Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Komórki NK są ważnym podzbiorem limfocytów, które wykazują ekspresję CD56 i nie mają ekspresji markera limfocytów T, CD3^1,2. Konwencjonalne komórki NK są klasyfikowane jako wrodzone komórki odpornościowe odpowiedzialne za nadzór immunologiczny nad komórkami zakażonymi wirusem i komórkami rakowymi. W przeciwieństwie do limfocytów T, komórki NK rozpoznają zakażone lub złośliwe komórki za pomocą CD16 lub innych receptorów aktywujących i nie wymagają tworzenia kompleksu między peptydami antygenowymi a cząsteczkami głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I^3,4. Ostatnie badania kliniczne z wykorzystaniem komórek CAR-NK z wykorzystaniem chimerycznego receptora antygenowego (CAR)-NK w leczeniu nawrotowych lub opornych na leczenie nowotworów CD19-dodatnich (chłoniak nieziarniczy lub przewlekła białaczka limfocytowa [CLL]) wykazały wyjątkowe zalety bezpieczeństwa komórek CAR-NK⁵. Na przykład infuzja komórek CAR-NK wiąże się z minimalną lub znikomą chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), neurotoksycznością, kardiotoksycznością i zespołem uwalniania cytokin (CRS)^6,7,8,9,10. Jednak konwencjonalne metody namnażania ludzkich komórek NK wykazały wyczerpujące fenotypy z silnym bratobójczym zabijaniem i niedoborem telomerów, co stanowi poważne wyzwanie w uzyskaniu odpowiedniej liczby funkcjonalnych komórek NK do immunoterapii adoptywnej¹¹.

Aby przezwyciężyć te wyzwania, opracowano metodę bezpośredniego namnażania pierwotnych komórek NK z niefrakcjonowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB) przy użyciu napromieniowanej i genetycznie modyfikowanej linii komórkowej 721.221 (dalej 221), ludzkiej linii komórkowej B-limfoblastoidalnej o niskiej ekspresji cząsteczek MHC klasy I³. Wcześniejsze badania wykazały znaczenie IL-21 w ekspansji komórek NK; w związku z tym opracowano genetycznie zmodyfikowaną błonę IL-21 wyrażającą wersję linii komórkowej 721.221 (zaczynając od teraz, 221-mIL-21) ^{11,12,13,14,15}. Wyniki wykazały, że pierwotne komórki NK o pojemności 221 mIL-21 z ekspandowaną komórką zasilającą były ekspandowane średnio do >40 000 razy z utrzymującą się wysoką czystością komórek NK przez około 2-3 tygodnie. Dodatkowe informacje dotyczące stosowania tego protokołu można znaleźć w Yang et al.¹⁶.

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie krok po kroku procedury nowego rozszerzania komórek PBNK, CBNK, NK pochodzących z tkanek i CAR-NK ex vivo.

Praca związana z tkankami ludzkimi i krwią w tym protokole jest zgodna z wytycznymi Rutgers University Institutional Review Board (IRB)

1. Ekspansja komórek NK z tkanek wątroby (Dzień 0), jak pokazano w Rysunek 1.

UWAGA: Początkowa liczba komórek i żywotność są silnie skorelowane z czasem od usunięcia narządu i początkową ilością próbki tkanki. Jeśli jednak tkanki zostaną umieszczone w 30 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) i przechowywane na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, komórki NK mogą nadal ekspansować się przy wysokiej czystości i żywotności do 24 godzin później.

