Artykuł metodologiczny

Standaryzowany mysi model pozaustrojowej terapii falami uderzeniowymi indukowanej regeneracją tkanek miękkich

897 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62338

⸱

28 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department for Cardiac Surgery, Innsbruck Medical University, 2Institute of Clinical and Functional Anatomy, Innsbruck Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje ustandaryzowany mysi model regeneracji tkanek za pomocą leczenia falą uderzeniową.

Streszczenie

Terapia falami uderzeniowymi (SWT) wykazuje obiecujące efekty regeneracyjne w kilku różnych tkankach. Jednak leżące u podstaw mechanizmy molekularne są słabo poznane. Angiogeneza, proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych, jest głównym motorem regeneracji tkanek miękkich, a także niedawno odkrytym efektem SWT. Nie jest w pełni zrozumiałe, w jaki sposób bodziec mechaniczny SWT indukuje angiogenezę i regenerację oraz które szlaki są zaangażowane. Aby jeszcze bardziej udoskonalić kliniczne zastosowanie SWT i uzyskać cenne informacje na temat tego, jak stymulacja mechaniczna może wpływać na regenerację tkanek i tkanek, potrzebny jest ustandaryzowany model SWT. Niniejszym opisujemy ustandaryzowany, łatwy do wdrożenia mysi model regeneracji wywołanej terapią falami uderzeniowymi, wykorzystujący model niedokrwienia kończyn tylnych.

Wprowadzenie

Terapia falą uderzeniową (SWT) została po raz pierwszy wprowadzona do praktyki klinicznej jako metoda rozkładu kamieni nerkowych poprzez pozaustrojowe zastosowanie. W latach dziewięćdziesiątych XX wieku przypadkowe odkrycie pogrubienia grzebienia biodrowego w nagraniach rentgenowskich po powtarzającej się litotrypsji ujawniło morfogenne działanie kości SWT1. Spowodowało to gwałtowny wzrost nowych zastosowań w ortopedii. SWT, tym samym przekształcił się w uznaną opcję leczenia braku zrostów kości długich, zapalenia nadkłykcia bocznego, a także zapalenia ścięgna Achillesa2,3,4,5. Najnowsze dowody ponownie rozszerzają spektrum aparatów poza ortopedię, na bardziej miękkie tkanki i zaburzenia gojenia się ran6,7. W tym przypadku badania mogą wykazać skuteczność SWT w niejednorodnym zespole schorzeń, w tym na przykład zaburzeniach erekcji lub spastyczności po udarze8,9,10.

Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw SWT nadal nie są w pełni zrozumiałe i wymagają dalszych badań. Koncentrując się na chorobach sercowo-naczyniowych, nasze poprzednie prace wykazały obiecujący wpływ SWT w mysim modelu zawału mięśnia sercowego. W ten sposób odkryto, że angiogeneza jest głównym czynnikiem napędzającym regenerację mięśnia sercowego po SWT11.

Angiogeneza opisuje rozwój nowych naczyń poprzez kiełkowanie i rozdzielanie wcześniej istniejących naczyń. W przypadku urazu te nowe naczynia ułatwiają przywrócenie przepływu krwi do uszkodzonego obszaru, a tym samym regenerację12.

Angiogeneza stanowi zatem cechę charakterystyczną regeneracji tkanek i potencjalne wyjaśnienie efektów SWT w tkankach miękkich. Jednak regeneracja jest złożonym procesem, w którym występują liczne mechanizmy induktorowe i efektorowe. Pomimo możliwości zbadania ich w izolowanych warunkach hodowli komórkowej, modele zwierzęce najlepiej nadają się do naśladowania tych złożonych procesów. Niedokrwienie kończyn tylnych jest dobrze znanym modelem do badania angiogenezy i regeneracji in vivo13. Aby wesprzeć dalsze badania nad regeneracyjnym działaniem SWT, niniejszym przedstawiamy wykonalny, standaryzowany, mysi model SWT w niedokrwieniu kończyn tylnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania na Uniwersytecie Medycznym w Innsbrucku oraz przez austriackie ministerstwo nauki (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Indukcja znieczulenia i przygotowanie operacyjne

