Artykuł metodologiczny

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

DOI:

10.3791/62336

⸱

8 lutego 2022

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, Rutgers-New Jersey Medical School, 2Department of Microbiology, Biochemistry & Molecular Genetics, Public Health Research Institute Center, New Jersey Medical School, Rutgers University, 3Center for Immunity and Inflammation, New Jersey Medical School, Rutgers-The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkami odpornościowymi zmodyfikowanymi przez chimeryczny receptor antygenowy (CAR) stała się nowym sposobem leczenia nowotworów i chorób zakaźnych. Immunoterapia oparta na NK, a w szczególności na komórkach CAR-NK, jest jednym z najbardziej obiecujących rozwiązań "z półki" bez poważnej toksyczności zagrażającej życiu. Jednak wąskim gardłem w opracowaniu skutecznej terapii CAR-NK jest uzyskanie wystarczającej liczby niewyczerpujących, długowiecznych, "gotowych" komórek CAR-NK od strony trzeciej. W tym miejscu opracowaliśmy nową metodę ekspansji CAR-NK przy użyciu linii komórek B transformowanej wirusem Epsteina-Barr (EBV) wyrażającej genetycznie zmodyfikowaną błonową formę interleukiny-21 (IL-21). W tym protokole przedstawiono procedury krok po kroku mające na celu ekspansję komórek NK i CAR-NK z krwi pępowinowej i krwi obwodowej, a także tkanek narządów litych. Prace te znacznie usprawnią rozwój kliniczny immunoterapii CAR-NK.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki NK są ważnym podzbiorem limfocytów, które wykazują ekspresję CD56 i nie mają ekspresji markera limfocytów T, CD31,2. Konwencjonalne komórki NK są klasyfikowane jako wrodzone komórki odpornościowe odpowiedzialne za nadzór immunologiczny nad komórkami zakażonymi wirusem i komórkami rakowymi. W przeciwieństwie do limfocytów T, komórki NK rozpoznają zakażone lub złośliwe komórki za pomocą CD16 lub innych receptorów aktywujących i nie wymagają tworzenia kompleksu między peptydami antygenowymi a cząsteczkami głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I3,4. Ostatnie badania kliniczne z wykorzystaniem komórek CAR-NK z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR)-NK w leczeniu nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworów CD19-dodatnich (chłoniak nieziarniczy lub przewlekła białaczka limfocytowa [CLL]) wykazały wyjątkowe zalety bezpieczeństwa komórek CAR-NK5. Na przykład infuzja komórek CAR-NK wiąże się z minimalną lub znikomą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), neurotoksycznością, kardiotoksycznością i zespołem uwalniania cytokin (CRS)6,7,8,9,10. Jednak konwencjonalne metody namnażania ludzkich komórek NK wykazały wyczerpujące fenotypy z silnym bratobójczym zabijaniem i niedoborem telomerów, co stanowi poważne wyzwanie w uzyskaniu odpowiedniej liczby funkcjonalnych komórek NK do immunoterapii adoptywnej11.

Aby przezwyciężyć te wyzwania, opracowano metodę bezpośredniego namnażania pierwotnych komórek NK z niefrakcjonowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB) przy użyciu napromieniowanej i genetycznie modyfikowanej linii komórkowej 721.221 (dalej 221), ludzkiej linii komórkowej B-limfoblastoidalnej o niskiej ekspresji cząsteczek MHC klasy I3. Wcześniejsze badania wykazały znaczenie IL-21 w ekspansji komórek NK; w związku z tym opracowano genetycznie zmodyfikowaną błonę IL-21 wyrażającą wersję linii komórkowej 721.221 (zaczynając od teraz, 221-mIL-21) 11,12,13,14,15. Wyniki wykazały, że pierwotne komórki NK o pojemności 221 mIL-21 z ekspandowaną komórką zasilającą były ekspandowane średnio do >40 000 razy z utrzymującą się wysoką czystością komórek NK przez około 2-3 tygodnie. Dodatkowe informacje dotyczące stosowania tego protokołu można znaleźć w Yang et al.16.

