Artykuł metodologiczny

Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek

DOI:

10.3791/62352

⸱

26 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1W. M. Keck Science Department, Scripps, Pitzer, and Claremont McKenna of The Claremont Colleges, 2W. M. Keck Science Department, Pitzer College, 3W. M. Keck Science Department, Scripps College, 4Department of Biochemistry and Biophysics, School of Medicine, University of California at San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół charakteryzacji ruchliwości i zachowania populacji komórek o rozmiarach stu mikronów do milimetrów za pomocą mikroskopii jasnego pola i śledzenia komórek. Ten test ujawnia, że Stentor coeruleus przechodzi przez cztery behawioralnie odrębne fazy podczas regeneracji utraconego aparatu ustnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stentor coeruleus jest dobrze znanym organizmem modelowym do badań nad regeneracją jednokomórkową. Analiza transkryptomiczna pojedynczych komórek ujawniła setki genów – wiele z nich nie jest związanych z aparatem ustnym (OA) – które są różnie regulowane w fazach podczas całego procesu regeneracji. Postawiono hipotezę, że ta systemowa reorganizacja i mobilizacja zasobów komórkowych w kierunku wzrostu nowej choroby zwyrodnieniowej stawów doprowadzi do obserwowalnych zmian w ruchu i zachowaniu odpowiadających w czasie fazom zróżnicowanej ekspresji genów. Jednak złożoność morfologiczna S. coeruleus wymagała opracowania testu w celu uchwycenia statystyk i skali czasowej. Do śledzenia komórek w krótkich filmach użyto niestandardowego skryptu, a statystyki zostały skompilowane na dużej populacji (N ~ 100). Po utracie choroby zwyrodnieniowej stawów S. coeruleus początkowo traci zdolność do ruchu kierunkowego; Następnie zaczynając od ~4 h, wykazuje znaczny spadek prędkości aż do ~8 h. Test ten stanowi użyteczne narzędzie do badań przesiewowych fenotypów ruchliwości i może być dostosowany do badania innych organizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stentor coeruleus (Stentor) jest dobrze znanym organizmem modelowym, który był używany do badania regeneracji jednokomórkowej ze względu na jego duży rozmiar, zdolność do wytrzymania kilku technik mikrochirurgicznych i łatwość hodowli w warunkach laboratoryjnych1,2,3. Wczesne badania nad regeneracją koncentrowały się na największej i najbardziej morfologicznie odrębnej cesze Stentora – chorobie zrodowej stawów – która całkowicie znika po wstrząsie chemicznym4,5,6. Zastąpienie de novo utraconej choroby zwyrodnieniowej stawów rozpoczyna się od pojawienia się nowego pasma błoniastego – układu rzęsek, które stopniowo przesuwają się w kierunku przedniej części komórki, zanim utworzą funkcjonalną chorobę zwyrodnieniową stawów w ciągu ośmiu etapów morfologicznych3. Etapy te były obserwowane sekwencyjnie, niezależnie od temperatury, i stanowią uniwersalny punkt odniesienia dla prawie wszystkich badań5.

Mechanistyczna analiza regeneracji Stentora wymaga narzędzi do pomiaru czasu regeneracji, które są na tyle solidne i proste, że można je zastosować do wielu próbek jako część chemicznego lub molekularnego badania. Standardową metodą wykonywania testu komórkowego jest obrazowanie, w tym przypadku obrazowania powstawania nowej choroby zwyrodnieniowej stawów podczas regeneracji. Jednak takie testy oparte na obrazowaniu są najbardziej skuteczne, gdy regenerująca się struktura zawiera odrębne składniki molekularne, które można wykorzystać jako markery, tak aby można je było łatwo wykryć na obrazie fluorescencyjnym. W przypadku choroby zwyrodnieniowej stawów Stentor znane składniki (rzęski, ciała podstawne) są również obecne na pozostałej powierzchni komórki; w związku z tym rozpoznanie przywrócenia otwartego dostępu nie może być osiągnięte jedynie poprzez poszukiwanie obecności lub braku komponentu.