1. Zidentyfikuj żywe obszary tkanek w celu uzyskania limfocytów z tkanek i skrawków za pomocą sterylnego sprzętu chirurgicznego.
2. Umieść tkanki w 30 ml HBSS (bez wapnia lub magnezu) i trzymaj na lodzie, aż będą gotowe do przygotowania do izolacji.
3. Zmiel tkankę w kostkę o długości <0,5 cm za pomocą sterylnych żyletek lub nożyczek i kleszczy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
4. Przygotuj 1x roztwór kolagenazy dożylnej (1 mg / ml), rozcieńczając 10x zapas w HBSS (10x Kolagenaza IV: 10 mg / ml lub ~ 200 U / ml).
5. Umieść zmielone kawałki tkanki w probówkach dysocjatora tkanek. Napełnij probówki nie więcej niż 4 g chusteczki i zanurz kawałki tkanki w ~ 10 ml 1x kolagenazy IV.
   UWAGA: Stosowanie DNazy I nie jest zalecane, ponieważ może nieznacznie zmniejszyć żywotność i wydajność NK. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi używanymi rurkami do dysocjacji tkanek.
6. Umieścić probówki dysocjatora tkanek w dysocjatorze tkankowym i zmiksować w temperaturze 37 °C, aby dokładnie zmielić tkankę.
   UWAGA: W przypadku tkanki wątroby może to potrwać ponad 30 minut. W przypadku bardziej kruchych tkanek może wystarczyć około 15 minut. Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat określonych probówek do dysocjacji tkanek i zastosowanego dysocjatora tkankowego.
7. Wyjmij probówki dysocjatora tkanek i przetrzyj przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 40 μm za pomocą końcówki strzykawki o pojemności 5 ml. Zebrać eluent i wyrzucić duże, niestrawione fragmenty.
8. Odwirowywać eluent w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
9. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 30% krzemionce pokrytej poliwinylopirolidonem (PVP), aby usunąć komórki tłuszczowe, które w przeciwnym razie zanieczyściłyby końcową frakcję limfocytów.
   1. Aby przygotować 1x krzemionkę pokrytą PVP, użyj rozcieńczenia 9:1 krzemionki pokrytej PVP w 10x PBS.
      UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretną zastosowaną krzemionką pokrytą PVP.
   2. Aby przygotować 30% krzemionki pokrytej PVP, rozcieńczyć 1x krzemionkę pokrytą PVP za pomocą PBS / HBSS.
10. Wirować osad komórkowy o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
11. Zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki R-10.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek R-10
12. Ostrożnie ułóż zawiesinę komórkową na 4 ml Ficollu lub pożywki do separacji limfocytów, aby oddzielić limfocyty od czerwonych krwinek i komórek wielojądrzastych.
13. Rozdzielić warstwy, wirując przy 400 x g przez 23 minuty w temperaturze pokojowej z wyłączonym przyspieszaniem i hamowaniem lub przy najniższym ustawieniu. Ostrożnie zdekantować górną warstwę pożywki i zebrać interfazę zawierającą limfocyty naciekające tkanki.
14. Przepłukać komórki 10 ml pożywki i przystąpić do zliczania komórek, cytometrii przepływowej, porcjowania i zamrażania komórek lub pierwotnego protokołu ekspansji NK.

2. Pierwotna ekspansja komórek NK z PBMC (lub CB lub tkanek narządowych) (Dzień 0), jak pokazano w Rysunek 2.

1. Rozmrozić zamrożony PBMC i zamrożone, napromieniowane komórki zasilające w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Przemyć oddzielnie PBMC i 100 napromieniowanych promieniami gamma (napromieniowanych Gy) komórek 221-mIL-21 przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut za pomocą 10 ml pożywki R-10.
3. Zaoszczędź 1 x 10⁶ komórek PBMC do cytometrii przepływowej.
   UWAGA: Początkowa czystość komórek NK jest ważnym czynnikiem przy obliczaniu szybkości ekspansji komórek NK.
4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki R-10. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego.
5. Wymieszać 5 x 10⁶ komórek PBMC z 10 x 10⁶ komórek 100 napromieniowanych Gy-221 komórek 221-mIL-21 w specjalnej 6-dołkowej płytce (patrz Tabela materiałów).
6. Dodać 30 ml pożywki R-10 uzupełnionej ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) (patrz tabela materiałów).
7. Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
8. Zastąp pożywkę pożywką R-10 uzupełnioną ludzką IL-2 (200 U/ml) i ludzką IL-15 (5 ng/ml) w celu utrzymania komórek NK co 3-4 dni.
   UWAGA: Utrzymuj mniej niż 20 x 10⁶ komórek na studzienkę w celu dalszej ekspansji przy każdej zmianie podłoża. Aby uzyskać najlepszą żywotność, upewnij się, że całkowita liczba komórek w każdym dołku nie przekracza 100 x 10⁶ komórek.
9. Zapisz całkowitą liczbę komórek, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co 3-4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.

3. Dołączenie komórek 293T (Dzień 2), jak pokazano na Rysunek 2.

1. Podzielić 1,8 x 10⁶ komórek 293T w 11 ml pożywki D-10 na płytkę 100 mm poddaną działaniu środka.
   UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu pożywek D-10
2. Inkubować komórki 293T w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .}

4. Transfekcja retrowirusa (Dzień 3)

1. W probówce o pojemności 1,7 ml wymieszaj 470 μl zredukowanej pożywki surowicy z 30 μl odczynnika do transfekcji.
   UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi zastosowanymi pożywkami o zredukowanej surowicy i odczynnikami do transfekcji.
2. W oddzielnej probówce o pojemności 1,7 ml dodaj 2,5 μg plazmidu pRDF, 3,75 μg plazmidu Pegpam3 i 2,5 μg konstruktu CAR w wektorze SFG do zredukowanej pożywki surowicy, tak aby końcowa objętość wynosiła 500 μL.
3. Roztwory z kroków 4.1 i 4.2 mieszać kroplami.
4. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
5. Dodać 1 ml mieszaniny z etapu 4.4 do płytki komórkowej 293T w dniu 1 w postaci kropli.
6. Inkubować płytkę (płytki) w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 48–72 godzin.

