Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Jednoczesne obrazowanie wapnia i stymulacja glukozy u żywych danio pręgowanych w celu zbadania funkcji β komórek in vivo

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62347

⸱

21 września 2021

 ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Therapies TU Dresden, 2German Center for Diabetes Research (DZD e.V.), Paul Langerhans Institute Dresden of the Helmholtz Center Munich at the University Hospital Carl Gustav Carus of TU Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj badanie przedstawia protokół obrazowania wapnia i stymulacji glukozy w komórkach β trzustki danio pręgowanego in vivo.

Streszczenie

Komórki β trzustki utrzymują homeostazę glukozy poprzez produkcję i wydzielanie insuliny zgodnie z poziomem glukozy we krwi. Zaburzenia funkcji komórek β są związane z hiperglikemią, która może prowadzić do cukrzycy. Podczas procesu wydzielania insuliny β-komórki doświadczają napływuCa2+. W związku z tym obrazowanie stymulowanego glukozą napływu Ca2 + za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) stanowi drogę do badania funkcji komórek β. Wcześniej badania wykazały, że izolowane wysepki danio pręgowanego wykazujące ekspresję GCaMP6 wykazują znaczną aktywność Ca2+ po stymulacji określonymi stężeniami glukozy. Jednak niezwykle ważne jest zbadanie, w jaki sposób komórki β reagują na glukozę nie w izolacji, ale w swoim naturalnym środowisku, gdzie są ogólnoustrojowo połączone, unaczynione i gęsto unerwione. W tym celu w badaniu wykorzystano przezroczystość optyczną larw danio pręgowanego we wczesnych stadiach rozwoju, aby wyjaśnić aktywność komórek β in vivo. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół obrazowaniaCa2+ i stymulacji glukozy w celu zbadania funkcji komórek β in vivo. Technika ta pozwala na monitorowanie skoordynowanej dynamikiCa2+ w β-komórkach z rozdzielczością pojedynczej komórki. Dodatkowo metoda ta może być stosowana do pracy z dowolnym roztworem do wstrzykiwań, takim jak małe cząsteczki lub peptydy. Podsumowując, protokół ilustruje potencjał modelu danio pręgowanego w zakresie badania koordynacji wysp trzustkowych in vivo oraz scharakteryzowania, w jaki sposób składniki środowiskowe i genetyczne mogą wpływać na funkcjonowanie komórek β.

Wprowadzenie

Komórki β trzustki wykazują unikalną zdolność do wydzielania insuliny w odpowiedzi na glukozę. Po posiłku bogatym w węglowodany poziom cukru we krwi wzrasta i dostaje się do komórek β, gdzie jest szybko metabolizowany do produkcji ATP. Wzrost stosunku wewnątrzkomórkowego ATP/ADP prowadzi do zamknięcia zależnych od ATP kanałów K+, depolaryzacji błony komórkowej i aktywacji zależnych od napięcia kanałów Ca2+. Szybki wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2 + stymuluje wydzielanie granulek insuliny przez komórki β.