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie krok po kroku procedury nowego rozszerzania komórek PBNK, CBNK, NK pochodzących z tkanek i CAR-NK ex vivo.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca związana z tkankami ludzkimi i krwią w tym protokole jest zgodna z wytycznymi Rutgers University Institutional Review Board (IRB)

1. Ekspansja komórek NK z tkanek wątroby (Dzień 0), jak pokazano w Rysunek 1.

UWAGA: Początkowa liczba komórek i żywotność są silnie skorelowane z czasem od usunięcia narządu i początkową ilością próbki tkanki. Jeśli jednak tkanki zostaną umieszczone w 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i przechowywane na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, komórki NK mogą nadal ekspansować się przy wysokiej czystości i żywotności do 24 godzin później.

  1. Zidentyfikuj żywe obszary tkanek w celu uzyskania limfocytów z tkanek i skrawków za pomocą sterylnego sprzętu chirurgicznego.
  2. Umieść tkanki w 30 ml HBSS (bez wapnia lub magnezu) i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do przygotowania do izolacji.
  3. Zmiel tkankę w kostkę o długości <0,5 cm za pomocą sterylnych żyletek lub nożyczek i kleszczy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Przygotuj 1x roztwór kolagenazy dożylnej (1 mg / ml), rozcieńczając 10x zapas w HBSS (10x Kolagenaza IV: 10 mg / ml lub ~ 200 U / ml).
  5. Umieść zmielone kawałki tkanki w probówkach dysocjatora tkanek. Napełnij probówki nie więcej niż 4 g chusteczki i zanurz kawałki tkanki w ~ 10 ml 1x kolagenazy IV.
    UWAGA: Stosowanie DNazy I nie jest zalecane, ponieważ może nieznacznie zmniejszyć żywotność i wydajność NK. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi używanymi rurkami do dysocjacji tkanek.
  6. Umieścić probówki dysocjatora tkanek w dysocjatorze tkankowym i zmiksować w temperaturze 37 °C, aby dokładnie zmielić tkankę.
    UWAGA: W przypadku tkanki wątroby może to potrwać ponad 30 minut. W przypadku bardziej kruchych tkanek może wystarczyć około 15 minut. Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat określonych probówek do dysocjacji tkanek i zastosowanego dysocjatora tkankowego.
  7. Wyjmij probówki dysocjatora tkanek i przetrzyj przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 40 μm za pomocą końcówki strzykawki o pojemności 5 ml. Zebrać eluent i wyrzucić duże, niestrawione fragmenty.
  8. Odwirowywać eluent w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
  9. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 30% krzemionce pokrytej poliwinylopirolidonem (PVP), aby usunąć komórki tłuszczowe, które w przeciwnym razie zanieczyściłyby końcową frakcję limfocytów.
    1. Aby przygotować 1x krzemionkę pokrytą PVP, użyj rozcieńczenia 9:1 krzemionki pokrytej PVP w 10x PBS.
      UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretną zastosowaną krzemionką pokrytą PVP.
    2. Aby przygotować 30% krzemionki pokrytej PVP, rozcieńczyć 1x krzemionkę pokrytą PVP za pomocą PBS / HBSS.
  10. Wirować osad komórkowy o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
  11. Zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki R-10.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek R-10
  12. Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na 4 ml Ficollu lub pożywki do separacji limfocytów, aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek i komórek wielojądrzastych.
  13. Rozdzielić warstwy, wirując przy 400 x g przez 23 minuty w temperaturze pokojowej z wyłączonym przyspieszaniem i hamowaniem lub przy najniższym ustawieniu. Ostrożnie zdekantować górną warstwę pożywki i zebrać interfazę zawierającą limfocyty naciekające tkanki.
  14. Przepłukać komórki 10 ml pożywki i przystąpić do zliczania komórek, cytometrii przepływowej, porcjowania i zamrażania komórek lub pierwotnego protokołu ekspansji NK.