  1. Przygotuj odpowiednie środowisko do zabiegów na zwierzętach: sterylizuj sprzęt, dezynfekuj powierzchnie, używaj jednorazowych masek, fartuchów izolacyjnych i rękawiczek.
  2. Uspokoić 18-12-tygodniową mysz (szczep i płeć w zależności od warunków eksperymentalnych) w komorze podłączonej do waporyzatora izofluranu w temperaturze 4%.
  3. Sprawdź, czy sedacja jest wystarczająca za pomocą pedału lub odruchu małżowiny usznej jako wskaźników głębokiego rozpoznawania bólu.
  4. Gdy zwierzę jest wystarczająco uspokojone, wyłącz przepływ izofluranu i podaj środki przeciwbólowe i znieczulające zgodnie z zatwierdzonym protokołem opieki i stosowania zwierząt, np. chlorowodorek ketaminy (80 mg/kg masy ciała) jako środek znieczulający i chlorowodorek ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) jako środek przeciwbólowy dootrzewnowy.
    UWAGA: Przygotuj strzykawkę z lekiem dootrzewnowym przed umieszczeniem zwierzęcia w komorze anestezjologicznej.
  5. Zbadaj głębokość znieczulenia 5 minut po wstrzyknięciu, oceniając odruch wycofania pedału.
  6. Zastosuj maść do oczu (np. 0,5 g retinolpalmitytanu), aby uniknąć uszkodzenia rogówki.
  7. Usuń włosy w okolicy operacyjnej i w jej pobliżu, w szczególności na lewej kończynie tylnej i pachwinie. Krem do depilacji może być używany zamiast maszynek do golenia lub trymerów, aby uniknąć obrażeń skóry.
  8. Unieruchom zwierzę w pozycji leżącej z wyprostowanymi kończynami na płycie grzewczej za pomocą taśmy klejącej.
  9. Zdezynfekuj i oczyść obszar zabiegu za pomocą 10% jodu powidonu lub podobnego środka dezynfekującego. Użyj sterylnej serwety polowej.

2. Procedura

  1. Do wykonania operacji należy użyć mikroskopu o powiększeniu od 10x do 20x.
  2. Wykonaj nacięcie skóry (~1,5 cm) proksymalnie do stawu kolanowego za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  3. Delikatnie oddziel skórę od leżącej pod nią tkanki za pomocą kleszczy.
  4. Zidentyfikuj naczynia udowe. Ostrożnie oddziel tętnicę, żyłę i nerw za pomocą kleszczy i nożyczek.
  5. Zaczynając proksymalnie na poziomie więzadła pachwinowego, ostrożnie usuń otaczającą tkankę łączną, aż tętnica zostanie optymalnie wyświetlona. Jako dystalny punkt końcowy powinno być widoczne rozgałęzienie tętnicy do tętnicy odpiszczelowej i podkolanowej.
  6. Podwiązać bliższą tętnicę udową na poziomie więzadła pachwinowego za pomocą szwu polipropylenowego 7-0.
  7. Zatkaj dystalny koniec tętnicy udowej proksymalnie do rozgałęzienia na tętnicę odpiszczelową i podkolanową za pomocą szwu polipropylenowego 7-0.
  8. Wyciąć odcinek tętnicy udowej między węzłem dystalnym i proksymalnym za pomocą diatermii.
    UWAGA: Możliwe jest również wycięcie tętnicy udowej poprzez przecięcie nożyczkami chirurgicznymi. Jednak użycie diatermii zamyka naczynie oprócz szwu w przypadku, gdy węzły zawiodą.
  9. Upewnij się, że tętnica udowa jest bezpiecznie niedrożna i nie widać krwawień w polu operacji.
    UWAGA: Zalecana jest wąska odległość między szwami skórnymi, aby uniknąć ultradźwiękowej dekontaminacji rany żelem podczas aplikacji SWT.
  10. Zszyj nacięcie skóry za pomocą niewchłanialnych nylonowych szwów 5-0 z pojedynczymi węzłami.
  11. Zdezynfekuj obszar operacyjny wacikami.