Raczej, jakaś forma rozpoznawania kształtu byłaby wymagana do wykrycia choroby zwyrodnieniowej stawów, co jest potencjalnie bardzo trudne, biorąc pod uwagę fakt, że komórki Stentora często zmieniają kształt poprzez szybki proces kurczenia. W pracy przedstawiono alternatywny test regeneracji, który opiera się na ruchliwej aktywności ciała i rzęsek w chorobie zwyrodnieniowej stawów. W miarę regeneracji choroby zwyrodnieniowej stawów nowo powstałe rzęski ulegają powtarzalnym zmianom położenia i aktywności, co z kolei wpływa na ruchliwość pływania komórki. Analizując ruchliwość, możliwe jest przeprowadzenie testu "regeneracji funkcjonalnej", który określa ilościowo regenerację poprzez ilościowe określenie funkcji zregenerowanych struktur. Poprzednia analiza funkcji rzęsek Stentor podczas regeneracji wykorzystywała prędkość obrazowania cząstek, w połączeniu z kulkami znacznikowymi dodanymi do pożywki zewnętrznej, aby zaobserwować zmiany we wzorcu przepływu na różnych etapach regeneracji7; Jednak takie podejście wymaga pracochłonnego obrazowania pojedynczych komórek i powiązanych z nimi pól przepływu, jedna po drugiej.

Używając ruchu samej komórki jako wskaźnika przepływu generowanego przez rzęski, możliwe byłoby równoległe analizowanie większej liczby komórek, przy użyciu systemów obrazowania o niskiej rozdzielczości, kompatybilnych z platformami przesiewowymi o wysokiej przepustowości. Test ten można w zasadzie wykorzystać do badania rozwoju i regeneracji funkcjonalnej innych organizmów pływających w skali od setek mikronów do milimetrów. Sekcja 1 protokołu opisuje konstrukcję wielodołkowego szkiełka do pobierania próbek, które pozwala na wysokoprzepustowe obrazowanie populacji komórek przez okres do całego dnia. Znajdują się szczegółowe informacje na temat dostosowywania do użytku z innymi typami komórek. Sekcja 2 protokołu obejmuje pozyskiwanie danych wideo do tego testu, które można przeprowadzić za pomocą mikroskopu preparacyjnego z cyfrową lustrzanką jednoobiektywową. Sekcja 3 protokołu zawiera przewodnik po śledzeniu komórek i obliczaniu prędkości komórek przy użyciu kodu MATLAB (informacje uzupełniające). Sekcja 4 protokołu wyjaśnia, jak przekształcić wyniki liczbowe w wykresy, jak pokazano na Rysunek 1C-F i Rysunek 2C dla łatwej interpretacji wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Populacja około stu komórek S. coeruleus została wyhodowana zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem JoVE8.

1. Przygotowanie próbki

  1. Wytnij kawałek silikonowego arkusza dystansowego o grubości 250 μm (tabela materiałów) nieco mniejszego zarówno pod względem wysokości, jak i szerokości niż szkiełko mikroskopowe. Za pomocą dziurkacza 5/16" utwórz okrągłe studnie. Należy pamiętać o pozostawieniu wystarczającej przestrzeni między sąsiednimi studzienkami, aby zapewnić dobre uszczelnienie.
    UWAGA: Uznano, że odstęp 3 mm między sąsiednimi studniami jest wystarczający. Przy odrobinie wprawy na jednym szkiełku można umieścić dziesięć studzienek.
  2. Rozpocznij regenerację choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez inkubację komórek w 10% sacharozie lub 2% moczniku przez 2 minuty (Rysunek 1A). Następnie umyj trzy razy świeżym medium8. Delikatnie odpipetować około dziesięciu stentorów do każdej studzienki. Należy zachować ostrożność przy jak najdokładniejszym dopasowaniu objętości próbki do objętości studzienki.
    UWAGA: W przypadku zastosowanych tutaj wymiarów studzienki do każdej studzienki odpipetowano 12,5 μl próbki.
  3. Zamknij studzienki, delikatnie opuszczając kawałek szkła nakrywkowego (patrz Tabela materiałów) nad studzienkami, zaczynając od jednej krawędzi. Użyj wąskiego i lekko elastycznego przedmiotu, takiego jak końcówka do pipety o pojemności 10 μl, aby docisnąć szklaną pokrywę w miejscu, w którym styka się z arkuszem silikonowym, aby zapewnić dobre uszczelnienie.