2. Pierwotna ekspansja komórek NK z PBMC (lub CB lub tkanek narządowych) (Dzień 0), jak pokazano w Rysunek 2.

  1. Rozmrozić zamrożony PBMC i zamrożone, napromieniowane komórki zasilające w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Przemyć oddzielnie PBMC i 100 napromieniowanych promieniami gamma (napromieniowanych Gy) komórek 221-mIL-21 przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut za pomocą 10 ml pożywki R-10.
  3. Zaoszczędź 1 x 106 komórek PBMC do cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Początkowa czystość komórek NK jest ważnym czynnikiem przy obliczaniu szybkości ekspansji komórek NK.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki R-10. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego.
  5. Wymieszać 5 x 106 komórek PBMC z 10 x 106 komórek 100 napromieniowanych Gy-221 komórek 221-mIL-21 w specjalnej 6-dołkowej płytce (patrz Tabela materiałów).
  6. Dodać 30 ml pożywki R-10 uzupełnionej ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) (patrz tabela materiałów).
  7. Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  8. Zastąp pożywkę pożywką R-10 uzupełnioną ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) w celu utrzymania komórek NK co 3-4 dni.
    UWAGA: Utrzymuj mniej niż 20 x 106 komórek na studzienkę w celu dalszej ekspansji przy każdej zmianie podłoża. Aby uzyskać najlepszą żywotność, upewnij się, że całkowita liczba komórek w każdym dołku nie przekracza 100 x 106 komórek.
  9. Zapisz całkowitą liczbę komórek, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co 3-4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.

3. Dołączenie komórek 293T (Dzień 2), jak pokazano na Rysunek 2.

  1. Podzielić 1,8 x 106 komórek 293T w 11 ml pożywki D-10 na płytkę 100 mm poddaną działaniu środka.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek D-10
  2. Inkubować komórki 293T w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

4. Transfekcja retrowirusa (Dzień 3)

  1. W probówce o pojemności 1,7 ml wymieszaj 470 μl zredukowanej pożywki surowicy z 30 μl odczynnika do transfekcji.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi zastosowanymi pożywkami o zredukowanej surowicy i odczynnikami do transfekcji.
  2. W oddzielnej probówce o pojemności 1,7 ml dodaj 2,5 μg plazmidu pRDF, 3,75 μg plazmidu Pegpam3 i 2,5 μg konstruktu CAR w wektorze SFG do zredukowanej pożywki surowicy, tak aby końcowa objętość wynosiła 500 μL.
  3. Roztwory z kroków 4.1 i 4.2 mieszać kroplami.
  4. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  5. Dodać 1 ml mieszaniny z etapu 4.4 do płytki komórkowej 293T w dniu 1 w postaci kropli.
  6. Inkubować płytkę (płytki) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48–72 godzin.

5. Powlekanie płytką Retronektyny (Dzień 3)

  1. Rozcieńczyć białko retronektyny solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 50-100 μg/ml.
  2. Dodać 500 μl rozcieńczonej retronektyny do każdej studzienki niepoddanej działaniu 24-dołkowej płytki (5 dołków na konstrukt CAR). Uszczelnić płytkę za pomocą parafilmu i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.