3. Aplikacja terapii falą uderzeniową

  1. Upewnij się, że nacięcie skóry jest całkowicie zamknięte.
  2. Zdefiniuj parametry leczenia na urządzeniu fali uderzeniowej. W tym eksperymentalnym ustawieniu użyto gęstości strumienia energii 0,1 mJ/mm2 przy częstotliwości 3 Hz, co daje łącznie 300 impulsów.
    UWAGA: Poziomy energii zostały zaczerpnięte z poprzednich wyników14 z wykorzystaniem skoncentrowanej pozaustrojowej terapii falą uderzeniową.
  3. Nałóż żel ultradźwiękowy na obszar zabiegowy po wewnętrznej stronie uda, aby zapewnić prawidłowe połączenie.
  4. Upewnij się, że w żelu nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.
    UWAGA: Prawidłowe sprzężenie z wystarczającą ilością żelu jest niezbędne do prawidłowego zastosowania SWT. Małe pęcherzyki powietrza w żelu pochłaniają fale uderzeniowe i zmniejszają ich działanie.
  5. Zastosuj 300 impulsów, przełączając przełącznik nożny, powoli przesuwając aplikator po udzie.
    UWAGA: Jeśli SWT nie zostanie zastosowany bezpośrednio po zabiegu, należy unikać możliwej absorpcji energii fali uderzeniowej z powodu odrastających włosów przez usunięcie przed zabiegiem.
  6. Po zabiegu zetrzyj resztki żelu ultradźwiękowego, aby zapobiec wychłodzeniu uda.
  7. Przenieś zwierzę do klatki regeneracyjnej wystawionej na działanie lampy grzewczej, aby uniknąć hipotermii.
  8. Uważnie obserwować zwierzę aż do wybudzenia i podać podskórnie dawkę 0,05 mg/kg masy ciała buprenorfiny w celu uzyskania odpowiedniego środka przeciwbólowego.
  9. Codziennie monitoruj zdrowie i dobrostan zwierząt, aż do całkowitego zagojenia się nacięcia chirurgicznego.
    UWAGA: Zabieg może być ograniczony do jednej sesji lub powtarzany wielokrotnie. W tym przykładzie została wykonana pojedyncza aplikacja.

4. Pomiar przepływu krwi

  1. Wykonaj pomiar przepływu krwi natychmiast po zabiegu i w różnych punktach czasowych po zabiegu, w zależności od warunków eksperymentalnych.
  2. Uspokoić zwierzę w komorze podłączonej do parownika izofluranu w stężeniu 4%.
  3. Gdy zwierzę zostanie uspokojone, wyłącz przepływ izofluranu i podaj środki znieczulające i przeciwbólowe. Zgodnie z zatwierdzonym protokołem pielęgnacji i stosowania zwierząt chlorowodorek ketaminy (80 mg/kg masy ciała) i chlorowodorek ksylazyny (5 mg/kg masy ciała) należy stosować dootrzewnowo.
  4. Zbadaj głębokość znieczulenia 5 minut po wstrzyknięciu, oceniając odruch wycofania pedału.
  5. Stosuj maść do oczu (np. 0,5 g retinolpalmitytu), aby uniknąć uszkodzenia rogówki.
  6. Unieruchom zwierzę w pozycji leżącej z wyprostowanymi kończynami na płycie grzewczej za pomocą taśmy klejącej.
  7. Skrupulatnie usuń włosy z obu tylnych kończyn.
  8. Zmierz perfuzję kończyny za pomocą laserowego dopplera zgodnie z instrukcją producenta.
    UWAGA: Jako główny parametr należy stosować stosunek przepływu krwi w kończynie niedokrwiennym do nieniedokrwiennego w kończynie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując ten protokół, można zaobserwować i monitorować istotne różnice w ukrwieniu kończyn tylnych po zastosowaniu interwencji w postaci SWT. Reprezentatywne obrazy wykazują wyraźną różnicę w kończynach leczonych za pomocą SWT. (Rysunek 1B) w porównaniu do nieleczonych kończyn kontrolnych (Rysunek 1A)W tym przypadku perfuzja została przedstawiona za pomocą mapy termicznej, gdzie kolory zimne reprezentują niską perfuzję, a ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Leczenie falą uderzeniową daje obiecujące wyniki w kilku warunkach regeneracji tkanek miękkich. Jednak, aby jeszcze bardziej zwiększyć, ulepszyć lub wyizolować te zdolności regeneracyjne, najpierw należy odkryć podstawy regeneracji indukowanej SWT na poziomie molekularnym. Regeneracja tkanek jest złożona i obejmuje wiele procesów biologicznych, w tym odporność wrodzoną i nabytą, stan zapalny, progresję cyklu komórkowego, apoptozę, różnicowanie komórkowe, angiogenezę i inne17,18

