$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Procedury zostały zatwierdzone przez University of Maryland, Baltimore Institutional Animal Care and Use Committee (Zatwierdzenie #0320017) i były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi etycznych badań na zwierzętach. Do badania włączono pięć dorosłych samców świń rasy Yorkshire o wadze od 50 do 70 kg. W badaniu wykorzystano cyfrowy system gromadzenia danych i sparowane oprogramowanie do rejestrowania wszystkich danych hemodynamicznych i temperatury. Pomiar parametrów serca w modelu trzody chlewnej składał się z następujących etapów: przygotowanie, termorozcieńczenie, wentrikulografia, wprowadzenie cewnika PV-loop i wreszcie eutanazja. Wszystkie pięć zwierząt poddano każdemu z trzech protokołów pomiaru rzutu serca.
1. Selekcja zwierząt i pomieszczenia
- Użyj młodocianych samców świń Yorkshire (Sus Scrofa) o wadze 50-70 kg.
- Zwierzęta domowe w klatkach o powierzchni co najmniej 30 stóp kwadratowych z wysokowęglową ściółką, taką jak siano, słoma lub wióry sosnowe. Trzymaj zwierzę indywidualnie, w noc poprzedzającą zabieg.
- Zezwalaj na okres aklimatyzacji dla nowych zwierząt zgodnie z wytycznymi instytucji.
UWAGA: Zazwyczaj jest to 48-72 godziny dla dużych ssaków7.
- Karm zwierzęta standardową dietą i zapewnij swobodny dostęp do wody do nocy poprzedzającej eksperyment.
- Pościć zwierzęta w noc poprzedzającą zabieg, aby zminimalizować ryzyko zachłyśnięcia podczas intubacji dotchawiczej.
- Monitoruj stan zdrowia zwierząt co tydzień, sprawdzając skórę pod kątem oznak obrażeń, takich jak strupy, zadrapania lub otarcia. Zadbaj o normalną pracę oddechową (15-30 oddechów/min) i prawidłowe, interaktywne zachowanie. Upewnij się, że błona śluzowa jamy ustnej jest różowa, wilgotna i bez wydzieliny.
- Regularnie waż zwierzęta, aby potwierdzić, że mają odpowiednie odżywianie. Wszelkie nieprawidłowości zgłaszaj personelowi weterynaryjnemu, a następnie wyłącz zwierzę z protokołu.
2. Sedacja i indukcja znieczulenia ogólnego
- Uspokoić zwierzę w pomieszczeniu przez domięśniowe wstrzyknięcie telazolu (4-5 mg/kg)/ ksylazyny (1,8-2,2 mg/kg) w poduszkę tłuszczową doogonową do ucha.
- Poczekaj, aż zwierzę zostanie w pełni uspokojone i reakcja na stymulację będzie minimalna lub żadna, aby zapewnić bezpieczne obchodzenie się i transport zwierzęcia.
- Przetransportuj zwierzę z pomieszczenia do sali zabiegowej i ułóż je w pozycji grzbietowej na stole operacyjnym
.
- Umieść sondę pulsoksymetryczną na uchu zwierzęcia i rozpocznij wentylację zwierzęcia za pomocą maski pyskowej za pomocą respiratora mechanicznego o stężeniu 100%O2. Upewnij się, że gumowa uszczelka maski jest prawidłowo uszczelniona wokół pyska. Po zapewnieniu prawidłowego uszczelnienia należy podawać 3-4% izofluranu, aż do wywołania znieczulenia ogólnego i rozluźnienia szczęki.
UWAGA: Należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi stosowania wziewnych środków lotnych. Ogólnie rzecz biorąc, sala zabiegowa musi być dobrze wentylowana, a w celu wyeliminowania narażenia inhalacyjnego należy zastosować odpowiedni mechanizm oczyszczania/wentylacji.
- Umieść rurkę ustno-tchawiczą za pomocą laryngoskopu, wyłączając parownik izofluranu i zdejmując maskę pyska. Niech druga osoba przytrzyma szczęki otwarte, podczas gdy operator włoży laryngoskop i przemieści nagłośnię brzusznie z dala od podniebienia miękkiego. Po wizualizacji strun głosowych wstaw 8-0 rurka dotchawicza (ET) przez struny głosowe o co najmniej 5 cm.
- Napompuj mankiet ET 10 ml powietrza i przymocuj rurkę ET do pyska zwierzęcia za pomocą taśmy pępowinowej. Potwierdź umieszczenie rurki przez uniesienie klatki piersiowej, końcowo-oddechowy CO2 i/lub osłuchiwanie klatki piersiowej.