Obrazowanie komórek wysp trzustkowych w nienaruszonej trzustce u myszy jest wymagające i wymaga eksterioryzacji całego narządu. Potężną alternatywą dla nieinwazyjnego obrazowania in vivo jest przeszczepienie wysp trzustkowych do przedniej komory (AC) oka myszy1. Przeszczepione wysepki do AC myszy naśladują środowisko in vivo, umożliwiając badania podłużne i obrazowanie Ca2+ in vivo2,3. Niemniej jednak proces rewaskularyzacji wysp trzustkowych może trwać kilka tygodni po przeszczepie wysp trzustkowych4. W związku z tym zachowanie pierwotnego środowiska natywnego, w którym komórki β są unaczynione i połączone ze statusem metabolicznym organizmu, oraz osiągnięcie rozdzielczości obrazowania pojedynczych komórek in vivo pozostaje bardzo trudne i czasochłonne.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, naukowcy opracowali transgeniczne linie danio pręgowanego wyrażające GECI w komórkach β, które pozwalają na wizualizację w czasie rzeczywistym napływu Ca2+ do komórek β5,6,7,8,9. Korzystając z tych narzędzi, stwierdzono, że w hodowli komórkowej komórki β danio pręgowanego wykazują konserwatywną reakcję na podwyższony poziom glukozy, podobnie jak w przypadku wysepek mysich i ludzkich. Co więcej, przejrzystość optyczna larw danio pręgowanego pozwoliła na zbadanie funkcji komórek β w ich naturalnym środowisku. Co ważne, już po 4 dniach od zapłodnienia (DPF) komórki β pierwotnej wysepki danio pręgowanego wyrażają markery dojrzałości, takie jak ortolog danio pręgowanego urokortyny3 (ucn3l) i wykazują reakcje in vitro na glukozę w zakresie fizjologicznym6. Ponadto wysepka danio pręgowanego jest gęsto unaczyniona i unerwiona10. Genetyczna ablacja komórek β na tym etapie prowadzi do nietolerancji glukozy. Co więcej, danio pręgowany wykazuje konserwatywne reakcje na środki obniżające poziom glukozy, takie jak insulina i pochodne sulfonylomocznika, co pokazuje, że pierwotna wyspa trzustkowa jest reagującą na glukozę i ogólnoustrojowo połączoną tkanką kontrolującą poziom glukozy. Te szczególne cechy sprawiają, że danio pręgowany jest unikalnym modelem do badania aktywności β komórek wysp trzustkowych in vivo11,12.

Protokół obrazowania Ca2+ i jednoczesnego wstrzykiwania glukozy bezpośrednio do krążenia danio pręgowanego pozwala na badanie reakcji komórek β na glukozę in vivo. Protokół ten umożliwia wstrzykiwanie określonych stężeń glukozy w połączeniu z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, które łącznie ujawniają skoordynowaną odpowiedź komórek β na glukozę oraz obecność komórek β pierwszej odpowiedzi in vivo13. Co więcej, protokół można dostosować do dowolnego roztworu do wstrzykiwań, takiego jak związki chemiczne lub małe peptydy. Ogólnie rzecz biorąc, metodologia ta ilustruje siłę modelu danio pręgowanego w badaniu koordynacji β komórek in vivo oraz w charakteryzowaniu, w jaki sposób składniki środowiskowe i genetyczne mogą wpływać na funkcjonowanie komórek β.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wcześniej ustalone linie transgeniczne użyte w tym badaniu to Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)6, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)14. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z prawem Unii Europejskiej i Niemiec (Tierschutzgesetz) oraz za zgodą Komisji Etyki Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie i Landesdirektion Sachsen (numery zezwoleń: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 i T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 i TVV33-2019). W tym badaniu wszystkie obrazowanie na żywo in vivo i iniekcje glukozy, a także procedury eksperymentalne przeprowadzono na larwach danio pręgowanego, które nie przekroczyły etapu 5 dni po zapłodnieniu (dpf), zgodnie z ustawą o ochronie zwierząt (TierSchVersV §14). Zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE wykorzystanie tych wcześniejszych stadiów danio pręgowanego zmniejsza liczbę zwierząt doświadczalnych, zgodnie z zasadami 3R.

1. Przygotowanie

UWAGA: Ten protokół dotyczy obrazowania in vivo Ca2+ pierwotnej wysepki danio pręgowanego z Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) podwójnie transgeniczne larwy. U tych zwierząt promotor insuliny napędza ekspresję cdt1-mCherry, który znakuje jądra poszczególnych komórek β czerwoną fluorescencją. GCaMP6s wykazuje zmiany w zielonej fluorescencji w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe poziomy Ca2+. Specyficzna ekspresja GCaMP6s w komórkach β pozwala na scharakteryzowanie reakcji na glukozę poszczególnych komórek bez ingerencji ze strony innych typów komórek lub tkanek.