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Holfeld J. i Grimm M. są udziałowcami Heart Regeneration Technologies GmbH, spółki spin-off Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku, której celem jest promowanie terapii falą uderzeniową serca (www.heart-regeneration.com). Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez nieograniczony grant badawczy AUVA dla JH i CGT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% Povidone
5-0 Nici nylonoweEthicon Inc.
7-0 szew jedwabnyEthicon Inc.
KauteryzacjaMartinME-102
krem do depilacjiNivea
GauzeGazin
Płyta
Znieczuleniechlorowodorkiem
Laserowe instrumentydopplerowskie
Narzędzia chirurgicznew porządku Narzędzia naukowe
ksylazyny
grzewcza ketaminy Znieczulenie chlorowodorkiem

Bibliografia

  1. Schaden, W., et al. Extracorporeal shockwave therapy (ESWT) - First choice treatment of fracture non-unions. International Journal of Surgery. 24, 179-183 (2015).
  2. Xu, Z. H., et al. Extracorporeal shock wave treatment in nonunions of long bone fractures. International Orthopaedics. 33, 789-793 (2009).
  3. Melegati, G., Tornese, D., Bandi, M., Rubini, M. Comparison of two ultrasonographic localization techniques for the treatment of lateral epicondylitis with extracorporeal shock wave therapy: A randomized study. Clinical Rehabilitation. 18, 366-370 (2004).
  4. Zhang, S., Li, H., Yao, W., Hua, Y., Li, Y. Therapeutic response of extracorporeal shock wave therapy for insertional achilles tendinopathy between sports-active and nonsports-active patients with 5-year follow-up. Orthopedic Journal of Sport Medicine. 8, 1-6 (2020).
  5. Dedes, V., et al. Effectiveness and safety of shockwave therapy in tendinopathies. Materia Socio Medica. 30, 141(2018).
  6. Surace, S. J., Deitch, J., Johnston, R. V., Shock Buchbinder, R. wave therapy for rotator cuff disease with or without calcification. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3 (3), 008962(2020).
  7. Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) for wound healing: Technology, mechanisms, and clinical efficacy. Wound Repair Regeneration. 20, 456-465 (2012).
  8. Fode, M., Hatzichristodoulou, G., Serefoglu, E. C., Verze, P., Albersen, M. Low-intensity shockwave therapy for erectile dysfunction: Is the evidence strong enough. Nature Reviews Urology. 14, 593-606 (2017).
  9. Guo, P., et al. Positive effects of extracorporeal shock wave therapy on spasticity in poststroke patients: a meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 26 (11), 2470-2476 (2017).
  10. Vardi, Y., Appel, B., Jacob, G., Massarwi, O., Gruenwald, I. Can low-intensity extracorporeal shockwave therapy improve erectile function? A 6-month follow-up pilot study in patients with organic erectile dysfunction. European Urology. 58, 243-248 (2010).
  11. Gollmann-Tepeköylü, C., et al. miR-19a-3p containing exosomes improve function of ischaemic myocardium upon shock wave therapy. Cardiovascular Research. 116 (6), 1226-1236 (2019).
  12. Otrock, Z. K., Mahfouz, R. A. R., Makarem, J. A., Shamseddine, A. I. Understanding the biology of angiogenesis: Review of the most important molecular mechanisms. Blood Cells, Molecules and Diseases. 39, 212-220 (2007).
  13. Ahn, H., et al. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Physiology and Behavior. 176, 139-148 (2017).
  14. Pölzl, L., et al. Defining a therapeutic range for regeneration of ischemic myocardium via shock waves. Science Reports. , 409(2021).
  15. Holfeld, J., et al. Low energy shock wave therapy induces angiogenesis in acute hind-limb ischemia via VEGF receptor 2 phosphorylation. PLoS One. 9, 1-7 (2014).
  16. Theurl, M., et al. The neuropeptide catestatin acts as a novel angiogenic cytokine via a basic fibroblast growth factor-dependent mechanism. Circulation Research. 107 (11), 1326-1335 (2010).
  17. Noonan, D. M., De Lerma Barbaro, A., Vannini, N., Mortara, L., Albini, A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: Decisions and indecisions. Cancer Metastasis Reviews. 27, 31-40 (2008).
  18. Aurora, A. B., Olson, E. N. Immune modulation of stem cells and regeneration. Cell Stem Cell. 15, 14-25 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Angiogenezastymulacja mechanicznaniedokrwienie ko czyny dolnejmedycyna regeneracyjnatworzenie naczy krwiono nych
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły