rurek po każdym uruchomieniu.

5. Eksperymenty NMR

1. Konfiguracja eksperymentów NMR.
   UWAGA: Wykonaj te czynności wcześniej, przed przygotowaniem próbki NMR w komórce, aby uniknąć opóźnień między pobraniem komórek a akwizycją danych.
   1. Utwórz nowy zestaw danych w spektrometrze NMR i ustaw parametry dla żądanych eksperymentów NMR.
   2. Ustawianie parametrów dla eksperymentów 1D ¹H NMR.
   3. Wyśrodkuj częstotliwość nośną ¹H na 4.7 ppm na sygnale wody.
   4. Wybierz program impulsowy zgesgp, ustaw szerokość widmową na 20 ppm i impuls kwadratowy 1,000 μs 180° do tłumienia wody. Ustaw opóźnienie między skanowaniami na 1 s. Uzyskaj widmo za pomocą 32 skanów.
   5. Dla komórek wyrażających nieznakowany CA II: wybierz program impulsowy p3919gp, ustaw szerokość widma na 30 ppm, aby pokryć obszar imino widma i dostosuj opóźnienie dwumianowego tłumienia wody tak, aby maksymalne wzbudzenie było wyśrodkowane na przesunięciach chemicznych sygnałów będących przedmiotem zainteresowania (d7 = 20 μs przy 950 MHz). Ustaw opóźnienie między skanowaniami na ≥1 s. Zdobądź za pomocą 512 skanów.
   6. Dla komórek wyrażających ¹⁵znakowanych N SOD1: wybierz program impulsów sfhmqf3gpph, ustaw szerokości widma ¹H i ¹⁵N odpowiednio na 16 i 50 ppm, przesunięcie impulsu kształtowego i szerokość pasma wzbudzenia odpowiednio na 8,5 i 6 ppm oraz impuls 350 μs dla schematu rozprzęgania (garp4 lub inny w zależności od instrumentu). Ustaw opóźnienie między skanowaniami na 0,3 s. Rejestracja z 16 skanami i 128 przyrostami w wymiarze ¹⁵N.
2. Akwizycja widm NMR w czasie rzeczywistym.
   1. Po włożeniu bioreaktora do spektrometru NMR odczekaj kilka minut, aby umożliwić wymianę pożywki.
      UWAGA: Proces ten można łatwo monitorować od momentu pojawienia się sygnału blokady, ponieważ PBS jest zastępowany medium zawierającym 2% D₂O.
   2. Dostosuj dopasowanie i dostrojenie kanału ¹H, podkładkę magnesu i oblicz długość impulsu ^{twardego 1}H 90°.
   3. Dostosuj poziomy mocy ¹H w każdej sekwencji impulsów zgodnie z twardym impulsem ¹H.
   4. Zapisać pierwsze widmo zgesgp ¹H, aby sprawdzić zawartość próbki i jednorodność pola.
   5. Skopiuj eksperymenty zgesgp i p3919gp/sfhmqcf3gpph na żądaną liczbę i umieść je w kolejce w buforze akwizycji.
      UWAGA: Widma zgesgp służą wyłącznie do kontroli stanu próbki i jednorodności pola; Dlatego można je pominąć lub rzadziej nagrywać.
   6. W przypadku komórek wykazujących ekspresję nieznakowanego CA II: przetwarzaj widma p3919gp, stosując wypełnienie zerem i funkcję wykładniczego rozszerzania linii (LB = 20 Hz).
   7. Dla komórek wyrażających ¹⁵znakowanych N SOD1: przetwarzaj widma sfhmqcf3gpph, stosując wypełnienie zerowe i funkcję kwadratowego okna dzwonka sinusoidalnego (SSB = 2) w obu wymiarach.
      UWAGA: Rozmiar przetwarzanych widm można dodatkowo zmniejszyć, usuwając obszary wolne od sygnałów (w Topspin odbywa się to poprzez ustawienie żądanych wartości STSR i STSI).