6. Transdukcja (Dzień 4)

  1. Odwirować płytkę retronektyny o stężeniu 2103 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  2. Zablokować każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 1 ml pożywki R-10.
  3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę.
  4. Podgrzej wirówkę do temperatury 32 °C, podczas gdy płytka retronektyny jest blokowana.
  5. Zebrać supernatant retrowirusa, filtrując transfekowane komórki 293T za pomocą filtra 0,45 μm.
  6. Porcjować 2 ml przefiltrowanego supernatantu retrowirusa do każdej studzienki.
  7. Odwirować 24-dołkową płytkę o stężeniu 2103 x g przez 2 godziny w temperaturze 32 °C.
  8. Podczas wirowania na płytce należy zebrać ekspandowane komórki PBNK z dnia 0 i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego.
    UWAGA: Kontynuuj rozszerzanie komórek PBNK, dodając pożywkę R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/mL) i IL-15 (5 ng/ml).
  9. Rozcieńczyć ekspandowane komórki PBNK pożywką R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml) do 2,5 x 105-5 x 105 komórek/ml (0,5 x 106-1 x 106 komórek na studzienkę).
    UWAGA: Zapisz całkowitą liczbę komórek, żywotność i zapisz 5 x 105 rozszerzonych komórek PBNK do cytometrii przepływowej, ponieważ te wartości są ważne przy określaniu szybkości ekspansji komórek NK.
  10. Po odwirowaniu częściowo odessać supernatant retrowirusa z każdej studzienki.
    UWAGA: Nie należy całkowicie aspirować, tj. pozostawić około 100 μl supernatantu retrowirusa na studzienkę, ponieważ zmniejszy to wydajność transdukcji.
  11. Podwielokrotność 2 ml rozcieńczonych ekspandowanych komórek PBNK od etapu 6.8 do każdego dołka.
  12. Odwirować płytkę przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 32 °C. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48-72 h.
    UWAGA: Nie parafilmuj płyty.

7. Zbiór komórek CAR-NK (dzień 6 lub 7), jak pokazano w Rysunek 2.

  1. Delikatnie zebrać komórki z 24-dołkowej płytki i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml
    UWAGA: Staraj się nie generować pęcherzyków, ponieważ spowoduje to zmniejszenie żywotności komórek.
  2. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut.
  3. Zawiesić osad z 1 ml pożywki R-10 i policzyć komórki za pomocą Trypan Blue.
    UWAGA: Zapisz 5 x 105 komórek do cytometrii przepływowej w celu określenia wydajności transdukcji.
  4. Przenieś zawieszone komórki na specjalną 6-dołkową płytkę zawierającą 30 ml pożywki R-10 uzupełnionej IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml).
  5. Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. Zastąp pożywkę R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml), aby utrzymać komórki NK co 3 - 4 dni.
    UWAGA: Utrzymuj mniej niż 20 x 106 komórek na studzienkę w celu dalszej ekspansji przy każdej zmianie. Aby uzyskać najlepszą żywotność, upewnij się, że całkowita liczba komórek w każdym dołku nie przekracza 100 x 106 komórek.
  7. Zapisuj całkowitą liczbę komórek, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co 3-4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.
  8. Komórki należy wykorzystać do odpowiednich testów in vitro lub in vivo.
    UWAGA: Ekspandowane ex vivo komórki PBNK i CAR-NK można hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez około 4 tygodnie.
  9. Zbadaj liczbę i czystość komórek NK w 7, 11, 14, 18 i 21 dniu za pomocą cytometrii przepływowej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny przebieg procesu infiltracji komórek NK i ekspansji komórek PBNK przy użyciu metodologii komórek zasilających 221-mIL-21 jest pokazany w Rysunek 1 i Rysunek 2. Rozszerzone komórki PBNK pobierano co 3 lub 4 dni do cytometrii przepływowej w celu określenia czystości komórek NK poprzez barwienie komórek anty-ludzkim CD56 i anty-ludzkim CD3. Eksperyment powtórzono przy użyciu dwóch różnych dawców, aby wykazać odtwarzalność systemu ekspansji (Rysunek 3). Wykazano, że komórki PBNK rozszerzone przez 221-mIL-21 rozszerzają się prawie 5 × 104 razy (Rysunek 3A). Co więcej, czystość komórek NK była wysoce utrzymana, około 85% przez cały 21-dniowy okres ekspansji (Rysunek 3B)". Korzystając z systemu ekspansji komórek zasilających 221-mIL-21, czystość komórek NK stale wahała się w zakresie 85%-95%, niezależnie od dawców (dane nie pokazane). Aby zademonstrować solidność systemu ekspansji 221-mIL-21, PBMC wybarwiono pod kątem anty-CD56 i anty-CD3 przed ekspansją, co wykazało czystość komórek 7,09% dla komórek NK i wysoki odsetek komórek T (Figura 4A). PBMC hodowano wspólnie z 221-mIL-21 w celu namnażania komórek NK; czystość NK została sprawdzona przed transdukcją CAR-NK w dniu 4 (Figura 4A). Komórki CAR-NK zebrano i wybarwiono pod kątem anty-CD56, anty-CD3 i anty-hIgG(H+L) F(ab')2, które wykazały wysoką populację komórek NK (86,9% w dniu 7) i wysoką skuteczność transdukcji CAR wynoszącą około 70% (Figura 4). Wyższą skuteczność transdukcji (do 95%) zaobserwowano również przy użyciu systemu pakowania retrowirusów. Podsumowując, dane te pokazują, że komórki zasilające 221-mIL-21 mogą z powodzeniem namnażać komórki NK i zachowywać czystość komórek NK ex vivo.

