Artykuł metodologiczny

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

DOI:

10.3791/62331

⸱

19 marca 2021

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnia dekada przyniosła ogromny postęp w zrozumieniu małych cząsteczek sygnałowych w fizjologii bakterii. W szczególności systematycznie identyfikowano i badano docelowe białka kilku wtórnych przekaźników pochodzących z nukleotydów (NSM) w organizmach modelowych. Osiągnięcia te wynikają głównie z opracowania kilku nowych technik, w tym techniki wychwytywania związków i różnicowego promienistego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA), które wykorzystano do systematycznej identyfikacji docelowych białek tych małych cząsteczek. W artykule opisano zastosowanie NSM, penta- i tetrafosforanów guanozyny (p)ppGpp, jako przykład i demonstrację wideo techniki DRaCALA. Za pomocą DRaCAL zidentyfikowano 9 z 20 znanych i 12 nowych białek docelowych (p)ppGpp w organizmie modelowym, Escherichia coli K-12, co dowodzi mocy tego testu. Zasadniczo, projekt DRaCALA może być wykorzystywany do badania małych ligandów, które mogą być znakowane izotopami promieniotwórczymi lub barwnikami fluorescencyjnymi. Najważniejsze kroki, zalety i wady DRaCALA są omówione tutaj w celu dalszego zastosowania tej techniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie używają kilku małych cząsteczek sygnałowych, aby dostosować się do ciągle zmieniającego się środowiska1,2. Na przykład autoinduktory, laktony N-acylohomoseryny i ich zmodyfikowane oligopeptydy, pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej między bakteriami w celu koordynowania zachowania populacji, zjawiska znanego jako quorum sensing2. Inną grupą małych cząsteczek sygnałowych są NSM, w tym szeroko badany cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP), cykliczny di-AMP, cykliczny monofosforan di-guanozyny (cykliczny di-GMP) oraz penta- i tetrafosforany guanozyny (p)ppGpp1. Bakterie wytwarzają te NSM w odpowiedzi na wiele różnych warunków stresowych. Po wyprodukowaniu cząsteczki te wiążą się z białkami docelowymi i regulują kilka różnych szlaków fizjologicznych i metabolicznych, aby poradzić sobie z napotkanymi stresami i zwiększyć przeżywalność bakterii. W związku z tym identyfikacja docelowych białek jest nieuniknionym warunkiem wstępnym do rozszyfrowania funkcji molekularnych tych małych cząsteczek.

Ostatnia dekada była świadkiem boomu wiedzy o tych małych cząsteczkach sygnałowych, głównie dzięki kilku innowacjom technicznym, które ujawniły docelowe białka tych małych cząsteczek. Należą do nich technika wychwytywania złożonego3,4,5, oraz różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA)6, które zostaną omówione w tym artykule.

Wynaleziona przez Vincenta Lee i współpracowników w 2011 roku6, DRaCALA wykorzystuje zdolność membrany nitrocelulozowej do zróżnicowanej sekwestracji wolnych i związanych z białkami ligandów. Cząsteczki, takie jak białka, nie mogą dyfundować na membranie nitrocelulozowej, podczas gdy małe ligandy, takie jak NSM, są do tego zdolne. Mieszając NSM (np. ppGpp) z białkiem, które ma być badane i wykrywając je na błonie, można spodziewać się dwóch scenariuszy (Rysunek 1): Jeśli (p)ppGpp zwiąże się z białkiem, znakowany radioaktywnie (p)ppGpp zostanie zatrzymany w środku plamki przez białko i nie będzie dyfundować na zewnątrz, dając intensywną małą kropkę (tj.., silny sygnał radioaktywny) pod luminowizorem. Jeśli jednak (p)ppGpp nie zwiąże się z białkiem, będzie swobodnie dyfundować na zewnątrz, tworząc dużą plamkę z jednolitym sygnałem radioaktywnym tła.