6. Analiza MCR-ALS

1. Do analizy widm CA II zaimportuj regiony spektralne 1D w MATLAB R2019b.
   1. W oprogramowaniu utwórz listę eksperymentów do wyeksportowania w menu Lista zestawów danych procesów.
   2. Korzystając ze zmodyfikowanej wersji programu au convbin2asc, wyeksportuj interesujący Cię obszar widmowy w formacie ASCII dla każdego spektrum.
      UWAGA: Spowoduje to utworzenie pliku tekstowego o nazwie ascii-spec.txt w każdym podkatalogu widma.
   3. W programie MATLAB zaimportuj regiony spektralne za pomocą niestandardowego skryptu Load_ascii_spectra.
      UWAGA: Ten skrypt wymaga katalogu zestawu danych jako danych wejściowych i tworzy widma tablicowe 2D zawierające skumulowane widma 1D oraz tablicę 1D cs zawierającą przesunięcia chemiczne.
   4. Uruchom skrypt Load_acqus, aby wyodrębnić znaczniki czasu z widm 1D.
      UWAGA: Ten skrypt tworzy tablicę 1D times_hours zawierającą przyrost czasu dla każdego widma wyrażony w godzinach, z początkowym widmem w czasie = 0.
2. Do analizy widm SOD1 zaimportuj widma 2D w MATLAB R2020b.
   1. W Topspin utwórz listę eksperymentów do wyeksportowania w menu Lista zestawów danych procesów.
   2. W programie MATLAB zaimportuj widma 2D za pomocą niestandardowego skryptu Load_2D_spectra.
      UWAGA: Ten skrypt wymaga katalogu zestawu danych jako danych wejściowych i tworzy tablicę 3D Spectra zawierającą skumulowane widma 2D oraz tablicę 1D cs zawierającą przesunięcia chemiczne.
   3. Uruchom skrypt Load_acqus, aby wyodrębnić znaczniki czasu z widm 2D.
   4. Określ obszary widmowe zainteresowania w niestandardowym Cut_2D_spectra skryptu i uruchom skrypt, aby wyciąć podtablice 3D [(¹H x ¹⁵N) intensywności widma) x czas]; przekształcić je w tablice 2D (punkty czasowe x intensywności spektralne) i połączyć je ze sobą.
      UWAGA: W ten sposób powstaje JoinSpec_flat tablicy 2D zawierającej przekształcone i połączone obszary widmowe.
3. Uruchom MCR-ALS 2.0 w trybie GUI.
   1. Otwórz graficzny interfejs użytkownika MCR-ALS 2.0, uruchamiając skrypt mcr_main.
   2. Na karcie Wybór danych załaduj widma lub macierz JoinSpec_flat. Dane można wykreślić w celu sprawdzenia.
   3. Oceń liczbę składników za pomocą dekompozycji wartości osobliwych (SVD) lub ręcznie.
      UWAGA: Liczba składników powinna odpowiadać liczbie odrębnych gatunków obecnych w doświadczeniu. W tym przypadku n = 2, co odpowiada wolnemu i związanemu białku.
   4. Wybierz metodę wstępnego oszacowania czystych widm. Można zastosować detekcję najczystszych zmiennych lub analizę czynnikową ewolucji (EFA).
   5. W oknie Wybór zbioru danych wybierz opcję Kontynuuj.
   6. Ustaw ograniczenia dla stężeń w oknie Ograniczenia: Tryb wiersza. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierz fnnls (Szybkie najmniejsze kwadraty ograniczone nieujemnością) jako "implementacja i 2 gatunki". Zastosuj ograniczenie 1 zamknięcia, ustaw ograniczenie na 1, warunek zamknięcia jako "równy" i zastosuj do wszystkich gatunków.
      UWAGA: Wymusza to, aby suma stężeń każdego gatunku była równa 1, tak aby uzyskane profile każdego gatunku były znormalizowane w odniesieniu do całkowitego stężenia białka.
   7. Ustaw ograniczenia dla widm w oknie Ograniczenia: Tryb kolumny. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierz fnnls jako "implementacja i 2 gatunki".
      UWAGA: To ograniczenie nie powinno być stosowane, jeśli w widmach NMR występują sygnały ujemne.
   8. W ostatnim oknie ustaw 50 iteracji i kryterium zbieżności 0,01. Określ nazwy wyjściowe dla stężeń, widm i odchylenia standardowego. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić złączkę MCR-ALS.
      UWAGA: Okno graficzne pokaże wynik dopasowania z wykresami profili stężeń i widmami czystych składników.
   9. W przypadku zestawu danych SOD1: użyj niestandardowego skryptu Rebuild_2D_spectra, aby zrekonstruować obszary spektralne 2D z danych wyjściowych 1D MCR-ALS i wykreślić je.