  1. Przygotuj pożywkę embrionalną E215.
  2. Przygotuj 0,003% (200 μm) 1-fenilo-2-tiomocznika (PTU) w 10% soli fizjologicznej Hanksa 15.
  3. Przygotuj 1% niskotopliwej agarozy (LMA) w pożywce embrionalnej E2, ogrzewając ją w kuchence mikrofalowej i filtrując za pomocą filtra o wielkości porów <25 μm. Utrzymuj LMA w temperaturze >37 °C przez okres do 1 tygodnia.
    UWAGA: Wszystkie roztwory należy przefiltrować, aby zapobiec zatkaniu szklanej kapilary używanej do wstrzykiwań.
  4. Przygotować 0,4% roztwór sulfonianu metanu trikainy (MS222) z 979 ml sterylnegoH2Oi 21 ml 1 M Tris (pH 9). Dostosuj pH do 7.
  5. Rozpuść 1,8 g D-glukozy w 50 ml PBS, aby przygotować 200 mM roztworu D-glukozy i przefiltruj go za pomocą filtrów o wielkości porów <25 μm. Przygotować roztwór roboczy D-glukozy (25 mM) przez rozcieńczenie 1:8 200 mM D-glukozy w 1x PBS (przefiltrowany). Przechowywać w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania. Dodaj 5 μl czerwieni fenolowej do 1 ml 25 mM D-Glukozy, aby móc uwidocznić roztwór po wstrzyknięciu.
    UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień. Jednak roztwór roboczy o stężeniu 25 mM należy przygotować na świeżo. Wyrzuć zapas, jeśli widoczne są jakiekolwiek oznaki zanieczyszczenia.
  6. Przygotować szklane kapilary do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do kapilar lub zaopatrzyć się w dostępne w handlu kapilary z mikroszkła. Ustawienia ciągnięcia igły są opisane w Tabeli materiałów.
    UWAGA: Stwierdzono, że kapilary mikroiniekcyjne wykonane ze szkła borokrzemianowego bez wewnętrznego włókna oferują lepsze wyniki w porównaniu z podobnymi kapilarnami z wewnętrznym włóknem.
  7. Zaopatrz się w naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm do mocowania larw danio pręgowanego. W protokole tym zastosowano czaszy ze szklanym dnem ze szklaną pokrywą 0,17 mm, ponieważ umożliwiają one obrazowanie za pomocą obiektywów korekcyjnych szkłem w układach konfokalnych.
  8. Zaopatrz się w końcówki do pipet z mikroładowaniem. W tym protokole zastosowano mikroładowarki o pojemności 20 μl i długości 100 mm.
  9. Zaopatrz się w zestaw mikro-pęset.
  10. Zaopatrz się w szalki Petriego o średnicy 90 mm do sortowania i hodowli danio pręgowanego.
  11. Zaopatrz się w olej mineralny.
  12. Zaopatrz się w mikropompę pneumatyczną lub system do dostarczania 1-5 nL objętości cieczy przez szklane kapilary.
  13. Do sortowania i montażu danio pręgowanego należy użyć mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w źródło światła oraz w niebiesko-czerwone kostki filtrujące do fluorescencji (CFP: wzbudzenie 420-450 nm, emisja 460-490 nm, TRITC: wzbudzenie: 532-554 nm, emisja: 570-613 nm; lub Texas-Red: wzbudzenie: 540-580 nm, emisja: 592-667 nm). Posortuj podwójnie transgeniczne Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) za pomocą stereoskopu. Wybierz zarodki z niebieską i czerwoną fluorescencją w siatkówce ze względu na ekspresję CFP i mCherry pod krystalinowym promotorem.
  14. Do obrazowania napływu Ca2+ w komórkach β należy użyć odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy powietrzne 10x (0,8 NA) i 40x (1,0 NA) wodne. Użyj stolika zawierającego uchwyt na talerze do naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
  15. Zaopatrz się w manipulator ręczny lub zmotoryzowany 3D z uchwytem kapilarnym. Włóż szklaną kapilę do uchwytu kapilary i zamontuj uchwyt kapilary w manipulatorze 3D.
    UWAGA: Manipulator 3D umożliwia precyzyjny ruch szklanej kapilary i wprowadzenie jej do larw danio pręgowanego.

2. Montaż larw danio pręgowanego

UWAGA: Podwójny transgeniczny Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) zarodki są traktowane 0,03% (20 μM) 1-fenyl-2-tiomocznik (PTU) w celu zahamowania pigmentacji od 24 godzin po zapłodnieniu. Przy 4,5 dpf znieczulij larwy za pomocą 0,04% końcowego stężenia Trikainy tuż przed montażem.

