Artykuł metodologiczny

Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

DOI:

10.3791/62332

⸱

12 marca 2021

 ,  , 
1Masonic Medical Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje nową metodę izolowania mysich brązowych adipocytów do analizy ekspresji genów i białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) jest odpowiedzialna za termogenezę bez dreszczy, a brązowe adipocyty (BA) są jednostkami funkcjonalnymi BAT. BA zawierają zarówno wielomiejscowe kropelki lipidów, jak i obfite mitochondria, a także wyrażają białko rozprzęgające 1 (UCP1). BA są podzielone na dwa podtypy w zależności od ich pochodzenia: klasyczne BA pochodzące z zarodków (cBA) i BA pochodzące z białych adipocytów. Ze względu na ich stosunkowo niską gęstość BA nie można wyizolować z BAT tradycyjną metodą wirowania. W tym badaniu opracowano nową metodę izolowania BA od myszy w celu analizy ekspresji genów i białek. W tym protokole BAT międzyłopatkowy od dorosłych myszy trawiono roztworem kolagenazy i dyspazy, a zdysocjowane BA wzbogacono 6% roztworem jodiksanalu. Wyizolowane BA poddano następnie lizie odczynnikiem Trizol w celu jednoczesnej izolacji RNA, DNA i białka. Po wyizolowaniu RNA do ekstrakcji białek wykorzystano fazę organiczną lizatu. Nasze dane wykazały, że 6% roztwór jodiksanolu skutecznie wzbogacił BA bez zakłócania dalszych badań ekspresji genów i białek. Płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) jest czynnikiem wzrostu, który reguluje wzrost i proliferację komórek mezenchymalnych. W porównaniu z brunatną tkanką tłuszczową, izolowane BA miały znacznie wyższą ekspresję Pdgfa. Podsumowując, ta nowa metoda stanowi platformę do badania biologii brązowych adipocytów na poziomie pojedynczego typu komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarówno myszy, jak i ludzie mają dwa rodzaje tkanki tłuszczowej: białą tkankę tłuszczową (WAT) i brązową tkankę tłuszczową (BAT)1. WAT magazynuje energię w postaci trójglicerydów w białych adipocytach, a brązowe adipocyty (BA) BAT rozpraszają energię chemiczną w postaci ciepła2. W oparciu o ich pochodzenie rozwojowe, BA są dalej klasyfikowane jako klasyczne BA (cBA), które powstały podczas rozwoju zarodka i BA pochodzące z białych adipocytów (komórki beżowe/brite, przekształcone z białych adipocytów w warunkach stresu)3. BA są wielomiejscowe i wyrażają białko termogeniczne rozprzęgające białko 1 (UCP1)4. Magazyn międzyłopatkowy BAT (iBAT) jest jednym z głównych magazynów cBA u małych ssaków5, podczas gdy beżowe komórki są rozproszone w WAT6.

Ze względu na ich naturę rozpraszania energii, BA cieszą się dużym zainteresowaniem jako cel terapeutyczny w celu zmniejszenia otyłości7. Aby wykorzystać BA do celów leczenia otyłości, konieczne jest zrozumienie mechanizmów molekularnych, które kontrolują funkcję, przeżycie i rekrutację BA. Tkanki tłuszczowe, w tym BAT i WAT, są niejednorodne. Oprócz adipocytów, tkanki tłuszczowe zawierają wiele innych typów komórek, takich jak komórki śródbłonka, mezenchymalne komórki macierzyste i makrofagi8. Chociaż dostępne są narzędzia genetyczne do specyficznego zubożania genów kandydujących u myszy BA, takie jak UCP1::Cre line9, techniki oczyszczania BA z BAT lub WAT są ograniczone, co utrudnia badanie BA na poziomie pojedynczej komórki. Ponadto, bez uzyskania czystych BA, relacje między BA i non-BA nie zostaną jasno określone. Na przykład receptor alfa płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRα) został wykorzystany jako marker dla niezróżnicowanych komórek mezenchymalnych i ulega ekspresji w komórkach śródbłonka i śródmiąższu BAT. W BAT zestresowanym zimnem komórki progenitorowe PDGFRα dodatnie dają początek nowym BAs10. PDGFRα jest aktywowany przez swój ligand PDGF, czynnik wzrostu, który reguluje wzrost i proliferację komórek mezenchymalnych11; jednak nie jest jasne, czy BA wpływają na zachowanie PDGFRα dodatnich komórek progenitorowych poprzez wydzielanie PDGF.