7. Test niebieskiego trypana

1. Odzyskaj zawartość probówki NMR za pomocą pipety Pasteura i przenieś nitki agarozy do probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml.
2. Usunąć pozostałą pożywkę, przepłukując nitki agarozy 600 μl PBS i odwirować je przy 4 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
3. Dodać 250 μl PBS i 50 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
4. Inkubować przez 2 minuty z ciągłym pipetowaniem.
5. Przemyć dwukrotnie 600 μl PBS, odrzucając supernatant.
6. Umieść kilka nitek agarozy na szkiełku mikroskopowym i posiekaj je żyletkami, aby uzyskać małe plasterki żelu. Wybierz najcieńsze warstwy (grubość < 0,4 mm, najlepiej ~0,2 mm) do analizy.
7. Przenieś plastry żelu do samodzielnie wykonanej komory do liczenia komórek składającej się z dwóch szkiełek umieszczonych w odstępach trzech warstw folii parafinowej (o całkowitej grubości ~0,4 mm) z każdej strony.
   UWAGA: Można również zastosować zjeżdżalnię komorową; Jednak plastry żelu grubsze niż wysokość komory (0,1 mm) zostałyby ściśnięte, rozrywając osadzone komórki.
8. Uzyskaj obrazy komórek wewnątrz agarozy i policz białe i niebieskie komórki.
9. Oblicz żywotność komórek jako (całkowita liczba komórek - niebieskie komórki) / całkowita liczba komórek.

Wyniki

Powyższy protokół pozwala na zamknięcie komórek w nitkach hydrożelu, aby zmaksymalizować żywotność komórek przez długie okresy czasu, niezbędne do badania procesów wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym. W bioreaktorze komórki są utrzymywane przy życiu i metabolicznie aktywne do 72 godzin, co potwierdza test błękitu trypanowego (Rysunek 2a-c). Zasadniczo protokół ten może być stosowany do obserwacji białka wewnątrzkomórkowego będącego przedmiotem zainteresowania, ulegającego jakimkolwiek zmianom konformacyjnym lub chemicznym. W pierwszym zastosowaniu opisanym powyżej bioreaktor jest stosowany do monitorowania w czasie rzeczywistym wiązania dwóch inhibitorów, AAZ i MZA, z nadekspresją CA II w cytozolu komórek HEK293T. Pierwsze zarejestrowane widmo rzeźbienia wzbudzenia ¹H (zgesgp) służy do oceny ogólnej intensywności sygnału (która jest proporcjonalna do liczby komórek), obecności sygnałów z nadekspresji białka i jednorodności pola (Rysunek 2d). W przypadku CA II wewnątrzkomórkowe wiązanie dwóch inhibitorów może być monitorowane za pomocą WATERGATE 3-9-19³⁵ 1D ¹H NMR spectra (p3919gp), obserwując sygnały ¹H w zakresie od 11 do 16 ppm. Sygnały te pochodzą z koordynujących histydyn i innych reszt aromatycznych CA II³⁶ i są zaburzone podczas wiązania liganda^14,15. Stężenia ligandów można wybrać na podstawie szybkości dyfuzji lub, jeśli są dostępne, z wcześniej określonych wartości przepuszczalności¹⁴. Pomyślne wiązanie jest potwierdzane wizualnie przez pojawienie się dodatkowego zestawu sygnałów w obszarze widmowym będącym przedmiotem zainteresowania, który stopniowo zastępuje oryginalne sygnały (Rysunek 3). Zależne od czasu krzywe wiązania uzyskuje się za pomocą analizy MCR-ALS, która oddziela dwa zestawy sygnałów NMR powstających z wolnego i związanego CA II (Rysunek 4a) i jednocześnie zapewnia względne profile stężeń dwóch gatunków ( Rysunek 4b). W drugim zastosowaniu bioreaktor jest stosowany do monitorowania tworzenia wewnątrzcząsteczkowego wiązania dwusiarczkowego SOD1 związanego z promowanego przez ebselen, mimetyk peroksydazy glutationowej, w komórkach ludzkich. Proces ten jest monitorowany poprzez obserwację zmian w widmach ^{1 H-15}N 2D SOFAST-HMQC³⁷ (które dostarcza odcisku palca konformacji szkieletu białkowego) spowodowanych zaburzeniami struktury białka wywołanymi tworzeniem wiązania dwusiarczkowego. Dodatkowe sygnały powstające z SOD1 utlenionego dwusiarczkiem pojawiają się w widmie ^{1 H-15}N i stopniowo zastępują te z SOD1 o obniżonej zawartości dwusiarczku. Analiza MCR-ALS na wybranych obszarach widma 2D rozdziela sygnały pochodzące od dwóch gatunków (Rysunek 5a) i podaje ich względne profile stężeń (Rysunek 5b). Uzyskane krzywe stężeń mogą być dalej analizowane za pomocą dopasowania nieliniowego, aby dostarczyć informacji na temat kinetyki badanych procesów²⁵.