figure-results-1
Rysunek 1: Diagram ekspansji komórek NK z próbek ludzkich organów. Krótko mówiąc, uzyskane próbki ludzkiej wątroby są mielone na małe kostki w celu mechanicznego trawienia. Zdysocjowane komórki są następnie izolowane za pomocą krzemionki pokrytej PVP i pożywki do separacji limfocytów. Co więcej, komórki NK są rozwijane przy użyciu protokołu rozszerzania opisanego w Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczny przebieg procesu generowania komórek CAR-NK z PBMC. Krótko mówiąc, komórki zasilające 221-mIL21 napromieniano przy 100 Gy przed kokulturacją PBMC uzupełnionymi IL-2 i IL-15 w dniu 0. Równolegle komórki 293T transfekowano systemem pakowania retrowirusa w celu wytworzenia retrowirusa CAR, który następnie transdukowano do rozszerzonych komórek PBNK w obecności IL-2 i IL-15. Pierwotne komórki CAR-NK zostały zebrane w dniu 7 i kontynuowały ekspansję przez 21 dni. Ten rysunek został zmodyfikowany z Yang et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Dynamiczna ekspansja komórek PBNK w trybie poklatkowym. (A) Krotne rozszerzenie PBNK podczas 22-dniowego kursu. Komórki barwiono anty-CD56 i anty-CD3 we wskazanych dniach do cytometrii przepływowej. Całkowitą liczbę komórek NK określono przez pomnożenie czystości komórek NK przez całkowitą liczbę komórek. Szybkość ekspansji została wygenerowana w następujący sposób: (Liczba komórek NK)Tn/(Liczba komórek NK)T0, gdzie Liczba komórek NK = (procent czystości komórek NK) × (całkowita liczba komórek), T0 to liczba komórek NK w czasie 0, a Tn to liczba komórek NK w dniu n. (B) Czystość komórek NK w ciągu 22-dniowego przebiegu czasu. Ekspansję komórek NK powtórzono dwa razy z dwoma różnymi dawcami. Słupki błędów reprezentują ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywna analiza cytometryczna komórek CAR-NK. (A) Reprezentatywne wykresy punktowe pokazujące dynamiczny upływ czasu czystości komórek NK komórek CAR-NK podczas 18-dniowego kursu. Analizę cytometrii przepływowej oceniano poprzez barwienie komórek anty-CD56 i anty-CD3 we wskazanych punktach czasowych. Dzień 0 oznacza okres przed ekspansją PBNK. Dzień 4 wskazuje na postekspansję PBNK i wstępną transdukcję komórek CAR-NK. Dzień 7 wskazuje na post-transdukcję komórek CAR-NK. (B) Reprezentatywne wykresy punktowe przedstawiające skuteczność transdukcji komórek CAR-NK przy użyciu systemu pakowania retrowirusów. Komórki barwiono anty-CD56, anty-CD3 i anty-hIgG(H+L) F(ab')2 do cytometrii przepływowej. (C) Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiające ekspresję CAR w różnych podzbiorach, w tym CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ i CD56-CD3- w dniu 18. Komórki barwiono anty-CD56, anty-CD3 i anty-hIgG(H+L) F(ab')2 (wskazując na ekspresję CAR) do cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość obecnych produktów CAR-NK w badaniach klinicznych wykorzystuje linie komórkowe NK17, takie jak NK-92, linia komórkowa wyizolowana od pacjenta z chłoniakiem nieziarniczym18, NK-92MI, niezależna od IL-2 linia komórkowaNK-92 19 i NKL, wyizolowana od pacjenta z dużymi ziarnistymi limfocytami20, ponieważ te linie komórkowe łatwo się namnażają w przypadku produktów "z półki". Jednak te linie komórkowe, np. komórki NK-92, mają marginalną skuteczność kliniczną i ekspansję in vivo, ponieważ wymagają napromieniania przed infuzją, co ogranicza ich proliferację i cytotoksyczność in vivo21. Biorąc pod uwagę te powody, obecnie badane są różne strategie ekspansji pierwotnych komórek NK z kilku źródeł, w tym krwi obwodowej, CB, szpiku kostnego (BM), ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HSC), indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i tkanek nowotworowych 21,22,23. Na przykład komórki NK mogą być ekspandowane ex vivo przy użyciu interleukin, w tym IL-15, IL-18 i IL-21. Linie komórek limfoblastoidalnych, takie jak komórki K562 lub linie komórek limfoblastoidalnych przekształcone w wirusa Epsteina-Barr, takie jak komórki 721.221, są również wykorzystywane do ekspansji komórek NK16. Jednak wyżej wymienione strategie często generują niewystarczającą liczbę komórek NK do adoptywnego transferu immunoterapii CAR-NK22,24. Aby pomóc w rozwiązaniu tego problemu, badanie przedstawia protokół ekspansji komórek NK ex vivo przy użyciu genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej przekształconej przez EBV, komórek zasilających 221-mIL-21.