  1. Aby utrzymać znieczulenie podczas sesji obrazowania, dodaj do 1% niskotopliwej agarozy końcowe stężenie 0,04% trikainy i 20 μM PTU. Agarozę LMA należy przechowywać w temperaturze >37 °C do momentu użycia. Roztwór ten należy stosować w tym samym dniu przygotowania.
  2. Sortuj znieczuloną podwójnie transgeniczną Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Larwy Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry). Umieść 3-5 ryb na szalce Petriego ze szklanym dnem i usuń większość płynu.
    UWAGA: Nie pozwól, aby larwy wyschły na tym etapie i zawsze zanurzaj je w minimalnej ilości E2.
  3. Dodaj 500 μl LMA na szklaną szalkę Petriego zawierającą rybę i za pomocą mikropęsety delikatnie przesuń rybę tak, aby prawa strona ryby stykała się bezpośrednio ze szklanym dnem. Usuń nadmiar agarozy i pozwól jej zastygnąć przez 1-3 minuty. Zauważ, że w tym momencie agaroza staje się lekko nieprzezroczysta (Rysunek 1B).
    UWAGA: Jeśli agaroza jest zbyt gorąca, może uszkodzić larwy. Aby tego uniknąć, pozwól agarozie ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 30-45 s przed dodaniem jej do larw.
  4. Gdy agaroza stanie się twarda, za pomocą mikropęsety ostrożnie usuń agarozę wokół obszaru serca, aby zapobiec złamaniu igły używanej do późniejszego wstrzyknięcia w kontakcie z agarozą (Rysunek 1C).
  5. Dodać 500 μl E2 zawierającego końcowe stężenie 0,04% trikainy i 20 μM PTU.
    UWAGA: Upewnij się, że nie wysuszysz larw podczas obrazowania na żywo.

3. Jednoczesna iniekcja i obrazowanie Ca2+ komórek β

UWAGA: Larwy, które mają nadmierne żółtko na trzustce z powodu opóźnienia rozwojowego, nie powinny być używane do obrazowania, ponieważ lipidy w żółtku zakłócają jakość obrazu. Ponadto stosuje się niskie moce lasera (0,5%-5%), aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności.