Rysunek 1: Schemat bioreaktora. Po lewej: widok przekroju pustej jednostki przepływu. Po prawej: schemat konfiguracji bioreaktora. Rurka wlotowa PEEK jest pokazana na zielono; rurka wylotowa PTFE jest pokazana na niebiesko. Lewy panel jest reprodukowany za zgodą Luchinat et al.²⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Test błękitu trypanowego na zamkniętych komórkach i kontrola próbki za pomocą ¹H NMR. reprezentatywne wycinki agarozy zawierające osadzone komórki i barwione błękitem trypanowym a) natychmiast po odlaniu i b) po 72 godzinach w bioreaktorze; c) żywotność komórek w funkcji czasu w bioreaktorze NMR w przepływie aktywnym (kolor) i w warunkach statycznych (kolor czerwony), mierzona za pomocą testu błękitu trypanowego. d) widma NMR zgesgp ¹H zarejestrowane na komórkach zanurzonych w agarozie z nadekspresją CA II przy braku (kolor) i w obecności (kolor czerwony) pęcherzyków gazu w bioreaktorze. W tym drugim przypadku zmniejszona jednorodność pola powoduje poszerzenie linii i pojawienie się artefaktów tłumienia rozpuszczalników. Interesujące cechy spektralne są oznaczone. Panele (a-c) są reprodukowane za zgodą Luchinat et al.²⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne dane NMR w czasie rzeczywistym w komórce ¹H uzyskane na komórkach otoczonych agarozą w bioreaktorze. Wykresy kaskadowe widm 1D ¹H NMR (region między 15,6 a 11,1 ppm) komórek HEK293T z nadekspresją CA II, a następnie potraktowanych (a) 25 μM AAZ i (b) 10 μM MZA, zarejestrowanych w funkcji czasu w bioreaktorze NMR. Czas leczenia ligandem jest pokazany strzałką. Intensywność spektralna (a.u.) jest oznaczona kolorem od niebieskiego (najniższa) do żółtego (najwyższa). Ten rysunek jest reprodukowany za zgodą Luchinat et al.²⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywny wynik MCR-ALS z widm 1D NMR. (a) ^{Widma 1}H NMR czystych składników zrekonstruowanych przez MCR-ALS: CA II przy braku ligandów () i w kompleksie z AAZ (czerwony) lub MZA (magenta); b) względne profile stężeń wolnego (czarnego) i związanego CA II w funkcji czasu po dodaniu AAZ (czerwony) lub MZA (magenta) otrzymany przez MCR-ALS. Czasy obróbki ligandem są oznaczone strzałkami. Ten rysunek jest reprodukowany za zgodą Luchinat et al.²⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywny wynik MCR-ALS z widm 2D NMR. (a) ¹obszary spektralne ^H-15N (oznaczone I-IV) czystych składników zrekonstruowanych przez MCR-ALS: SOD1 o obniżonej zawartości dwusiarczku () i utleniony dwusiarczkiem SOD1 (czerwony); b) względny profil stężeń czystych składników w funkcji czasu po dodaniu ebselenu (oznaczony strzałką) otrzymany za pomocą MCR-ALS. Ten rysunek jest reprodukowany za zgodą Luchinat et al.²⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Celem wykorzystania bioreaktora do eksperymentu NMR w komórce jest utrzymanie komórek przy życiu i aktywności metabolicznej przez dłuższy czas. Aby osiągnąć ten cel, należy wziąć pod uwagę szereg kluczowych aspektów. Po pierwsze, niezwykle ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego podczas przygotowywania próbki komórki i podczas pozyskiwania danych NMR. Jeśli w laboratorium stosuje się szczepy E. coli lub inne bakterie powszechnie stosowane do klonowania genów i ekspresji rekombinowanych białek, mogą one zanieczyścić komórki podczas przygotowywania próbki. Po umieszczeniu w bioreaktorze bakterie będą szybko rosły, wykorzystując świeżą pożywkę wzrostową i spowodują śmierć komórek z powodu produkcji endotoksyn. Zanieczyszczenie bakteryjne jest wykrywane dopiero w zaawansowanym stadium, kiedy zmienia kolor podłoża na żółty i mętny. Ponadto niepełne czyszczenie bioreaktora może spowodować zanieczyszczenie pompy lub przewodów bakteriami, drożdżami lub powszechnymi pleśniami.