Ponadto, DRaCALA może wykryć interakcję między małą cząsteczką a nieoczyszczonym białkiem w lizacie komórkowym, jeśli białko jest obecne w wystarczającej ilości. Ta prostota pozwala na wykorzystanie DRaCALA do szybkiej identyfikacji docelowych białek przy użyciu biblioteki ekspresji ORFeome. Rzeczywiście, docelowe białka cAMP7, cykliczne di-AMP8, cykliczne di-GMP9,10, oraz (p)ppGpp11,12,13 były systematycznie identyfikowane za pomocą DRaCALA. W tym artykule wideo użyto (p)ppGpp jako przykładu, aby zademonstrować i opisać kluczowe kroki i zagadnienia związane z przeprowadzeniem udanego badania przesiewowego DRaCALA. Warto zauważyć, że przed uruchomieniem DRaCALA zaleca się zapoznanie się z bardziej szczegółowym opisem klasy DRaCAL14 w połączeniu z tym artykułem.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Zasada działania DRaCALA. (A) Schemat testu DRaCALA. Szczegółowe informacje można znaleźć w tekście. (B) Kwantyfikacja i obliczanie frakcji wiążącej. Szczegółowe informacje można znaleźć w tekście. Krótko mówiąc, plamki DRaCALA zostaną przeanalizowane poprzez narysowanie dwóch okręgów, które opisują całą plamkę i wewnętrzną ciemną kropkę (tj. zatrzymaną (p)ppGpp ze względu na wiązanie badanego białka). Specyficzny sygnał wiążący to sygnał promieniotwórczy wewnętrznego okręgu (S1) po odjęciu niespecyficznego sygnału tła (obliczony według wzoru A1 × ((S2-S 1)/(A2-A 1))). Frakcja wiążąca to specyficzny sygnał wiążący podzielony przez całkowity sygnał promieniotwórczy (S2). Skróty: DRaCALA = Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego; p)ppGpp = penta- i tetrafosforany guanozyny; RT = temperatura pokojowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie lizatów całokomórkowych

  1. Zaszczepij szczepy E. coli K-12 ASKA ORFeome collection szczepy 15 w 1,5 ml bulionu lizogenicznego (LB) zawierającego 25 μg / ml chloramfenikolu w 96-dołkowych płytkach głębokich. Rosnąć przez noc (O/N) przez 18 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min. Następnego dnia dodać izopropylowy β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) (końcowe 0,5 mM) do kultur O/N w celu wywołania ekspresji białka w temperaturze 30 °C przez 6 godzin.
  2. Granulki rozdrabniać do 500 x g przez 10 min. Zamrażać granulki w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Aby lizować komórki, dodaj 150 μl buforu do lizy L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, uzupełnione 2 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu (PMSF), 40 μg/ml DNazy 1 i 0,5 mg / ml lizozymu) w celu ponownego zawieszenia osadu.
  3. Zamrażać komórki w temperaturze -80 °C przez 30 minut, a następnie rozmrażać w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Powtórzyć ten cykl trzy razy, aby dokonać lizy komórek. Przed użyciem lizaty przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Oczyszczanie Relseq i GppA

UWAGA: Rekombinowane białka Relseq ze Streptococcus equisimilis i GppA z E. coli K-12 są używane do syntezy znakowanych radioaktywnie pppGpp i ppGpp, odpowiednio.