- Podłącz rurkę ET do aparatu anestezjologicznego z wymiennikiem ciepła i wilgoci.
- Dostosuj ustawienia respiratora mechanicznego, aby dostarczyć wdychaną frakcję O2 na poziomie 30%, z objętością oddechową 7-10 ml / kg i częstością oddechów 10-16 oddechów / min, aby utrzymać ciśnienie CO2 na końcu oddechu na poziomie 38-42 mmHg.
- Zwróć i utrzymuj wziewny środek znieczulający, stosując 1,5-3% izofluranu. Monitoruj zwierzę pod kątem oznak bólu i dyskomfortu, takich jak mimowolne ruchy lub tachykardia. Regulować izofluran do momentu ustąpienia ruchów lub ustąpienia tachykardii.
3. Sterylizacja i przygotowanie miejsca operowanego
- Przytnij włosy leżące nad i przezskórne miejsca dostępu (obustronna szyja brzuszna) za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia włosów.
- Przygotuj i wyszoruj wszystkie przezskórne miejsca nakłuć betadyną i alkoholem izopropylowym i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
- Umieść sterylne zasłony wokół miejsc operacji, aby zachować sterylne pola operacyjne i zapobiec zanieczyszczeniu. Zabezpiecz je na miejscu za pomocą zszywek.
- Przymocuj zwierzę do stołu operacyjnego, przytrzymując kończyny przednie i tylne do stołu za pomocą taśmy lub liny. Umieść poduszkę grzewczą pod zwierzęciem i ustaw na 37 °C.
- Nałóż lubrykant na bazie wody na końcówkę sondy temperatury i włóż sondę do odbytnicy, aby zapewnić ciągłe dane o temperaturze ciała.
- Umieść elektrody samoprzylepne EKG na prawej i lewej bocznej ścianie klatki piersiowej. Podłącz przewody EKG do elektrod samoprzylepnych i podłącz przewody EKG do jednostki zbierającej dane.
- Ostrożnie przestaw zwierzę na leżącą brzuszną, upewniając się, że przewody oddechowe i przewody EKG są kontrolowane podczas przenoszenia.
4. Kaniulacja żyły szyjnej zewnętrznej
UWAGA: Dostęp do żyły szyjnej uzyskuje się do wprowadzenia prawej kaniuli żylnej przedsionkowej podczas procedury termorozcieńczania.
- Skorzystaj ze wskazówek ultrasonograficznych (USG), aby zlokalizować żyłę szyjną zewnętrzną w bruździe szyjnej znajdującej się w bocznej okolicy szyi. Nakłuć skórę igłą 18 G umieszczoną pod kątem 45° do skóry i wsunąć końcówkę do światła żylnego pod kierunkiem USA.
- Przełóż prowadnik Seldingera 0,035" przez igłę do światła żylnego. Wyjmij igłę, pozostawiając prowadnik na miejscu w świetle żylnym.
- Wykonaj 5-milimetrowe nacięcie skóry przylegające do drutu za pomocą skalpela z ostrzem #11 i nawlecz 15-centymetrową osłonkę z rozszerzaczem o długości 7 Fr do żyły nad prowadnikiem. Zdejmij prowadnik i rozszerzacz. Upewnij się, że osłona pozostaje na swoim miejscu. Zszyj pochewkę na miejscu, przyszywając ją do skóry za pomocą jedwabnych szwów 3-0.
- Powtórz kroki od 4.1 do 4.3, aby kaniulować przeciwległą żyłę szyjną zewnętrzną.
5. Kaniulacja tętnicy szyjnej
UWAGA: Kanituacja tętnicy szyjnej jest wykonywana w celu zapewnienia dostępu do lewej komory i korzenia aorty podczas termorozcieńczenia, wentrikulografii kontrastowej i wprowadzania cewnika z pętlą PV.
- Zlokalizuj tętnicę szyjną boczną do tchawicy za pomocą sondy amerykańskiej. Zapewnij przepływ pulsacyjny za pomocą kolorowego obrazowania dopplerowskiego, jeśli jest dostępne.
- Nakłuć skórę igłą 18 G umieszczoną pod kątem 45° do skóry i wprowadzić ją do światła tętnicy w polu widzenia USG. Przeprowadź prowadnik Seldingera 0,035" przez igłę i do światła tętnicy. Wyjmij igłę, pozostawiając prowadnik na miejscu w świetle tętnicy.
- Wykonaj 5 mm nacięcie skóry w pobliżu drutu za pomocą skalpela z ostrzem #11 i nawlecz 20 cm osłonkę 7 Fr z rozszerzaczem do tętnicy nad prowadnikiem. Pozostaw 5-10 cm pochewki na zewnątrz skóry. Zdejmij prowadnicę i rozszerzacz i upewnij się, że osłona pozostaje na swoim miejscu. Zabezpiecz osłonę na miejscu, przyszywając ją do skóry za pomocą 3-0 jedwabnych szwów8.
6. Pomiar rzutu serca
UWAGA: Wszystkie poniższe metody są wykonywane sekwencyjnie na każdym z 5 zwierząt użytych w tym badaniu.
- Termorozcieńczanie
- Wprowadzić sondę termopary typu T przez osłonkę tętnicy szyjnej i wprowadzić sondę do korzenia aorty za pomocą wskazówek fluoroskopowych.
- Podłącz sondę do systemu zbierania danych. Poczekaj kilka minut na zebranie danych, aby ustalić pewną wyjściową temperaturę aorty. Pewną temperaturę bazową osiąga się, gdy utrzymuje się w granicach 1 °C od wartości środkowej przez 2-3 minuty od zebrania danych.
- Następnie wprowadzić cewnik o długości 5 Fr, 110 cm przez zewnętrzną osłonkę żyły szyjnej i skierować cewnik do prawego przedsionka za pomocą fluoroskopii.
- Po zweryfikowaniu pozycji mocno przepłukać 20 ml soli fizjologicznej o temperaturze 12 °C do cewnika.
- Obserwuj krzywą ugięcia temperatury w oprogramowaniu do zbierania danych. Zaznacz ten obszar i użyj funkcji rzutu serca w oprogramowaniu do obliczenia rzutu serca (Rysunek 1).
- W razie potrzeby powtórz ten proces 3-5 razy, aby uzyskać średnią wartość z tych pomiarów.
- Wentrikulografia
- Korzystając z przenośnego naprowadzania fluoroskopowego rentgenowskiego, wprowadź prowadnik 0,035" przez osłonkę tętnicy szyjnej do lewej komory. Przesuń osłonę tak, aby końcówka przechodziła przez zastawkę aortalną. Usuń drut doprowadzający 0,035" i wprowadź 80-centymetrowy cewnik warkoczowy markerowy przez osłonę tętnicy szyjnej tak, aby warkocz spoczywał w wierzchołku lewej linii. Wycofaj osłonę na 5 cm, pozostawiając warkocz na miejscu, tak aby osłona nie znajdowała się już w LV.
- Upewnij się, że cały personel w pomieszczeniu nosi odpowiedniki ołowianych fartuchów 0.5 mm. Niech każda osoba znajdująca się w promieniu 1 m od emitera nosi okulary ołowiowe.
- Zminimalizuj czas włączania wiązki i upewnij się, że emiter jest dobrze skolimowany, aby zmniejszyć narażenie personelu laboratoryjnego.
- Upewnij się, że cały personel stoi jak najdalej od emitera, a jednocześnie jest w stanie wykonać procedurę, aby zmniejszyć narażenie.
- Podłącz cewnik do wstrzykiwacza kontrastowego z co najmniej 30 ml jodowanego kontrastu. Zanotuj aktualne tętno zwierzęcia.
- Skonfiguruj wtryskiwacz mocy tak, aby dostarczał 15 mL/s kontrastu, co daje łącznie 30 ml i uzbrój urządzenie.
- Skonfiguruj fluoroskop do cyfrowej angiografii subtrakcyjnej (DSA) przy 30 klatkach/s przy 30° lewego nachylenia przedniego.
- Uruchom DSA na fluoroskopie i poczekaj, aż obraz zostanie odjęty. Rozpocznij wstrzykiwanie mocy, gdy tylko obraz odejmowania zostanie pokazany przez maszynę do fluoroskopii. Zrób to, naciskając przycisk wtryskiwacza, gdy tylko maszyna do fluoroskopii odejmie materiał nieprzezroczysty dla promieni rentgenowskich z obrazu, tak aby tylko komora niskiego napięcia była zmętniona podczas serii obrazów (Rysunek 2A).
UWAGA: Alternatywnie, klasyczna fluoroskopia może być użyta do wentrikulografii, jeśli DSA jest niedostępne.
- Prześlij te obrazy do systemu archiwizacji i komunikacji obrazów (PACS).
- Zaimportuj obrazy brzusznika do oprogramowania do obrazowania ilościowego.
- Korzystając z funkcji analizy lewej komory, skalibruj oprogramowanie do obrazu, używając znaczników 1 cm na warkoczu markera jako odniesienia.
- Kliknij przycisk End Diastole (Zakończ rozkurcz) i wyszukaj na obrazach DSA ramkę przedstawiającą największą objętość LV wskazującą na koniec rozkurczu. Następnie śledź granicę LV za pomocą myszy w małych odstępach, aby zapewnić dokładność.
- Następnie kliknij przycisk Zakończ skurcz i wyszukaj ramkę przedstawiającą skurcz końcowy, w której objętość LV jest najmniejsza. Ponownie prześledź granicę LV w taki sam sposób, jak w poprzednim kroku.
- Kliknij przycisk Analizuj. Następnie program przeprowadza ilościową analizę objętościową przy użyciu metody długości obszaru Dodge'a-Sandlera9 w celu obliczenia objętości końcowoskurczowej, objętości końcoworozkurczowej, a także objętości wyrzutowej. Dane są następnie drukowane w dokumencie zestawienia LV.
- Określ pojemność minutową serca, mnożąc zmierzoną objętość wyrzutową przez wcześniej zarejestrowane tętno.
- Cewnik z pętlą ciśnieniowo-objętościową
- Zanurz cewnik z pętlą fotowoltaiczną w zwykłej soli fizjologicznej na co najmniej 20 minut przed użyciem. Podłącz cewnik do systemu zbierania danych.
- Włóż końcówkę cewnika PV-loop zawierającego przetwornik ciśnienia do strzykawki z solą fizjologiczną i przytrzymaj przetwornik ciśnienia tuż pod menisku. Za pomocą przycisków zgrubnej i precyzyjnej regulacji na module cewnika wyreguluj wyjściowy sygnał ciśnienia, aż wskaże 0 mmHg w oprogramowaniu do zbierania danych.
- Skalibruj rezystywność krwi i objętość wyrzutową cewnika PV-loop zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Producent sugeruje stosowanie rezystywności krwi 1,5 mΩ i objętości wyrzutowej 60 ml dla dużych modeli zwierzęcych.
- Podobnie jak w kroku 6.2.1, włóż prowadnik 0,035" do pochewki tętnicy szyjnej i wsuń go do lewej komory za pomocą prowadzenia fluoroskopowego. Przesuń osłonkę, aż przejdzie przez zastawkę aortalną. Usuń prowadnicę, pozostawiając osłonę na miejscu i włóż cewnik z pętlą PV pod kierunkiem fluoroskopowym przez osłonę tętnicy szyjnej, aż część warkocza będzie spoczywać w wierzchołku lewej wysokości (Rysunek 2B). Wyciągnij osłonę ~5 cm, aby nie znajdowała się już w LV, pozostawiając warkocz na miejscu.
- Zgodnie z instrukcjami producenta wykonaj skanowanie linii bazowej przed zebraniem danych, przechodząc do opcji Skanowanie linii bazowej na ekranie akwizycji danych i naciśnij przycisk Enter. Skan wyjściowy jest wykonywany przy użyciu systemu cewnika PV-loop w celu potwierdzenia dokładnego pomiaru tętna. Naciśnij ponownie przycisk Enter, aby rozpocząć pobieranie danych o ciśnieniu i objętości. Segmenty głośności można przewijać, aby uzyskać najlepszy przebieg głośności.
- Sprawdź krzywą objętości ciśnienia wprowadzaną do oprogramowania do zbierania danych. Upewnij się, że pętla fotowoltaiczna jest odpowiednio nagrana, która powinna być prostokątna z gładkimi krawędziami. (Rysunek 2C). Jeśli nie, delikatnie zmień położenie cewnika, przekręcając go lub przesuwając w przód iw tył, aż zostanie zarejestrowana odpowiednia pętla. Oblicz objętość wyrzutową i pojemność minutową serca, mnożąc tętno przez różnicę między objętością końcoworozkurczową i końcowoskurczową.
- Zabezpiecz cewnik na miejscu za pomocą taśmy lub szwu, aby zapewnić odpowiednie ułożenie w całym tekście.
7. Eutanazja
- Poddaj zwierzę eutanazji za pomocą >2 mEq/kg chlorku potasu (50-70 ml 2 mEq/ml KCl) przez osłonkę żyły szyjnej.
- Kontynuuj znieczulenie ogólne i monitorowanie pracy serca do momentu, gdy zapis EKG nie wykaże aktywności elektrycznej serca, a ciśnienie CO2 w końcówce oddechu osiągnie 0 mmHg.
UWAGA: Monitorowanie hemodynamiczne było prowadzone przez cały czas trwania eksperymentu.