Warunkiem powodzenia eksperymentu jest uniknięcie tworzenia się pęcherzyków gazu. Pęcherzyki gazu uwięzione między nitkami agarozy w objętości czynnej cewki NMR wprowadziłyby duże niejednorodności pola magnetycznego, powodując niepełne tłumienie sygnału_H2Oi poważną utratę jakości widmowej (ryc. 2d). Pęcherzyki mogą być spowodowane przez powietrze uwięzione w układzie lub przez tworzenie się gazowego CO₂ . Tego pierwszego można łatwo uniknąć, przepłukując system pożywką przed włożeniem próbki komórki, podczas gdy w celu uniknięcia tego drugiego zaleca się zmniejszenie stężenia_NaHCO3 w pożywce wzrostowej i utrzymywanie wszystkich części systemu w stałej temperaturze, aby zminimalizować różnice w rozpuszczalności CO₂ . Komórkowy metabolizm tlenowy może również powodować powstawanie gazowego CO_{2 ,} czemu można zapobiec poprzez zwiększenie natężenia przepływu.

Żywotność komórek powinna być sprawdzana po każdym przebiegu za pomocą testu błękitu trypanowego. Nie daje to jednak wglądu w aktywność metaboliczną. Aby uzyskać pełniejszy obraz stanu metabolicznego komórek podczas pracy bioreaktora, można wykonać widma ³¹P NMR w celu oceny produkcji ATP w funkcji czasu^23,25. Jednak często do tego pomiaru niezbędna jest dedykowana sonda, która może pozwolić na jednoczesny zapis z ¹H NMR.

W przypadku CA II obecność dobrze rozdzielonych sygnałów reporterowych w nietypowym regionie widma ¹H ułatwia analizę z prostych widm 1D NMR i nie wymaga wzbogacania izotopów podczas ekspresji białek. Ogólnie rzecz biorąc, inne białka mogą powodować powstawanie sygnałów ¹H przydatnych do monitorowania zmian widmowych w innych regionach, takich jak ten typowy dla hydrofobowego rdzenia białka między 0 a -1 ppm¹¹; jednak regiony te są zwykle zatłoczone dla pofałdowanych białek większych niż ~10 kDa. W tym przypadku, jak pokazano w przypadku SOD1, lepiej jest wzbogacić białko w ¹⁵N, dostarczając równomiernie 15 pożywki wzbogaconej w ¹⁵N podczas ekspresji białka oraz monitorować zmiany w czasie rzeczywistym w widmach 2D ^{1 H-15}N NMR. Widma 2D są importowane jako tablice 2D w programie MATLAB, przestawiane do tablic 1D i układane w stos przed analizą MCR-ALS. To ostatnie podejście ma ogólne zastosowanie do każdego białka wewnątrzkomórkowego, które powoduje powstawanie wykrywalnych sygnałów i dostarcza informacji o zmianach konformacyjnych białka na poziomie pojedynczej reszty. Zasadniczo to ostatnie podejście można uogólnić na widma nD i inne schematy znakowania izotopów.