  1. Hoduj i zbieraj komórki z nadekspresją każdego białka.
    1. Hodować szczep E. coli BL21 DE3 do fazy wykładniczej (gęstość optyczna (OD) ~0,3-0,4) w bulionie LB i odwirować 1 ml kultury przy 6000 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki 100 μl lodowatego bulionu TSB (bulion LB uzupełniony 0,1 g / ml PEG3350, 0,05 ml / ml dimetylosulfotlenku, 20 mM MgCl2).
    2. Zmieszać plazmidy zawierające znakowane histydyną relseq i gppA, każdy o sile 100 ng, z powyższymi zawiesinami komórek w TSB i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny komórek w temperaturze 42 °C przez 40 s. Umieścić mieszaninę na lodzie na 2 minuty i dodać 1 ml bulionu LB w temperaturze pokojowej, aby umożliwić komórkom regenerację przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 160 obr./min.
    3. Zebrane komórki ułożyć na płytkach agarowych LB uzupełnionych odpowiednimi antybiotykami (Relseq: 100 μg/ml ampicyliny; GppA: 30 μg/ml kanamycyny). Następnego dnia zaszczepić kolonie w bulionie LB, aby rozpocząć prekultury O/N obu szczepów w temperaturze 37 °C.
    4. Po 18 godzinach zaszczepić 500 ml pożywki LB 10 ml kultur O/N i odpowiednimi antybiotykami. Hodować kultury przez wytrząsanie z prędkością 160 obr./min w temperaturze 37 °C. Gdy OD600nm osiągnie 0,5-0,7, indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 mM IPTG i rosnąc przez 3 godziny w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min.
    5. Zebrać komórki, wirując w temperaturze 6084 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 20 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i ponownie odwirować przy 1912 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zdekantować supernatant i zamrozić granulki w temperaturze -20 °C.
  2. Oczyszczanie powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (Ni-NTA)
    UWAGA: Od tego momentu upewnij się, że próbki są zimne.
    1. Dodać 40 ml lodowatego buforu do lizy L2 (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 10 mM imidazolu, 10 mM β-merkaptoetanolu uzupełnionego inhibitorami proteazy (tabletka wolna od EDTA; patrz tabela materiałów) w celu ponownego zawieszenia osadu. Lizuj komórki za pomocą sonikacji (60% amplitudy, 2 s WŁ./ 4 s WYŁĄCZ przez 8 min WŁ.). Oczyścić lizat przez wirowanie w temperaturze 23,426 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C i kontynuować z supernatantem do oczyszczenia.
    2. Podczas powyższego wirowania przygotuj żywicę Ni-NTA.
      1. Przenieść 500 μl homogenizowanej żywicy Ni-NTA do stojącej kolumny do chromatografii polipropylenowej i pozostawić na 15 minut, a roztwór do przechowywania spłynie. Przemyć żywicę dwukrotnie 15 ml ultraczystej wody, a następnie przemyć kolumnę 15 ml buforu do lizy L2.
    3. Załadować oczyszczony supernatant lizatu komórkowego z kroku 1 do kolumny i pozwolić mu przepłynąć. Przepłukać kolumnę 30 ml buforu płuczącego (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 20 mM imidazolu).
    4. Trzykrotnie eluować białka za pomocą 400 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerolu, 500 mM imidazolu). Następnie powtórzyć elucję z kolejnymi 300 μl buforu elucyjnego. Połączyć eluowane białka do końcowej objętości 700 μl.
  3. Filtracja żelowa
    1. Przygotować żelowy bufor filtracyjny (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerolu). Przemyć kolumnę wykluczającą wielkość jedną objętością kolumny (25 ml) żelowego buforu filtracyjnego.
    2. Załadować powyższą próbkę o objętości 700 μl za pomocą pętli o pojemności 500 μl, uruchomić z prędkością 0,5 ml/min i zebrać 2-3 frakcje, każda o objętości 0,5 ml, zawierające odpowiednie białka.
    3. Połączyć i zagęścić frakcje zawierające każde z białek za pomocą kolumny wirowej i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda.

3. Synteza 32pppGpp i ppGpp znakowanych P

  1. Przeprowadzić reakcję Relseq na małą skalę w probówce z nakrętką (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Pracuj z odczynnikami promieniotwórczymi tylko w licencjonowanym miejscu i przy użyciu środków ochrony osobistej.
Rozdział pkt. szt.
Objętość (μL)
Mała skalaDuża skala
Woda ultraczysta
10x bufor Relseq*cyfra arabska50
ATP (finał 8 mM)
Relseq (4 μM final)
32Trifosforan P-α-guanozyny (GTP) (końcowe 120 nM) (UWAGA)0,25
łączny 20500

Tabela 1: Gromadzenie informacji dla małych i dużych reakcji syntezy 32pppGpp znakowanych P. *10x bufor Relseq zawiera 250 mM Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Skrót: pppGpp = pentafosforan guanozyny.