5. Powlekanie płytką Retronektyny (Dzień 3)

1. Rozcieńczyć białko retronektyny solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 50-100 μg/ml.
2. Dodać 500 μl rozcieńczonej retronektyny do każdej studzienki niepoddanej działaniu 24-dołkowej płytki (5 dołków na konstrukt CAR). Uszczelnić płytkę za pomocą parafilmu i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.

6. Transdukcja (Dzień 4)

1. Odwirować płytkę retronektyny o stężeniu 2103 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
2. Zablokować każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 1 ml pożywki R-10.
3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 1 godzinę.
4. Podgrzej wirówkę do temperatury 32 °C, podczas gdy płytka retronektyny jest blokowana.
5. Zebrać supernatant retrowirusa, filtrując transfekowane komórki 293T za pomocą filtra 0,45 μm.
6. Porcjować 2 ml przefiltrowanego supernatantu retrowirusa do każdej studzienki.
7. Odwirować 24-dołkową płytkę o stężeniu 2103 x g przez 2 godziny w temperaturze 32 °C.
8. Podczas wirowania na płytce należy zebrać ekspandowane komórki PBNK z dnia 0 i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego.
   UWAGA: Kontynuuj rozszerzanie komórek PBNK, dodając pożywkę R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/mL) i IL-15 (5 ng/ml).
9. Rozcieńczyć ekspandowane komórki PBNK pożywką R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml) do 2,5 x 10^5-5 x 10⁵ komórek/ml (0,5 x 10^6-1 x 10⁶ komórek na studzienkę).
   UWAGA: Zapisz całkowitą liczbę komórek, żywotność i zapisz 5 x 10⁵ rozszerzonych komórek PBNK do cytometrii przepływowej, ponieważ te wartości są ważne przy określaniu szybkości ekspansji komórek NK.
10. Po odwirowaniu częściowo odessać supernatant retrowirusa z każdej studzienki.
    UWAGA: Nie należy całkowicie aspirować, tj. pozostawić około 100 μl supernatantu retrowirusa na studzienkę, ponieważ zmniejszy to wydajność transdukcji.
11. Podwielokrotność 2 ml rozcieńczonych ekspandowanych komórek PBNK od etapu 6.8 do każdego dołka.
12. Odwirować płytkę przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 32 °C. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 48-72 h.
    UWAGA: Nie parafilmuj płyty.

7. Zbiór komórek CAR-NK (dzień 6 lub 7), jak pokazano w Rysunek 2.

1. Delikatnie zebrać komórki z 24-dołkowej płytki i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml
   UWAGA: Staraj się nie generować pęcherzyków, ponieważ spowoduje to zmniejszenie żywotności komórek.
2. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut.
3. Zawiesić osad z 1 ml pożywki R-10 i policzyć komórki za pomocą Trypan Blue.
   UWAGA: Zapisz 5 x 10⁵ komórek do cytometrii przepływowej w celu określenia wydajności transdukcji.
4. Przenieś zawieszone komórki na specjalną 6-dołkową płytkę zawierającą 30 ml pożywki R-10 uzupełnionej IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml).
5. Inkubować specjalną 6-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
6. Zastąp pożywkę R-10 uzupełnioną IL-2 (200 U/ml) i IL-15 (5 ng/ml), aby utrzymać komórki NK co 3 - 4 dni.
   UWAGA: Utrzymuj mniej niż 20 x 10⁶ komórek na studzienkę w celu dalszej ekspansji przy każdej zmianie. Aby uzyskać najlepszą żywotność, upewnij się, że całkowita liczba komórek w każdym dołku nie przekracza 100 x 10⁶ komórek.
7. Zapisuj całkowitą liczbę komórek, żywotność i wykonuj cytometrię przepływową co 3-4 dni, aby obliczyć szybkość ekspansji komórek NK.
8. Komórki należy wykorzystać do odpowiednich testów in vitro lub in vivo.
   UWAGA: Ekspandowane ex vivo komórki PBNK i CAR-NK można hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez około 4 tygodnie.
9. Zbadaj liczbę i czystość komórek NK w 7, 11, 14, 18 i 21 dniu za pomocą cytometrii przepływowej.