  1. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i mikropęsety odetnij końcówkę szklanej kapilary.
    UWAGA: Nie przecinaj więcej niż tylko końcówkę kapilary, ponieważ średnica kapilary powinna być mniejsza niż droga dopływowa serca danio pręgowanego.
  2. Korzystając z końcówek obciążających, napełnij igłę 25 mM roztworem D-Glukozy.
    UWAGA: Kapilara musi być równomiernie wypełniona, zwracając szczególną uwagę, aby nie tworzyć się pęcherzyków powietrza, ponieważ przeszkadzają one w dostarczaniu odpowiednich objętości iniekcji.
  3. Zamontuj szklaną kapilę w uchwycie kapilary i podłącz ją do mikropompy. Utrzymuj mikropompę na poziomie ciśnienia wtrysku w zakresie 500-1 000 hPa, ciśnienia kompensacyjnego = 0 hPa i czasu dostawy = 1 s.
  4. Do kalibracji objętości wstrzyknięcia należy użyć mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w stopniowany okular. Umieść kroplę oleju mineralnego w szklanym szkiełku pod stereoskopem. Dostosuj zoom stereoskopu do potęgi 4 za pomocą obiektywu 1,5x. Wkładka do wstrzykiwania szklanej kapilary do oleju mineralnego.
    UWAGA: 5 nL odpowiada 5 jednostkom podziałki pokazanej w okularze stereoskopu. Zwiększ lub zmniejsz ciśnienie wtrysku mikropompy, aby wyregulować objętość kropli.
  5. Zamontuj uchwyt kapilarny w manipulatorze 3D.
    UWAGA: Manipulator 3D powinien umożliwiać precyzyjną kontrolę ruchu w kierunkach x, y i z uchwytu kapilary.
  6. Ostrożnie umieścić naczynie zawierające zamontowane larwy na uchwycie płytki mikroskopu konfokalnego. Użyj obiektywu powietrznego 10x, 0,8 NA, aby zlokalizować larwy za pomocą opcji jasnego pola.
  7. Ustaw danio pręgowanego stroną serca w kierunku, w którym znajduje się kapilara i manipulator 3D. Obserwując czerwoną fluorescencję, upewnij się, że wysepka znajduje się w środku pola widzenia.
    UWAGA: Od tego momentu scena powinna pozostać nieruchoma (Rysunek 2).
  8. Za pomocą manipulatora 3D przesuń szklaną kapilarnę w kierunku serca larw, wniknij w skórę i skieruj się do jamy osierdziowej. Ostrożnie umieść kapilarnę w środku wspólnej żyły kardynalnej (CCV) i zatoki żylnej (SV), znajdującej się około 100-200 μm od przedsionka serca16, (Rysunek 1B i Rysunek 2C). Kąt igły wynosi około 20-30° w stosunku do powierzchni płytki. Jeśli krawędź płytki jest zbyt wysoka, zdejmij ją, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do kapilary.
    UWAGA: Jest to krytyczny krok, ponieważ wymagana jest bardzo ostrożna penetracja; Szybkie ruchy mogą zaburzać pracę serca lub powodować powodowanie rozeznania krwi w tym obszarze. Jeśli przepływ krwi jest zaburzony, należy użyć innej próbki. Ponieważ manipulator 3D utrzymuje stałą pozycję, unikaj ruchów stolika, aby nie ingerować w tkankę serca.
  9. Po umieszczeniu kapilary w SV zmień na obiektyw 40x, 1,2 NA zanurzenia w wodzie. Korzystając z czerwonych i zielonych zwierciadeł dichromatycznych 488/561, znajdź jądrowy sygnał mCherry w komórkach β i skup się na wysepce.
    UWAGA: Poszczególne jądra powinny być wyraźnie widoczne i powinna być obecna niska zielona fluorescencja (Rysunek 1D).
  10. Ustaw jednoczesną akwizycję dla GCaMP6s i fluorescencji mCherry z następującymi parametrami w menu Smart Setup: GFP (GCaMP6s), wzbudzenie: 488 nm, emisja: 498-555 nm, fałszywy kolor: zielony (Wybierz GFP); mCherry, wzbudzenie: 561 nm (mCherry), emisja: 570-640 nm, fałszywy kolor: czerwony (Wybierz mCherry). Światło przechodzące, fałszywy kolor: szarości.
  11. Dostosuj płaszczyznę obrazowania, dopasowując płaszczyznę ogniskowej wzdłuż osi z wysepki. Znajdź płaszczyznę, która zawiera większość komórek β.
  12. Dostosuj wzmocnienie jądrowego sygnału mCherry, aby uzyskać jednolitą identyfikację każdej pojedynczej komórki i pokryć około 70% histogramu kolorów.
  13. Dostosuj wzmocnienie sygnału GCaMP6s, aby pokryć co najmniej 25% histogramu kolorów, ponieważ GCaMP6s zwiększa swoją jasność nawet 4-krotnie.
  14. Dostosuj wzmocnienie przechodzącego światła, aby uzyskać jednolity sygnał próbki pokrywający około 70% histogramu kolorów.
    UWAGA: Szary kanał służy do wizualizacji i zapewnienia prawidłowego przepływu krwi przez wyspę trzustkową.
  15. W trybie akwizycji ustaw rozdzielczość obrazu na 512 x 512 pikseli, powiększenie na 5, krok linii na 3, szybkość skanowania na 13, a linię uśredniania na 2-3. Wybierz opcję Szeregi czasowe i ustaw Czas trwania na 500 cykli, z szybkością akwizycji 150 ms na klatkę.
    UWAGA: Pierwsze 50 klatek szeregów czasowych odpowiada podstawowej fluorescencji przed wstrzyknięciem glukozy. Zaobserwowano, że niektóre β-komórki wykazują podstawową aktywność in vivo. Reagująca komórka β z czasem wykaże wzrost intensywności zielonej fluorescencji wraz z wstrzyknięciem glukozy. Większość komórek β wykazuje odpowiedź na wstrzyknięcie 25 mM glukozy in vivo.
  16. Rozpocznij obrazowanie. Po pierwszych 50 klatkach (7,5 s) wstrzyknij glukozę za pomocą mikropompy.
    UWAGA: Wstrzyknięcia mogą powodować niewielki ruch, który może przesunąć płaszczyznę ogniskową wysepki. Podczas nagrywania filmu ruchy jelit mogą zmienić płaszczyznę ogniskową wysepki.
  17. Miej oko na akwizycję obrazu i ręcznie dostosuj współrzędne x, y i z, aby zachować tę samą płaszczyznę ogniskowej wzdłuż filmu.
  18. Po wstrzyknięciu glukozy system rejestruje odpowiedź wysp trzustkowych w postaci napływuCa2+ jako wzrost fluorescencji GCaMP. Po każdym wstrzyknięciu należy pozostawić larwy na odpoczynek przez co najmniej 5 minut przed dalszą stymulacją.
    UWAGA: Upewnij się, że jądra komórek pozostają stabilne podczas procesu. Jeśli wysepka porusza się w znacznym stopniu podczas akwizycji lub jeśli wysepka przesunęła się poza płaszczyznę ogniskową, próbka nie może być wykorzystana do dalszej analizy.
  19. Powtórzyć wstrzyknięcie trzy razy. Zapisz filmy w formatach TIF, CZI lub LSM (zalecane). Po zarejestrowaniu odpowiedzi Ca2+ bardzo powoli usuń naczynia włosowate z serca. Przechodzenie do następnego przykładu.
    UWAGA: Larwy danio pręgowanego można odzyskać na szalkę Petriego ze świeżym E2 zawierającym PTU.