  1. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w termomikserze przez 1 godzinę, następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut i umieszczać na lodzie przez 5 minut. Odwirować wytrącone białko w temperaturze 15 700 x g przez 5 minut i przenieść supernatant (zsyntetyzowany 32P-pppGpp) do nowej probówki z nakrętką.
  2. Aby zsyntetyzować 32P-ppGpp z 32P-pppGpp, przenieś połowę produktu 32p-pppGpp do nowej probówki z nakrętką i dodaj 1 μM GppA. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie umieścić na lodzie na 5 minut.
  3. Odwirować wytrącone białko w ilości 15 700 x g przez 5 minut i przenieść supernatant (zsyntetyzowany 32P-ppGpp) do nowej probówki z nakrętką.
  4. Analizować 32P-pppGpp i 32P-ppGpp, umieszczając 1 μl próbek na płytce do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) (płytki TLC z celulozy modyfikowanej polietylenopinaminą) przy użyciu 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, jako fazy ruchomej.
    UWAGA: Jako kontrolę należy użyć 5'-trifosforanu guanozyny znakowanego α-32P (32P-α-GTP).
  5. Całkowicie wysusz płytkę TLC, umieść ją między przezroczystym plastikowym folderem i wystaw na ekran luminoforowy do przechowywania przez 5 minut. Wizualizacja i kwantyfikacja sygnałów za pomocą phosphorimager.
    UWAGA: Gdy proporcje 32P-pppGpp i 32P-ppGpp są wyższe niż 85%, można zebrać i zsyntetyzować reakcję na dużą skalę (500 μl, wystarczającą do przesiewania 20 płytek 96-dołkowych) przy użyciu tabeli 1.

4. Badania przesiewowe DRaCALA docelowych białek (p)ppGpp

  1. Rozmrozić i przenieść 20 μl lizatów całych komórek na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery V. Dodać 2,5 j./studzienkę endonukleazy z Serratia marcescens i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu zmniejszenia lepkości lizatu. Umieść lizaty na lodzie na 20 minut.
  2. Wymieszać 32P-pppGpp i 32P-ppGpp w stosunku 1:1 i dodać 1x bufor do lizy L1, aby końcowe stężenie (p)ppGpp było równe 4 nM.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę podobieństwo chemiczne między pppGpp i ppGpp, mieszanka obu substancji chemicznych uprości proces przesiewowy.
  3. Za pomocą pipety wielokanałowej i końcówek do pipet z filtrem dodaj i wymieszaj 10 μl mieszaniny (p)ppGpp z lizatem komórkowym. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
  4. Umyj narzędzie do szpilek 96 x, umieszczając je w 0,01% roztworze detergentu niejonowego na 30 s i susz na bibułce przez 30 s. Powtórz mycie narzędzia do szpilek 3x.
  5. Umieść szpilkę w powyższych 96-dołkowych płytkach na próbki i odczekaj 30 s. Podnieś szpilkę prosto do góry i umieść ją prosto w dół na membranie nitrocelulozowej przez 30 s.
    UWAGA: W przypadku braku plamki należy pobrać 2 μl odpowiednich próbek za pomocą pipety i końcówek z filtrem. Wskazane jest wykonanie zduplikowanego miejsca z tej samej próbki, jak wskazano poniżej.
  6. Suszyć membranę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umieść membranę między przezroczystym plastikowym folderem i wystawiaj ją na ekran luminoforowy do przechowywania przez 5 minut. Wizualizacja za pomocą luminowizatora.