Niedawno opublikowano protokół izolacji BAs, który opiera się na sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją (FACS)12. W tym protokole użyto 3% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do oddzielenia BA od innych BA i wzbogaconych BA poddano dalszemu oczyszczaniu za pomocą FACS. Zastosowanie tego protokołu jest ograniczone wymogiem procesu FACS, który opiera się zarówno na sprzęcie, jak i doświadczeniach operacyjnych FACS. W ramach tego badania opracowano nowy protokół izolowania BA od BAT. BA wyizolowane za pomocą tego protokołu mogą być bezpośrednio wykorzystane do badań ekspresji genów i białek. Co więcej, dane z tego badania sugerują, że BA są głównym zasobem PDGF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy były utrzymywane w warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Masoński Komitet ds. Badań Medycznych i Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). UCP1::Cre9 i Rosa 26tdTomato mysze lines13 zostały zgłoszone wcześniej. Wszystkie myszy utrzymywano w temperaturze pokojowej z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności.

1. Przygotowanie roztworów i brunatna tkanka tłuszczowa (BAT)

  1. Przygotować roztwór do wytrawiania i separacji w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml.
  2. 10 ml roztworu do wytrawiania BAT: Do 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dodać 3,5 mg/ml dypazy II, 1 mg/ml kolagenazy II i 10 mM CaCl2, aby uzyskać roztwór do wytrawiania BAT.
  3. 10 ml 12% roztworu jodiksanolu (roztwór do separacji): Wymieszaj 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% jodiksanolu, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 6,865 ml ddH2O, aby uzyskać 12% jodiksanolu.
  4. Poddaj eutanazji jedną dorosłą mysz z powodu przedawkowania CO2. Krótko napełnij klatkę myszy 100% CO2 przy szybkości przemieszczania 10-30% objętości klatki na minutę 5 minut później, potwierdź śmierć, sprawdzając, czy nie ma widocznego oddechu.
  5. Wypreparuj zwierzę i zbierz międzyłopatkowy BAT. Usuń warstwy WAT i mięśni pod mikroskopem stereoskopowym.
  6. Aby uzyskać wystarczające roztrawienie, należy pokroić każdy płat BAT na części o wielkości ~ 3 mm3 i umieścić je w czystej kolbie o pojemności 50 ml z metalowym mieszadłem i 5 ml roztworu do wytrawiania. Przed rozpoczęciem mineralizacji pozostawić kolbę zawierającą BAT i bufor do mineralizacji na lodzie przez 1 godz.
    UWAGA: W kolejnych krokach do izolacji brązowych adipocytów użyto około 80 mg BAT.

2. Procedura izolacji BA

  1. Umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym, które jest zamknięte w inkubatorze. Ustawić prędkość mieszania odpowiednio na 60 obr./min i temperaturę inkubatora na 35 °C. Trawienie trwa około 30 minut. Jeżeli podczas trawienia plastry BAT tworzą grudki wokół pręta mieszadła, należy użyć końcówki pipety o pojemności 1 ml w celu rozerwania zagregowanych tkanek.
  2. Umieść filtr siatkowy o pojemności 70 μm na czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Odpipetować około 4 ml zawiesiny komórek przez sitko. Umyj sitko 4 ml 12% roztworu jodiksanolu. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać komórki i roztwór jodiksanolu. Przenieś mieszaninę komórek do dwóch przezroczystych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Pod koniec trawienia roztwór trawiący powinien być mętny, co wskazuje na wystarczające trawienie. Za każdym razem używaj świeżego roztworu do trawienia. Raz przygotowany roztwór do wytrawiania należy zużyć w ciągu 2 godzin.
  3. Powtórzyć kroki 2.2 i 2.3 jeszcze raz, jeśli trawienie nie jest wystarczające.
  4. Pozostawić przezroczyste probówki z polistyrenu zawierające roztwór rozdzielający i BA na lodzie na 1 godzinę. BA utworzą warstwę na górze.
  5. Pobrać 20 μl wyizolowanych BA do badania mikroskopowego.