4. Kwantyfikacja śladów fluorescencji GCaMP dla poszczególnych komórek β

UWAGA: Jeśli zwierzę wykazuje zbyt dużą ruchliwość, film można ustabilizować za pomocą wtyczki FIJI Rejestracja serii oparta na deskryptorze (2d/3d + t)17.

  1. Załaduj obraz do analizy, przeciągając go i upuszczając na FIDŻI. W oknie Opcje importu bioformatu kliknij OK.
    UWAGA: W przypadku formatów, które nie są obsługiwane przez FIDŻI, przekonwertuj filmy na format tiff w celu analizy.
  2. Aby wyodrębnić intensywność fluorescencji GCaMP, kliknij menu Analizuj > ustaw pomiary. Zaznacz pole Gęstość zintegrowana i kliknij OK.
    1. Otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji.
    2. W menu FIDŻI wybierz opcję Wielokąty znajdujące się na pasku narzędzi.
    3. Ręcznie narysuj wielokąt obejmujący obszar nieco większy niż jądro komórkowe i obejmujący część obszaru cytoplazmatycznego komórki, aby zapewnić prawidłowe określenie ilościowe odpowiedzi Ca2+ w pojedynczej komórce.
    4. Upewnij się, że położenie ROI jest spójne nad ramkami; jeśli to konieczne, dostosuj ROI.
    5. Dodaj wybrany ROI do Menedżera ROI, klikając przycisk Dodaj [t].
  3. Aby określić ilościowo sygnał GCaMP, oddziel kanały obrazu. Kliknij menu FIDŻI Obraz > Kolory > Podziel kanały i wybierz Zielony kanał.
  4. W Menedżerze ROI zaznacz wszystkie obszary i kliknij menu Więcej > Multi Measure. Zapisz wyniki.
    UWAGA: Jeśli komórka wysunie się poza obszar wielokąta z powodu wstrzyknięcia glukozy lub ruchu zwierzęcia, wyodrębnij fluorescencję komórki przed i po ruchu, ręcznie dostosowując obszar wielokąta.
  5. Aby przeprowadzić analizę pojedynczej komórki, wykonaj następujące kroki.
    1. Usuń kwiatostan tła. W tym celu należy rozważyć fluoryzację tła jako minimalną wartość zarejestrowaną na filmie dla każdej komórki (FMIN). Wartość minimalna jest odejmowana od całego szeregu czasowego (FT -F MIN) DLA KAŻDEJ KOMÓRKI.
    2. Znormalizuj wartości fluorescencji w całym filmie. Aby to osiągnąć, podziel każdą wartość przez najwyższą wartość intensywności w nagraniach dla każdej komórki. W tym celu należy obliczyć różnicę między FMIN a FMAX, tj. (FMAX - FMIN). Podzielić (FT -F MIN) / (FMAX - FMIN).
      UWAGA: Ten krok umożliwia porównanie odpowiedzi Ca2 + między różnymi komórkami i między wysepkami różnych zwierząt, ponieważ będą one emitować różne poziomy intensywności fluorescencji w zależności od płaszczyzny ogniskowej i dostępności komórki lub wysepki do obrazowania.
  6. Po uzyskaniu wartości fluorescencji pojedynczej komórki użyj programu (np. Excel lub R), aby przetworzyć wartości fluorescencyjne zmierzone od kroku 4 i automatycznie wykreślić ślady fluorescencyjne. Do przeprowadzenia analizy w niniejszym protokole (krok 6) wykorzystano tabelę uzupełniającą 1 (Singlecelltrace.xlsx).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowano ten protokół w celu scharakteryzowania odpowiedzi na glukozę poszczególnych komórek β w ich naturalnym środowisku. W tym celu larwę danio pręgowanego umieszcza się na szalce Petriego z szklanym dnem. Za pomocą manipulatora 3D do układu krążenia wprowadza się szklaną kapilarę, celując w SV (Rysunek 1 i Rycina 2). Pozwala to na wstrzykiwanie określonych objętości roztworów o zdefiniowanym stężeniu. Jednocześnie indukowany glukozą napływ Ca2+...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole zbadano dynamikę Ca2+ komórek β w ich natywnym mikrośrodowisku z rozdzielczością pojedynczej komórki. Jest to możliwe dzięki stymulacji komórek β danio pręgowanego za pomocą wstrzyknięcia glukozy do krążenia, jednocześnie rejestrując ich dynamikę Ca2+ za pomocą GCaMP6.