2. Mikroskopia światła widzialnego poklatkowa

  1. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw powiększenie na najmniejsze dostępne, tak aby jedna studzienka zmieściła się w kadrze w całości.
    UWAGA: W tym protokole w mikroskopie zastosowano adapter aparatu 1,6x i powiększenie 1x na obiektywie.
  2. Rozpocznij film poklatkowy. Uzyskaj 10-sekundowe wideo przy 30 klatkach na sekundę z każdej studni w każdym punkcie czasowym. Jeśli używasz zestawu mikroskopowego z zmotoryzowanym stolikiem XY, zautomatyzuj cały film poklatkowy. W przeciwnym razie upewnij się, że użytkownik jest obecny w każdym punkcie czasu, aby ręcznie przetłumaczyć próbkę w celu zarejestrowania każdego dołka.
    UWAGA: Unikaj pozostawiania próbki oświetlonej, gdy nie obrazuje, aby uniknąć ogrzewania i parowania. Objętości próbek są małe, a parowanie doprowadzi do powstania pęcherzyków powietrza.
  3. Zapisywanie filmów w formacie TIFF, MOV lub AVI.
    UWAGA: Są to najpopularniejsze typy plików wideo, które nie są zastrzeżone. W zależności od konkretnego oprogramowania mikroskopowego, filmy mogą być domyślnie zapisywane w zastrzeżonym typie pliku, ale następnie można je wyeksportować do jednego z wyżej wymienionych typów plików.
  4. Użyj współczynnika konwersji piksel na milimetr dla skali fizycznej i wykonaj kalibrację lub użyj znanego rozmiaru piksela z używanej kamery. Aby przeprowadzić kalibrację, uzyskaj wyraźny obraz szkiełka kalibracyjnego lub przezroczystej linijki przy tych samych ustawieniach powiększenia, co filmy. Korzystając z dowolnego programu do przeglądania obrazów, policz liczbę pikseli między znacznikami znanej odległości fizycznej.
    UWAGA: Na przykład, jeśli na obrazie linijki znaki 1 mm i 2 mm są oddzielone od siebie o 100 pikseli, współczynnik konwersji wynosi 1 mm na 100 pikseli. Alternatywnie, aby określić ten współczynnik na podstawie rozmiaru piksela aparatu, po prostu pomnóż rozmiar piksela aparatu przez powiększenie. Na przykład, jeśli używany aparat ma piksele 3,45 μm, a użyte powiększenie wynosiło 1,6x, konwersja wynosi 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm na 1 piksel.