Schematyczny przebieg procesu infiltracji komórek NK i ekspansji komórek PBNK przy użyciu metodologii komórek zasilających 221-mIL-21 jest pokazany w Rysunek 1 i Rysunek 2. Rozszerzone komórki PBNK pobierano co 3 lub 4 dni do cytometrii przepływowej w celu określenia czystości komórek NK poprzez barwienie komórek anty-ludzkim CD56 i anty-ludzkim CD3. Eksperyment powtórzono przy użyciu dwóch różnych dawców, aby wykazać odtwarzalność systemu ekspansji (Rysunek 3). Wykazano, że komórki PBNK rozszerzone przez 221-mIL-21 rozszerzają się prawie 5 × 104 razy (Rysunek 3A). Co więcej, czystość komórek NK była wysoce utrzymana, około 85% przez cały 21-dniowy okres ekspansji (Rysunek 3B)". Korzystając z systemu ekspansji komórek zasilających 221-mIL-21, czystość komórek NK stale wahała się w zakresie 85%-95%, niezależnie od dawców (dane nie pokazane). Aby zademonstrować solidność systemu ekspansji 221-mIL-21, PBMC wybarwiono pod kątem anty-CD56 i anty-CD3 przed ekspansją, co wykazało czystość komórek 7,09% dla komórek NK i wysoki odsetek komórek T (Figura 4A). PBMC hodowano wspólnie z 221-mIL-21 w celu namnażania komórek NK; czystość NK została sprawdzona przed transdukcją CAR-NK w dniu 4 (Figura 4A). Komórki CAR-NK zebrano i wybarwiono pod kątem anty-CD56, anty-CD3 i anty-hIgG(H+L) F(ab')2, które wykazały wysoką populację komórek NK (86,9% w dniu 7) i wysoką skuteczność transdukcji CAR wynoszącą około 70% (Figura 4). Wyższą skuteczność transdukcji (do 95%) zaobserwowano również przy użyciu systemu pakowania retrowirusów. Podsumowując, dane te pokazują, że komórki zasilające 221-mIL-21 mogą z powodzeniem namnażać komórki NK i zachowywać czystość komórek NK ex vivo.

Rysunek 1: Diagram ekspansji komórek NK z próbek ludzkich organów. Krótko mówiąc, uzyskane próbki ludzkiej wątroby są mielone na małe kostki w celu mechanicznego trawienia. Zdysocjowane komórki są następnie izolowane za pomocą krzemionki pokrytej PVP i pożywki do separacji limfocytów. Co więcej, komórki NK są rozwijane przy użyciu protokołu rozszerzania opisanego w Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schematyczny przebieg procesu generowania komórek CAR-NK z PBMC. Krótko mówiąc, komórki zasilające 221-mIL21 napromieniano przy 100 Gy przed kokulturacją PBMC uzupełnionymi IL-2 i IL-15 w dniu 0. Równolegle komórki 293T transfekowano systemem pakowania retrowirusa w celu wytworzenia retrowirusa CAR, który następnie transdukowano do rozszerzonych komórek PBNK w obecności IL-2 i IL-15. Pierwotne komórki CAR-NK zostały zebrane w dniu 7 i kontynuowały ekspansję przez 21 dni. Ten rysunek został zmodyfikowany z Yang et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Dynamiczna ekspansja komórek PBNK w trybie poklatkowym. (A) Krotne rozszerzenie PBNK podczas 22-dniowego kursu. Komórki barwiono anty-CD56 i anty-CD3 we wskazanych dniach do cytometrii przepływowej. Całkowitą liczbę komórek NK określono przez pomnożenie czystości komórek NK przez całkowitą liczbę komórek. Szybkość ekspansji została wygenerowana w następujący sposób: (Liczba komórek NK)Tn/(Liczba komórek NK)T0, gdzie Liczba komórek NK = (procent czystości komórek NK) × (całkowita liczba komórek), T0 to liczba komórek NK w czasie 0, a Tn to liczba komórek NK w dniu n. (B) Czystość komórek NK w ciągu 22-dniowego przebiegu czasu. Ekspansję komórek NK powtórzono dwa razy z dwoma różnymi dawcami. Słupki błędów reprezentują ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywna analiza cytometryczna komórek CAR-NK. (A) Reprezentatywne wykresy punktowe pokazujące dynamiczny upływ czasu czystości komórek NK komórek CAR-NK podczas 18-dniowego kursu. Analizę cytometrii przepływowej oceniano poprzez barwienie komórek anty-CD56 i anty-CD3 we wskazanych punktach czasowych. Dzień 0 oznacza okres przed ekspansją PBNK. Dzień 4 wskazuje na postekspansję PBNK i wstępną transdukcję komórek CAR-NK. Dzień 7 wskazuje na post-transdukcję komórek CAR-NK. (B) Reprezentatywne wykresy punktowe przedstawiające skuteczność transdukcji komórek CAR-NK przy użyciu systemu pakowania retrowirusów. Komórki barwiono anty-CD56, anty-CD3 i anty-hIgG(H+L) F(ab')2 do cytometrii przepływowej. (C) Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiające ekspresję CAR w różnych podzbiorach, w tym CD56+CD3-, CD56-CD3+, CD56+CD3+ i CD56-CD3- w dniu 18. Komórki barwiono anty-CD56, anty-CD3 i anty-hIgG(H+L) F(ab')2 (wskazując na ekspresję CAR) do cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.