Protokół ma trzy główne zalety. Po pierwsze, naukowcy wykazali, że komórki β danio pręgowanego wykazują skoordynowaną reakcję na stymulację glukozy in vivo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Nikolay Ninov otrzymał fundusze z Centrum Terapii Regeneracyjnych w Dreźnie na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie oraz Niemieckiego Centrum Badań nad Cukrzycą (DZD), a także granty badawcze z Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) i Międzynarodowej Grupy Szkoleniowej ds. Badań (IRTG 2251), Strategie immunologiczne i komórkowe w chorobach metabolicznych. Jesteśmy wdzięczni Zakładowi Mikroskopii Świetlnej w CRTD za wsparcie we wszystkich technikach obrazowania. Dziękujemy Zakładowi Rybackiemu przy CRTD za wszelką pomoc techniczną i wsparcie dla ryb.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mmMattekP35G-1.5-14-CUżywamy tego naczynia ze szklanym dnem do montażu larw danio pręgowanego i wykonywania mikroskopii konfokalnej
Niebiesko-zielona kostka filtracyjnaZEISS489038-9901-000Zestaw filtrów 38 HE
Mikroskop konfokalnyZEISSLSM 980
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
Excel ( 2016)https://www.office.com/
Femtojet Eppendorf5252000013To urządzenie jest pneumatyczną mikropompą, która umożliwia precyzyjne dostarczanie objętości i jest wyposażona w uchwyt kapilarny. Używamy mikropompy Femtojet (ciśnienie wtrysku w zakresie 500-1000 hPa; ciśnienie kompensacyjne = 0 hPa; i czas dostawy = 1 sekunda).   
Femtotipy, szklane kapilary gotowe do użycia.Eppendorf5242952008Są to gotowe do użycia szklane naczynia włosowate, które mogą zastąpić naczynka naciągnięte.
FIDŻI, przy użyciu ImageJ Wersja: 1.51chttps://fiji.sc/
Lampa fluorescencyjnaZEISS423013-9010-000Oświetlacz HXP 120 V
Kapilary szklane 3,5"Drummonds Scientific Company3-000-203-G/XUżywamy tych szklanych naczyń włosowatych do przygotowania naczyń włosowatych, ciągnąc je za pomocą ściągacza kapilarnego
InjectmanEppendorf5192000019To urządzenie pozwala na manipulację 3D uchwytu kapilary
Niskotopliwa agarozaBiozymSztuka. -Nr.: 840101Używamy agarozy do montażu danio pręgowanego na naczyniu ze szklanym dnem
Końcówka mikroładowarki do mikrokapilar szklanych 0,5 – 20 µ L, 100 mmEppendorf 5242956003Długie końcówki do napełniania szklanych kapilar roztworami
Mikropęsety Dumont Swiss made0102-4-POZa pomocą mikropęsety przesuwamy larwy danio pręgowanego podczas montażu oraz odcinamy końcówkę szklanej kapilary (np. Dumont, rozmiar 4). 
Olej mineralnySigma-AldrichM5904Używamy oleju mineralnego do kalibracji wielkości kropli do wstrzykiwania
P-1000 Ściągacz do pipet nowej generacjiProdukty naukoweP-1000Używamy tego ściągacza kapilarnego do przygotowania szklanej kapilary za pomocą naczyń włosowatych Drumond. Używamy ściągacza kapilarnego P-1000 o następujących parametrach: Ciepło: 650, Uciąg: 20, Vel: 160, Czas: 200, Ciśnienie: 500.
PTU (1-fenylo-2-tiomocznik )Sigma-AldrichP7629Używamy tego związku do hamowania pigmentacji podczas rozwoju danio pręgowanego
Czerwona kostka filtracyjnaZEISS000000-1114-462 Zestaw filtrów 45 HQ TexasRed
Mikroskop stereoskopowyZEISS495015-0001-000SteREO Discovery.V8
Filtry strzykawkowe, sterylne. Wielkość porów 0,2 i mikro; mPall Corporation 4612Używamy ich do filtrowania wszystkich roztworów i zapobiegania kapilarnej odzieży igłowej
Transgeniczna linia danio pręgowanego: Tg(ins: cdt1-mCherry; cryaa:WPRyb); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)
metanosulfonian trikainy (MS222)Sigma-Aldrich  E10521Używamy tego związku do znieczulania larw ryb