3. Śledzenie komórek

  1. Pobierz dwa skrypty, TrackCells.m i CleanTraces.m, do łatwej do zapamiętania lokalizacji na komputerze. Jeśli dane wideo nie znajdują się jeszcze na tym komputerze, przenieś je do tego komputera.
    UWAGA: Filmy z danymi i skrypty nie muszą znajdować się w tym samym folderze.
  2. Uporządkuj filmy z danymi w folderach, po jednym dla każdego punktu czasowego. Najpierw użyj skryptu TrackCells.m, aby wykonać automatyczne śledzenie komórek w filmach wideo z danymi. Otwórz TrackCells.m i uruchom skrypt.
  3. Wybierz opcję Dodaj do ścieżki, jeśli pojawi się monit w wyskakującym okienku., co zwykle ma miejsce tylko wtedy, gdy skrypt jest uruchamiany po raz pierwszy z danego folderu. Po wyświetleniu monitu wybierz co najmniej jeden film wideo z danymi, aby rozpocząć śledzenie, przejdź do filmów wideo z danymi (sekcja 2). Zaznacz wiele plików wideo, klikając z wciśniętym Shift, klikając z wciśniętym Control lub przytrzymując lewy przycisk myszy podczas przesuwania nad plikami, aby je podświetlić.
  4. Po zadowoleniu z listy plików w polu Nazwa pliku: u dołu okna monitu kliknij Otwórz. Najpierw wykonaj test na jednym filmie, aby upewnić się, że wszystkie parametry są ustawione poprawnie (patrz dyskusja poniżej).
    UWAGA: Ten skrypt utworzy teraz folder dla każdego wybranego pliku wideo. Następnie zapisze w tym folderze każdą klatkę wideo jako plik .jpg oraz plik o nazwie position_estimates.mat, który zawiera wszystkie ślady znalezione w filmie. W zależności od rozmiaru filmów, liczby filmów i szybkości komputera, działanie tego skryptu może zająć wiele godzin.

4. Weryfikacja śladów

  1. Przed kontynuowaniem sprawdź, czy kroki opisane w sekcji 3 zostały wykonane poprawnie, sprawdzając, czy nie ma żadnych komunikatów o błędach. Użyj skryptu CleanTraces.m, aby ręcznie odrzucić nietypowe lub fałszywe ślady. Otwórz CleanTraces.m w oknie edytora MATLAB, klikając dwukrotnie plik.
  2. Po wyświetleniu monitu Wybierz folder danych wyjściowych przez TrackCells.m. Będzie miał taką samą nazwę jak plik wideo, przejdź do jednego z folderów utworzonych zgodnie z opisem w sekcji 3. Wybierz tylko jeden folder.
    UWAGA: Ten skrypt będzie teraz wyświetlał ślady jeden po drugim w wyskakującym okienku. Są one nakładane na klatkę wideo, w której zaczyna się ślad, w kolorze zielonym, oraz klatkę wideo, w której ślad się kończy, w kolorze karmazynowym. W związku z tym prawidłowy ślad powinien łączyć zieloną komórkę i komórkę karmazynową.
  3. Po wyświetleniu monitu wprowadź wartość 1, aby zachować ślad i 0, aby odrzucić ślad. Naciśnij Enter, aby przejść do następnego śladu.
    UWAGA: Nowe ślady będą wyświetlane do momentu, gdy nie będzie już żadnych śladów lub nie zostanie pokazanych pierwszych sześćdziesięciu. Po zakończeniu tego procesu skrypt automatycznie utworzy folder o nazwie CLEAN TRACES do zapisywania danych wyjściowych i wyświetli wszystkie pozostałe ślady na pierwszej klatce wideo (Rysunek 1B). Ten obraz jest automatycznie zapisywany jako LabeledTraces.png do wykorzystania w przyszłości. Wszystkie ślady, które użytkownik zdecydował się zachować, zostaną zapisane w pliku clean_traces.mat.
  4. Wykonaj ten krok dla wszystkich filmów w jednym punkcie czasowym, zanim przejdziesz dalej.
    UWAGA: W przypadku danych zawartych w tym manuskrypcie uzyskano jeden film wideo dla każdej studni w każdym punkcie czasowym, co daje w sumie dziesięć filmów wideo na punkt czasowy.