5. Kwantyfikacja i identyfikacja potencjalnych białek docelowych

  1. Użyj oprogramowania analitycznego powiązanego z phosphorimager, aby otworzyć plik .gel z wizualizowanymi płytkami. Użyj funkcji Analiza tablicowa, aby zdefiniować 96 miejsc, konfigurując siatkę 12 kolumn x 8 wierszy.
  2. Zdefiniuj duże okręgi, aby opisać zewnętrzną krawędź całych plam (patrz Rysunek 1B). Wyeksportuj objętość + tło i obszar zdefiniowanych dużych okręgów i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym.
    UWAGA: W razie potrzeby zmień położenie każdego pojedynczego okręgu tak, aby idealnie nakładało się na plamki, i zmień rozmiar każdego pojedynczego okręgu, aby był nieco większy niż rzeczywista plamka.
  3. Zmniejsz rozmiar zdefiniowanych okręgów, aby opisać małe wewnętrzne kropki. Wyeksportuj objętość + tło i obszar zdefiniowanych małych okręgów i zapisz w arkuszu kalkulacyjnym.
  4. Oblicz ułamki wiążące w arkuszu kalkulacyjnym, korzystając z równania w Rysunek 1B, a następnie wykreśl dane. Zidentyfikuj potencjalne białka wiążące w studzienkach, które wykazują wysokie frakcje wiążące w porównaniu z większością innych studzienek.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Ogólny przebieg procesu przesiewowego DRaCALA. Indukowana jest produkcja białka z kolekcji Escherichia coli ASKA, a komórki są poddawane lizie. Tymczasem rekombinowane białka Relseq-His i GppA-His są oczyszczane i wykorzystywane do syntezy 32znakowanych P pppGpp i ppGpp z 32P-α-GTP. Znakowane radioaktywnie cząsteczki (p)ppGpp są następnie mieszane z lizatami, a narzędzie do szpilek 96 jest używane do wykrywania mieszanin na membranie nitrocelulozowej w celu późniejszego wystawienia na ekran magazynowania luminoforu, obrazowania i kwantyfikacji sygnałów radioaktywnych. Skróty: DRaCALA = Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego; p)ppGpp = penta- i tetrafosforany guanozyny; RT = temperatura pokojowa; IPTG = β-d-1-tiogalaktopiranozyd izopropylowy; GTP = 5'-trifosforan guanozyny; SDS-PAGE = elektroforeza w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu; TLC = chromatografia cienkowarstwowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępowanie zgodnie z wyżej opisanym protokołem zazwyczaj daje dwa rodzaje wyników (Rysunek 3).

Rysunek 3A pokazuje płytkę ze stosunkowo niskimi sygnałami wiązania tła (frakcje wiążące < 0,025) z większości odwiertów. Dodatni sygnał wiązania z odwiertu H3 daje frakcję wiązania ~0,35, która jest znacznie wyższa niż obserwowana dla innych dołków. Nawet bez kwantyfikacji, dobrze H3 jest niezwykłe, co sugeruje, że docelowe białko wyra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z kluczowych etapów przeprowadzania badań przesiewowych DRaCALA jest uzyskanie dobrych lizatów całych komórek. Po pierwsze, badane białka powinny być produkowane w dużych ilościach i w formach rozpuszczalnych. Po drugie, liza komórek powinna być całkowita, a lepkość lizatu musi być minimalna. Włączenie lizozymu i zastosowanie trzech cykli zamrażania i rozmrażania często wystarcza do całkowitej lizy komórek. Jednak uwolnione chromosomalne DNA sprawia, że lizat jest lepki i generuje wysoki sygnał wiązania tła, co sk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca jest wspierana przez grant projektu NNF (NNF19OC0058331) dla YEZ oraz program Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy o grant Marie Skłodowska-Curie (nr 801199) dla MLS.