Jeśli chodzi o zastosowanie do różnych typów komórek, protokół powinien być łatwo dostosowany do różnych linii komórkowych i nie wymaga, aby białko będące przedmiotem zainteresowania było bezpośrednio wyrażane w komórkach. Dlatego inne podejścia do NMR w komórce można połączyć z tym protokołem, w którym makrocząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wytwarzana rekombinacyjnie lub syntetyzowana, a następnie wprowadzana do komórek przez elektroporację lub inne metody dostarczania ^1,9,38. Podczas pracy z różnymi liniami komórkowymi lub protokołami przygotowania próbek, parametry takie jak stężenie agarozy, grubość nici i końcowa gęstość komórek w niciach agarozy mogą wymagać empirycznej optymalizacji. Co więcej, zastosowanie opisanego tutaj protokołu jest ograniczone do komórek, które tolerują enkapsulację agarozy. Inne typy komórek mogą wymagać różnych preparatów hydrożelowych, podczas gdy inna konfiguracja jest zalecana podczas analizy komórek, które natywnie rosną w zawiesinie, na przykład wykorzystując współosiową membranę mikrodializacyjną, aby zapewnić dyfuzję składników odżywczych, jednocześnie utrzymując zawieszone komórki zamknięte w probówce NMR²³.

W porównaniu z innymi konstrukcjami bioreaktorów NMR 19,20,21,22^, opisywane tutaj urządzenie opiera się na dostępnej na rynku jednostce przepływowej, dostosowanej z niewielkimi modyfikacjami. Dzięki temu urządzenie można łatwo powielać w różnych laboratoriach z wysoką powtarzalnością. Ponadto umożliwia standaryzację działania i pełną zgodność z surowymi przepisami bezpieczeństwa laboratoryjnego, jeśli zajdzie taka potrzeba. Ogólnie rzecz biorąc, elastyczność i łatwość obsługi bioreaktora powinna pozwolić na wiele innych zastosowań NMR roztworu, zarówno w komórkach, jak i in vitro, oprócz tych, o których już informowano^23,25. Ostatecznie ten sam projekt bioreaktora może zostać zastosowany do próbek, które bardziej przypominają fizjologiczne środowisko tkanki, takich jak sferoidy lub organoidy, pod warunkiem, że zostaną znalezione odpowiednie rusztowania do utrzymania takich próbek przy życiu - lub nawet podtrzymania ich wzrostu - w spektrometrze NMR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich	251275
D2O	Sigma-Aldrich	453366
DMEM, wysoka glukoza	Life Technologies	10313-021
DMEM, wysoka glukoza, proszek	Sigma-Aldrich	D5648
FBS	Life Technologies	10270
HCl	Sigma-Aldrich	30721
L-glutamina (200 mM)	Life Technologies	25030
Agaroza o niskiej żeli, proszek	Sigma-Aldrich	A4018
NaHCO3, proszek	Carlo Erba	478537
PBS	Life Technologies	10010
Penicylina– streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
NaOH, granulki	Sigma-Aldrich	30620
Roztwór błękitu trypanowego (0,4% (wag./vol)	Sigma-Aldrich	T8154	Zwrot(y) wskazujący rodzaj zagrożenia: H350 może powodować raka.
Trypsyna– EDTA (0,05% (wag./vol))Life	Technologies	25300-054
Equipment
Avance III Spektrometr wyposażony w sondę kriogeniczną 5 mm	Bruker	n/a	Wszystkie nowoczesne spektrometry i magnesy wąskootworowe wyposażone w sondy 5 mm są kompatybilne.
Jednostka przepływowa InsightMR	Bruker	n/a
Moduł pompy P-920 firmy Ä KTA FPLC	GE Healthcare	n/a	Każda pompa perystaltyczna lub strzykawkowa FPLC, HPLC powinna być kompatybilna z jednostką przepływu.