Metodologia ekspansji przy użyciu komórek zasilających 221-mIL-21 pokazana w tym protokole jest zoptymalizowana pod kątem ekspansji komórek NK z szybkością ekspansji co najmniej 10 do 100 razy wyższą niż w przypadku innych linii komórkowych białaczki, w tym HL-60 i OCl-AML3 z ekspresją błony IL-21, K562 i K652-mIL21 z ekspresją liganda OX40 22,24,25. Ekspresja CAR jest również oceniana przez około 2 tygodnie ex vivo. Co ważniejsze, strategia ekspansji komórek zasilających 221-mIL-21 może być stosowana do namnażania komórek NK z różnych źródeł, w tym PBMC, CB i narządów stałych, takich jak wątroba, bez początkowego etapu wzbogacania NK. Chociaż system zasilający 221-mIL-21 nie jest tak zależny od dawcy jak wyżej wymienione linie komórkowe zasilające, nie jest całkowicie niezależny od dawców. Średnio system ekspansji 221-mIL-21 może osiągnąć 90% czystości komórek NK przy wysokiej liczbie komórek NK, przy około <5% zanieczyszczenia limfocytów T w 14 dniu po ekspansji. Dlatego, aby wyeliminować możliwość zanieczyszczenia limfocytów T, konieczne jest wyizolowanie komórek NK z otrzymanych próbek przed ekspansją ex vivo lub zastosowanie systemu selekcji CD3+ w celu wyeliminowania limfocytów T po ekspansji ex vivo.