5. Wizualizacja danych

UWAGA: Aby wizualnie porównać ruchliwość całej populacji komórek w różnych punktach czasowych, wszystkie ślady z sekcji 4 zostały przetłumaczone tak, aby zaczynały się od początku i tworzyły jeden wykres przemieszczenia radialnego w funkcji czasu dla każdego punktu czasowego (Rysunek 1C-F, zobacz Rysunek Uzupełniający S1 dla wszystkich punktów czasowych).

  1. Zacznij od pobrania skryptu zatytułowanego SpaghettiPlots.m. Otwórz i uruchom skrypt. Gdy pojawi się okno przeglądarki plików z monitem Wybierz folder czasu zawierający dane studni (clean_traces.mat) do wykresu, przejdź do folderu jednego z punktów czasowych. Zwróć uwagę, że ten folder powinien zawierać w sobie folder dla każdego z analizowanych filmów.
  2. Po wyświetleniu monitu Kalibracja: Jaka jest liczba pikseli na milimetr?, wpisz wartość kalibracji znajdującą się w kroku 2.4 i naciśnij Enter.
    UWAGA: Skrypt połączy teraz ślady ze wszystkich analizowanych filmów w tym momencie w jeden wykres (Rysunek 1C-F). Słabe kropkowane okręgi na wykresie wskazują przemieszczenia promieniowe 1, 2, 3 i 4 mm.
  3. W razie potrzeby dostosuj osie wykresu, zmieniając wiersz 55 skryptu, który domyślnie jest ustawiony na rr = 4 w celu uwzględnienia promienia do 4 mm. Zapisz wykres.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego testu jest ilościowe określenie stopniowej zmiany wzorców ruchu i stopniowego wzrostu prędkości ruchu z komórek w dużej (N ~100) regenerującej się populacji Stentora. Aby ułatwić interpretację wyników, niestandardowy kod zawarty w tym protokole generuje dwa typy wykresów: nakładkę wszystkich śladów ruchu komórek w zestawie danych wideo (Rysunek 1C-F i Rysunek S1) oraz wykres prędkości pływania według godziny od rozpoczęcia regenera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie istnieje wiele algorytmów śledzenia cząstek i komórek, niektóre całkowicie bezpłatne. Koszt i łatwość obsługi to często kompromisy wymagające kompromisu. Ponadto wiele z istniejących programów do śledzenia komórek jest zaprojektowanych do śledzenia powolnego ruchu pełzania komórek hodowli tkankowych, a nie szybkiego ruchu pływackiego Stentora, który obraca się podczas pływania i może ulegać nagłym zmianom kierunku. Po przetestowaniu wielu z tych opcji, przedstawiony tutaj protokół ma być kompleksowym roz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Dziękujemy Evanowi Burnsowi, Mitowi Patelowi, Melanie Melo i Skylar Widman za pomoc w niektórych wstępnych analizach i testach kodu. Dziękujemy Markowi Slabodnickowi za dyskusję i sugestie. WFM potwierdza wsparcie z grantu NIH R35 GM130327.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Arkusz silikonowy o grubości 0,25 mmGrace Bio-LabsCWS-S-0,25
24 x 50 mm, #1,5 szkło nakrywkoweFisher ScientificNC1034527Jak zauważono w Dyskusji, można użyć mniejszego szkła nakrywkowego, jeśli na jednym szkiełku umieści się mniej studzienek na próbki.
Użyliśmy aparatuUżyliśmy Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT szczepChlamydomonas Centrum zasobówCC-125
MATLABMATHWORKS
Matlab Image Processing ToolboxMATHWORKSpotrzebne dla TrackCells.m i CleanTraces.m
CCD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
  2. Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
  3. Tartar, V. The Biology of Stentor. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).
  4. Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
  5. Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
  6. Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861(2014).
  7. Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167(2020).
  8. Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759(2018).
  9. Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788(2017).
  10. Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stentor coeruleusregeneracja jednokom rkowamikroskopia poklatkowatest motyliczno ci kom rekwykresy spaghettiprzyleganie za pomoc dysku przylepnegozsynchronizowana regeneracja

Powiązane artykuły