Bibliografia

  1. Speier,, et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocol. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  2. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. Federation of American Society of Experimental Biology Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  3. Chen, C., et al. Alterations in beta-cell calcium dynamics and efficacy outweigh islet mass adaptation in compensation of insulin resistance and prediabetes onset. Diabetes. 65 (9), 2676-2685 (2016).
  4. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  5. Janjuha, S., Pal Singh, S., Ninov, N. Analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  6. Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nature Communications. 8 (1), 664(2017).
  7. Lorincz, R., et al. In vivo monitoring of intracellular Ca2+ dynamics in the pancreatic beta-cells of zebrafish embryos. Islets. 10 (6), 221-238 (2018).
  8. Mullapudi, S. T., et al. Disruption of the pancreatic vasculature in zebrafish affects islet architecture and function. Development. 146 (21), (2019).
  9. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. eLife. 8, 41540(2019).
  10. Yang, Y. H. C., Kawakami, K., Stainier, D. Y. A new mode of pancreatic islet innervation revealed by live imaging in zebrafish. eLife. 7, 34519(2018).
  11. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  12. Nath, A. K., et al. PTPMT1 inhibition lowers glucose through succinate dehydrogenase phosphorylation. Cell Reports. 10 (5), 694-701 (2015).
  13. Salem, V., et al. Leader β-cells coordinate Ca2+ dynamics across pancreatic islets in vivo. Nature Metabolism. 1 (6), 615-629 (2019).
  14. Ninov, N., et al. Metabolic regulation of cellular plasticity in the pancreas. Current Biology. 23 (13), 1242-1250 (2013).
  15. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Delgadillo-Silva, L. F., et al. Modelling pancreatic beta-cell inflammation in zebrafish identifies the natural product wedelolactone for human islet protection. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 036004(2019).
  19. Emfinger, C. H., et al. Beta-cell excitability and excitability-driven diabetes in adult zebrafish islets. Physiological Reports. 7 (11), 14101(2019).
  20. Zhang, M., Goforth, P., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. The Ca2+ dynamics of isolated mouse beta-cells and islets: implications for mathematical models. Biophysical Journal. 84 (5), 2852-2870 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki beta ryb zebrafishobrazowanie in vivowydzielanie insulinygenetycznie kodowane wska niki wapniazebrafish GCaMP6srozdzielczo pojedynczej kom rkikoordynacja wysepekhomeostaza glukozy
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.