Jednym z zarzutów związanych ze stosowaniem systemu ekspansji komórek NK jest to, że komórki zasilające mogły nie zostać w pełni wyeliminowane po ekspansji lub przed transfuzją, co może budzić poważne obawy regulacyjne; Dlatego tak ważne jest całkowite wyeliminowanie komórek żywicielskich przed transfuzją. Jednak ostatnie badania kliniczne CAR-NK, w których komórki zasilające K562-mIL21-4-1BBL zostały wykorzystane do ekspansji komórek CBNK ex vivo 24,25, nie wykazały żadnych niepokojących powikłań. Co więcej, nasze wstępne dane wykazały stopniowy spadek napromieniowanej populacji 221-mIL-21 wraz z postępem ekspansji (dane nie pokazane). Jednak aby ta metoda ekspansji mogła zostać wdrożona w warunkach klinicznych, potrzebne są bardziej obszerne badania. Reasumując, system ekspansji 221-mIL-21 pomaga rozwiązać problem ekspansji pierwotnych komórek CAR-NK, a tym samym znacząco przyczyni się do szerszego zastosowania immunoterapii opartej na komórkach CAR-NK w najbliższej przyszłości.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Liu (Dr. Hsiang-chi Tseng, Dr. Xuening Wang i Dr. Chih-Hsiung Chen) za ich komentarze na temat manuskryptów. Chcielibyśmy podziękować dr Gianpietro Dotti za wektory SFG i dr Ericowi Longowi za 721.221 komórek. Praca ta była częściowo wspierana przez HL125018 (D. Liu), AI124769 (D. Liu), AI129594 (D. Liu), AI130197 (D. Liu) i Rutgers-Health Advance Funding (program NIH REACH), U01HL150852 (R. Panettieri, S. Libutti i R. Pasqualini), S10OD025182 (D. Liu) oraz fundusze Rutgers University-New Jersey Medical School Startup dla D. Liu Laboratory.