3. Izolacja RNA i białek z BA

  1. Odpipetować warstwę BA do dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml w celu izolacji RNA i białka. Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu jodiksanolu, nie naruszając warstwy BAs.
  2. Dodaj 1 ml Trizolu, aby jednocześnie wyizolować RNA, DNA i białko do roztworu komórkowego. Wymieszaj tyle, aby komórki uległy lizie.
  3. Dodać 200 μl chloroformu, aby oddzielić fazy.
  4. Odwirować probówkę o stężeniu 9,981 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Po odwirowaniu użyj fazy wodnej do izolacji RNA. W tym badaniu do odwrotnej transkrypcji wykorzystano całkowite RNA, a ilościowy RT-PCR przeprowadzono za pomocą Real-Time PCR. Sekwencje podkładów są wymienione w Tabeli materiałów.
  6. Przenieść 300 μl fazy organicznej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
  7. Do fazy organicznej dodaj 2,5 objętości 100% etanolu i wiruj przez 10 s.
  8. Dodaj 200 μl 1-bromo-3-chloropropanu i wiruj przez 10 sekund.
  9. Dodaj 600 μl podwójnie destylowanej wody i wiruj przez 10 sekund.
  10. Odstawić zmieszany roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Wirować przy 9,981 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na tym etapie fazy zostaną rozdzielone. Faza białkowa jest zlokalizowana w środkowej warstwie.
  12. Usuń górny roztwór wodny. Do pozostałego roztworu dodać 1 ml 100% etanolu.
  13. Wirować przez 10 min, 9 981 x g, 4 °C. Po odwirowaniu utworzy się osadek białka. Odrzucić supernatant.
  14. Umyj granulki 1 ml 100% etanolu.
  15. Wirować przez 10 minut, 9981 x g, 4 °C. Zachować osad i wyrzucić supernatant.
  16. Suszyć granulat na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Zmierz wagę mokrego granulatu. Dodać 1% roztwór SDS w proporcji 20 μL/mg granulki.
  18. Rozpuść osad, wkładając rurkę do rozgrzanego shakera. Ustaw temperaturę na 55 °C, a prędkość na 11 x g. Całkowite rozpuszczenie granulki białka zajmuje zwykle 5-10 minut.
    UWAGA: Stężenie rozpuszczonego białka można zmierzyć za pomocą testu BCA14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie BAT międzyłopatkowego do izolacji brązowych adipocytów
Proces izolacji brązowych adipocytów (BA) jest przedstawiony w Rysunek 1A. Cały proces, od przygotowania BAT i roztworów do mineralizacji/separacji, do uzyskania wyizolowanych BA, zajmie około 4 godzin.

U dorosłych myszy występuje obfitość BAT w obszarze międzyłopatkowym. Ten międzyłopatkowy BAT (iBAT) jest pokryty warstwami mięśniowymi i WAT (Rysunek 1B). P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ramach tego badania opracowano nową metodę izolowania BA do analizy ekspresji genów i białek.

W opublikowanym protokole izolacji BA zastosowano 3% roztwór BSA w celu wzbogacenia BA12. Niemniej jednak, wzbogacone BA osiągnięte przez ten opublikowany protokół nie mogły być bezpośrednio wykorzystane do analizy ekspresji białek. Dzieje się tak, ponieważ skoncentrowany BSA istniejący w roztworze BA zakłóca następującą ekstrakcję białka. Gdy BA wzbogacone w 3% roztwór BSA p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z. Lin był wspierany przez fundusze National Institutes of Health HL138454-01 i Masońskiego Instytutu Badań Medycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała
AntygenFirmaKatalog
PPARγLSBioLs-C368478
PDGFRaSanta Cruzsc-398206
UCP1R& System DIC6158P
Chemical and solutions
Collagenaza, typ IIThermo Fisher Scientific17101015
1-bromo-3-chloropropanSigma-AldrichB62404
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) GoldbioA-421-10
Chlorek wapniaBio BasicCT1330
ChloroformIBI ScientificIB05040
Dispase II, proteazaSigma-AldrichD5693
EDTABio BasicEB0107
EtanolIBI ScientificIB15724
LiQuant Uniwersalny zielony qPCR Master MixLifeSctLS01131905Y
Sześciowodny chlorek magnezuBoston BioProductsP-855
OneScrip Plus Synteza cDNA SuperMixABMG454
OptiPrep (jodiksanol)Cosmo Bio USAAXS-1114542
PBS (10x)Caisson LabsPBL07
PBS (1x)Caisson LabsPBL06
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher Scientific23227
Chlorek potasuBoston BioProductsP-1435
SimplyBlue bezpieczny barwnikInvitrogenLC6060
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich75746
Odczynnik TrizolTechnologie życia15596018
Starters
Nazwa genu (gatunek) Do przodudo tyłu
Pdgfra (mysz)CTCAGCTGTCTCCTCACACAgGCAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mysz)TGTGCCCATTCGCAGGAAGAGTTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mysz)TGCTGAACATCTCCCCCTTCTCTCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1ACTGCCACACCTCCAGTCATTCTTTGCCTCACTCAGGATTGG
silny>Sprzęt< / silny>
Nazwa< / silny>Firma< / silny>Zastosowanie< / silny>
Keyence BZ-X700KeyenceImaging brązowe adipocyty
Mieszadło magnetyczneVWRDisocjacja BAT
QuantStudio 6 Flex Zastosowany system PCR w czasie rzeczywistym BiosystemIlościowy PCR
System obrazowania Odyssey FcLI-CORWestern blot
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674(2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja gen wizolacja kom rekwzbogacanie jodiksanolemtrawienie kolagenazel SDS PAGEwielop cherzykowe krople lipid wbia ko rozprz gaj ce 1

Powiązane artykuły