figure-acknowledgements-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
32P-α-GTPPerkinelmerBLU006X250UC
96 x narzędzie do szpilekV& P ScientificVP 40496 Replikator, w centrach 9 mm, średnica 4,2 mm, długość 24 mm
96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania w kształcie litery VSterilinMIC9004Mikropłytka Sterilin V Studzienka 611V96
AgarOXOID - Thermo FisherLP0011Agar nr 1
Szczep kolekcjonerski ASKANBRP, SHIGEN, JAPONIAPatrz: Badania DNA, tom 12, wydanie 5, 2005, strony 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
BenzonazaSIGMAE1014-25KUgenetycznie modyfikowana endonukleaza z Serratia marcescens
Bradford Protein Assay DyeBio-Rad5000006Koncentrat odczynnika
DMSOSIGMAD8418≥ 99,9%
DNaza 1SIGMADN25-1G
filtracja żelowa 10x300 kolumnaGE Healthcare28990944zawiera 20% etanolu jako konserwantu
GlicerolPanReac AppliChem122329.1214Glicerol 87% do analizy
HiperkasetaAmershamRPN 1164720 x 40 cm
ImidazolSIGMA56750puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
IP Storage Ekran fosforowyFUJIFILM28956474BAS-MS 2040 20x 40 cm
Izopropyl β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)SIGMAI6758Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd
Bulion lizogeniczny (LB)Invitrogen - Thermo Fisher12795027Miller's LB Rosół na bazie
lizozymuSIGMAL4949z białka jaja kurzego; BioUltra, liofilizowany proszek, ≥ 98%
MgCl2 (chlorek magnezu)Pipeta208337
MilliQ do wodyultraczystej
Thermo Scientific4661110F1 - Końcówka zaciskowa; 1-10 ul, 8 x kanały
NaClVWR Chemicals27810AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA AgarozaQiagen30230
Nitroceluloza Błona BibułowaAmersham Protran10600003Premium 0,45 um 300 mm x 4 m
PBSOXOID - Thermo FisherBR0014GSól fizjologiczna buforowana fosforanem (Dulbecco A), Tabletki
PEG3350 (Glikol polietylenowy 3350)SIGMA202444
fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)SIGMA93482Roztwór fluorku fenylometanosulfonylu - 0,1 M w etanolu (T)
LuminoforownikGE Healthcare28955809Typhoon FLA-7000 Końcówki do pipet z luminopatem
, filtrowaneThermo Scientific94410040ClipTip 12,5 μ l niesterylna
kolumna chromatograficzna Poly-Prep Kolumna chromatograficznaBio-Rad7311550polipropylenowa
Inhibitor proteazy MiniPierceA32955Tabletki,
rurka z nakrętkąTermo Scientific3488Probówki mikrocentyfugowe, 2,0 ml z nakrętką, niesterylne
SLS 96-głębokie płytki dołkoweGreiner780285MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, naturalna
kolumna wirowaMilliporeUFC500396Amicon Ultra -0,5 ml Filtry odśrodkowe
ThermomixerEppendorf5382000015Thermomixer C
Płytka TLC (płytki PEI-celuloza F TLC)Merck Millipore105579DC PEI-celuloza F (20 x 20 cm)
TrisSIGMABP152Tris Baza do biologii molekularnej
Tween 20SIGMAP1379lepki niejonowy detergent
i beta;-merkaptoetanolSIGMAM314899% (GC/miareczkowanie)
wielokanałowa SIGMA bez EDTA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
  2. Camilli, A., Bassler, B. L. Bacterial small-molecule signaling pathways. Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).
  3. Luo, Y., et al. The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).
  4. Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).
  5. Laventie, B. J., et al. Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins. Journal of Visual Experiments. (97), e51404(2015).
  6. Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).
  7. Zhang, Y., et al. Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).
  8. Corrigan, R. M., et al. Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).
  9. Roelofs, K. G., et al. Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems. PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232(2015).
  10. Fang, X., et al. GIL, a new c-di-GMP-binding protein domain involved in regulation of cellulose synthesis in enterobacteria. Molecular Microbiology. 93 (3), 439-452 (2014).
  11. Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).
  12. Zhang, Y., Zbornikova, E., Rejman, D., Gerdes, K. Novel (p)ppGpp binding and metabolizing proteins of Escherichia coli. Mbio. 9 (2), 02188(2018).
  13. Yang, J., et al. The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp. Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).
  14. Orr, M. W., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA) for high-throughput detection of protein-metabolite interactions in bacteria. Methods in Molecular Biology. 1535, 25-41 (2017).
  15. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (A complete Set of E. coli K-12 ORF archive): Unique resources for biological research. DNA Research. 12 (5), 291-299 (2005).
  16. Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate. Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).
  17. Zhang, Y. E., et al. p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch. Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).
  18. Wang, B., et al. Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp. Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza DRaCALAwi zanie ma ych ligand widentyfikacja bia ka docelowegobakteryjne cz steczki sygna oweguanozynopentafosforanguanozyntetrafosforanoczyszczanie bia ekchromatografia cienkowarstwowaobrazowanie fosforoweizotermiczna kalorymetria miareczkowa

Powiązane artykuły