Materiały



Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 mm poddane obróbce powierzchniowej sterylne naczynia do hodowli tkanekVWR10062-880Do transfekcji
komórek 293TATCCCRL-3216Do transfekcji
6-dołkowa płytka G-REXWilson Wolf80240MDo ekspansji komórek NK
AF647-sprzężony fragment AffiniPure F(ab')2 anty-ludzki IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-606-088Dla przepływu cytometria
Konstrukt CAR w wektorze SFGWygenerowany w laboratorium dr Dongfang LiuDo transfekcji
10%
D-10 pożywka
Składnik: DMEM		VWR45000-304
D-10 media
Składnik: Płodowa surowica bydlęca (FBS)		Corning35-010-CV10%
D-10 media
Składnik: Penicylina Streptomycyna		VWR45000-6521%
FastFlow & Nisko wiążąca membrana Millipore Express PESMillexSLHPR33RBDo transdukcji
Odczynnik do transfekcji GenejuiceVWR80611-356Do transfekcji
GentleMACS C-tubesMiltenyi Biotec130-093-237Do izolacji TIL
gentleMACS OctoMiltenyi BiotecCytatDo izolacji TIL
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS - bez wapń lub magnez)ThermoFisher14170120Do izolacji TIL
Ludzka IL-15Peprotech200-15Do ekspansji komórek NK
Ludzka IL-2Peprotech200-02Do ekspansji komórek NK
Napromieniowane komórki zasilające 221-mIL21Wygenerowane w laboratorium dr Dongfang LiuZamrożone w pożywkach kriokonserwacyjnych
Corning25-072-CVDo izolacji TIL
OPTI-MEMThermoFisher31895Do transfekcji
PE anty-ludzki klon CD3 HIT3aBiolegend300308Do cytometrii przepływowej
PE/Cy7 anty-ludzki klon CD56 (NCAM) 5.1H11BioLegend362509Do cytometrii przepływowej
Plazmid Pegpam3Wygenerowany w laboratorium dr Dongfang Liu transfekcja
PercollGE Healthcare17089101Do izolacji TIL
Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMCs)New York Blood CenterWyizolowane z osocza zdrowych dawców, zamrożone w pożywce kriokonserwującej
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS)Corning21-040-CVDo transdukcji
plazmidu pRDFWygenerowany w laboratoriumDo transfekcji
R-10 media
Składniki: RPMI 1640		VWR45000-404
R-10 media
Składnik: L-glutamina		VWR45000-3041%
R-10 media
Składnik: Penicylina Streptomycyna		VWR45000-6521%
R-10 media
Składnik: Surowica bydlęca płodu (FBS)		Corning35-010-CV10%
RetronektynaWygenerowane w laboratorium dr Dongfang Liudomowej robotyDo transdukcji
Trypan BlueCorning25-900-ClDo liczenia komórek
Nieobrobiona płytka 24-dołkowaFisher Scientific13-690-071Do transdukcji
Kolagenaza IV Sigma C4-22-1G Do izolacji TIL Pożywka kriokonserwacyjna Składnik: Surowica bydlęca płodu (FBS)Corning 35-010-CV 90% pożywki kriokonserwowej Składnik: Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma D2050 Pożywki do separacji limfocytów Dla dr Dongfang Liu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Acker, H. H., et al. CD56 in the immune system: More than a marker for cytotoxicity. Frontiers in Immunology. 8, 892(2017).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Shimizu, Y., et al. Transfer and expression of three cloned human non-HLA-A,B,C class I major histocompatibility complex genes in mutant lymphoblastoid cells. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 85 (1), 227-231 (1988).
  4. Wu, J., Lanier, L. L. Natural killer cells and cancer. Advances in Cancer Research. 90, 127-156 (2003).
  5. Liu, E., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. The New England Journal of Medicine. 382 (6), 545-553 (2020).
  6. Alonso-Camino, V., et al. Efficacy and toxicity management of CAR-T-cell immunotherapy: a matter of responsiveness control or tumour-specificity. Biochemical Society Transactions. 44 (2), 406-411 (2016).
  7. Bonifant, C. L., Jackson, H. J., Brentjens, R. J., Curran, K. J. Toxicity and management in CAR T-cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16011(2016).
  8. Kalaitsidou, M., Kueberuwa, G., Schitt, A., Gilham, D. E. CAR T-cell therapy: toxicity and the relevance of preclinical models. Immunotherapy. 7 (5), 487-497 (2015).
  9. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  10. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  11. Zhang, Y., et al. In vivo kinetics of human natural killer cells: the effects of ageing and acute and chronic viral infection. Immunology. 121 (2), 258-265 (2007).
  12. Vidard, L., et al. CD137 (4-1BB) Engagement fine-tunes synergistic IL-15- and IL-21-driven nk cell proliferation. Journal of Immunology. 203 (3), Baltimore, Md. 676-685 (2019).
  13. Venkatasubramanian, S., et al. IL-21-dependent expansion of memory-like NK cells enhances protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Mucosal Immunology. 10 (4), 1031-1042 (2017).
  14. Ojo, E. O., et al. Membrane bound IL-21 based NK cell feeder cells drive robust expansion and metabolic activation of NK cells. Scientific Reports. 9 (1), 14916(2019).
  15. Denman, C. J., et al. Membrane-bound IL-21 promotes sustained ex vivo proliferation of human natural killer cells. PLoS One. 7 (1), 30264(2012).
  16. Yang, Y., et al. Superior expansion and cytotoxicity of human primary NK and CAR-NK cells from various sources via enriched metabolic pathways. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 428-445 (2020).
  17. Liu, S., et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 7(2021).
  18. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell-line (Nk-92) with phenotypical and functional-characteristics of activated natural-killer-cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
  19. Tam, Y. K., et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Human Gene Therapy. 10 (8), 1359-1373 (1999).
  20. Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
  21. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (2), 167-176 (2018).
  22. Tseng, H. C., et al. Efficacy of anti-CD147 chimeric antigen receptors targeting hepatocellular carcinoma. Nature Communications. 11 (1), 4810(2020).
  23. Easom, N. J. W., et al. IL-15 overcomes hepatocellular carcinoma-induced NK cell dysfunction. Frontiers in Immunology. 9, 1009(2018).
  24. Granzin, M., et al. Highly efficient IL-21 and feeder cell-driven ex vivo expansion of human NK cells with therapeutic activity in a xenograft mouse model of melanoma. Oncoimmunology. 5 (9), 1219007(2016).
  25. Liu, E. L., et al. Cord blood derived natural killer cells engineered with a chimeric antigen receptor targeting CD19 and expressing IL-15 have long term persistence and exert potent anti-leukemia activity. Blood. 126 (23), (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki Natural Killerimmunoterapia NKcytometria przep ywowaNK z krwi obwodowejNK z krwi p powinowejizolacja limfocyt wtransdukcja retrowirusowa

Powiązane artykuły